（细胞生物学专业论文）紫外线诱导家蚕卵巢细胞（bmn—swu1）凋亡的研究.pdf

摘要 紫外线诱导家蚕卵巢细胞( b m n s w u l ) 凋亡的研究 细胞生物学专业硕士研究生：陈默 指导教师：潘敏慧教授 鲁成教授 摘要 目前华中师大实验小组已经证明，在紫外线照射或杆状病毒诱导的昆虫细胞凋亡中，c y t c 从线粒体释放到细胞质中提示了与哺乳动物细胞的凋亡相同，这表明线粒体在昆虫细胞凋 亡中也具有重要作用。作为生物学、遗传学和发育生物学模式昆虫之一的家蚕，其细胞凋亡 研究尚处于初始阶段是否存在线粒体途径仍然未知。本研究以家蚕卵巢细胞b n 悄一s 、u 1 细胞为实验材料，对紫外线诱导的细胞凋亡进行了初步的研究，获得了以下研究结果。 l 砌卿纪基因克隆与信息分析 本实验成功克隆了家蚕砌，蠡c 基因，c d n ak 为5 7 0 b p ，o l 心长：3 2 4 b p ( o l 心：“_ 4 0 7 ) ， 编码1 0 8 个氨基酸残基，预测分子量为1 1 7l 。通过结构域预测，编码蛋白含有一个典型的 c y k 结构域。通过多序列比对显示，与n c b i 登录的人、人鼠和果蝇( 9 l c d 和钞纪_ p ) 的 蛋白序列相似性分别为7 5 ，8 3 ，7 5 和8 8 。基冈组序列分析结果显示砌啪基因具有 4 个外显子，外显子内含子边界处均符合g t a g 规则。参与凋亡时与凋亡蛋白酶激活因子 ( a p a 卜1 ) 相互作用的关键位点在家蚕细胞色素c 中是基本保守的 2 u v c 诱导家蚕b i i 悄一s w u l 细胞凋亡- u v c 处理家蚕b m n s w u l 细胞后，可诱导b m n s 、砌l 细胞产生典型细胞凋亡光 镜下可见细胞膜表面突出或形成小泡。细胞破裂成凋亡小体u v c 处理2 4 h 后，细胞几乎全 部破裂成凋亡小体。h 0 e c l l e s t 3 3 2 5 8 染色显示感染细胞核逐渐形变直至破裂成小块而被凋亡 小体包裹。b n n s 、) i ，u l 细胞处理后d i n a 琼脂糖凝胶电泳成典型凋亡细胞d n a 梯形电泳谱带。 3u v c 诱导家蚕b m n s 、砌l 细胞凋亡时细胞内线粒体变化 流式细胞仪对线粒体膜电位进行检测结果表明细胞经罗丹明( 砌的一1 2 3 ) 染色后在 流式细胞仪上检测，u v c 处理后1 2 h 的b m n s w u l 细胞中，膜电位f 降的细胞明显增多， 荧光峰左移即朝荧光强度减少的方向移动，说明此时膜电位下降。w b s 舡珊b i o n i n g 检测蛋 白c y t c 在细胞质和线粒体中的含量，结果显示b m n s 、砌1 细胞在处理后1 2 h 线粒体中的c y t c 被释放到了细胞质中这与很多在哺乳动物中所作的结果相同 两南人学硕i 学伸i 仑史 关键词：家蚕细胞凋亡线粒体细胞色素c a b s t r a d s m d y o na p o p t o s i so fb m n s w u lc e uo f b d m 勿历优d 力i n d u c e db y u 1 t r a v i o l e tl i g h t m a j o r ： m a s t e rc a n d i d a t e ： a d v i s o r ： c e nb i o l o g y c h e nm o p r o fp a nm i n h u i p r o fl uc h e n g a b s t r a c t s of b r n 豫v eb e 锄p m v e dt i l a tc y t ci s 他i e a d 丘o mm i t o c h o n 耐at 0c y t 叩l 笛mi i ic e n a p 叩t o s i s 砌u c e db yu l 蛔v i o l e tl i g h to rb 孔u l o v i m sb yt l l e 陀a r c hg r o 叩o fh 啪毋h o n g n 眦玳们u i l i v e 幅i t y t h i s 他s u l ts u g g e s t s 吐i a n i t o c h o n 砸ap l a yk e ym l e i l la p o l ，t o s i si i ii 璐e c tc e l l s l i l 汜m 锄y 删砌m l i 锄c e l l s a so mo ft l l em o d ei 璐e c t si i ib i o l o g y ，h e 删哆觚dd e v c l 叩m 锄t a l b i o l o g y ，m e 代a r c ho na p i 叩t 0 s i so fb 响b y xm 嘶i ss t i l la tt l l e 研m a r ys t a g e y e ti ti su n c l e 盯 t l i a tw h e m 盯t l l e i st l l es 锄p a t i l w a yi i lb o m b y xm o r io rn o t i i lt l l i sw o r l 【s ，a p o p t o s i si n d u c c d b yu v c w e 他s t i l d i e di i lb m n s w ulc e n s t 1 l em a i nr 妫u l t sa m 弱f o l l o w s ： 1 1 1 圮c l o 肥o f 砌f c 觚dt 1 1 eb i o i n f o m m t i o na l a y s i s w ec l o n e dm eg e n ec y t o c h r o m eci ns i l k w o 肿( b o m b y xm o r i ) 锄d 锄a l y 跫di t s q u e n c e 1 n h e 麟u i t s 蜘t i l a t t i l e l g t h o f i t sc d n a 柚d o l 强玳5 7 0 b p 锄d3 2 4 b p ( o r f ：8 4 4 0 7 ) m d e d u c e d 州e i i li s1 0 8 龃锄dd c d u c e dm o l e c u kw e i g h ti sl1 7 k d i th 勰at y p i c a ld 0 眦i no f c 弘o c h m ec 加i d 他s u l t so b t a i n e db yu s i n gc l u s t a lws h o wt l 协tt h ed e d u dp m t e i ns h a 玎胬7 5 i d e n t i t yw i t i lh l 蛐矾，8 3 w i t l lm t ，7 5 w i t l ld s 叩h i l a ( n y o ) a n d8 8 w i t l ld r o s o p h i l a ( n y p ) 1 i 圮西t i c a la m i a c i d sf o rc 如0 c h r o n 圮c ：a p a f i i n t e m c t i i sc 伽鲫n 忸t i v e s h a 他s7 5 i d t i 哆w i t i lh u m 姐，8 3 w i t hr a t ，7 5 w i t id r o s o p h i l a ( n y d ) 锄d8 8 w i t l id p h i l a ( n y - p x a n dt l l er 豁u l 埝o fg 明o l t 砖a l a y s i ss h o wt h a tt l i eg e n ec c m t a i n s4e x o 锄dt h e ya l lc f 0 肌e dm e g t a g 九l l e a i t l 圮嘶t i c a l 锄i n o 孔i d sf o rc ”0 c l 啪m ec ：a p a f li r i t e r 跹t i i sc 伽髓r v a t i v ei n b o 瑚b y x m r i 2 a p o t o s i si n d u c e db yu v ci nb m n s w u lc e l l s m i c o p i ce x 觚l i n a t i o no fb m n s w ulc e l l sd e a i i e dw 油u v 陀v e a i e dp g 陀s s j v ec e n b l e b b i n gs t a n i i 】哆a tl2 hp i 狮dc u l m i n a t i n gi nt o t a lc e l ld e s 咖c t i a t2 4 hp i t h e 纳g i n e n t a t i o fi n d u c e dc c u 咖c i e iw 雏s h o w e dw i t hh 0 e c h e s t 3 3 2 5 8 a g a m g e le i e c 仃0 p h o 他s i s 锄l y s i so f l 两南入学硕l 。学仃涂史 量曼鼍曼鼍曼皇曼曼曼曼皇曼曼曼曼曼皇曼曼皇曼曼曼曼曼曼曼曼曼磐曼量b ；矗竺董立ii皇s 兰兰皇璺璺曼曼曼曼曼鼍曼曼皇曼曼曼舅舅曼曼曼曼曼曼曼皇 d n ae x t r t e df b o md e a l l e dc e us h o w e dt y p i c a ld n al a d d e r a l lt h e s u p p o r t o dt h a tu v c 骶a t e db m n s 、 ，ulc e l l s 帅d e r g oa p o p t o s i s 3 n ec h 锄g eo f 仃i i t o c h o n 嘶o ni na p o p t o s i so fb m n s w ulc e l l s 砌u c e d b yu v c u 惦i n gm en o wc 巾眦仃ya 渤y e f f o r to fu v c0 nm i 妣h o n “a l 腿m b 啪ep o t e n t i a lw 签 i n v s t i g a t e db yr h 1 2 3s t a i n i n go fc e l l s t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h er h 1 2 3n u o 他s c e n t i n t e n s i t yi n b m n s w ulc e l l sw 弱r e d u c e da 缸r 仃e a n i l e n t 五时12 h ，锄dn u o r e s c e n c ep e a l 【s l l i r1 e r 1 1 1 ee 脆c t s o fu v c0 na p o p t o s i s 陀l a t e dp r o t e i nc y t cw e r ei n v e s t i g a t e db yw e s t e mb l o n i n g c y t cw 弱佗l e 勰e d f 如mm i t o c h o n “at oc y t 0 l i ca f t c ri n d u c t i f o rl2 h a n dt h i s 托s u l ti si d e n t i a lw i t l lm 卸y m a m n l a l i a nc e s ? k e _ y w o r d s ：砌西畛朋口一 a p o p t o s i s m i t o c h o n d r i o n c y t o c h r o m ec 部分缩j 弓的中英文对照 部分缩写的中英文对照 独创性声明 学位论文题目：苤处缦透昱塞蚕理篡缉胞( 麴堕二墨盥! 12 凋圭鲍盈究 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为 获得西南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文作者： 签字日期：豳扩年6 月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密， 口保密期限至年月止) 互 学位论文作者签名：腊砝导师签名：彳 签字日期： 洲年月 配体( l i g 柚d ) 分子是这些受体分子盼激活剂， 除n g f 外，所有配体都属t n f 超家族。c d 9 5 l 结合c d 9 5 、t nf 或淋巴毒素q 结合t n f r l 、 a p 0 3 l 或t 、 ，e a k 结合d r 3 、a p 0 2 配体( a p 0 2 l 、t r a l l ) 结合d r 4 和d r 5 ，结合c a r l 的配体不清楚 1 2 3 内质网凋亡信号途径 近年来研究发现，除了以上细胞凋亡信号传递途径外细胞内存在新的细胞凋亡信号通 路一内质网c a s p a s c - 1 2 途径。该通路主要由位于胞浆的c a l p a i n 和位于内质网的c 舔p a s e 1 2 组 成内质网在细胞蛋白质生物合成过程中处于中心地位也是细胞内钙离子的储存库之一 i 彤l 。细胞内钙离子通道、钙结合蛋白以及隔离离子内质网及其它的细胞空间内的调。诲。钙 离子在诸如生殖、细胞增殖、中枢神经系统的学习记忆等一些生理过程中发挥重要作用。内 质网参与蛋白质翻译后的修饰、折卺和寡聚化，还参与脂质代谢和类固醇激素的合成、钙的 储存，朱折叠或错误折叠蛋白的增多、胞内钙的火衡引起的内质网的应激反应，以及由过强 的内质网虑激反应诱导的细胞凋亡这是与死亡受体和线粒体介导细胞凋亡不同的一条途径， 主要由c a s p a s r l 2 活化引起c 勰p a 辩级联反应所介导4 6 1 。 1 3u v 诱导的细胞凋亡 1 3 1u v 诱变机理 紫外线携带的能量很小，穿透力弱，不足以引起物质的电离，属于非电离射线。紫外线 的波长范围是1 3 铲3 9 0 n m ，分为u v a ( 波长为3 2 0 一3 ) ，u v b ( 波长为2 8 0 - 3 2 0 舯) 。u v c ( 波 k 小丁2 8 0 n m ) 其中对诱变有效的范用是2 0 0 3 0 0 n m ，而2 6 0 n m 效果最好，它能使原丰中的内 7 两南大学硕。f ：学位论文 层电子提高能量。而成为活化分子由于紫外线带有人约3 5 e r 的能量，它足以引起一个分子 中某些化学键发生断裂、交联而产生化学变化，物质吸收紫外线后，物质分子由于电子的激 发而变成激发分子，从而引起分子结构的改变。在紫外线的照射下，d n a 分子结构变化的形 式很多，例如，d n a 链的断裂，d n a 分子内和分子间的交联，d n a 和蛋白质的交联，胞嘧啶 的水合作用，以及嘧啶二聚体昀形成等，这些变化都有可能引起基因突变，d n a 中嘧啶对紫 外线诱变的敏感性要比嘌呤大1 0 倍左右，常见t t 二聚体以共价键在相邻的二个碱基间联结而 成的嘧啶二聚体，是发生在d n a 的同一条链上的两个相邻的胸腺嘧啶残基闻形成t t 聚体，也 可形成t c 或c c 二聚体。火剂量的紫外线照射，能引起d n a 双螺旋的局部变性，可使两条互补 链上的两个嘧啶残基互相靠近而形成二聚体，从而引起交联。当d n a 复制时两链间的交联 会阻碍双链的分开与复制，同一条链上相邻胸腺嘧啶之间二聚体的形成，则会阻碍碱基的正 常配对，这样，不是导致复制的突然停止，就是导致在新形成的链上诱发一个改变了基丙序 列。 1 3 2u v 诱导的细胞凋亡 近年来研究发现u v 不仅能引发日光性皮炎、皮肤老化、免疫抑制、白内障和皮肤癌等疾 病，还能诱导细胞发生凋亡。文献报道紫外线叮诱导人表皮的【肌g e r h a n s 细胞，角质细胞凋亡 1 4 7 船l ，也可诱导人u 1 3 9 ，h e l a ，a 4 3 l 细胞系及b t 一2 乳腺癌、h l 一6 0 骨髓淋巴瘤、3 t 3 成纤维细 胞i 矧、人肠癌l o v o 和h t - 2 9 凋亡。其诱导机制上不明确，可能是在基因水平上激发一些与凋 亡相关的基因表达发生改变有关。f r e n c h 等的研究表明紫外线诱导人u 9 3 7 ，h e l a 细胞发生凋亡 时c l u s t e r i n ( 即1 r i 冲m 2 ) 基因表达+ r 降或消失。而亿嘲嘞等的研究显示，u v 照射后可激发培养 细胞的各种原癌基因( p r o t 0 - o n c o g e n e s 的转录活性，包括f c 奶u n 家族，紫外线照射表皮后可引 起c j 帅，j 硼b 和c f o s m r n a 升高。而b c 卜2 的转录下降。s c h r e i b e f 发现缺乏c 一凰的鼠3 t 3 成纤 维细胞在受到紫外线的照射时，较野生犁的3 t 3 成纤维细胞，其克隆存活和增殖能力明显下降， 细胞凋亡增加1 5 i i 。在昆虫细胞多以s f - 9 ，s f 2 l 为模型来探索u v 照射后的细胞凋亡的分子机制。 1 3 3u v 诱导的细胞凋亡可能机制 u v 诱导凋亡的机制具有细胞特异性，科研人员对u v 诱导的凋亡作过大量的研究提出了如 下几种可能的机制( 如图1 ) ： 8 第一章文献综述 图lu v 诱导细胞凋亡的信号通路i 删 1 3 3 1d n a 损伤介导的细胞凋亡 当u v 照射细胞后，细胞内的生色团将光能转化为生物化学信号，从而行使生物学功能。 d n a 作为u v 的一个主要靶标，u v 可以引起两种类型的d n a 损伤：嘧啶二聚体的形成和光生产 物。通常情况下这些损伤可通过核昔酸切除修复，也可通过光复活作用取得相同的效网，它能 分解由于紫外线照射而形成的嘧啶二聚体，去除d n a 损伤，恢复d n a 的正常双螺旋结构i ”j 当d n a 受损伤后p 5 3 增多介导细胞生k 在g l 期停滞以修复损伤：不可逆损伤发生时p 5 3 则通过诱导凋亡启动细胞夕| 三亡。不同齐i j 量u v 对凋亡和p 5 3 的诱导也不同：小剂量促进d n a 损伤 修复，中剂量引起不定数量细胞进行修复或凋亡，大剂量剡诱导凋亡h e n s e l e i t 等已经证实了 p 5 3 在u v 诱导凋亡中的作刚。k u l m s 等研究发现，经紫外线处理的h e i a 细胞，通过脂质体介导 的光复活酶转染细胞通过光复活作用使嘧啶二二聚体减少，在一定程度上可抑制细胞凋亡发 生嘲在鼠和人体内实验也得剑了同样的结果，通过脂质体介到的t 4 n 5 转染细胞，在一定程度 上减少了晒伤细胞的数目l i 。 由此可见，细胞基因组d n a 的损伤在紫外线诱导的细胞凋亡中扮演重要角色。然而，经紫 外线处理后一方面可促进p 5 3 表达并伴随着细胞凋亡，防止肿瘤的发生：另一方面可造成p 5 3 基 因的突变，提高肿瘤发病宰。经u v 处理后的角质形成细胞人约有4 发生p 5 3 基因的突变，然 而，非常少的细胞发生癌变由此可见还涉及其他的途径诱导细胞凋亡啪l 。k u l m s 等在体外实 验证实通过光复活作用提高d n a 的修复，并没有完全抑制凋亡的发生。表明还存在其他的通 路起始细胞凋亡l 1 3 3 2 死亡受体介导的细胞凋亡 紫外线处理人角质细胞株h a c a t 后，免疫沉淀显示u v 诱导其凋亡的机制是直接激活 9 两两入学坝l 掌位论义 c d 9 5 ，通过连接器蛋白f a d d ，启动凋亡通路1 5 7 l 。激光共聚焦扫描显微镜显示，经紫外线处 理的细胞c d 9 5 受体在细胞表面簇集。相反未经处理的细胞只有很少的c d 9 5 在细胞表面存在。 r e h e m t a l i a 等用紫外线处理乳腺癌细胞株m c f 7 ，也观察到了同样的现象。r o n e 等报道川紫 外线处理细胞可直接活化细胞表面一些受体( 如：表皮生长因子、t n f 、干扰素一1 ) 活化的受 体可激活胞内刷k 信号通路侧。如果将细胞置下1 0 条件下用紫外线处理，那么将阻i ：j n k 信 号通路的活化，因为在这样的条件下可抑制这些受体在细胞表面的群集因此，较低的温度 下用紫外线处理h a c a t 细胞几乎可完全抑制c d 9 5 群集，从而降低凋亡率例。以上的结果表 明紫外线诱导的细胞凋亡可由膜表面死亡受体介导。 如果紫外线诱导的细胞凋亡存在两条途径：一条途径由d n a 损伤而诱发的细胞凋亡：另一 条途径是由细胞死亡受体介导的细胞凋亡，那么通过抑制这两条通路将导致细胞凋亡率的降 低。为了阐明这个问题k u i m s 等在4 条件f 用紫外线处理h e l 瑚胞，然后通过光复活作h j 进 行d n a 修复。低温条件下，使死亡受体的群集受到抑制，从而在一定程度上降低了凋亡率：通 过光复活作用提高d n a 的修复。细胞凋亡明显被抑制。因此，只有两条通路同时被阻断，才能 抑制凋亡的发生1 5 5 1 。以上的研究表明，d n a 损伤和死亡受体两条通路即相互联系义相互独立。 然而，即使阻断死亡受体通路，同时减少d n a 损伤，也不能完全阻l l 二细胞凋亡的发生。由此 可见在紫外线诱导的细胞凋亡中可能还存在第二条途径。 1 3 3 3 线粒体损伤介导的细胞凋亡 b c 卜2 家族的表达产物对线粒体内一些促凋亡冈子的释放具有调控功能因此在决定细胞 生死中也具有十分重要的作用i 枷5 。b c 卜2 家族的凋亡蛋白由抑制凋亡蛋白和促进凋亡蛋白2 类蛋白质所组成，包括b c 卜2 ，b c 卜x l 、b c 卜硒，b a kb a d ，b a g - 1 ，b a l c ，b i k 和b i d 等。b c 卜2 和b c i x i 主要分布在线粒体膜与细胞质中，可以阻止孔道的形成，使c y t c 不能通过外膜，从而抑制凋亡 1 6 2 l ：b c 卜硒，b 戤，b a d ，b 笞l ，b a l ( ，b i k 和b i d 则分布于细胞质中具有促进细胞凋亡的作朋。研 究发现u v 可以使b c i 一2 的表达f 调从而诱发凋亡，同时伴随着s m a c d i a b l o 从线粒体释放 到胞质1 3 9 4 们。活化型s m d i a b l o 蛋白n 2 末端的i a p 结合域是调节凋亡的功能区，该区一口 与凋亡抑制蛋白( i a p s ) 相结合，即解除l a p s 对c 笛p a 9 及c 舔p 觞e 3 活性的抑制作用，从而促进 凋亡1 6 5 两i 并且研究发现在某些u v 诱导的凋亡中线粒体途径和死亡受体途径同时存在1 6 7 1 。 1 3 3 4 其他机制 1 3 3 4 1 神经酰胺介导的细胞凋亡 人量的研究表明，鞘磷脂的代谢产物可能参与某些细胞凋亡信号传递途径。在t n f a 等启 动的众多信号途径调竹子中神经鞘磷脂的代谢产物一神经酰胺可能是凋亡启动的关键调肖 子。经紫外线处理的细胞能激活神经鞘磷脂酶( a s m 弱e ) 通路，它能水解鞘磷脂而产生神经酰 胺，神经酰胺作为第二信使片；动细胞凋亡【矾叫神经酰胺调1 7 u v 诱导的州k 的活性，对丁凋亡 1 0 第一章文献综述 基因的转录激活是必须的，抑制刷k 的活性将阻断u v 诱导的2 9 3 细胞凋亡i m j 研究发现在 a s m a 鸵缺失的细胞株，u v 诱导的小k 的活性被阻断。然而，等研究发现，类脂组织细 胞增多症病人的成纤维细胞在缺失a s m a 辩的情况下用紫外线处理细胞可激活玳k 信号通路 由此可见，a s m 粼和神经酰胺在u v 活化的小k 通路与细胞凋亡之间的作用还有等阐明 m a d l i u m i t a 等研究发现，u v 可诱导的凋亡被神经酞胺调节具种属特异性【7 l l 。 1 3 3 4 2 蛋白激酶c ( p l ) 蛋白激酶在调节表皮分化中起着重要作用，近年来还发现其参与u v 诱导的多种细胞类型 的凋亡【7 2 1 正常人p k c 经u v 辐射，可使p k c 在其亲水端产生一催化区域。这一变化可提高p k c 的活性，而抑制p k c 的活性能阻滞u v 诱导凋亡的发生 1 4 细胞凋亡检测常用方法 1 4 1 形态学观察 凋亡最初根据某些单个细胞死亡时细胞碎裂如花瓣或树叶散落股的形态学特征目前对 细胞凋亡的认识正在不断得到深化。检测凋亡细胞的方法也逐渐增多，但形态改变仍是确定 细胞凋亡的最可靠的方法光学显微镜和电子显微镜观察是最直观的细胞凋亡检测方法 ( 1 ) 光学显微镜观察 凋亡细胞的主要特征为核染色质致密深染，形成致密质块，有时可碎裂。在h e 染色的组 织切片中细胞体积缩小，胞质致密、嗜酸性染色增强，并可形成凋亡小体在组织中凋亡细 胞常以分散单个形式存在，凋亡细胞与周围细胞分离，不引起炎症反应。本方法简便易行， 但在细胞密集的组织中对于改变不典型的细胞判断较困难，常缺乏较为特征的指标，具有较 强的主观性，重复性差，本方法可用于凋亡现象的初步观察作为分析指标之一1 7 3 1 一 ( 2 ) 电子显微镜观察 关于凋亡细胞的超微结构特征，包括透射电镜和扫描电镜下的改变在许多文献中已有 详尽描述。凋亡细胞的典型形态改变如胞质的岗缩，染色质浓缩成半月形或帽状附于核膜， 核的碎裂和凋亡小体形成等，在透射电镜卜得到最佳的体现。为凋亡细胞判定提供了最可靠 的依据本方法的缺点是样品制作过程较复杂且仪器、设备的费用昂贵，较难，“泛大量开 展l 矧。由于样品范围局限，在凋亡细胞数较少时需进行人最的观察才能观察到典型的凋亡改 变还应指出的是，在观察体外培养的凋亡细胞时，常可见到各阶段的改变，并可见到较多 典型的凋亡小体，凋亡初期胞体收缩、染色质边聚和后期凋亡小体( 或整个凋亡细胞) 被吞 噬和降解的现象也经常出现。一些不典魁的改变容易被忽略，在观察时要特别予以注意。 1 4 2d n a l a d d e r 分析 d n a 凝胶电泳图谱簪现“梯状”断裂现象是细胞凋亡的一个重要典碰标：占，是发生凋亡 l l 两雨大学硕i ：掌位论义 的一个可靠证据。检测原理是细胞发生凋亡或坏死，其细胞d n a 均发生断裂，细胞内小分子 量d n a 片断增加，高分子d n a 减少，胞质内出现d n a 片断。但凋亡细胞d n a 断裂点均有 规律的发生在核小体之间，出现1 8 铲2 0 0 b p d n a 片断，而坏死细胞的d n a 断裂点为无特征的 杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡。并可与坏死细胞区别。止常活细胞d n a 电 泳出现阶梯状( l a d d e r 条带；坏死细胞d n a 电泳类似血抹片时的连续性条带m a n i i l 等人报 道了药物与细胞内特异的靶点结合后，诱导的细胞凋亡途径存在细胞特异性细胞类型、细 胞分化程度的不同，参与凋亡的细胞成分或凋亡的调控机制也可能不同，不论什么因素诱导 何种细胞凋亡，最终都要通过不同途径激活细胞内的内源性核酸内切酶。从而引起染色体d n a 的断裂形成d n a 片段，凝胶电泳时出现典型的梯形带。已有的研究报道表明许多化学物 质诱导的动物细胞凋亡与化学物质的浓度直接有关【7 4 l 1 4 3m r n a 水平的检测 研究者们发现了很多在细胞凋亡时农达异常的牲冈检测这些特异基冈的表达水平也成 为检测细胞凋亡的一种常片j 方法。据报道，f 笛蛋n 结合受体后能诱导癌细胞中的细胞毒性t 细胞( c 归t o x i c t c e n s ) 等靶细胞。b c 卜2 和b c 卜x ( 长的) 作为抗凋亡b c 卜2 和b c 卜x ) 的调 节物它f | j 的袭达水平比例决定了细胞是凋亡还遗存活。一般多采朋n o n h e m 杂交和r t - p c r 对它们进行检测嘲。随着近年来荧光定醚p c r 技术的发展，圳定龉p c r 技术来检测基因表达 水平无疑比之前者更快更准确。i n t e r g e n 公，司的a m p i m u o r a p 叩t o s i s g 朗es y s t e m & 就根据这一 新技术原理，通过检测是略，b 戤一a l p l l a 季i ib c 卜x 基闪的i i l i 州a 表达水平米进行细胞凋亡的检 测。 1 4 4 抗体法 在细胞凋亡的过程中，一些特异性的细胞蛋自被激活或降解。这些蛋白的活性和分子量 变化，可以作为判断凋亡发生的依据。目前，抗c 删抗体及抗f a l 冲抗体是两种常用的抗 体，通过w 色s t e 棚b l o t t i n g 的方法检测c a s p a 或f a l 冲分子量变化，而检测细胞凋亡的发生 碘化丙啶( p r o p i d i u mi o d i d e ，p 1 ) 检测膜联蛋白( 锄e x i n ) v 标记d n a 琼脂凝胶电泳法猾亡 蛋白质酶c a s p a 一3 及其底物的检测f 7 6 j 1 4 5 酶活性测定 c a s p a 是细胞凋亡的主要效应酶，凋亡发生时c a s p a s e 由无活性的酶原转变为有活性的 酶形式，发挥天冬氨酸特异的催化活性。人 ：合成荧光标记的c a s p a 短肽底物，可以根据荧 光强度变化定量或定性检测c a s p a 辩的活性改型7 7 1 。 1 4 6t u n e l 细胞凋亡晚期中，核酸内切酶在核小体之间剪切核d n a 产生人量长度在1 8 0 _ 2 0 0 b p 的 1 2 第一章文献综述 d n a 片段细胞凋亡中，染色体d n a 双链断裂或单链断裂而产生人量的粘性3 l o h 末端， 可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶( t d r ) 的作用下，将带标记的椰( 多为d l 厂r p ) 间接( 通 过地高锌) 或直接接到d n a 片段的3 - o h 端，在通过酶联显色或荧光检测定最分析结则嘲 从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核营酸末端转移酶介导的缺口末端标记 法( t 鲫m i n a l 也似y 肌c l t i d y lt r a 舶f e 娜ef 豫d i a t c di l i c k dl a b e l i l l g ，t l 尉e l ) 。由予正常的或 正在增殖的细胞几乎没有d n a 的断裂，因而没有3 一o h 形成，很少能够被染色。n 肘e l 实 际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原 位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征可用于石蜡包埋组织切片、冰 冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡 细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用7 9 1 1 4 7 流式细胞仪分析 1 9 8 0 年，l 釉g l o s i s 首先使用流式细胞术( n o wc y t o m e 仃y ，f c m 分析了凋亡细胞的染色体 1 5 2 l ，此后越来越多的人采用f c m 研究细胞凋亡，同时结合荧光探钟标记技术检测d n a 断裂 及其与凋亡相关基因的表达，提高了灵敏度和特异性，并由定性发展为定量技术。通过荧光 激发分选细胞可以大量快速地测定单个细胞。到目前为此，国外已经研究出至少六种利用 流式细胞术分析细胞凋亡的方法，即h o e c h e s t - p i 染色法，选择性光解法，乙醇抽提法、吖 啶橙( a 0 ) 染色法、来端标记法，缺口平移法1 8 0 1 其中吖啶橙染色法利用凋亡细胞d n a 对变 性敏感性的增强h c h e s t p i 染色法利用凋亡细胞膜通透性的增强，d n a 可染性的降低其 他主要是利用凋亡细胞发生d n a 断裂这一特性。流式细胞仪检测凋亡细胞是通过检查其光射 特征及荧光参数时行的细胞穿过流式细胞仪的激光束集点时使激光发生散射，分析散射光 可以提供细胞大小及结构的信息散射光包括前向散射光和左向角散射光两种，前向散射光 的强度与细胞大小、体积相产，右向角射光的强度与细胞结构的析射性、颗粒性有关细胞 凋亡过程中出现的形态改变如细胞皱缩、胞膜起泡、核浓缩和碎裂等可以使光散射特性发生 改变。早期凋亡细胞主要表现为前向散射光减弱而右向角散射光增强或不变，前者反映了细 胞的皱缩，后者反映了细胞的核逐缩及碎裂晚期凋亡细胞的前向散射光和右向角散射光均 减弱由于光散射的产生并非凋亡细胞的特异性指标，细胞的机械性损伤和细胞坏死也可以 使前向散射光减弱【g o ；引j 。因此，只有将光散射特性的检测与荧光参数的检测结合起来才能准确 地辨认凋亡细胞 细胞凋亡过程中核酸内切酶在d n a 分子核小体间的降解，导致小分子d n a 漏出。核d n a 含量下降，细胞荧光染色后作流式细胞仪分析，可以发现在d n a 直方图上正常二二倍体细胞的 g o ，g i 箩前出现一个弧二倍体峰( x u b g l 峰即a p 峰一a p 叩t o t i cp e a i c ) ，代表凋亡细胞根 据此弧二二倍体峰可以计算凋亡细胞的百分率此外流式细胞术还可以通过测定线粒体膜的 i 乜位、溶酶体质子泵的活性及细胞d n 总蛋白质比例等方法辨认凋亡细胞。 1 3 两南人学硕f 掌位论文 ( 1 ) 凋亡亚峰分析 p i 法是流式细胞术常用的定量检测细胞凋亡的方法。染料p l 可穿透细胞膜与d n a 结合， 这主要是因为p i 据有至少2 种功能：a 区分活死细胞，p i 不能穿透活细胞的细胞膜，因此， 只有死亡的细胞才能被p i 染色b 研究细胞周期，根据p i 的可染性，可以明确地分辨出g 0 肥1 ( 二倍体蜂) 、s ( 平台) 和g 2 傩( 4 倍体峰) 期细胞占细胞总数地比例，p i 染色检测凋亡的原 理主要是通过p i 与细胞核d n a 结合，测定细胞内d n a 含量亚二倍体的出现。实际上是由于 细胞凋亡时d i n a 含量低于正常细胞使其在直方图上表现为一个荧光强度比正常细胞要小的峰 亚二倍体峰即凋亡细胞d n a ，根据凋亡峰的人小可定量检测出凋亡的细胞百分数。该法简便、 快速、价廉，应用普遍，然而不能分辨凋亡和坏死细胞l 配l 。 ( 2 ) 磷脂酰丝氨酸( p s ) 在细胞膜上的检测 磷脂酰丝氨酸是一种带负电荷的磷脂，正常情况下仅分布于细胞膜内侧，但在细胞凋亡 早期，则由膜内侧转移到膜外侧，暴鳝在膜外表面。a n n e x i nv 是一种c a 2 + 依赖的磷脂结合 蛋白，可与磷脂酰丝氨酸特异结合，但与其它磷脂较少或不发生结合。因此，可利用f 丌 ( n u o 把踮e i i li “y 觚t e ) 标记的n e x mv 作为敏感探针，检测细胞膜表面暴露有p s 的凋 亡细胞：坏死细胞则由于凡e x i n v 能进入胞内与p s 结合而呈阳性，所以通常联合p i 染色将 其区分出来。a n 鹏x i nv f 1 1 r c p i 法可有效区分正常、凋亡及坏死细胞，是目前定性、定量检 测细胞凋亡的一种好方法。该法多用于悬浮培养细胞，而对贴壁培养细胞，则需先用加m e x i i l v _ f 1 1 染色后再用胰蛋白酶消化后进行测定f 8 3 l 。采用a n n e x i nv f r r c 撑i 、i s n t ( h is 油n i c k 们m l 撕o n ) 、t i 腿l 等对凋亡细胞进行f c m 分析表明：磷脂酰丝氨酸外化发生于染色质凝聚、 d n a 断裂之前，是一个较早期发生的凋亡事件，这对于尽早特异性识别、吞噬尚未失去细胞 膜完整性的凋亡细胞极为重要可避免炎症反应及继发的组织损伤随【矧。a 胁e x i i iv f r r c ，p i 还可结合其它染料对同一细胞样品进行多色荧光标记。进行多参数分析，这不仅增加了信息 量，还可更好地了解细胞凋亡的变化过程。 1 5 家蚕细胞凋亡研究现状与前景 家蚕属于完全变态昆虫，在一个世代中经过卵、幼虫、蛹、成虫四个形态完全不同的发 育阶段。家蚕要完成正常的发育变态，必须完成新旧组织的更替，在这一过程伴随着非常活 跃的细胞程序性死亡，也就是细胞凋亡。研究家蚕的细胞凋亡是从分子水平上研究家蚕发 育变态的重要途径同时，家蚕作为鳞翅目昆虫中的重要的代表。对其细胞凋亡机制的研究 有助于寻找潜在的防治农林业害虫的新方法。关丁：家蚕中的细胞凋亡研究已有一些报道，例 如家蚕的血液能起抗凋亡作埘，蜕皮激素能诱发细胞凋亡。但与线虫、果蝇、人等模式生物 相比。家蚕中的细胞凋亡代谢途径的研究仍处于起步阶段。目前，在家蚕细胞凋亡分子调控 网络士线上的很多关键基因还没被找剑，进一步研究家蚕的细胞凋亡调控网络，必须找到更多 1 4 第一章文献综述 的相关基冈，特别是在细胞凋亡中起核心作用的基因如比如c y t c 和c 雏p 獬 钟仰进、曾林等利用形态学观察方法、分子生物学检测方法以及2 0 - 羟基蜕皮酮和放线菌 酮体外培养方法研究了家蚕肋m 参肌州蛹变态期丝腺组织的退化与细胞凋亡特征显微镜 的观察显示家蚕丝腺的逐渐退化发生在吐丝期间。d n a 梯度电泳的分析表明程序性细胞死亡 可能伴随发生在丝腺的退化过程中。在离体培养条件下用2 0 _ 羟基蜕皮酮处理5 龄第6 天幼虫 的丝腺，导致的细胞凋亡提前予对照，提示在进入蛹变态期前，2 0 一羟基蜕皮酮提早激发了介 导家蚕丝腺细胞凋亡与水解机制的遗传调控级联系统他们认为，2 0 一羟基蜕皮酮能够诱导家 蚕丝腺组织在蛹变态期发生程序性细胞死亡瞰1 朱玉芳研究了重金属对家蚕细胞急性损伤的 影响，发现细胞损伤程度及死亡率与c d c l 2 浓度呈明显的量效关系浓度为3 6 p m o l l 的c d c l 2 溶液处理2 4 h 的b r n n 细胞，通过a 即瑚染色在正置镜下观察出现了细胞凋亡的一些特征通过 形态学的检测发现，b i 州细胞在c d 2 + 浓度2 0 l 蚰l i 存在凋亡的现象。并且研究了p b 2 + 、c d 2 + 混合添食对家蚕生长发育及细胞凋亡的影响，研究表明添食p b 2 + 、c d 2 + 两种混合重金属离子 的家蚕体型比单一添食相应含量c d 2 + 的大，其体长大予单一添食相同含量p b 2 + 、c d 2 + 的家蚕： 单一重金属离子作用下的家蚕d n a 发生明显的梯状态断裂，出现细胞凋亡现象，而混合重金 属诱导的家蚕细胞d n a 完整，朱发生凋亡现象，预示着竞争化点假说住家蚕体内的存在l 。5 1 吴福泉等对甜菜夜蛾( s p o d o p t 啪e x i g 阻) 核型多角体病毒( s e n p v ) 经空斑法纯化获得 g l 、g 3 、g 4 三个克隆株。将三个克隆株及日本分离的s e n p v 的游离病毒粒子感染家蚕细胞 株( b m n ) 后，4 8h 开始引起细胞凋亡，脱壁漂浮于培养液中，7 2h 后基本凋亡。感染的b r i l n 细胞核未观察到病毒多角体，用空斑法朱检出s c n p v 出芽病毒粒子( b v ) 的形成；、s t c i n 印 迹分析也未能检出多角体蛋白。而d n a 原位杂交印迹( s l o tb l o t ) 分析，发现s e n p v 能在b n 悄 细胞中复制病毒d n a ；提取感染s e n p v 的b m n 细胞d n a 作酶切电泳，获得特异的s e n p v d n a 区带。并发现e c o ri 、p s ti 的酶切位点有所改变。讨论了& i n p v 感染谁寄主细胞并能在其 中复制病毒d n a 的可能性l s 6 1 在分析家蚕的淋巴血( s h ) 时发现它能抑制感染了a c n p v 的s f l 9 细胞的凋亡，分析也表明 s h 是作用于s f - c a s p a s e 1 的上游【阴在分析s h 的凋亡抑制成分时发现，抑制凋亡和抗凋亡的 是一种3 0 k 蛋白3 0 k 七6 编码的3 0 k 蛋白和s h 起同样的抑制凋亡的作用1 8 8 j ，内源表达或外源添 加3 0 k 蛋白均可抑制细胞凋亡3 0 k 6 基因的表达降低了细胞内c 笛p a 辩一3 的活性。同时分析也 表明了3 0 蛋白的抑制凋亡是作用丁c 弱p a 辩一3 上游的l 叫 、 在近来对家蚕病毒中凋亡相关基因的研究中，新发现r b m n 细胞的二个凋亡相关基因 发现其中一个是c p g vl a p 的同族体。之前，i a p 的同族体已经各自从酵母、线虫、哺乳动物和 昆虫中被发现。果蝇的i a p 同族d i a p l 和d i a p 2 是从昆虫中最先发现的i a p 基网的同族体。 n v 0 2 1 8 9 6 ，一个e s t ，它是一个家蚕i a p 同族体c e i n a 序列的一部分。此外，研究表明这个家 1 5 两南火学硕i 学位论文 蚕的队p 存在于b n r n p v 感染的过程中因为鳞翅目是杆状病毒i a p 的主要宿主，而且病毒的i a p 同族体只在杆状病毒的成员中发现。所以尽管家蚕的i 印同族体的序列是不完整的，还是推测 它的杆状病毒是从鳞翅目的杆状病毒i a p 进化来的。另外分离到的另一个凋亡