（运筹学与控制论专业论文）连续发酵非线性动力系统定性分析与参数辨识.pdf

大连理工大学硕士学位论文 摘要 本课题以甘油为底物，采用微生物歧化方法生产l ，3 丙二醇的连续发酵过程为背 景，根据发酵过程的特性和动态行为，研究符合发酵过程特性的连续发酵动力系统的性 质，并建立符合代谢机理的基因调控连续发酵动力系统基因调控连续发酵动力系统的 建立和研究为实验上采用基因敲除等技术培养高产量新菌种提供理论指导本课题受国 家“十五”科技攻关计划项目。发酵工程生产l ，3 - 丙二醇”( 编号为2 0 0 1 b a 7 0 8 8 0 1 0 4 ) 和国家高技术研究发展计划( 8 6 3 计划) “生物柴油与1 ，孓丙二醇的联产工艺”( 编号 为2 0 0 7 a a 0 2 2 2 0 8 ) 的资助此项研究为实现l ，3 - 丙二醇的产业化生产提供理论指导因 此，该项目研究具有重要的理论意义与应用价值本论文的研究内容与取得的主要结果 可概括如下： 1 、对微生物连续发酵的底物和主要产物的五维非线性动力系统的平衡点进行分析 证明了平衡点的存在性，推导和简化平衡点的求解并给出有效的数值算法根据给出的 数值算法求出了给定实验操作范围内的平衡点，从数值计算上验证了多态现象的存在， 并研究了实验操作条件对多态现象的影响最后，对多态和单态下平衡点的稳定性进行 了分析所取得的结果从数值和理论的角度对实验中的多态和分岔现象进行了解释 2 、对克雷伯氏菌胞内甘油代谢的还原途径及其基因调控机理进行分析和推断，在 此基础上建立基因调控连续发酵动力系统研究该系统的基本性质( 解的存在性和唯一 性) ，并根据实验数据建立参数辨识模型，证明辨识问题最优解的存在性最后，构造优 化算法对系统进行参数辨识 关键词：非线性动力系统；平衡点；稳定性；。基因调控；参数辨识 p a r a m e t e r si d e n t i f i c a t i o na n da n a l y s i so fn o n l i n e a rd y n a m i c s s y s t e mi nm i c r o b i a lc o n t i n u o u sc u l t u r e s a b s t r a c t af i v e - d i m e n s i o n a ln o n l i n e a rd y n a m i cs y s t e m ，w h i c hd e s c r i b e st h ep r o c e s so fg l y c e r o lm i - c r o o r g a n i s mf e r m e n t a t i o ni nc o n t i n u o u sc u l t u r e ，i ss t u d i e di nt h i sd i s s e r t a t i o n a c c o r d i n gt o t h ef e a t u r e sa n dt h ed y n a m i cb e h a v i o r so ft h ef e r m e n t a t i o np r o c e s s ，w es t u d ys o m ep r o p e r t i e s o ft h i ss y s t e mi nt h e o r y t h e nw ep r o p o s ean e wm o d e lt od e s c r i b et h eg e n e t i cr e g u l a t i o no f d h ar e g u l o ni nt h er e d u c t i v ep a t h w a yo fg l y c e r o lf e r m e n t a t i o n t h es t u d yo ft h en e wm o d e lc a l l n o to n l yb eh e l p f u lf o rd e e p l yu n d e r s t a n d i n gm e t a b o l i ca n dg e n e t i cr e g u l a t i o no fd h ar e g u l o n o fg l y c e r o lm e t a b o l i s m ，b u ta l s op r o v i d ec e r t a i nr e f e r e n c ef o rg e n e t i cm o d i f i c a t i o no fk l e b s i e l l a p n e u m o n i a e t 脑w o r kw a ss u p p o r t e db yt h et e n t h5y e a r s p r o j e c t so fs c i e n c ea n dt e c h n o l o g y a d m i n i s t r a t i o no fc h i n a “m i c r o b i a lp r o d u c t i o no f1 ，3 - p r o p a n e d i o l ”( n o 2 0 0 1 b a 7 0 8 8 0 1 - 0 4 ) a n dt h e n a t i o n a lm 曲t e c h n o l o g yr e s e a r c ha n dd e v e l o p m e n tp r o g r a mo fc h h m ( 8 6 3p r o g r a m ) “b i o d i e s e la n d1 ，3 - p r o p a n e d i o li n t e g r a t e dp r o d u c t i o n ”( n o 2 0 0 7 a a 0 2 2 2 0 8 ) t h em a i n r e s u l t so b t a i n e di nt h i sd i s s e r t a t i o nm a yb es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： 1 t h ep r o p e r t i e so ft h ef i v e - d i m e n s i o n a ls y s t e ma r ed i s c u s s e dq u a l i t a t i v e l y e x i s t e n tc o n d i - t i o no fe q u i l i b r i u mp o i n t sf o rt h es y s t e mi sd e d u c e da n da na l g o r i t h mi sc o n s t r u c t e dt oc o m p u t e e q u i l i b r i u m sf o rg i v e nd i l u t i o nr a t ea n ds u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o ni nf e e dm e d i u m t h r o u g ht h e c o m p u t a t i o no ft h ee q u i l i b r i u m sb yf i x i n gd i l u t i o nr a t eb u tv a r y i n gs u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o ni n f e e dm e d i u m w ec o n f i r mt h ee x i s t e n c eo fm u l t i p l es t e a d ys t a t e s t h es t a b i l i t yo ft h es y s t e m i sa l s oi n v e s t i g a t e di nt h e o r y t h er e s u l t sa r ei na c z r d a n c ew i t ht h ep h e n o m e n ao fm u l t i p l e s t e a d ys t a t e sa n db i f u r c a t i o nw h i c hh a v eb e e no b s e r v e di nt h ee x p e r i m e n t s 2 t h er e d u c t i v ep a t h w a ya n dt h eg e n e t i cr e g u l a t i o no fg l y c e r o lf e r m e n t a t i o na r ea n a l y z e d b a s i n go nt h ea n a l y s i s ，w eb u i l dag e n e t i cr e g u l a t i n gd y n a m i cs y s t e m t h e nw ed i s c u s ss o m e b a s i cp r o p e r t i e so ft h es y s t e m ，s u c ha se x i s t e n c ea n du n i q u e n e s so ft h es o l u t i o nt ot h es y s t e m m o r e o v e r ，w eb u i l da no p t i m i z a t i o nm o d e lt oi d e n t i f yt h ep a r a m e t e r so ft h es y s t e m a tl a s t ，a n a l g o r i t h mi sc o n s t r u c t e dt os o l v et h ep a r a m e t e r si d e n t i f i c a t i o np r o b l e m ， k e y w o r d s ：n o n l i n e a rd y n a m i cs y s t e m ；e q u i l i b r i u mp o i n t s ；s t a b i l i t y ；g e n e t i cr e g u l a t i o n ；p a - r a m e t e r si d e n t i f i c a t i o n i i i 独创性说明 作者郑重声明：本硕士学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作 及取得研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得大连理工大学 或者其他单位的学位或证书所使用过的材料与我一同工作的同志对本研究 所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 作者签名： 雌啉 大连理工大学硕士学位论文 大连理工大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解。大连理工大学硕士、博士学位论文版权使用 规定”，同意大连理工大学保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅本人授权大连理工大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，也可采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论 文 作者签名； 导师签名；艺堕兰弛 寥翌菱年亟目卫日 大连理工大学硕士学位论文 第一章绪论 1 1 微生物发酵法研究概况 1 1 1 微生物发酵方式 j 在微生物发酵过程中，常用的有三种方法；间歇发酵，连续发酵和批式流加发酵 间歇发酵是把一定量的微生物菌种和一定浓度的底物( 本文中指甘油) 放在同一个 发酵罐中搅拌均匀后进行培养，并给予微生物生长所必需的条件，如供氧，适宜的温度 等，在底物甘油的作用下，微生物通过自身代谢迅速生长，代谢的产物包括l ，3 - 丙二醇 和其他副产物( 如乙酸和乙醇等) 经过一段时间打开发酵罐，微生物培养成功微生物 的间歇发酵培养中，底物的浓度逐渐减少，间歇发酵操作简单，可以得到较高的产物浓 度但生产强度较低，实际生产中很少直接采用，一般是作为连续发酵和批式流加发酵 的培养基 批式流加是先往发酵罐加入一定量的微生物和底物，进行一段时间的间歇发酵，然 后再往发酵液中加入底物，再进行间歇发酵，如此数次，直到加到预定的体积为止批 式流加发酵能够得到较高的产物浓度，而且能提高底物的利用率但是这种培养方式自 动化程度低，操作麻烦 连续发酵是指连续不断地向发酵罐注入底物，同时提供各种辅助条件，又连续不断 地从发酵罐取出发酵液，整个过程中保持发酵罐内发酵液的体积不变，并使得培养过程 连续化连续培养有利于提高生产强度，但产物的浓度较低由于它具有操作简单、自 动化程度高的优点，是产业化设计理想的生产方式，因此探讨微生物连续培养具有一定 的实际意义 1 1 2 微生物发酵生产1 ，孓丙二醇的研究进展 自二十世纪八十年代以来，甘油发酵转化为l ，3 - 丙二醇已成为一个研究的热点，这主 要是因为l ，3 - 丙二醇作为一种重要的化工原料，它可以广泛应用于合成聚合材料的单体 以及溶剂、抗冻剂等1 ，3 丙二醇的生产方法主要有化学合成法和微生物发酵法两种， 目前工业生产中应用的是化学合成法，但无论哪一种化学合成法都需要在高温，高压及 催化剂存在的情况下进行因此，成本较高，操作条件恶劣，也就限制了l ，3 丙二醇生 产的发展 微生物发酵生产l ，3 - 丙二醇目前尚处于实验室阶段。但它是以生物技术为特征的“绿 色工业”，向传统石油化工提出了强有力的挑战，因而具有重要的现实意义与化学合成 法相比，微生物发酵法具有利用可再生资源、选择性高、分离纯化简单、无环境污染、 1 连续发酵非线性动力系统定性分析与参数辨识 成本低等优点通常可以将微生物生产法分为两类：一是以葡萄糖为底物用基因工程菌 生产1 , 3 p d ，二是用肠道细菌( 如肺炎克雷伯氏菌) 将甘油歧化为1 , 3 - p d 美国杜邦 公司和世界第二大工业酶生产商g e n e n c o r 国际有限公司在世界范围内申请了以葡萄糖作 底物的基因工程菌生产1 , 3 - p d 的技术专利但是这项技术离工业化生产还有相当大的距 离，主要问题是糖的转化率和产物的浓度均较低。例如，1 , 3 - p d 在发酵液中的浓度仅为 6 - 9 9 l 相比之下，肠道细菌的批式流加发酵过程可以转化6 0 以上甘油，i , 3 - p d 的浓 度可以达到5 0 9 l 有专利报道以葡萄糖作为辅助底物可以将甘油的转化率提高到接近 1 0 0 因此，一些甘油过剩的欧共体国家( 如德国、法国) 正积极开展甘油转化1 , 3 - p d 和2 , 3 - 丁二醇的研究工作，并已取得了许多可喜的成果 我国应用微生物发酵法生产1 ，3 _ 丙二醇的研究尚处于实验室阶段就研究现状来看， 普遍存在1 , 3 p d 产量过低，生产强度不高等问题因此要实现微生物法向工业化的过 渡，需要实现系统的可控性，以及尽可能提高生产强度、甘油转化率和产物浓度除了要 不断改进生产工艺，还应对发酵所用菌种的代谢过程和基因调控机理进行深入研究，这 有助于设计新的微生物发酵实验方案和抑制不需要的微生物代谢产物的产生近年来， 在这方面也有较多的研究【1 】_ 5 】，特别是发酵过程中胞内生成1 , 3 - p d 的还原途径的研 究，已经取得一些成果【6 】 9 】其中，文献 3 】对甘油歧化为1 ，3 - 丙二醇的胞内代谢途径 和关键酶基因表达做了研究，文献【9 】基于代谢机理对一些新的菌种筛选和改造方法进行 了讨论这些工作对今后通过基因改造培养新菌种实现提高1 , 3 - p d 产量有着重要意义 1 1 3 微生物发酵中用到的数学方法及研究进展 数学方法在微生物发酵中的应用很广泛，通过对过程的模拟、描述，能解释很多实 验中出现的非线性现象，也能实现发酵过程的可控操作，但微生物发酵过程本身比较复 杂，产物种类多造成方程维数的增加，即使在同样外界条件下也可能得出不同的结果，这 些特点都增加了数学描述的难度，导致了计算值和实验值之间误差较大数学建模过程 中往往提出一些假设便于数学方法的应用，如何用更适合的数学方法、做更少的假设、 更贴切实际过程的模型来描述反应过程是长期以来大家共同关注的问题 描述微生物发酵动态过程广泛应用的是微分方程由于描述微生物发酵动态行为的 非线性常微分方程模型一般没有解析解，在以往的应用研究中，在一定的简化假设下， 可将模型转化为逐段线性常微分方程，采用线性常微分方程的性质进行分析、讨论也 有文献直接对非线性常微分方程模型进行数值模拟 迄今为止，已有不少工作致力于通过数学模型来研究微生物生产1 ，3 丙二醇发酵过 程，解释发酵过程中的各类现象并实现对发酵过程的最优控制例如，曾安平、修志龙、 k m e n z e l 1 0 1 4 】等人通过对发酵机理的研究，建立了发酵过程的动力学模型，并利用 2 大连理工大学硕士学位论文 模型初步解释了实验中出现的振荡和多态现象；孙丽华、马永峰【1 5 ，1 6 】等人在原有模 型的基础上引入时滞，得到了h o p 分岔，并画出了在给定参数下系统的周期解；高彩霞 【1 7 ，1 8 】、李晓红【1 9 - 2 1 】和王刚等人对曾安平等人提出的间歇发酵、连续发酵和批式流加 发酵的数学模型进行了参数辨识和最优控制；孙亚琴【7 】基于基因调控机理，建立了基因 调控下连续发酵的动力学模型 1 2 系统生物学研究现状及意义 系统生物学着眼手从系统的角度认识和理解生物系统，这里的生物系统一般指从分 子网络、细胞、组织、器官到个体行为水平它是一个研究生物系统中所有组分的构成， 以及在特定条件下这些组分间的相互作用关系的学科。它以整体化和定量化为特征，实 现从基因到细胞、组织、个体等各个层次的关联信息的整合，其核心任务是通过对生物 系统结构和动力学的认识，最终实现对生命的控制和设计 系统生物学需要多学科( 如生命学科、信息学科、系统学科和分析学科) 的通力合 作这也是目前系统生物学面临的最大的挑战：所期待的深层次的学科交叉融合尚未形 成在技术层面上，尽管科学实践已经积累了大量的生物信息，但多数是描述性的，而 且不同层次的信息缺乏足够的关联性因此，真正可用于系统整合和模拟的数据非常匮 乏。另外，由于高通量、定量分析工具的缺乏，系统水平全面和精确的测量仍是系统生物 学的一大主要挑战 我们要特别说明的是，系统生物学本身并不是一个新兴的学科在过去，科学家已经 从理论( b e rt a l a n f f y , 1 9 6 4 ；r o s e n ，1 9 7 0 和b u r n s ，1 9 7 3 ；s a v a g e a u ，1 9 7 6 ) 和计算( g a r i i n k e l 等， 1 9 6 1 ；h i g gi n s ，1 9 6 5 ) 的角度进行了大量的工作但直到现在，由于转录组学、蛋白质 组学以及代谢组学方面的进步，从事这一领域的研究人员才开始获得足够多和广泛的数 据，以解码完整活细胞( 从系统角度) 的复杂行为生物研究正经历着从对单个细胞的 手工测量到对大量成分的自动( 高通量) 并行测量的转变大量的细胞成分及其相互关 联的复杂性，导致以前在分子生物学中占主导地位的还原论方法不再适用现在的研究 我们面临着将细胞功能单分子定性模型替换为将细胞看为一个整体并能够定量解释其特 征的模型。 近年来，分子种类在库( 或群体) 水平上的生化系统的动态特性一直备受关注库是 一组不能相互识别的分子这些库是细胞生化网络系统的组成成分，因此也是仿真数学 模型中的变量这个网络由生化反应和连接各个库的传输过程组成每个库的动态( 或 者更确切的称为动力学) 都可以由常微分方程表示，如方程( 1 2 1 ) 所示因此，系统 3 连续发酵非线性动力系统定性分析与参数辨识 就可以由表示所有库的常微分方程组来表示 警= m ) 一夕( z ) ( 1 驯 总的来说，通过观察一个系统对其建立模型的完整过程需要做如下三个方面的工作： 确定模型中不同变量( 各种生化反应及其反应物、产物和作用) 之间的关系； 确定可以合理表达每个反应速率的数学函数，它是一个关于底物、产物和效应器的函 数； 估计在这些数学函数中所包含的各个参数的数值 目前，前两个工作一直是比较困难的，因为有些库之间的相互关系并不能确定，即 使能够得到确定，也有很多关系是很难用数学表达式来准确的描述 1 3 参数辨识常用方法 参数辨识问题实际上是一个逆问题它是根据测定的数据和建立的模型来确定一组 参数使得由模型得到的数值结果能最好的拟合测试值，是系统建模中极其关键的一个工 作参数估计的好坏决定了用模型来解释实际问题的可信度 一般来说，基于实际问题提出的数学模型的参数都是有实际意义的，如表示某一反 应的速率常数，因此一般都是有约束范围的一般地，参数辨识都按照以下步骤进行( 见 图1 1 ) s 比较实验数据和仿真数据的值； 如果差值足够小，结束仿真，否则调整模型参数值； 仿真实验； 返回步骤 图1 1 ：调谐模型的模拟优化过程 正如w o l p e r t 3 2 】所指出的，没有任何一个数值优化算法对于所有问题而言都适合 4 大连理工大学硕士学位论文 优化算法的性能是与问题和数据本身有关的，而且变化相当大常用的优化算法很多， 而最常用的是以下三类： ( 1 ) 梯度搜索；( 2 ) 直接搜索；( 3 ) 随机方向搜索 ( 1 ) 、梯度搜索是沿着由函数所确定的方向寻找最小值其中许多方法都源于牛顿 法，使用一阶和二阶导数这类方法的共同点是它们总是收敛到与初始猜测值最接近的 最小值由于目标函数一般为仿真值和测试值的平方和函数，它会有不止一个极小值， 而距离初始猜测值最近的一个极小值成为全局最小值的可能性并不高，因此，这类算法 在工程应用中经常不受信赖 ( 2 ) 、直接搜索方法不需要计算方向导数使目标函数最小化这类方法大都是确定性 的，也就是说并不使用随机数在任何时候使用相同的数据和初始猜测值都会得到一致 的结果这类搜索算法的步骤是，在上一步有限个候选解的基础上，确定如何继续在误差 超平面上下降尽管这类算法的收敛速度比目标函数选取得好的梯度搜索方法慢一些， 但该方法的鲁棒性更强 ( 3 ) 、随机搜索算法是基于对随机数的操作，因此即便是使用相同的数据和初始猜 测，通常也不会有一致的结果这类方法包括进化算法和模拟退火算法这类方法的主 要优点是能够找到全局最优解，但其运行时间却远远大于其他两类方法 在实际问题中，特别是大规模的系统中，如全细胞模型，系统往往有大量的动力学 参数需要估计一般来说，很难有算法对所有的参数都能得到最佳估计这主要是有以 下原因s 第一，当参数很多时，初始猜测值离最优解很近的可能性就很小，而很多算法 ( 如梯度算法) 只有在初始猜测值离最优解很近时才能得到好的收敛性；第二，对于时 间过程的数据而言，可能有些参数有相当大的变化，但时间过程并没有受到任何可见的 影响，也就是说，模型对这些参数并不敏感；第三，收集的观测数据太少，如用2 0 个样 本估计3 6 个参数，这样得到的参数估计结果往往不具有代表性 我们要说明的是，上面的讨论都是假设建立的系统模型本身是正确的，也就是能够 正确反映系统各个库之间的关系。但是，正如我们在上一节所提到的，确定一个生物系统 的变量以及变量间的关系至今还存在很多技术困难的我们所建立和讨论的模型也是有 可能出现错误的，比如由于技术问题，有些重要的物质没有被观察到，或者是有些物质 之间的关系推断错误因此，当参数辨识的结果一直无法很好的拟合实测观察数据时， 我们就要考虑是否出于模型本身的问题当然，这超出本论文所讨论的范围，但我们今 后的研究工作将以这个为重点，通过建立模型参数辨识一检测结果修改模型的过程 来推断胞内各代谢物关系，甚至发现新的代谢物和代谢途径，从而确定胞内代谢路径和 调控机理 5 连续发酵非线性动力系统定性分析与参数辨识 1 4 本论文主要工作 本课题以甘油为底物，采用微生物歧化方法生产l ，参丙二醇的连续发酵过程为背 景，根据发酵过程的特性和动态行为，研究符合发酵过程特性的连续发酵动力系统的性 质，并建立符合代谢机理的基因调控连续发酵动力系统基因调控连续发酵动力系统的 建立和研究为实验上采用基因敲除等技术培养高产量新菌种提供理论指导本课题受国 家“十五”科技攻关计划项目“发酵工程生产l ，参丙二醇”( 编号为2 0 0 1 b a 7 0 8 8 0 1 0 4 ) 和国家高技术研究发展计划( 8 6 3 计划) “生物柴油与1 ，孓丙二醇的联产工艺”( 编号 为2 0 0 7 a a 0 2 2 2 0 8 ) 的资助此项研究为实现l ，3 - 丙二醇的产业化生产提供理论指导因 此，该项目研究具有重要的理论意义与应用价值本论文的研究内容与取得的主要结果 可概括如下。 1 、对微生物连续发酵的底物和主要产物的五维非线性动力系统的平衡点进行分析 证明了平衡点的存在性，推导和简化平衡点的求解并给出有效的数值算法根据给出的 数值算法求出了给定实验操作范围内的平衡点，从数值计算上验证了多态现象的存在， 并研究了实验操作条件对多态现象的影响最后，对多态和单态下平衡点的稳定性进行 了分析所取得的结果从数值和理论的角度对实验中的多态和分岔现象进行了解释 2 、对克雷伯氏菌胞内甘油代谢的还原途径及其基因调控机理进行分析和推断，在 此基础上建立基因调控连续发酵动力系统研究该系统的基本性质( 解的存在性和唯一 性) ，并根据实验数据建立参数辨识模型，证明辨识问题最优解的存在性最后，构造优 化算法对系统进行参数辨识 6 大连理工大学硕士学位论文 第二章预备知识 2 1常用的几类生化速度函数 2 1 1 生化反应速度函数 生化反应动力学模型即是运用数学函数来体现生化反应速度，因此动力学模型中的 函数又常称为速度函数。典型的生化速度函数把代谢物浓度的空间变化和浓度本身联系 起来在不包括酶的一级降解反应的最简单情况下，速度直接与浓度成比例用简单的 符号来表示，这种基本化学反应速度方程可以写为： v ( x ) = 一k x( 2 1 1 ) 其中x 为底物浓度，速度常数k 定义为正值这个公式的起源可以追溯到1 0 0 多年前 s v a n t ea r r h e n i u s 的统计热力学的研究，具体细节可以从热力学与动力学书本中查到 2 0 世纪早期，m i e h a e l i s 和m e n t e n ( 1 9 1 3 ) 基于h e n r i ( 1 9 0 3 ) 的早期思想对酶促反应提 出了反应式，这个反应式就是1 0 0 多年来被广泛应用的米氏速度定律，其形式如下： 口( x ) 。丽v m a x , ) ( 2 l 2 ) 其中，s 为底物，x 为产物，戤为最大反应速率，j 为米氏常数 2 1 2 细胞增长速度函数 细胞生长过程，根据均衡生长模型的假设，可以用细胞浓度的变化来加以描述现 代细胞生长动力学模型奠基人m o n o d 早在1 9 4 2 年就指出，细胞的比生长速率与限制性 基质浓度的关系可用下式表示： p2 丽# m a x k ；s ( 2 1 3 ) 该方程称为m o n o d 方程，其结构与米氏方程一致其中a 为限制性底物的浓度。此外， 微生物学家根据实验，还提出了各种形式的微生物比生长速率和养料浓度的关系比较 常用的有以下几种形式： m o n o dh a l d e n c e ：p = 嗡 “ k + c a + 迸 第三类h o u i n g 功能反应函数；p = 群凑 i v l e v 功能函数：p = l e “g m o n o d 具有内在代谢： p = 铬笔一k d 除以上介绍的四种模型外，常见的还有t e s s i e t 模型、b l a c k m a n 模型和有抑制阀的培养 模型等，由于本论文并没有涉及到，就不一一介绍 7 连续发酵非线性动力系统定性分析与参数辨识 2 1 3 物质跨膜运输速度函数 物质的跨膜转运可分为被动转运和主动转运被动转运又可分为单纯扩散和异化扩 散主动转运包括狭义上的主动转运以及出胞和入胞 被动转运是不耗能的，它是一个顺浓度梯度的转运过程影响被动运输主要因素有 两个：膜两侧的溶质分子浓度梯度浓度梯度大，物质顺浓度梯度扩散就多；浓度梯 度消失，扩散就停止膜对物质的通透性因此，被动扩散的扩散速度经常用如下方程 描述： t ，= k ( c , 1 一c s 2 ) ( 2 1 4 ) 其中常数k 体现膜对物质的通透性，l ，2 分别为物质的胞内外浓度 主动转运般是由膜的低浓度一侧向高浓度一侧转运的过程，因此是种耗能过程 在假设能量足够的情况下，主动转运的速度函数经常用米氏方程表示 2 2微生物连续发酵动力学模型 为了探索和了解微生物发酵过程中的变化规律，人们尝试利用数学模型来描述微生 物的发酵过程，并通过理论分析掌握其变化规律，最终利用规律来满足人们的各种需求 下面简单介绍甘油连续发酵的数学模型 利用数学模型的方法来描述微生物在培养器内的发酵过程，主要考虑各因素浓度的 变化由于培养器中是均匀搅拌的，因此一般假设容器内各物质的浓度是均匀的此外， 由于培养器是在恒温恒压下工作的，因此只考虑浓度随时间的变化发酵过程的产物有 多种，其中含量较大的是1 ，3 - 丙二醇，乙酸和乙醇，且实验也证明了它们的浓度变化对 发酵过程是有影响而其他副产物，如乳酸、琥珀酸、甲酸和2 ，孓丁二醇，它们的总浓度 不超过5 ，本文忽略不计 微生物连续培养过程中，微生物、底物和产物的变化率可以表示为 微生物的变化率= 增长一输出 底物的变化率= 输入一输出一消耗 产物的变化率= 生成一输出 我们考虑了微生物、胞外残余甘油、胞外产物l ，3 - 丙二醇、乙酸和乙醇的关系，因 此要考虑微生物的比生长速率，底物甘油的比消耗速率以及三种产物的比生成速率此 外，由于我们考虑的是连续发酵过程，因此要引入关键的操作条件，即稀释速率和初始 8 大连理工大学硕士学位论文 甘油浓度根据上面的变化率等式，有下面物料反应平衡式，即连续发酵动力学模型 i 叠l ( t ) = ( t z d ) z 1 ( t ) 叠2 ( t ) = d ( c s o x 2 ( t ) ) 一q 2 x l ( t ) t t = t o ，t 1 ，z ( t 0 ) = z o ( 2 2 5 ) i 磊( t ) = q i x l ( 亡) 一d z ( t ) i = 3 ，4 ，5 其中，p 为微生物的比生长速率，单位为每小时( h - 1 ) ；d 为稀释速率，单位为每小时 ( h 一1 ) ；z 1 ( t ) 表示在t t o ，t ，】时刻微生物浓度，单位为g l ；z 2 ( t ) ，x 3 ( t ) ，z 4 ( t ) ，x s ( t ) 分别 表示在t 【t o ，t 门时刻底物甘油、产物1 ，3 丙二醇、乙酸和乙醇的浓度，单位为m m o l l ； t f 为实验的终端时刻( 一般指达到稳态的时刻) 为了讨论方便，在后面章节中，如果不 强调各物质和时间的关系，我们将z 1 ( t ) ，z 2 ( t ) ，z 3 ( 亡) ，z 4 ( 亡) ，x s ( t ) 简记为x l ，x 2 ，x 3 ，x 4 ，x 5 ，一般来说，微生物的比生长速率是底物浓度的函数，因为在培养器中微生物的增长 依赖于底物的营养研究进一步表明，甘油既是细胞生长的底物，又是潜在的抑制剂， 培养器中产物的浓度对微生物的生长也起抑制作用，当它们达到特定浓度时，微生物就 不再生长，我们称这特定的浓度为临界浓度文 2 6 】介绍了几种比生长速率的表达式， 其中最常用的是m o n o d 方程文【2 7 】根据上述机理在m o n o d 模型的基础上作了修改， 如下式。 p = p m 云( 1 一薏) ( 1 一蠢) ( 1 一薏) ( 1 一嚣) ( 2 一26 ) 其中p m 是最大比生长速率，鲍是m o n o d 常数，z ：0 = 2 ，3 ，4 ，5 ) 表示甘油浓度和三种 产物浓度的临界值上述几个常量在p h = 7 0 的培养条件下的值列于下表： 表1 实验研究中也发现了甘油浓度对甘油比消耗速率和产物比生长速率的影响在甘油 过量时，其比消耗速率和产物的比生长速率呈s 型饱和曲线状变化针对这种现象，曾安 平等人【1 l 】在p 矾维持模型的基础上增加了一个代谢过量项，建立了过量动力学模型， 如下所示； i 口2 = m 2 + 参+ 够瓦军霹 口3 2 m 3 + 凹+ 好彘 ( 2 2 7 ) iq 4 = m 4 + p 即+ 四最 、。 【q s = 9 2 ( 丧+ c 2 + d z 2 ) 高彩霞【1 7 】对( 2 2 7 ) 的参数进行辨识，得到结果如表2 和表3 所示： 表2 9 连续发酵非线性动力系统定性分析与参数辨识 表3 根据实验数据及模型的实际意义，我们作如下假设： 假设( h 1 ) ：生物量的最高浓度为z ；= 1 0 ( g l ) ； 假设( h 2 ) s 发酵液中各成分浓度始终为非负值，且不超过对应的临界值，即 v t 【t o ，t f ，v v ：= ( 。，d ) q 1 q 2 全w o r 2 , 0 筑( t ) z ：，i = 1 ，2 ，3 ，4 ，5 其中q 1 = 【1 0 0 ，1 8 0 0 ，q 2 = 【0 0 5 ，0 6 7 依上述说明，发酵实验状态变量的取值范围为 在连续发酵过程中，初值z o 为事先给出的，其取值范围为s o ：= a 口d 2 3 代谢过程基因调控机理 传统意义上来讲，生化网络的计算机模型只描述形成小分子炭流的反应，也就是代 谢途径它假设蛋白质( 1 晦) 浓度不变，这样m r n a 和核糖体的浓度也保持恒定在这样 的条件下，遗传物质可被认为是不变的另一方面，也有对遗传子系统本身建模，而不 用考虑其代谢部分此时是假设代谢速度太快，因此它在本质上处于平衡状态且由遗 传物质表达在这两种情况下，我们都必须假设遗传和代谢部分是分离的，但实际情况 并不总是这样的，甚至这样的假定是不具有普遍意义的 上一节所建立的连续发酵模型就属于第一种类型该模型是一个描述胞外产物关系 的动力学模型，其对胞内甘油消耗和1 ，孓丙二醇的产生采用黑匣子方式进行处理这一 模型虽能体现底物和产物之间的抑制关系，但是不能直观看出底物消耗和产物生成的机 理因此，虽然数值模拟结果表明了这个模型能较好的拟合实验数据，也能解释发酵过程 中的一些非线性现象，但它不能解释胞内的基因调控机理，因此就不能为我们通过基因 改造提高1 ，3 - 丙二醇产量提供有用信息基于这个原因，我们需要对胞内代谢途径和代 谢机理进行研究在后面的章节中，我们将根据胞内代谢机理建立一个更完整的模型， 使模型不但能模拟实验结果，也能较好的描述胞内的代谢过程 1 0 朝 z0 。：l = 以 a 大连理工大学硕士学位论文 2 3 1 原核生物的基因调控表达 在细菌中，编码代谢所需酶的基因通常成簇聚集在染色体上，形成功能性复合体， 称为操纵子典型的操纵子包括结构基因、启动子区、操作子区和调节基因 结构基因编码酶，一个操纵子的结构基因通常是相邻的r n a 聚合酶从个结构基 因转移到另一个结构基因，将所有的基因转录成一条m r n a 随后，这条m r n a 被翻译 到代谢途径中的不同的酶因此，开启一个基因就开启了该操纵子上所有的产酶基因 启动子是开始转录前r n a 聚合酶结合到d n a 的位点操纵基因通常与启动子相邻或重 叠，是阻抑物的结合位点阻抑物是一种基因调控蛋白操纵子表达的关键是阻抑物 当阻抑物与操纵基因结合时，启动子不能与聚合酶结合，因此结构基因不能转录以色 氨酸操纵子为例，阻抑物自身并不能与操纵基因结合，而只有与特定因子( 色氨酸) 形成 复合物，作为d n a 结合体才是有活性的，以共阻遏物发挥功能当胞内色氨酸缺乏时， 操纵基因位点开放与r n a 聚合酶结合，转录色氨酸操纵子的的结构基因，产生了合成色 氨酸的酶一旦可从环境获取色氨酸，将不再需要色氨酸合成途径涉及的酶在这些条 件下，色氨酸浓度的增加导致形成色氨酸阻遏物复合体，阻断转录 2 3 2 甘油发酵下克雷伯氏菌胞内代谢机理 克雷伯氏菌以甘油为底物的代谢途径如图2 1 所示【2 9 】好氧条件下代谢包括三羧 酸循环部分，厌氧条件下产生乙酸、乙醇等副产物可见，该系统是涉及到两个平行路 线的过程：通过氧化途径，甘油被与n a d + 相连的甘油脱氢酶( g d h ) 催化脱氢生成二 羟基丙酮( d h a ) ，进一步代谢为丙酮酸，生成能量a t p 和还原当量n a d + n a d h 2 及 乙酸、乙醇，并伴随着微生物细胞的生长；而通过与之平行的还原途径甘油则被与维生 素b 1 2 相关联的甘油脱水酶( g d h t ) 催化脱水生成3 羟基丙醛( 3 - h p a ) ，其进一步 由与n a d h 相连的1 , 3 - p d 氧化还原酶( p d o r ) 还原为产物1 ，3 - 丙二醇( 1 , 3 - p d ) ，同时 消耗氧化途径上生成的过量还原型辅酶i ( n a d h 2 ) 本文的研究重点放在还原途径 由图2 1 可见甘油歧化过程所涉及的酶主要有：甘油脱水酶( g d h t ) 、1 , 3 - p d 氧化 还原酶( p d o r ) 、甘油脱氢酶( g d h ) 、二羟基丙酮激酶( d h a k ) 、丙酮酸脱氢酶系 ( p d h ) 、丙酮酸甲酸裂解酶( p f l ) 及铁蛋白氧化还原酶系等其中g d h 、g d h t 、 p d o r 这三个酶的活性对1 , 3 - p d 的形成至关重要，是甘油歧化过程的关键酶另外， g d h t 是限速酶f 3 0 】 对编码甘油代谢过程的酶的基因研究发现，其中的甘油脱氢酶，二羟基丙酮激酶， 甘油脱水酶和1 ，3 - 丙二醇脱氢酶在厌氧条件下都受同一调节子d h a 系统的控制进一步 研究发现在厌氧条件下d h a 调节子的诱导不受甘油浓度的影响而在好氧条件下，甘油 1 1 连续发酵非线性动力系统定性分析与参数辨识 浓度过量时诱导d h a 系统，甘油限量时诱导主要调控甘油三磷酸酶的操纵子g l p 系统， d h a 系统则受到抑制d i m 调节子能使克雷伯氏菌以甘油为底物在厌氧条件下产生l ，3 - 丙二醇，大肠杆菌e c o l i 中不含有d h a 调节子所以同样条件下不能产生l ，3 _ 丙二醇由 此可见，d h a 调节子是微生物代谢产生1 ，3 - 丙二醇的关键调节子 3 l 】 由图2 1 可见，孓羟基丙醛既是g d h t 催化的产物，又是1 , 3 - p d 的底物所以它 直接关系到目标产物的产生另外，研究发现，3 - h p a 既能抑制细胞的生长又能抑制氧 化途径上甘油脱氢酶的活性，所以它是一种毒性较强的中间代谢物 3 6 ，3 7 】此外，通过 研究推断3 - h p a 会与调节蛋白结合，形成共阻抑物，然后结合在d h a 调节子的操纵基因 上，从而阻断了甘油脱氢酶、二羟基丙酮激酶、甘油脱水酶和l ，3 丙二醇氧化还原酶的 合成具体如图2 2 所示 2 4 微分动力系统稳定性 本节的主要结果选自文【2 4 】主要介绍和稳定性有关的概念及结论 给定微分方程组 圣 ) = ，( z ) ， ，：q 冗n ，尺n( 2 4 1 ) 在相空间舻的域q 内，向量场，( z ) 不随时间t 而改变，它是定常场，相应的方程组 ( 2 4 1 ) 称为定常系统或自治系统 定义2 4 1 若存在矿q 使得，( 矿) = 0 ，则矿是系统偿彳j ，j 的一个平衡点，也称为此 系统的一个奇点 对于自治系统任意平衡点稳定性的研究都可以转化为下面系统零解稳定性的研究 事实上，设z = 矿是自治系统( 2 4 1 ) 的任意平衡点，做变换 则系统( 2 4 1 ) 变为 y2z z 雪( t ) = ( u + z + ) 全f ( u )( 2 4 2 ) 而系统( 2 4 1 ) 的平衡点z = 矿，对应于( 2 4 2 ) 的零解( 平衡点) y = 0 即研究系统 ( 2 4 1 ) 任意平衡点z = z 。的稳定性就等价于研究系统( 2 4 2 ) 的零解的稳定性因此，只 考虑系统( 2 4 1 ) 零解的稳定性 定义2 4 2 设z ( t ；t o ，x 0 ) 是系统偿彳j 夕适合初始条件z ( t o ) = x 0 的解 1 2 大连理工大学硕士学位论文 p ，若垤 0 ，孙( e ) 0 ，当0 x 0i l t o ，恒有 i lz ( 亡；t o ，x o ) i i 0 ，当0 x oi i 0 都存在x 0 与t l t o ，使x 0 e o ，则称z = 0 为不稳定的 定义2 4 3 考虑自治系统 圣 ) = ，( z ) ，c 1 ( q ；矽) ，q 舻 设f ( o ) = 0 ，把，在。= 0 处用带p e a n o 余项的t a y l o r 公式展开，得 圣 ) = a