（遗传学专业论文）βsgt与hsp70hsp90相互作用的研究.pdf

南京医科大学2 0 0 8 届硕士毕业论文 中文摘要 第部分ds 6 t 与h s p t o h s p 9 0 在酵母和体外的相互作用 2 0 0 3 年发现s g t 的同源异构体ds g t ，研究表明o 【s g t 能与热休 克蛋白家族的h s p 7 0 、h s p 9 0 等相互作用，形成复合物调节分子伴侣活 性，所以又称为共分子伴侣。 为了近一步研究ds g t 的功能，目前尚没有文献报道ds g t 和 h s p 9 0p 是否有相互作用。我们以ps g t 为诱饵蛋白，通过酵母双杂交 技术得到了ps g t 与h s p 9 0d 结合随后，我们在体外结合实验中，通 过原核表达的g s t - ds g t 融合蛋白和h s p 9 0d 蛋白共孵育，证明了p s g t 和h s p 9 0d 在体外的结合。 ds g t 由3 0 4 个氨基酸组成，分子量是3 4 k d ，其特征是分子中间 含有三个串联重复的t p r 结构域。t p r 结构域在许多胞内事件中介导 特异性蛋白间的相互作用。为了弄清楚ps g t 是否通过t p r 结构域与 h s p 7 0 h s p 9 0 结合和h s p 7 0 h s p 9 0c o o h 一末端序列对ds g t 与 h s p 7 0 h s p 9 0 相互作用的影响，我们构建了多个h s p 7 0 h s p 9 0c o o h - 末端序列突变体，在酵母中验证出ds g t 的t p r 结构域和m e e v d 的结 合是h s p 9 0 和ds g t 相互作用的核心结合部位；t p r 和g p t i e e v d 结合 显示了在形成h s p 7 0 ds g t 复合物中有重要的作用；e e v d 序列上的 天冬氨酸( d ) 和缬氨酸( v ) 被认为是t p r 结构域在h s p 70 h s p 90 泊 位点，它对t p r 蛋白结合分子伴侣有关键性的作用 关键词：ps g t ；h s p 7 0 h s p 9 0 ；蛋白质相互作用；突变；酵母双杂交 l l 南京医科大学2 0 0 8 届硕士毕业论文 第二部分ds g t 的组织分布和h s p 9 0d 对细胞周期的影响 在本文中我们显示了k s g t 蛋白的两个同源异构体ds g t 和0 【s g t 。 这两个异构体的氨基酸序列有6 0 的同源性。ps g t 也存在于酵母、 鼠等中，人和鼠的同源性达9 6 。ds g t ) l 乎在脑中高表达而在其他 组织中几乎不表达。构建重组质粒p c d n a 3 1 - m y c - h s p 9 0p 经亚克隆、 纯化、酶切鉴定后，用脂质体法转染h e l a 细胞，研究h s p 9 0d 对细胞增 殖的影响。以转染空载m y c 质粒的h e1 a 细胞为对照，用流式细胞术测定 分析h s p 90d 对细胞增殖和细胞周期的影响。转染 p c d n a 3 1 - m y c - h s p 9 0d 的h e l a 细胞，影响细胞周期，s 期d n a 含量增 高，促进肿瘤细胞的增殖。 关键词：h s p 90p ；转染；细胞周期 1 1 1 南京医科大学2 0 0 8 届硕士毕业论文 a b s t r a c t p a r t l ：i d e n t i f i c a t i o no ft h ea s s o c i a t i o no fp s g t w i t he l s p 7 0 h s p 9 0i n y e a s tc e l i sa n dv i t r o t oi d e n t i f yt h ea s s o c i a t i o no f1 3 s g ta n dh s p 7 0 h s p 9 0i nt h ey e a s t c e l l sa n dv i t r o 3 s g tw a si d e n t i f i e da sa ni s o f o r mo fa s g t i n2 0 0 3 t o l u t h e re l u c i d a t et h eb i o l o g i c a lf u n c t i o n so f1 3 s g t ，w es e a r c h e df o r h s p 9 0 3 t h a ts p e c i f i c a l l ya s s o c i a t ew i t h l b s g tw i t hy e a s tt w o _ h y b r i d s c r e e ne x p e r i m e n t s m o r e o v e r ，i no r d e rt od e t e r m i n e w h e t h e rp s g ti n t e r a c t e dw i t hh s p 9 0 1 3 i n v i t r o ，w ep e r f o r m e dag s tp u l l d o w ne x p e r i m e n t b s g ti sc o m p o s e do f3 0 4a m i n oa c i d s ，t h e m o l e c u l a rm a s si s 3 4 k d a t h et p rd o m a i ni si nt h em i d d l eo ft h ep r o t e i n t h et p rd o m a i n f o u n di nm a n yp r o t e i n si sb e l i e v e dt om e d i a t ep r o t e i n - p r o t e i ni n t e r a c t i o n i nt h e p r e s e n t s t u d yp s g tc o n t a i n i n gt p rd o m a i n sh a v e s h o w nt o i n t e r a c tw i t hh s p 7 0o rw i t hh s p 9 0 h e r e ，w ed e m o n s t r a t e dt h a tt h e c t e r m i n a lp e n t a p e p t i d eo fh s p 7 0a n dh s p 9 0h a sa ni m p o r t a n tr o l ei n t p r - m e d i a t e dc o f a c t o rb i n d i n g c o n s t r u c t i n gt h ed e l e t i o no fc - t e r m i n a l ， w es h o w nt h a tt h ei n t e r a c t i o no ft p rw i t hm e e v do fh s p 9 0 i s i d e n t i f i e da st h ec o r ec o n t a c tf o rs g tb i n d i n gt oh s p 9 0 ；t h ef o r m a t i o no f t h eh s p 7 0 s g tc o m p l e xd e p e n d so nr e c o g n i t i o no ft h ep t i e e v db y t p rd o m a i ni nt h ey e a s t a s pa n dv a lo ft h ee e v dm o t i fa r ei d e n t i f i e d a sg e n e r a la n c h o rr e s i d u e s ，w h i c ha r ec r i t i c a li nh s p 9 0b i n d i n gb yt p r d o m a i n k e y w o r d s ： 1 3 s g t ；h s p 7 0 h s p 9 0 ；a s s o c i a t i o n ；y e a s tc e l l s i v 南京医科大学2 0 0 8 届硕士毕业论文 p a r ti i ：t i s s u ed i s t r i b u t i o no fp s g ta n dt h e e f f e c t i o no nt h e c e l lc y c l e w ed e s c r i b eh e r ea ni s o f o r mo fa s g tw i t h6 0 a m i n oa c i d s e q u e n c ei d e n t i t yt h a tn a m e1 3 s g t 1 3 s g ti sa l m o s te x c l u s i v e l ye x p r e s s e d i nb r a i n t h ea m i n oa c i ds e q u e n c eo fr a t1 3 s g ti sc o m p a r e dw i t h s e q u e n c e so fe x p r e s s e ds e q u e n c et a g sf o r1 3 s g tf r o mm o u s e ，h u m a n a n d w i t hs e q u e n c e so fp s g tf r o mg a l l u s ，m o u s e ，a n dc a n i s i nt h i sp r e s e n t s t u d y ，w e c o n t r u c t e d e u k a r y o f i ce x p r e s s i o n p l a s m i d p c d n a 3 1 一m y c h s p 9 0 1 3 a n dw a s i n t r o d u c e di n t oh e l ac e l l sl i n e a f t e r b e i n gs u b c l o n e d ，t h er e c o m b i n e dp l a s m i dw a sp u r i f i e da n di d e n t i f i e db y l i m i t e de n z y m ed i g e s t i o n t h eg r o w t ho fh s p 9 0 1 3h i 曲l ye x p r e s s i n gc e l l l i n ea f f e c tt h ec e l lc y c l ea n dt h ed n ac o n t e n to fsp h a s ew a sh i g h e r b y f l o wc y t o m e t r y ，w ed e m o n s t r a t et h a tt h ee f f e c to fh i g hl e v e lh s p 9 0 1 3o n c e l lp r o l i f er a t i o nw a st oa c c e l e r a t ec e l lg r o w t hb ya f f e c t i n gc e l lc y c l e k e y w o r d s ：h s p 9 0 1 3 ；h e l ac e l l s ；c e l lc y c l e ；f l o wc y t o m e t r y v 南京医科大学2 0 0 8 届硕士毕业论文 论文独创性声明 本论文巨兰堡! 鱼旦! p ! q 奠墨2 2 1 担至笠旦鲍盟窒是我个人在导师指 导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除了特别加以标注和 致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究成果。 其他同志对本研究的启发和所做的贡献均在论文中作了明确的声明 并表示了谢意。 专业：逢r 著 作者签名：幸而 日期：力。g 占f 论文使用授权声明 本人完全了解南京医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以 公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保 存论文。保密的论文在解密后遵守此规定。 作者签名：幸而 导师签名巧锹日期： 冲参 南京医科大学2 0 0 8 届硕士毕业论文 第部分l j ls g t 与h s p 7 0 h s p 9 0 在酵母和体外的相互作用 前言 在细胞生理事件中，蛋白质能否正确的折叠是关键的检查点。应 激因素例如相对高的温度，缺乏营养，低氧，重金属均可导致不正确 的蛋白质折叠产生，这样会产生蛋白质的聚集【1 4 】。暴露于不利 条件下，几乎所有组织细胞已经能够形成适当自身保护反应，例如通 过迅速增加蛋白质的合成和一些蛋白如热休克蛋白( h s p ) 和应激蛋 白的选择性聚集以确保蛋白质构象稳定。到目前为止，已有7 个超 h s p 家族，其代表是h s p l 0 ，h s p 2 7 ，h s p 4 0 ，h s p 6 0 ，h s p 7 0 ，h s p 9 0 和 h s p l10 都被发现。它们是根据分子重量而命名的。这些是应激状态 下细胞生存所必须的【3 ，5 9 】。 h s p 7 0 和h s p 90 被认为是主要的折叠蛋白，它们和新合成的未折 叠的肽链结合( h s p 7 0 ) ，这样能够阻滞未成熟的新生肽链自身连接或 保持已经成熟蛋白质处于无活性状态( h s p 9 0 ) ，【3 ，6 ，8 1 0 】。热 休克蛋白和配体、共分子伴侣形成多种蛋白复合物。这些共分子伴侣 可能调节和选择性结合配体蛋白【2 ，4 ，9 ，1 1 1 4 】。h s p 7 0 和h s p 9 0 从配体蛋白释放出来后，h s p 6 0 和h s p 2 7 家族成员和一些其他的相关 蛋白的参与进去这样折叠过程就完成了【3 ，8 】。 在没有应激状态下，h s p 9 0 大约占胞浆总蛋白成分的1 2 ，而 在应激条件下，它会增加到4 6 。这就使得h s p 9 0 成为真核细胞蛋 白质组中含量丰富的一种蛋白【2 ，9 ，1 3 ，1 5 】。h s p 9 0 是进化上保守 的蛋白，人类和大肠杆菌属( h t p g ) ：酵母和哺乳动物中含有两种极 为相同的同源异构体h s p 9 0o 【和h s p 9 0d ( 除了果蝇只有一种( h s p 8 3 ) ， 南京医科大学2 0 0 8 届硕士毕业论文 到目前为止两者功能几乎没有不同。唯一的不同是两者的表达调控不 同，人类胞浆中的h s p 9 0o 【主要是热休克依赖型表达蛋白，而小量的 h s p 9 0d 是组成型表达( 或者在某些细胞类型中是生长因子诱导型) 真核生物中有1 5 0 2 种蛋白质和h s p 9 0 相互作用，可以主要分为两 类：共分子伴侣类和底物类。底物类又被称为配体类，依靠h s p 9 0 分 子伴侣功能正确的折叠、拥有稳定和特异的活性。共分子伴侣支持 h s p 9 0 选择性的结合扣控制靶配体【2 ，6 ，9 ，1 7 ，1 8 】。其中一种共 分子伴侣包含t p r 模序( 保守的3 4 个氧基酸序列) 特异的和h s p 9 0c o o h 一末端序3 f q m e e v i ) 结合。例如h o p ( 在酵母中是s ti ) 、亲免素、 f k b p 51 ，f k b p 5 2 和c y cl o p h i1i n - 40 ，e 3 泛素连接酶、c h i p ，p p 5 和 u n c - 4 5 必须是和h s p 9 0c 一末端m e e v d 序列结合，然而其它序列也调 控着各自的相互作用18 ，9 ，13 ，16 ，19 21 】。 仅s g t ( s m a l lg l u t a m i n e r i c ht e t r a t r i c o p e p t i d er e p e a t t p r ) 克隆于1 9 9 8 年，它能与细小病毒非结构蛋白n s i 和h i v - 1 病毒编 码的v p u 蛋白相互作用，所以0 【s g t 叉名为病毒蛋白u 结合蛋白( v i r al p r o t e i nu h i n d i n gp r o t e i n ，u p b ) 。0 【s g t 是t p r 模序蛋白质家族 中的一员，共f f 有3 13 个氨基酸，其特征是分子的中部含有三个t p r ( t e t r a t r i c o p e t ti d er e p e a t ) 结构域，在胞浆和胞核中是广泛分布 的【2 2 】。近年的研究表明，o 【s g t 可以和h s p 7 0 结合，h s p 7 0c o o n 一 末端的突变会影响s g t 和n s p 70 的结合，说明了c 0 0 h 一末端是结合位 点。o 【s g t 蛋白作为一种共分子伴侣而存在，在促进细胞凋亡协助伴 侣蛋白功能的研究逐步深入【2 3 】。ds g t 是仅s g t 的同源蛋白【2 4 】， 下图是ds g t 的结构。 2 c 南京医科大学2 0 0 8 届硕士毕业论文 已有文献报道ds g t c s p h s p t o 形成复合物，促进神经递质的释放。 因此，我们以ps g t 为诱饵蛋白，验证其与h s p 9 01 3 是否相互作用。同 时运用在酵母中共转4 - 匕p g b k t 7 和p a c t 2 质粒及设置阴性和阳性对照 确证了ds g t 与h s p 9 01 3 的相互作用。本实验室构建了几个 h s p 9 0 h s p 7 0c o o h - 端的突变质粒通过酵母双杂交技术研究其对结合 ps g t 的影响。 酵母双杂交是寻找相互作用蛋白的重要筛选方法之一【2 5 2 7 1 。 此技术源于对酵母转录因子g a l 4 的研究与认识。典型的转录激活因子 包括结构上可以分开的、功能上相互独立的两个结构域：d n a 结合结 构域( d n ab i n d i n gd o m a i n ，d n a b d ) 和转录激活结构域( a c ti v a t i o n d o m ai n ，a d ) 。d n a - b d 结构域和a d 结构域单独分别作用并不能激活转 录反应，但是当二者在空间上足够靠近时，则呈现完整的转录因子活 性并可激活转录。酵母双杂交系统就是基于这个原理设计的。将两个 待测蛋白分子与a d 圾, b d 融合，构建出相应的质粒载体；再将两个质粒 载体共转化至酵母体内表达，如果两者能够相互作用，就能通过待测 蛋白的桥梁作用使a d 与b d 靠近，从而形成一个完整的转录激活因子， 激活相应的报告基因表达【2 8 】。通过对报告基因表型的检测分析， 可以判定待测蛋白分子间是否有相互作用，原理如下图所示： 胡h 一脚 墨墨司一r 匡主i 三固 南京陕科大学2 0 0 8 届硕士毕业论文 酵母双杂交系统由三个部分组成：与b d 融合的蛋白表达载体， 被表达的蛋白称诱饵蛋白( b a it ) ；a d 融合的蛋白表达载体，其表 达的蛋白称靶蛋白( p r e y ) ；带有一个或多个报告基因的宿主菌株。 常用的报告基因有h i s 3 、u r a 3 、l a c z 和a d e 2 等。而菌株则具有相应的 营养缺陷型。 m a g n e g s t t mp ul 卜d o w ns y st e m 是侦9 n , , g s t f u sio np r o t ein s 和 p r e yp r o t e i n s 间蛋白质交互作用的系统。先将b a c t e r i a ll y s a t e 中 的g s t - f u sio np r ot ein s ( b a it p r o t ei n ) j ，j , m a g n e g s t t mp a r ticle s 纯化固定。另外使用t n t q u i c kc o u p l e d tr a n s c rip tio n tr a n slati o nr e a cti o n 合成被标记的p r e yp r o t ei n s ， 再以b a i tp r o t e i n 抓取p r e yp r o t e i n s 。非专一结合的蛋白质会在w a s h 的过程中去除，之后进行p r e yp r o t ei n 的分析【2 9 3 5 】。若p r e y p r o t ei n s 合成时以放射性标记，则可使用s d s p a g e 和 a u t o r a d i o g r a p h y 侦测；若p r e yp r o t e i n s 合成时以非放射性标记则可 使用专一的抗体进行w e st e r nb lo tti n g 侦测，原理如下。 p h i s 1 “7 宇。：? ：# 苫f ，r ；兰；兰毛：鬻7 “。 p h a l e2 h 1 1 m o b i i z a t j o n ：e a j t ( g s tf u o l - t i ) p r c 垃e 1o 1 om a c i n e ( j s t o p a r t t c i e e e i p 口r i i l l l n | a - c o n t o ! ( g s t f u e i o n )( g s t ) b a c t o n a 上 w a l h 上 上 匪噩噩】_ ( + 。 _ f l 一一， p r 气量篓嚣三 三三二 1 l w a o h l e i n e j e 圈 上 j r b | n d i n g 啊9 e 呈墨口 一一一一 f i g r e - 0 v e r v i p w0 ft i r em - t s x l e g s t 。p l l d o w ns y l t e mp r o t o c o l p p r 母yp l 。o t e 1 h i 一、1 9 1 、e g s t 7 “p - t i c i 廿 4 南京医科大学2 0 0 8 届硕士毕业论文 材料和方法 1 材料 酵母双杂交系统p g b k t 7 ，d n ab d 质粒；p a c t 2 ( a d 质粒) ；y 1 9 0 ，酵 母培养基及氨基酸，c a r ri n gd n a 购自上海睿星生物技术公司，限制 性核酸内切酶、t , d n a 连接酶购自t a k a r a 公司。质粒小量抽提试剂盒、 胶回收试剂盒分别购自天为生物技术有限公司和p r o m e g a r & 司。 m a g n e g s t 硼p u l1 - d o w ns y st e m 试剂盒购自p r o m e g a & - 司。 2 仪器： p c r 仪( b i o - r a d 公司) ；离心机( e p p e n d o r f j a 司) ；d n a 电泳槽( 南京 大学d y y 一6 b 稳流稳压电泳仪) ；凝胶成像装置( 上海松下公司) ；空气 摇床( 上海福玛实验设备有限公司) 3 多聚酶链反应【p c r ) 引物设计 3 1 全长ds g t 和全长h s p 9 0 酵母质粒构建 ( 1 ) p a c t 2 - ps g t 和p g b k t 7 一ps g t ( s f ii 酶切位点) s e n s ep ri m e r ：5 c a t g g c c a a t c c g g c c a t g c c t g a g g a a g t g c a c c 3 a n ti s e n s ep ri m e r ：5 c g t g g c c t c t a a g g c c t a t c a c t c c t g c t g g t c 3 ( 2 ) p a c t 2 一h s p 90d 和p g b k t 7 一h s p 90d s e n s ep ri m e r ：5 c a t g g c c a a t c c g g c c a t g a g g g g c c c t g t g g g t g c t g g g c 3 a n ti - s e n s ep ri m e r ：5 g t c g g c c t c t a a g g c c c t a a t c g a c t t c t t c c a t g c g g a 3 ( 3 ) p a c t 2 一h s p 9 0o 【和p g b k t 7 - h s p 900 【 s e n s ep ri m e r ：5 g g g g a g g c c a a t c c g g c c a t g c c t g a g g a a a c c c a g a c c3 a n ti - s e n s e p ri m e r ：5 g g g a g g c c t c t a a g g c c g t c t a c t t c t t c c a t g c g t g a t 3 3 2ds g t 三联t p r 结构域肽段的酵母质粒构建 p a c t 2 - ps g tt p r 和p g b k t 7 一ds g tt p r 气 南京医科大学2 0 0 8 届硕士毕业论文 s e n s ep ri m e t ：5 c a t g g c c a a t c c g g c c g c g a g c g c c t c a a a a c c g a a 3 a n ti s e n s ep r i m e r ：5 c g i g g c c t c i a a g ( ；1 c i c c g c t a t c t t g a g g t t g g a 3 3 3 h s p 70 h s p goc o o h - 端突变酵母质粒的构建 ( 1 ) p a c t 2 一m e e v d g f p s e n se p ri m er ：5 c a t g g c c a a t c c g g c c a t g g a a g a a g t a3 a n ti p ri m e r ：5 c g t g g c c t c t a a g g c c t a c t t g t a c a g c t c g t c c a t 3 ( 2 ) p a c t 2 一g f p - m e e v d s e n s ep ri m e r ：5 c a t g g c c a a t c c g g c c a t g g a a g a a a t a g a c 3 a n ti p ri m e r ：5 c g t g g c c t c t a a g g c c t a t g c c a c c t c c t c a a t g g t 3 ( 3 ) p a c t 2 一g f p e e v d s e n s ep ri m e r ：5 c a t g g c c a a t c c g g c c a t g g t g a g c a a g g g c g a g g a 3 a n ti p ri m e r ：5 c g t g g e c t c t a a g g c c t a g t c t a c t t c t t c c t t g t a 3 ( 4 ) p a c t 2 一g f p g p t i e e v d s e n sep ri m e r ：5 c a t g g c c a a t c c g g c c a t g g t g a g c a a g g g c g a g g a3 a n ti p ri m er ：5 c g t g g c c t c t a a g g c c t a a t c c a c c t c c t c a a t g g t g g g g c c3 ( 5 ) p a c t 2 一h sp 90 - m e e v a s e n s ep r i m e r ：5 c a t g g c c a a t c c g g c c a t g g t g a g c a a g g g c g a g g a 3 a n ti p ri m e r ：5 c g t g g c c t c t a a g g c c t a t g c t a c t t c t t c c a t 3 s fii 酶切位点g g c c n n 硼n n g g c c 4 质粒的构建 4 1 制备大肠杆菌e c o lid h 5 a 感受态细胞 1 ) d h 50 【涂于无抗生素的培养皿上。 2 ) 1 6 - 1 8 小时后，挑单克隆) n 2 5 m ls o b 中3 7 恒温，2 2 0 r p m l 振荡 培养过夜( 约6 - 8 小时) 。 3 ) 取三个5 0 0 m l 烧瓶，各力口入2 5 0 m is o b 各加入4 m l ，2 m l ，l m l ，菌液1 8 6 南京医科大学2 0 0 8 届硕士毕业论文 一2 2 中速2 0 0 r p m3 6 小时。 4 ) 次日测o d 。植。 5 ) 约4 5 分钟测一次，直至o d 为0 5 5 左右。 6 ) 培养瓶置于冰上10 分钟。 7 ) 4 3 90 0 r p m 离心10 分钟。 8 ) 倒去培养液，离心管倒扣纸上吸干。 9 ) 8 0 m l 预冷的i n o u e 转化缓冲液，温和重悬。 1o ) 4 3 9 0 0 r p m10 分钟。 1 1 ) 重复8 步骤。 1 2 ) 加2 0 r a l 预冷的i n o u e 转化缓冲液，温和重悬。 1 3 ) 加1 5 m l d m s o ，混匀，冰上静置1 0 分钟。 1 4 ) 分装，加液氮凝固，一70 c 保存( 6 月左右) 。 4 2 p c r 扩增目的e d n a 片断 构建p g b k t 7 - ds g t 的模板：全长的ps g t 是购自a t c c ( a m e r c i a n t y p ec u lt u r ec o ll e c ti o n ) p o t b 7 载体。 构建p g b k t 7 - h s p 9 00 【的模：南京医科大学生殖医学惠赠的质粒 p e t 2 8 a h s p 9 0o 【 构建p g b k t 7 - h s p 9 0d 的模板：质粒p c a g g s f l a g h s p 9 0d p c r 反应体系： 模板( o 1 - 1ug u1 )1 “l 10 xm 9 2 +1oul 10 xb u f f e r10 “1 上游引物( 10 p m 0 1 )2 5 “1 下游引物( 10 p m 0 1 ) 2 5u1 d n t p ( 1o m m ) 10u1 7 南京医科大学2 0 0 8 届硕士毕业论文 h ：0 63 “l ! 垒g 堕! 丛! 总体积 10 0ul p c r 反应条件：( 9 4 c 5 分钟) 1 个循环 j ( 9 4 * ( 2 3 0 秒5 5 3 0 秒7 2 1 分钟) * 3 0 个循环 l ( 7 2 10 分钟) 1 个循环 用于ps g t 的p c r 延伸条件为7 2 1 分钟 用于h s p 9 00 【全长和h s p 9 0d 全长的p c r 延伸条件为7 2 3 分钟，其余 不变。 4 3 d m a j 号段和裁体的酶切 将p c r 反应产物或含目的基因的质粒用限制性内切酶在5 0 c 水浴约2 小时，此反应通常在1 5 m l e p p e n d o r f 离心管内进行，反应体系如下： d n a ( o i - iug 1 ) 1oul 10 酶切缓冲液 2ul 限制性内切酶s f ii2 l d d h 2 0 6u1 总体积 2 0u1 空载体的酶切反应体系如下： d n a ( 0 i - i g 1 ) 10ul 10 酶切缓冲液 2 “1 限制性内切酶s f ii 2u1 鱼鱼旦! q 鱼丛! 总体积 20ul 8 南京医科大学2 0 0 8 届硕士毕业论文 4 4 d n a 片段的纯化( t a k a r ad n af r a g m e n tp u ri fic a ti o nk it 试剂盒) 1 ) 向p c r 反应液中加入3 倍量的d bb u f f e r ( 如果需加入的d bb u f f e r 量不足1 0 0ul 时应h x 10 0u1 ) ，然后均匀混合。 2 ) 将试剂盒中的s p i nc o l u m n 安置于c o ll e c ti o nt u b e _ l 。 3 ) 将上述操作1 的溶液转移至s p i nc 0 1 u m n ，1 2 ，0 0 0 r p m 离心1 分钟， 弃滤液。 注) 如将滤液再 i r ) n s p i nc 0 1 u m n 冲 离心一次，可以提高d n a 的回收率。 4 ) 将5 0 0ul 的r i n s e h 加a n s p i nc o l u m n 中，1 2 ，0 0 0 r p m 离心3 0 秒钟， 弃滤液。 5 ) 将7 0 0 “1 的r i n s e b h 口n s p i nc 0 1 u m n ，1 2 ，0 0 0 r p m 离心3 0 秒，弃 滤液。 6 ) 重复操作步骤5 。 7 ) 将s p i nc o l u m n 按置于新的1 5 m l 的离心管上，在s p i nc o l u m n 膜的 中央h 叭2 5 - 3 0u1 的灭菌水或e l u ti o nb u f f e r ，室温静置1 分钟。 注) 把灭菌水或e l u ti o nb u f f e r 加热至6 0 c 使用时有利于提高洗脱效 率。 8 ) 1 2 ，0 0 0 r p m 离心1 分钟洗脱d n a 。 4 5 d n a 片段的回收( 胶回收试剂盒为o m e g a 公司u 1t r a - s e pg el e x t r a c t i o nk i t 产品) 1 ) 将p c r 反应产物或酶切反应物用1 琼脂糖凝胶进行电泳。 2 ) 当电泳足够的时间后，小心在紫外灯下切出d n a f i 断并尽可能切除 多余的残胶，避免在紫外光下曝光时间超过3 0 秒。 3 ) 称好一个1 5 m l 离心管，将切下的胶转入离心管中，然后称重，按 凝胶密度为l g m l ，算出凝胶的体积；例如0 2 9 的凝胶块体积为0 2 m 1 加入等体积的u 1t r a s e p b i n d i n gb u f f e r 。5 0 5 5 。c 孵育1o 分钟至胶 9 南京医科大学2 0 0 8 届硕士毕业论文 完全溶解，每2 3 分钟涡旋或振荡一次。 4 ) 加入1ou1u 1t r a - s e pb e a d s 至溶液中，室温下孵育10 分钟，室温 下，1 0 ，0 0 0 g 离心1 分钟沉淀玻璃珠，弃去溶液。 5 ) 加a 5 0 0 “1 w a s hb u f f e r ( 已加入无水乙醇) ，涡旋3 5 分钟重悬， 离心10 ，0 0 0 g 沉淀离心。 6 ) 去除溶液，用5 0 0 “1 w a s hb u f f e r 重复步骤5 一次 7 ) 去除溶液，彻底吸尽溶液，空气干燥1 0 - 1 5 分钟，这一步对d n a 产 量相当关键 8 ) 加入10 - 1 5 “1 的灭菌水或t eb u f f e r ( p h 8 0 ) ，涡旋重悬沉淀。 5 0 c - 5 5 孵育5 分钟，室温下1 0 ，0 0 0 g g 心1 分钟沉淀玻璃珠 9 ) 小心转移上清液至新的离心管中，上清液包含纯净的d n a 。这一步 可以洗脱出8 0 - 9 0 d n a 1 0 ) 产量及定量：在核酸蛋白测量仪上钡i d n a 浓度 4 5 插入片段和载体的连接 将酶切过的插入片段与载体用t 4 连接酶连接2 2 2 小时 反应体系如下： 载体d n a ( 0 1 - 1ug u1 ) 2ul 插2 x d n a ( 0 1 - 1ug 1 ) 2ul 2 t 4 连接缓冲液5 “1 t 4 d n a 连接酶 1 丛l 总体积 10 “l 4 6 转化 将连接产物转化入大肠杆菌e c o li d h 5o 【感受态细胞 ( 1 ) 取1 0ul 连接反应液加入装有1 0 0u1e c o lid h 5o t 感受态细胞的 1 5m le p p e n d o r f 管，轻弹e p p e n d o r f 管底部混匀，冰浴2 0 - 3 0 分钟 i o 南京医科大学2 0 0 8 届硕士毕业论文 ( 2 ) 4 2 热激1 5 分钟，迅速转移至冰浴2 - - 3 分钟 ( 3 ) h 0 2 x 5 0 0u1 新鲜l b 培养液，置于3 7 。c 摇床1 8 0 r p m 振荡孵育1 小时 ( 4 ) 离c x 6 0 0 0 r p m 5 分钟，去留部分上清重悬沉淀，将细胞悬液涂布 于l b 固体培养板( 含抗生素筛选因素) 正置培养，半小时后翻板。 ( 5 ) 3 7 c 倒置培养1 6 - 1 8 小时单菌落出现，放入4 保存 4 7 质粒的鉴定 ( 1 ) 挑取多个单克隆放入1 5 m 1 离心管3 m l 的l b 培养基中，3 7 摇菌过夜 1 6 - 1 8 小时 ( 2 ) 各取菌液2 “1 作为模板，用特异性的引物p c r 鉴定。 4 8 质粒的抽提 碱裂解法小量制备细菌质粒( 用于酶切鉴定及转化感受态e c o li 或 酵母) ( 1 ) 柱平衡步骤：向吸附柱c b 3t p ( 吸附柱放入收集管中) h , ) x 50 0ul 的平衡液b l ，1 2 ，0 0 0 r p m 宴j 心1 分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱 重新放回收集管中。 ( 2 ) 取1 - 5 m l 过夜培养鉴定的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心 机，1 2 ，0 0 0 r p m 凄j 心1 分钟，尽量吸除上清( 茵液较多时可以通过多次 离心将菌体沉淀收集到一个离心管中) 。 ( 3 ) 向留有菌体沉淀的离心管中加入2 5 0 “1 溶液p 1 ( 请先检查是否已 ) ，g ) x r n a s e a ) 使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。注意：如 果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。 ( 4 ) 向离心管中加入2 5 0u1 溶液p 2 ，温和地上下翻转6 - 8 ，l 使菌体充分 裂解。注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组d n a ，此时 菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5 分钟，以免质粒受到破坏。 如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。 南京医科大学2 0 0 8 届硕士毕业论文 ( 5 ) 向离心管中加, 入3 5 0 “1 溶液p 3 ，立即温和的上下翻转6 - 8 次，充分 混匀，此时将出现白色絮状沉淀。1 2 ，0 0 0 r p m 离心1 0 分钟，此时在离 心底部形成沉淀。注意：p 3 加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。 如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。 ( 6 ) 将上一步收集的上清用移液器转移到吸附柱c b 3 中，( 吸附柱放入 收集管中) ，注意尽量不要吸出沉淀。1 2 ，0 0 0 r p m 离c 2 3 0 - 6 0 秒，倒掉 收集管中的废液，将吸附柱c b 3 放入收集管中。 ( 7 ) 向吸附叶 c b 3 中加入5 0 0u1 去蛋白液p d ，1 2 ，0 0 0 r p m 离心3 0 - 6 0 秒， 倒掉收集管中的废液，将吸附柱c b 3 重新放回收集管中。 ( 8 ) 向吸附柱中c b 3 中加) x 7 0 0 l 漂洗液p w ( 请先检查是否已加入无 水乙醇) 1 2 ，0 0 0 r p m 离c 33 0 - 6 0 秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱c b 3 放入收集管中。 ( 9 ) 向吸附柱c b 3 中加n 5 0 0 “1 漂洗液p w ，1 2 ，0 0 0 r p m 离c 2 3 0 - 6 0 秒， 倒掉收集管中的废液。 ( 10 ) 将吸附柱c b 3 础k 收集管中，1 2 ，0 0 0 离心2 分钟，目的是将吸附 柱中残余的漂洗液去除。将吸附柱c b 3 开盖，置于室温放置数分钟， 以彻底凉千吸附柱中残余的漂洗液。 ( 1 1 ) 将吸附柱c b 3 置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位 滴加5 0 - 1 0 0 “l 洗脱缓冲液e b ，室温放置2 分钟，1 2 ，0 0 0 r p m 离心2 分 钟将质粒溶液收集到离心管中。注意；为了增加质粒的回收效率，可 将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，重复步骤1 1 。若用水做洗脱液， 应保证其p h 值在7 0 - 8 5 范围，洗脱缓冲液体积不应少于5 0ul 。d n a 产物应保存在- 2 0 c