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鞘氨醇单胞菌降解溴氨酸及强化体系d n a 指纹解析 将菌株q y y 的游离态及固定化细胞分别投加到溴氨酸处理体系中进行生物强化降解 研究，结果表明：投加固定化细胞的系统具有较强的降解能力，并且抗冲击负荷能力较 强，处理效果稳定。而投加不同接种量对强化效果有显著的影响，投加量为9 0 7 的系统 显示出最强的去除效果，在连续5 0 天的运行中维持9 0 以上的降解率。为了确保d n a 指 纹分析的全面、准确，建立了从活性污泥中快速提取基因组d n a 的新方法，过程包括粗 提与精制两个步骤，简化了繁琐的提取程序，提高了提取效率。该方法提取的基因组 d n a ，其o d z 6 0 与o d 2 s o 的比值为1 8 2 ，纯度满足分子操作的需要。在此基础上，利用 d n a 指纹技术，如扩增核糖体限制性酶切片断多态分析及核糖体基因间隔序列分析，并借 助16 sr d n a 序列分析，对强化体系进行微生物群落动态解析，进而揭示系统微观结构与 宏观功能之间内在的联系。研究表明，经生物强化的污泥系统，其微生物多样性显著增 加；系统的指纹多态性因投加微生物的形态不同而有明显差异。遗传分析表明，无论是以 游离态或是固定化细胞的形式进行投加，菌株q y y 均可在复杂的强化系统中存活，并保 持较高的代谢活性，用于遗传分析的1 6 sr d n a 序列登录g e n b a n k ，序列号为 a y 7 5 1 3 0 3 、a y 7 5 5 3 6 2 至a y 7 5 5 4 1 2 。 关键词：生物强化；溴氨酸；d n a 指纹；鞘氨醇单胞菌 大连理工大学博士学位论文 a b s t r a c t t h ep u r p o s eo ft h i sd i s s e r t a t i o ni st oi n v e s t i g a t et h ec h a r a c t e r i s t i c so fan e w l yi s o l a t e d s p h i n g o m o n a sx e n o p h a g aq y y w i t ht h ea b i l i t yt od e g r a d eb r o m o a m i n ea c i d ( b a a ) 1 k p h y s i o b i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i z a t i o na n d1 6 sr d n am o l e c u l a ri d e n t i f i e a t i o nw e r ec a r r i e do u t t h e c h a r a c t e r i s t i c so f s t r a i nq y y g r o w t h a n db a a d e g r a d a t i o n w e r ea l s oi n v e s t i g a t e da n dt h ep o s s i b l e m e t a b o l i c p a t h w a y o fb a ad e g r a d a t i o n b y s t r a i n q y yw a sp r e s u m e d m e a n w h i l e ， b i o a u g m e n t a t i o no fb a ad e g r a d a t i o nw i t hs l l a h - iq y y a sa u g m e n t e di n o e u k m a sw 船s t u d i e d , a n d t h ed y n a m i ca n ds t r u c t u r a lc h a n g e so fm i e r o b i a lc o m m u n i t yi na u g m e n t e ds y s t e mw e r er e v e a l v e d b y m o d e mm o l e c u l a re c o l o g i c a l t e c h n i q u e s s w a i nq w i sa ne f f i c i e n t b a a - d e g r a d i n gs t r a i n i t w a si d e n t i f i e da s s p h i n g o m o n a s x e n o p h a g ab e l o n g i n g t op r o t e o b a c 招r i aas u b c l a s sb a s e do rm o r p h o l o g i c a la n d p h y s i o b i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c sa n d1 6 sr d n a s e q u e n c ea n a l y s i s s t r a i nq w i sd e p o s i t e da sa p a t e n t s t r a i ni nc h i n ag e n e r a lm i c r o o r g a n i s mc u l t u r ec e n t e rw i t ht h ea c c e s s i o nn u m b e rc g m c c11 7 2 t h e16 sr d n as e q u e n c eo fs t r a i nq y ys h a r e d1 1 i 曲s i m i l a r i t y ( 9 9 ) w i t ht h a to f t y p es t r a i n d s m 6 3 8 3 t h e1 6 sr d n a s e q u e n c eo f s t r a i nq y vw a ss u b m i t t e d , t og e n b a n kw i t ht h en u m b e r a y 6 1 1 7 1 6 a n o v e l n o n - f u n c t i o n w i d e p l a s m i d 0 s x - q y y ) a b o u t5 6 8 3 b p w 私i s o l a t e d f r o m s t r a i n q y y b y t h em e g a p l a s m i de x t m e f i o ns t r a t e g y t h ep l a s m i d c o n t a i n sf o u ro p e n i n gr e a d i n g 盘d r f l e s ( o r f s ) ，o f w h - i c hc o n t a i n sg e n ee n c o d i n gr e p l i c a t i o np r o t e i no f ec o l i t h es e q u e n c eo f p s x - q y y w a ss u b m i t t e dt og e n b a n kw i t ht h ea c c e s s i o nn u m b e ra y 7 8 7 1 4 6 n l ec h a r a c t e r i s t i c so fs t r a i nq y y g r o w t ha n d b a a d e g r a d a t i o nw 雠i n v e s t i g a t e dw i t ht h e p u r p o s eo fb u i l d i n gaf o u n d a t i o nf o rb i o a u g m e n t a t i o ne x p e r i m e n t s s t r a i nq y yi sr e s i s t a n tt o s t r e p t o m y c i na n ds e n s i t i v e t oo t h e ra n t i b i o t i c s 田1 eo p t i m a lc o n d i t i o n sf o rb o t hg r o w t ha n d d e g r a d a t i o np r o c e s sa r ea sf o l l o w s ：p h = 7 0 ，t e m p e r a t u r e3 0 ( 2 ，曲蜘s p e e d1 5 0 r m i na n d i n o c u l a t i o na m o u n t8 s t r a i nq y vc a nt o l e r a t eu pt o1 0 0 0 m g lb a a 日1 eo p t i m a l d e g r a d a t i o n c o n d i t i o n so f r e s t i n gc e l l sw e r ea l s oo b t a i n e da sf o l l o w s ：p h = 8 5 ，t e m p e r a t u r e 3 0 ，s h a k 地s p e e d 15 0 r r a i n t h ee n t r a p p e di m m o b i l i z a t i o nm e t h o do f a l 西n a t es o d i u mw a sa d o p t e d t h eo p t i m a l d e g r a d a t i o nc o n d i t i o n sf o ri m m o b i l i z e dc e l l sa r eo b t a i n e da sf o l l o w s ：s h a k i n gs p e e d1 5 0 r r a i n , t e m p e r a t u r e3 0 p h = 4 0 - 8 0 t h em e t a b o l i cp a t h w a yo fb a a d e g r a d a t i o nb ys t r a i nq y y 、幡i n v e s t i g a t e db ya d v a n c e d a n a l y 在c a li n s t r u m e n t ss u c ha su v - s ，i o nc h r o m a t o g r a m ，h p l c - m a s s ，h - n m r , e t c t h ef i n a l p r o d u c t s w e r ei d e n t i f i e da n dt h e p o s s i b l em e t a b o l i cp a t h w a yw a sp r e s u m e d d u r i n gt h e 鞘氨醇单胞菌降解溴氮酸及强化体系d n a 指纹解析 d e g r a d a t i o n ，t h e r e m o v a lo ft o c ，c o d e ri s 5 2 5 8 a n d 5 6 7 9 ，r e s p e c t i v e l y ，a n d t h e a n t h r a q u i n o n er i n gi s c l e a v e d i tw a s p r e s u m e d t h a tt h ed e g r a d a t i o np r o c e s ss h o u l db ei m t i 砷e db y r i n gh y d r o x y l a f i o nd i o x y g e n a s ea n dr i n gc l e a v a g ed i o x y g e n a s e t h em a i nf i n a lp r o d u c t sa r e 2 一 a m i n o 3 - h y d r o x y l 一5 一b r o m o p h e n y l - s u l f o n i ca c i da n d2 - a m i n o - 4 h y d r o x y l - 5 - b r o m o p h e n y l * s u l f o n i c a c i d b o t hs u s p e n d e da n di m m o b i l i z e dc e i l so fs t r a i nq y yw e r ei n o c u l a t e di n t ob a at r e a t m e n t s y s t e m , t h er e s u l t ss h o w t h a tt h es e c o n do n ee x h i b i t ss t r o n gc a p a b i l i t yt od e g r a d eb a 九a n dc a n t o l e r a t eh i g hs h o c k - l o a d i n g sw i t ht h er e l a t i v e l ys t a b l ef u n c t i o n h o w e v e r , d i f f e r e n ti n o c u l u m sh a v e as i g n i f i c a n ti m p a c to nb i o a u g m e n t a f i o n , t h er e s u l t sd e m o n s t r a t et h a tt h es y s t e mw i t h9 0 7 i n o c u l u m sh a st h es t r o n g e s tr e m o v a le f f i c i e n c y d u r i n g5 0 do p e r a t i o n ，t h ed e g r a d a t i o ne f f i c i e n c y m a i n t a i n sm o r et h a n9 0 f o rd n a f i n g e r p r i n ta n a l y s i s ，an o v e l 印p m a c h f o rr a p i de x t r a c t i o no f g e n o m i cd n a f r o ma c t i v a t e d s l u d g ew a sd e v e l o p e d t h e e x t r a c t i o n p r o t o c o l c o n s i s t so f t w o s t e p s ： c r u d ee x t r a c t i o na n df u r t h e rp u r i f i c a t i o n , w h i c hs i m p l i f i e st h ec o m p l i c a t e de x t r a c t i o np r o c e s sa n d i m p r o v e se x t r a c t i o ne f f i c i e n c y t h ev a l u eo fd 2 6 0 o d 2 8 0i s a b o u t1 8 2 ，w h i c hi ss u f f i c i e n tf o r m o l e c u l a r o p e r a t i o n i no r d e rt oe s t i m a t et h ei n h e r e n tr e l a t i o n s h i pb e t w e e nc o m m u n i t yd y n a m i c s a n df u n c t i o no fa u g m e n t e ds y s t e ma n dr e v e a lm i c r o b i a lc o m m u n i t yd y n a m i c s ，d n af i n g e r p r i n t t e c h n i q u e ss u c h a sa m p l i f i e dr i b o s o m a ld n ar e s t r i c t i o na n a l y s i s ( a r d k a ) r i b o s o m a li n 魄e m c s p a c e ra n a l y s i s ( r i s a ) a n d1 6 sr d n ag e n es e q u e n c i n gw e r eu s e d n l er e s u l t si n d i c a t et h a tt h e m i c r o b i a lc o m m u n i t yd y n a m i c sa r es u b s t a n t i a l l yc h a n g e d i ti sc o n c l u d e dt h a tt h e r ei sd i s t i n c t d i f f e r e n c ea m o n gf i n g e r p r i n t so ft h es y a e m s w h i c ha r ci n o c u l a t e dw i t hd i f f e r e n tc e l lf o r m s a c c o r d i n gt ot h eg e n e t i ca n a l y s i s ，t h ei n t r o d u c e ds t r a i nq y y i s p e r s i s t e n t i nt h ea u g m e n t e d s y s t e m sa n dm a i n t a i n sh i g hm e t a b o l i ca c t i v i t y ，n l e 1 6 sr d n a s e q u e n c e su s e df o rp h y l o g e n e t i c a n a l y s i sw e r es u b m i t t e dt og e n b a n k w i t ht h ea c c e s s i o nn u m b e r 娥5 1 3 0 3a n df r o ma y 7 5 5 3 6 2 t oa y 7 5 5 4 12 k e yw o r d s ：b i o a u g m e n t a t i o n ；b r o m o a m i n ea c i d ；d n af i n g e r p r i n t s ；s p h i n g o m o n a s 一 独创- 眭说明 作者郑重声明：本博士学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得大连理 工大学或其他单位的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对 本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 作者签名：馥缝旌日期：趔主：乙苎 大连理工大学博士学位论文 大连理工大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解“大连理工大学硕士、博士学位论 文版权使用规定”，同意大连理工大学保留并向国家有关部门或机构送交学 位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大连理工大学 可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，也可采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。 作者签名：塑煎遮 导师签名： 2 翌嚷丝 3 莎年7 月箩e t 1 2 7 大连理工大学博士学位论文 1 文献综述 人工合成的染料品种繁多、结构复杂、化学稳定性好，生物可降解性差，多数染料具 有“三致”作用，是重要的环境污染物。水体是仅次于大气的主要环境因素，是“三废” 等污染物的主要承载者和汇集地之一。染料和印染废水的排放，不但造成水环境的严重污 染，而且由于渗透或淋溶作用，会对地下水及地表水造成次生污染，引起农业生态环境的 破坏：更为严重的是，污染物可通过饮用水或土壤一植物系统，由食物链进入人体，直接 危及人类健康。随着环境法制力度的加强，越来越多的企业力求有效的废水修复技术。而 有关染料废水有效处理及其对环境、人体影响的研究则成为许多环保工作者的重要课题。 染料和印染废水是最难处理的工业废水之一，其脱色和降解已成为世界性的研究难点和热 点。目前国内外对染料的研究主要集中于偶氮染料，而对于结构上更难生物降鳃的葸醌染 料及其中间体的研究涉及较少。 近年来，生物法处理蒽醌染料废水倍受青睐。但由于葸醌染料大多是结构复杂的芳香 族化合物，结构稳定、可生化性差、难于生物降解，且生成的中间产物结构复杂，往往具 有毒性或致癌性，从而利用传统的生物处理法效果不佳。因此，寻求一种更安全、更有 效、更彻底、更价廉的生物处理法则成为当务之急。许多环境工作者正在通过各种试验与 研究，试图寻求一种成功的葸醌染料废水的处理工艺。生物强化技术( b i o a u g m c n t a t i o n ) 是一种新发展起来的高效生物处理技术，即通过向自然菌群中投加多种有效微生物，以加 速目标去除物的降解，改善水质，提高系统处理效果。目前，利用生物强化技术处理难降 解有机物是国内外环境工程领域的研究热点。因此，通过生物强化技术可增强葸醌染料及 其中间体废水的处理效果，在实际废水处理过程中是行之有效的方法。 生物强化技术在难降解有机废水的处理中显示出巨大的应用潜力。然而，至今关于复 杂的生物强化系统群落结构与宏观处理功自之间内在的联系尚需深入研究。随着现代分子 生态技术在环境中的广泛应用，使得揭示这一内在联系成为可能。不仅可以通过d n a 指纹 技术，揭示微生物群落的动态；还可以利用1 6 sr d n a 序列分析来确定群落的微观结构，同 时，可以对投加生物菌制剂的存活进行跟踪及定性分析。总之，将各种分子生态技术有机 结合，对生物强化系统进行全面的解析，从而使一直被称为“黑箱”的污泥系统变得“可 视化”。 鞘氨醇单胞菌降解溴氨酸及强化体系d n a 指纹解析 1 1 蒽醌染料及其中间体废水处理研究进展 葸醌类活性染料以其色泽鲜艳、固色率高、染色牢度好等特点，成为目前发展最快的 一种染料。然而在日新月异的今天，我们所面i 临的发展与环境保护的冲突日益尖锐。印 染行业中所产生的大量未处理或处理未达标废水的直接排放成为我国江河湖海的主要污染 源，其中含有大量被称为“环境荷尔蒙”的有害物质【2 j 。发达国家的环保部门已对染料生 产及使用厂家所排放废水的毒性提出了严格的限制要求 3 j ，毒性主要来源于废水中的染料 产品、副产物、合成中间体及无机盐等物质。蒽醌类染料废水含有较多的多环芳香族化合 物，具有c o d 、色度、酸度均较高，可生化性差，b o d 5 c o d 0 1 ，不易被氧化等特点， 成为难处理的工业废水，探索对它们盼有效处理方法已经成为现今国内外积极研究的课 题。 1 1 1 蒽醌染料废水的物理、化学处理方法 目前，蒽醌染料及其中间体废水的处理方法主要包括物理、化学法以及生物法。每种 方法各有利弊 4 1 ，表1 1 中列出了各种物理、化学法的优、缺点。尽管这些方法可以脱除颜 色，但往往成本很高且染料在浓缩污泥中的积累成为难处理的问题。过量化学物质的使用 也有可能造成二次污染。 表1 1 各种物理、化学方法的比较 t a b l e1 1c o m p a r i s o n so f e a c h p h y s i c a la n d c h e m i c a lm e t h o d 物理或化学方法优点缺点 吸附法 膜技术 混凝法 电解法 光催化氧化 臭氧氧化 处理染料种类多 能够去除所有染料 工程投资低、处理量大 对疏水性染料脱色效果很高 脱色率高达9 0 以上、运行费用低、 综合效果好、易于工程化 投药量少、残渣少 作用染料范围广、无污泥生成 装置简单、占地小、易于自动控制 2 吸附剂需要再生或处置 浓缩的污泥产生 水质变化适应性差、对亲水性的染料 脱色效率低、产生大量泥渣 单位电耗和铁耗大、铁屑易生锈、 铁泥处置困难、可行性及通用性一般 催化刹的回用及光源、催化剂的价格高 成本高、不适合大流量的废水处理 大连理工大学博士学位论文 处理蒽醌染料及其中间体的各种物理、化学方法的研究比较深入t 现将该领域研究的 最新进展进行简要概述。顾建忠等 5 1 用电子加速器进行辐照蒽醌染料溶液，可使染料溶液 达到完全脱色。辐照后溶液的带色基团吸收峰逐渐消失，染料分子中的带色基团已被降 解，辐照后染料溶液的c o d 明显减少，溶液中还原性污染物质大大减少，样品中有机物量 下降。詹伯君等旧用混凝沉淀法、微电池法、0 3 法对1 ，4 - 二羟基一5 ，8 - 二氨基蒽醌衍生物染 料废水进行预处理后，再用生物膜s b r 法和活性污泥s b r 法进行生化处理，处理后的废水 可达标排放。薛少华等 7 1 采用了微电解工艺处理高浓度葸醌染料生产废水，经过该工艺处 理的废水c o d 去除率达n t j 9 7 4 ，脱色率达n 9 5 9 ，基本可以实现达标排放。张耀斌等”j 采用流动态微波催化法处理含有酸性葸醌绿染料的废水，酸性葸醌绿染料的脱色率可以达 到8 0 。刘德启等【9 】采用稀土配合少量的双氧水氧化含有葸醌染料的废水，并使其发生耦 合形成聚集体，从而改变它们在废水中的溶解性和沉降性。 申哲民等【l0 】用分类归纳法分析了活性碳纤维( a c f ) 三维电极法和f e n t o n 试剂法对染料 废水的处理效果。结果表明，a c f 三维电极法对各类染料的脱色率都很高，对还原染料、 直接染料的总有机碳去除率较高，且效果稳定；f e n t o n 试剂法的效果受染料种类和结构的 影响较大，但对相似结构、相同种类染料的处理效果相似：对还原葸酮类染料废水的色度 去除率和t o c 去除率较差：对偶氮类染料的色度去除率$ i t o c 去除率较高。两种方法对染 料废水的适应性不同，但有一定的互补性。a y s e 每i k j k 1 1 】比较了激光、紫外光、u v + h 2 0 2 ( p h = 1 ) 、u v + h 2 0 2 口黔7 ) 对染料废水的脱色效果，发现u v + h 2 0 2 在p h = l 时脱色效果最 好。此外，紫外光的引入可以大大提高氧化荆的氧化能力。张晓等【1 2 】用树脂吸附法对1 ，4 二羟基葸醌生产废水进行处理研究，处理效果良好。 陈永森等【i3 】采用复极性固定床电解槽( b p b c ) 对水溶性染料的电解脱色进行了较系统 的实验研究。结果表明，b p b c 通过电氧化还原作用可以破坏偶氮、葸酿、三芳甲烷、杂 葸类、酞菁和金属络合各类染料分予结构中的发色共轭体系，而使染料降解脱色，染料的 分子结构及其空间构型对其电解行为有影响。许海粱等【14 】用复极性固定床电解槽对蒽醌染 料活性艳蓝k n r 、x - b r 、s n - 4 r 、弱酸艳绿g s 等进行电解处理研究。结果表明b p b c 可 以破坏染料分子结构中的发色共轭体系，色度$ 口c o d c ，的去出率分别达到9 8 和8 5 以 匕。 3 鞘氨醇单胞菌降解溴氨酸及强化体系d n a 指纹解析 1 1 2 蒽醌染料废水的生物处理方法 与物理、化学法相比，生物法不仅价廉，而且无二次污染，符合可持续性发展的需 要。据统计，生化法处理废水的成本为0 “1 0 元吨废水。因此，生物法被称为“环境友 善”的高效处理方法。2 0 世纪9 0 年代起，世界各国陆续开始了染料微生物降解的研究。 1 1 2 1 降解蒽醌染料的微生物资源 近年来，研究者已从活性污泥或其它环境样品中分离选育出多种对葸醌染料有降解作 用的特效菌，如表1 2 所示： 表1 2 降解葸醌染料的微生物资源 t a b l e 1 2 刑匮c m o r g a n i s m r e s o u r c e sf o r b i o d e g r a d a t i o no f a n t h r a q u i n o n ed y e s 微生物名称好厌氧葸醌染料名r 1 f 萼了两 假单胞菌 芽孢杆菌 酵母菌 白腐菌 青霉菌 a e 砌m d ，z 印g m 3 ，q 3 ，厌氧活性蓝 p s e u d o m a r s s p z 1 ，g m - i g 酸性绿 r h o d o c y c l u sg e l a t i n o s u sx l , - 1 活性艳蓝k n r b a c i l l u s s u b t i l i s 好氧p v - 1 2 b a c i l l u s g o r d o n a e d r - 1 5 b a c i l l u sb e m e o v o r n a s d ( 3 - 1 i b a c i l l u s s p 1 1 7 0 1 3 7 1 9 t e e t i l o n b l u e p i e h i a c m o m a l a 好氧分散红1 5 r h o d o t o r u l a h a r r i s o n s p 活性艳蓝k n r p c h r y s o s p o r i u m好氧 活性艳蓝1 5 cv e r s i c o l o r p v 1 2 b k v i f - 1 7 6 7 p e n i c i l l i u ms p g x 2 好氧活性艳蓝心恨 p e n i c i l l i u m s p x 5 酸性蒽醌蓝、分散蓝 p e n i c i l l i u mo x a l i c u mb x l 黄孢原毛平革菌p h c m e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m 好氧活性艳蓝k n r 2 9 】 1 1 2 2 常见蒽醌染料的生物降解 蒽醌染料的用量仅次于偶氮染料，按用途可分为酸性、活性、分散、还原蒽醌染料， 具有耐晒牢度强、颜色鲜艳两太优点，在红、紫、蓝、绿等深色染料中占有不可替代的重 要位置。常见的葸醌型酸性、活性或分散染料包括：酸性蓝、酸性绿、活性艳蓝、分散 红、分散蓝等a 活性艳蓝k n r 是一种产量很高、且较为常用的蒽醌染料，其化学结构式如 4 垌 耍 捌 刎 冽 5 7 争 1 5 叫 瞵 大连理工大学博士学位论文 图1 1 所示。活性艳蓝岫k 溶性强，是有毒、难降解有机污染物的代表，因此，国内外学 者大多数都以活性艳蓝鼢幔为模式底物进行相关化合物生物降解的研究。 c h 2 c h 2 0 s 0 3 n a 图1 1 活性艳蓝讯的化学结构式 f i g 1 1c h e m i c a l s t r u c t u r eo f b r i l l i a n tb l u ek n r y u 等【1 5 】在实际厌氧一好氧废水处理设备中分离了3 株优势假单胞菌属菌株( g m 3 、 q 3 、z i ) ，它们对难降解的葸醌染料如活性蓝，酸性绿的单独降解效果并不十分明显，降 解率约1 4 , - - 2 4 ；但g m 3 在与城市活性污泥混合降解作用中，活性蓝的去除率可达7 7 ，而 且脱色速率加快，时间缩短，适应范围也变得广泛。w a l k e r 等b t 研究了3 株不同细菌 ( b a c i l l u sg o r d o n a e ，b a c i l l u sb e m e o v o r a n s ，p s e u d o m o n a sp u t i d a ) 对酸性葸醌染料1 1 m r 的生 物降解和生物吸附作用，发现细菌对染料降解作用占主要地位，而1 9 的染料脱色现象是 由于t b 4 r 在菌体生物量上的吸附造成的。i t o h 等【1 8 】筛选出的枯草杆蘑渤c i l l u ss u b a l 谶够 以5 o 1 0 4 m o l l 的染料为唯一碳源生长。在温度为3 7 * ( 3 、p h 值为7 0 、摇床培养时，几乎能 使1 ，4 - 二羟基蒽醌f p w 2 ) ，1 - 氨基一4 - 羟基蒽醌( d r i o ，1 - 氨基一4 - 甲基葸醌0 9 0 1 1 ) 三 种染料完全脱色，而1 ，4 - 二氨基蒽醌不能脱色。h u 等【1 9 】从活性污泥中筛选出吸附能力较强 的细菌和酵母菌，它们能吸附葸醌染料，其吸附等温线符合f r e l m d l i c h 方程，吸附主要发生 在细胞壁。董新姣等刚从染料厂的污泥中筛选分离到一株染料脱色优势酵母菌了2 2 ，经初 步鉴定为红酵母属( r h o d o t o r u l ah a r r i s o ns p ) 对葸醌染料的脱色率可达9 4 3 1 以上。i t o h 等【2 “发现真菌c o r i o l u sv e r s i c o l o r 可降解葸醌染料p v l 2 ，在p h 7 0 ，温度2 4 ，摇床转速 1 2 0 r m i n 震荡培养1 4 天，降解率达1 0 0 。侯红漫等田】发现白腐菌糙皮侧尔p l e u r o t u s o s t r e a t u s 能够分泌胞外漆酶，该酶在1 2 4 , 时内对葸醌染料活性艳蓝k n r 的脱色率为7 0 ： 同时，添加小分子介体物质可使染料完全脱色。s o a r e s 等田】利用产漆酶白腐菌降解蒽醌染 料，脱色率较高。p o l m a n 等刚用1 0 株自腐菌对活性艳蓝l 咖t 废水进行脱色研究，结果发 现，它们对k n r 脱色的机理是生物吸附作用，脱色效果各不相同，最高可达到6 0 m g 染* q t g 生物量。 。5 鞘氨醇单胞菌降解溴氨酸及强化体系d n a 指纹解析 林晓华等口5 1 采用梯度平板筛选法，从染布厂废水池污泥中分离到l 株对葸醌染料k n k 有较强脱色能力的青霉菌p e n i c i l l i u ms p x 5 ，对活性艳蓝k n r 的脱色率在9 5 v a _ k ；采用海 藻酸钙和卡拉胶对青霉菌x 5 进行固定化，结果表明固定化青霉菌对k n r 有较好的脱色效 果。张书军等 2 6 1 研究了染料高效吸附菌( 青霉菌b x l ) 的生长条件及其对活性艳蓝k n r 的 吸附特性。结果表明，青霉菌b x l 生长分3 个阶段：孢子活化、线性生长和萄体自解。用培 养4 8 小时的活菌体吸附水中的1 0 0 m g l 的活性艳蓝k n r ，2 小时脱色率达9 3 7 ，2 0 时干 菌体对染料的最大饱和吸附量为1 5 9 m g g 。辛宝平等口7 】研究表明，青霉菌g x 2 x v j 4 种蒽醌染 料，溴氨酸、活性艳蓝k n r 、酸性蒽醌蓝和分散蓝吸附性能良好，对2 5 0 m g l 活性艳蓝 k n r 的吸附率高达1 0 0 ，对4 0 0 叫皿的k n r 吸附率也可达9 1 4 。 宋文化等口q 分离并考察了真菌n x l 对葸醌染料l t 及其中间体溴氨酸的作用，结果表 明，n x l 对于k n r 及溴氨酸有很好的絮凝效果，并利用优势菌株n d l 、n d 2 对葸醌染料 q r 及溴氨酸进行了脱色研究，并证明降解基因定位于质粒上。p a t r i c i o 等【j 1 1 实验发现，木 质素过氧化酶对蒽醌染料活性艳蓝 r 的好氧降解效果不太理想，反应经过2 4 小时，达到 5 0 的脱色率后，再增加酶量时，几乎观察不到进一步的脱色现象。肖继波等田】从广州某 印染厂生化处理池的污泥中筛选到l 株对葸醌染料具有高效吸附脱色作用的菌株h x 。考察 了碳源浓度、氮源浓度、盐度、染料浓度对蒽醌染料l o 限吸附脱色的影响。结果表明，对 于接入的生长菌体，碳源浓度高于7 5 9 l 时，染料才能完全脱色；染料对菌株瞰的生长有 一定抑制性，但菌株h x 仍表现出了优异的吸附性能，对于2 5 0 m g l 的k n r 可在4 8 小时内完 全脱色，4 0 0 m g l 组在7 2 小时内脱色率达9 4 ，6 0 0 m g l 组7 2 小时脱色率可达7 8 4 ：吸附 菌h x 的生长和染料脱色同步进行，菌体干重达最大时染料的脱色率亦达最大。 1 1 3 慧醌染料中间体溴氨酸的处理进展 几乎所有的蒽醌染料都是n 一羟基或氨基的衍生物，常见的葸醌染料中间体有：1 氨一 4 一溴蒽醌一2 - 磺酸滞称溴氨酸) 、l - 氨基葸醌、1 ，4 - - 氨基葸醌、i ，4 - 二羟基蒽醌、2 ，4 二 溴一1 - 氨基葸醌、1 ，5 - 二硝基一4 ，8 二羟基蒽醌及1 ，8 - 二硝基一4 ，5 二羟基葸醌等。其中， 溴氨酸是较为重要的一种合成中间体，本文着重阐述溴氨酸的生物降解研究进展。 1 1 3 1 溴氨酸的性质及应用 溴氨酸的化学名称为，l 一氮基一4 溴蒽醌一2 磺酸，分子式c t 4 h s o s n s b r ，常温下为红 色针状晶体，溶于水。主要是以氯磺酸或发烟硫酸作磺化荆经磺化1 氨基蒽醌，再溴化而 制得。 一6 大连理工大学博士学位论文 澳氨酸广泛用于合成蒽醌型分散染料、活性染料和酸性蒽醌染料等，其中，活性染料 是染料工业中重要的深色品种，国内现有活性艳蓝k n r 、s n - 4 r 、x - b r 、艳蓝k - 3 r 、弱 酸性艳蓝g a w 、r a n 、分散兰2 b l n 、k b k 、x - 3 r 、弱酸艳绿g s 等多个品种，年生产能 力近万吨 1 ，2 】。这些染料的生产中产生大量工艺废水，每生产1 吨产品约产生工艺废水1 5 吨 以上。出于该类产品及其生产所用原料均有较高水溶性，因此，其废水的色度和c o d 较 高，分别达至i j 3 0 0 0 - 7 0 0 0 倍和1 3 0 0 0 0 - - 4 0 0 0 0 m g l ，重金属铜含量则达3 5 0 r r 虮。 目前，国内溴氨酸活性染料一半以上由乡镇企业生产，因缺乏三废治理手段和设旋， 生产废水基本未经有效治理，造成了严重的环境污染和长期致污隐患。现有国内生产厂家 对其生产废水多数未经良好治理，对环境和江河造成严重污染。为此，研究制定经济合 理、实用有效的治理方法具有重要的现实意义和推广应用价值，应结合该系列染料生产废 水的实际特点设计治理方案以便达到预期的处理效果，从而协调环境改善和企业的长足发 展。 1 1 3 2 生物法处理澳氨酸研究进展 据文献报道，国外几乎没有单纯针对溴氨酸生物降解的报道，而国内主要有两所大学 对溴氨酸生物降解开展了一些研究工作，分别是南开大学和大连理工大学，表1 3 中列出 了高效溴氨酸的降解菌株。 表1 3 高效溴氨酸降解菌株 t a b l e1 3h i g he f f i c i e n ts t r a i n sf o rb r o m o a m i n ea c i dd e g r a d a t i o n 南开大学，辛宝平等口7 ，3 8 1 从受溴氨酸污染地筛选出菌株( s 3 ，它对溴氨酸有脱色作 用。菌株生长随着碳源浓度增加而增加，溴氨酸能刺激菌株生长，溴氨酸浓度达到 1 0 0 0 m g ，l 也能被菌株基本脱色。庄源益等。9 1 从污染地分离筛选出的菌株b x 2 6 对溴氨酸有 显著的降解脱色作用，降解过程受降解酶的控制。试验结果表明，降解酶为溴氨酸诱导的 7 鞘氨醇单胞菌降解溴氨酸及强化体系d n a 指纹解析 胞外酶，该酶在温度高于5 0 处理后失活，盐度高于l 会显著降低该酶活力，酶对溴氨酸 的催化脱色要有氧参加，氮气气氛中酶活受抑制。李莹等p 3 加】从化工厂污泥中分离至f j 4 株 假单胞菌属菌株，它们对溴氨酸有显著降解和脱色作用；随后，用聚乙烯醇( p v a ) 包埋 鞘氨醇单胞菌( s p h i n g o m o n a ss p n 1 ) ，对溴氨酸进行降解研究，固定化细胞降解溴氨酸的 降解率为9 9 。 大连理工大学黄丽萍等 4 1 】从溴氨酸生产车间的活性污泥中筛选到以溴氨酸为唯一碳、 氮源，并对溴氨酸有较强降解能力的菌株h p 3 。菌株降解溴氨酸的中间产物是邻苯二甲 酸，终产物为2 一氨基一3 一羟基一5 溴苯磺酸钠和2 ，3 - 二羟基一5 溴苯磺酸钠。金若菲等t 3 6 从 污泥中筛选出5 株对溴氨酸有较强脱色能力的菌株，经鉴定为假单胞菌属菌株。研究表 明，混合菌群可耐受溴氨酸的极限为5 9 ，l ，溴氨酸经微生物降解脱色后产生一新产物，此 产物的最大吸收波长为4 1 0 n m 。 1 1 3 3 蒽醍染料及溴氨酸的生物降解机理 蒽醌染料及其中间体大多属于稠环芳烃类化合物，因此，它们的生物降解机理比较复 杂。然而，任何化合物盼生物降解都遵循一般的规律，即代谢途径是由微生物分泌的酶催 化完成【4 2 删。稠环芳香化合物经微生物作用，最终分解为相应的单环芳烃被降解，如图1 2 所示。因此，对单环芳香化合物降解酶的深入理解有助于揭示稠环芳香化合物的降解机 理。 非酶重组 +