（遗传学专业论文）牛蛙生长激素基因克隆及其表达效应研究.pdf

四川i 大学博l + 学位论文 牛蛙生长激素基因克隆及其表达效应研究 遗传学专业 博士研究生龙章富指导教师刘世贵教授 摘要：动物生长激素( g r o w t hh o r m o n e ，g h ) 是由脑垂体间叶细胞分泌 的一种多肽激素，具有调节生长发育，参与体内代谢调节，增进食欲，提 高食物转化率等作用，然而垂体中生长激素含量极低，分离纯化比较困难， 使得生长激素生理功能的进一步研究和应用受到限制。随着现代生物技术 的发展，基因重组生长激素应用于研究和生产已经成为可能。研究表明， 基因重组的生长激素与天然的生长激素一样具有生物活性，但重组生长激 素蛋白应用于生产仍存在用量大、成本高、效果稳定性差等缺点。 随着d n a 疫苗研究的不断深入，质粒肌肉注射动物被证实能增强动 物的免疫能力，但生长激素基因在动物体内的转染表达研究却极少报道。 本研究首次以两栖动物牛蛙为研究对象，进行了其生长激素基因的克隆以 及原核表达质粒与真核表达重组质粒的构建、重组牛蛙g h 蛋白的生物活 性和免疫活性检测以及重组蛋白制剂和核酸制剂的制备及其体内促长作 用等表达效应研究，研究目的在于求证重组真核表达质粒是否能在牛蛙中 表达、其促长效应是否强于重组b 硒h 蛋白，为探索重组生长激素真核表 达质粒能否替代重组g h 蛋白作为动物促长基因制剂等研究奠定理论基 础。 首先，以成体牛蛙的脑垂体总r n a 为模板，进行r t - - p c r 扩增得 到约6 6 0 b p 的特异性p c r 产物带，切下琼脂糖凝胶中的特异产物带进行 c d n a 胶回收，将c d n a 与p m d l 8 一t 载体进行t a 克隆连接并转化到 d h 5 c te c o l i 后，进行菌落p c r 、质粒酶切鉴定，筛选出阳性菌株，测序 结果经b l a s t 分析，与已报道的牛蛙生长激素基因高度同源，证实此阳 性克隆为牛蛀生长激素基因转化子，命名为p b f g h 。克隆得到的牛蛀生 长激素基因b f g h 编码2 1 5 个氨基酸残基，分子量为2 4 9 k d a ，等f 乜点为 7 7 7 ；疏水氨基酸3 7 7 ，亲水氨基酸3 5 8 ，碱性氨基酸1 4 9 ，酸性氨撼 酸1 l6 。其1 2 5 a a 为b f g h 信号肽序列，与已有报道的牛蛙g h 信号肽 j 芋列完全。一致：2 6 2 1 5 a a 为成熟肽序列。b f g h 与p a n 等( 1 9 8 8 ) 报道的牛 蛀g h 相比在蛋白质序列( c a a 3 1 0 3 8 ，j s 0 0 3 7 ) 有9 4 的同源性，与 叫川人学博i 学位论文 t a k a h a s h i 等( 1 9 9 2 ) 报道的牛蛙g h 蛋白序列( a a b 2 4 7 9 2 ) 的同源性为 9 7 ，与k o b a l y a s h i 等( 1 9 9 1 ) 报道的牛蛙g h 蛋白序歹m j ( a a b l 9 4 2 8 ) 的同源 性为9 5 。本研究克隆的牛蛙生长激素基因b f g h 已在g e n b a n k 登记 ( a y 2 5 1 5 3 8 ) 。 采用双酶切牛蛙g h 基因c d n a 片断和原核表达载体p g e x l 一九t ， 将b f g hc d n a 定向插入到p g e x l - - x t ，经酶切鉴定后进行i p t g 诱导表 达研究。表达研究结果包括三方面，一是重组p g b f g h 在大肠杆菌中表 达的融合蛋白分子量为5 0 9 k d a ，符合推导分析的预期大小；二是诱导条 件的优化，在添加i m m li p t g 诱导表达3 h r s 就能得到高效表达，经定 量分析，牛蛙生长激素基因在大肠杆菌中的表达量可达到菌体总蛋白的 2 9 3 ；通过比较不同诱导时问和不同浓度的诱导剂用量等研究，结果表 明在i p t g 浓度为0 i m m l 时，3 7 诱导表达4 h r s ，其表达量与1 m m l 浓度的i p t g ，3 7 诱导表达3 h r s 的表达量一致，这为大量表达生产重组 牛蛙g h 蛋白时降低i p t g 用量、从而降低生产成本提供了理论依据。三 是重组b f g h 在大肠杆菌中的表达以形成包涵体的形式存在。 通过回收原核表达的牛蛙g h 重组蛋白( r e - b f g h ) ，并制各抗b 好h 的兔抗高免血清，采用牛蛙肝受体膜蛋白为吸附受体，以回收的重组牛蛙 生长激素融合蛋白为抗原，兔抗b f g h 高免血清为一抗，辣根过氧化物酶 标羊抗兔i g g ( h r p i g g ) 为二抗，进行e l i s a r a 检测，验证了回收 的重组牛蛙生长激素融合蛋白具有较强的生物活性和免疫活性。 以v r l 0 2 0 为载体，构建了牛蛙g h 真核表达质粒v b f g h 、草鱼g h 真核表达质粒v g c g h ，并以脂质体为载体进行了c o s 7 细胞转染表达实验。 在转染2 4 - - 7 2 h r s 后，对抽提的转染细胞总r n a 进行r t - - p c r 检测发现， 转染2 4 h r sv b f g h 在c o s 7 细胞中即有转录，并在7 2 h r s 时转录量最强； 以转染细胞培养液为抗原进行e l i s a - - r a 检测。转染2 4 h r s 、4 8 h r s 、7 2 h r s 的牛蛙生长激素表达量分别为2 5 4 0 n g m l ，5 8 6 7 n g m l 和7 3 4 7 n g r 0 1 。 为进一步验证牛蛙重组生长激素蛋白和真核表达质粒转染表达对牛 蛙的生物活性，进行脂质体包裹重组r e b f g h 蛋白、脂质体包裹v b f g h 质粒、脂质体包裹草鱼g h 真核表达质粒v g c g h 、脂质体包裹v r l 0 2 0 质粒对牛蛙体内促长效果的比较研究，并以脂质体包裹生理盐水为对照， 研究结果表明，脂质体包裹重组b f g h 蛋白、脂质体包裹v b f g h 质粒、 v g c g h 质粒和v r l 0 2 0 质粒均较对照组有明显提高牛蛀血清g h 含量的 作用，但以脂质体包裹重组r e b f g h 蛋白、牛蛙g h 真核表达质粒v b f g h 脂质体包裹组的效果最佳血清g h 含量的差异和增重幅度与对照达显著 水甲。 关键词：牛蛙，生长激素，丛 k l - 表达，效应，转染 些型叁兰堡! ：兰丝堡兰 m o l e c u l a r c l o n i n g t h ec d n a e n c o d i n g a d u l tb u l l f r o g g r o w t h h o r m o n ea n di t st ra n s g e n e tic e x p r e s s i o n e f f e c t so ne x p e r i m e n t a lb u l l f r o g m a j o r ：g e n e t i c s p h d c a n d i d a t e ：l o n gz h a n g f u s u p e r v i s o r ：l i us h i g u i a b s t r a c t ：a n i m a lg r o w t hh o r m o n e ( g h ) i sav e r yi m p o r t a n tp r o t e i nh o r m o n ew h i c hi s s e c r e t e db yt h ea n t e r i o rp i t u i t a r yc e l l sa n dp l a y sm a n y i m p o r t a n tr o l e so na n i m a l s ，s u c h a s r e g u l a t i n gs o m a t i cg r o w t ha n ds t i m u l a t i n ga p p e t i t e ，a f f e c t i n gv a r i o u sm e t a b o l i ca c t i v i t i e s a n di m p r o v i n gt h ef o o dt r a n s f o r m a t i o nr a t e ，e t c a l t h o u g hg hh a ss om a n yf u n c t i o n s ，i ti s l i m i t e di nt h ea p p l i c a t i o na n df u n c t i o n a lr e s e a r c h e sb e c a u s et h en a t u r a lg o w t hh o r m o n e c o n t e n ti sv e r yl o wa n dd i f f i c u l tt op u r l f y a l o n gw i t ht h e d e v e l o p m e n t o f b i o t e c h n o l o g y , w ec a no b t a i nl a r g ea m o u n to f r e c o m b i n a n t g r o w t hh o r m o n ep r o t e i nw h i c hs h o w s i th a v e t h es a m eb i o l o g i c a la c t i v i t i e so fn a t u r a lg h ，a n di t sw i d e l yr e p o r t e da p p l i c a t i o ns t u d i e s a r es h o w e dt h a tt h er e c o m b i n a n tg h p r o t e i n sc a l ls i g n i f i c a n t l ys t i m u l a t et h ee x p e r i m e n t a l a n i m a l sg r o w t ha n da p p e t i t ew h e ni ti s c o n t i n u o u s l ya n dl a r g ed o s a g e su s e do nt h e e x p e r i m e n t a la n i m a l se v e r yd a y a l t h o u g hd n av a c c i n er e s e a r c hs h o w ss t a b l ee f f e c to fe n h a n c i n gt h ei m m u n e r e s p o n s e sa n dt h ea b i l i t i e sa g a i n s td i s e a s e so nt h ee x p e r i m e n t a la n i m a l st h a ta r ei n j e c t e d w i t h a n t i g e ng e n e s r e c o m b i n a n tp l a s m i d s ，s u c hs t u d yo fg r o w t hh o r m o n eg e n ea r e s e l d o mr e p o r t e d a p p l i c a t i o n so fa n i m a l sg r o w t hh o r m o n ea r em o s t l ys t u d i e db ym e a n s o f p r o t e i nt y p e ，u pt on o w ，n oo t h e rr e p o r t sa b o u tg hg e n ed i r e c t l yu s e di na n i m a l sh a v e b e e nf o u n de x c e p to n ep a p e ra b o u tt h et r a n s f e c t i o no fh u m a ng h g e n ei n t om i c e ， i nt h i sr e s e a r c h ，w es t u d i e dt h ec h a n g e si nt h eb u l l f r o g sa f t e rt h e ya r es e p a r a t e l y i n j e c t e dw i t ht h er e c o m b i n a n tb u l l f r o gg hp r o t e i n ( r e - b f g h ) ，b u l l f r o gg hp l a s m i d ( v b y g ，g r a s sc a r pg hp l a s m i d ( v g c g 忉a n de x p r e s s i o nv e c t o rv r l 0 2 0w h i l et h e 08 5 s a i l - w a t e ra st h ec o n t r 0 1 f o rt h ep u r p o s e1 0d e t e r m i n et h ep o s s i b i l i t yo ft h a tt h e e u k a r y o t i ce x p r e s s i o np l a s m i dv b y g t la n dv g c g h a r ee x p r e s s e di na d u l tb u l l f r o g sa n d a f f e c tt h e i rg r o w t hr a t ea n dp l a s m ag h ，w e h o p et h er e s u l t sw i l lh e l pd e v e l o p i n gan e w a p p r o a c ht op r o m o t et h ea n i m a lg r o w t h m a i nw o r k sa n dt h e i r i m p o r t a n tr e s u l t s a r e 3 p u 川1 人学溥i 。学位论义 s h o w e da sf o l l o w i n g f i r s t l y t h e c d n ae n c o d i n gb u l l f r o gg hi sa m p l i f i e db yu s eo ft h et o t a lr n a ， e x t r a c t e df r o ma d u l tb u l l f r o g sp i t u i t a r y ，a st b et e m p l a t e ，pl ( 5 - c 鱼鱼丛a t gg c t t e ag g gt t ag g c ) a n dp 2 ( 5 - c 鱼鱼巡t 1 1 aa a a g g t g c ag t t g e t ) a s t h e p r i m e rp a i ra n do n ep a r t i c u l a rc d n ap r o d u c t 、6 6 0 b p ，w a so b t a i n e da f t e rt h er t - p c r t h e p r o d u c t w a sp u r i f i e db yu s i n gd n aa g a r o s eg e le x t r a c t i o nm e t h o d a f t e rt h e p u r i f i e d e d n aa n d p m d l 8 - tv e c t o r w e r e l i g a t e d a t1 6 co v e r n i g h t ，t h el i g a t i o n p r o d u c t sw e r et r a n s f o r m e di n t o e c o i ls t r a i nd h 5 0 ta n dt h e nt h et r a n s f o r m a n t sw e r e s c r e e n e db yc l o n ep e rm e t h o dt h er e c o m b i n a n tp l a s m i d sw e r ee x t r a c t e da n dt h e p o s i t i v ep l a s m i d ，n a m e dp b f g h w a sd e t e r m i n e db ye n z y m a t i cd i g e s t i o nm e t h o d a f t e r s e q u e n c i n go ft h ep o s i t i v ec l o n ea n da n a l y z e db yb l a s t o nl i n e ，i ti sp r o v e dt h a tt h e p o s i t i v eo n ei st h ef u l l - l e n g t hc d n ae n c o d i n gt h ep r e g ho fb u l l f r o ga n di te n c o d e sa d e d u c e dp e p t i d eo f2l5a m i n oa c i d s ( a a ) ，w i t hm o l e c u l a rw e i g h t2 4 9 k d a ，i s o e l e c t r i c p o i n ta t7 7 7 ，a n dh y d r o p h o b i ca m i n oa c i d s3 7 7 h y d r o p h i l i ca m i n oa c i d s3 5 8 b a s i ca m i n oa c i d s1 4 9 a n da c i d i ca m i n oa c i d s11 6 i tc o n s i s t so f2 5 a nm a k i n gu p t h es i g n a lp e p t i d ea n dt h e s i g n a lp e p t i d ei ss a m e a so t h e r b u l l f r o gg hg e n e o t h e r1 9 0a a c o n s t i t u t i n gt h em a t u r e - p e p t i d e i nt h el a a er s o m er e s i d u e sd i 髋rf r o mo t h e rr e p o t so n b u l l f r o gg h ，i nd e t a i l ，b 硒h i nt h i s s t u d ys h a r e s9 7 9 5 a n d9 4 a as e q u e n c e s i m i l a r i t y w i t ht h ek n o w n s e q u e n c e s f r o mo t h e r r e p o r t s t h a tt h e i r i d e n t i f i c a t i o n a c c e s s i o na r e r e s p e c t i v e l ya a b 2 4 7 9 2 ( t a k a h a s h in ，e ta 1 ，1 9 9 1 ) ，a a b l 9 4 2 8 ( k o b a y a s h it ，e ta 1 ，1 9 9 2 ) ，c a a 3 1 0 3 8 ( p a nf m ，e ta 1 ，1 9 8 8 ) n e wc l o n e db f g h g e n e a n di t sd e d u c e da m i n oa c i d ss e q u e n c ew e r ed e p o s i t e dt og e n b a n ku n d e rt h ea c c e s s i o n n u m b e r a y 2 5 1 5 3 8 ( p r o t e i n a c c e s s i o nn u m b e r a a p 0 4 3 5 6 ) s e c o n d l y ，t h ee x p r e s s i o no fb f g hi ne c o l ia n dp u r i f i c a t i o no ft h er e c o m b i n a n t b f l t hp r o t e i n ( r e b f g h ) h a v eb e e nd o n ea f t e rt h ep r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n p l a s m i d p g b f g hh a sb e e nc o n s t r u c t e d ap r e d o m i n a n tb a n dc o r r e s p o n d i n gt ot h ee x p e c t e ds i z e o fb f g hf u s i o np r o t e i n ( 5 0 9 k d a ) w a so b s e r v e di nt o t a lc e l le x t r a c ta n di n d i c a t i n gt h e e f f i c i e n ts y n t h e s i so fr e - b f g hw h i c ha c c o u n tf o r2 9 3 i nt h et o t a lp r o t e i na f t e re c o l i b l 2 l ( d e 3 ) p g b f g hc e l l sw e r ei n d u c e db y1m m li p t ga t3 7 3 h r s i ti sf o u n dt h a t t h ei p t gc o n t e n tc a nb ed e c r e a s e dt o0 1m m lw h e ni n d u c t i o nc o n d i t i o nb e i n g3 7 4 h r s ia n dt h e f u s i o np r o t e i nc a nr e a c h e dt h es a m ec o n t e n tw h i l et h e i n d u c e m e n ta t 1 0 m m l i p t g3 7 3 h r st h i sr e s u l ti n d i c a t e st h a tw e c a nr e d u c et h ei p t gd o s a g ea n d s o b r i n go u t al o ws p e n d i n gi nt h el a r g e s c a l e p r o d u c t i o nf o rt h er e b f g hp r o t e i n a n o t h e rr e s u l ti st h e b j g hp r o k a r y o t i c e x p r e s s i o np r o d u c t se x i s t e db y f o r m i n g i n c l u s i o n b o d i e si ne c o l ic e l l s t h i r d l y ，t h ea n t i - r a b b i tp l a s m aw a sp r e p a r e db yi n j e c t e dt h er a b b i tw i t h p u r i f i e d r e 。b f g h p r o t e i n t h e n ，t h eb i q a c t i v i t yo ft h ep u r i f i e dr e b f g i jw a sa u t l l e n t i c a t e db v e l i s a r aa s s a ya n di ti sd o n eb ya s i n gt h eb u l l f r o gh e p a t i cm e m b r a n er e c e p t o rd r o t e i n y t l 川j ( 学博l 学位论文 a st h es p e c i f i ca b s o r p t i v er e c e p t o rt h ep u r i f i e dr e c o m b i n a n tb u l l f r o gg h f u s i o np r o t e i n a st h ea n t i g e n ，r a b b i ta n t i r e - b f g hs e r aa st h ep r i m a r ya n t i b o d y ，a n dt h eh r p - s h e e pa n t i r a b b i tl g ga 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d s e p a r a t e l yw i t hv b j g h , v g c g h , v r l 0 2 0p l a s m i da n dr e c o m b i n a n tb u l l f r o gg h p r o t e i n c a no b v i o u s l yp r o m o t et h es o m a t i cg r o w t ha n dh e i g h t e np l a s m ag h c o n t e n t s ，b u ti ti s b e s tw h e nt h eb u l l f r o gg r o u p si n j e c t e dw i t hr e b f g hp r o t e i n c l so rv b f g h c l s a b o v ea l l ，an e wg e n ee n c o d i n gb u l l f r o gg hh a sb e e nc l o n e da n di ts h o w sl a r g e d i f f e r e n c e c o m p a r e d w i t ho t h e r r e p o r t s b f g hh a sb e e ne x p r e s s e dj ne c o l ia n d s y n t h e s i z e d 2 93 o ft h et o t a l p r o t e i n t h ep u r i f i e d r e b f g hf u s i o n p r o t e i n h a s b i o a c t i v i t i e sa n di m m u n o c o m p e t e n c et o b u l l f r o gh e p a t i cm e m b r a n er e c e p t o rp r o t e i n v b ) g hp l a s m i dc a nb et r a n s f e c t e di n t oc o s 7c e l l sa n df u r t h e rs t u d yi ne x p e r i m e n t a l b u l l f r o gs h o w e dt h ev b f g he n t r a p p e dw i t hc a t i o n i cl i p o s o m ec a no b v i o u s l ys t i m u l a t e t h es o m a t i cg r o w t ha n dh e i g h t e nt h ep l a s m ag hc o n t e n t so f b u l l f r o g s s ow ec o n c l u d e d t h a te u k a r y o t i ce x p r e s s i o np l a s m i dv b f g h e n t r a p p e dw i t hc l s c a np l a yag r e a t e rr o l ei n p r o m o t i n g t h eb u l l f r o gg r o w t ha sw e l la sr e b f g hp r o t e i nd o e s k e y w o r d s ：g r o w t hh o r m o n e ( g h ) ，b u l l f r o g ，g e n e e x p r e s s i o n ，e f f e c t ，t r a n s f e c t i o n 5 p q 川1 人学博l + 学位论文 前言 动物生长激素对动物体的生长、发育起着重要的调节作用，它在动物 育种和养殖生产中的应用一直受到研究者的关注。对生长激素( g h ) 的 研究大约已有一个世纪的历史。到目前为止，动物g h 的研究文献较多， 主要涉及g h 的分泌调节、基因序列、蛋白质结构、基因克隆与表达、转 g h 基因动物、重组g h 蛋白应用效果等领域；从研究对象来讲，哺乳动 物尤其是人的g h 和鱼类动物g h 的研究报道最多，而两栖动物和爬行动 物的g h 研究相对较少，国内在两栖和爬行动物g h 的研究还未真正起步。 1 生长激素的功能 动物生长激素是由动物脑垂体间叶细胞分泌的一种多肽激素，具有调 节生长发育，参与体内代谢调节，增强食欲，提高食物转化率等作用 ( h o u o w a y ，e ta 1 ，1 9 9 8 ) 。此外，生长激素还有调节渗透压的功能 ( h i r a n o ，1 9 9 1 ；s e d d i k i ，e ta 1 ，1 9 9 6 ) ，参与蛋白质、糖和脂肪的合成与代谢 ( 许克圣等，1 9 9 1 ) 。早期的实验发现切除垂体对大鼠、蛙、狗的体型大小能 产生巨大影响，如去垂体鱼的生长发育与体内蛋白质的合成随即停止，当 注射纯化的生长激素后，去除垂体的鱼又恢复生长，外源生长激素的接纳 对鱼体生长表现出补偿效应，提示动物垂体内存在促进身体生长的物质 ( p i c k f o r dg e ，1 9 5 4 ；许克圣等，1 9 9 1 ) 。 在硬骨鱼中，生长激素的促生长作用主要是作为新陈代谢的调控子元 件，促进脂肪更多地分解作为能源，使吸收的氨基酸更多地用于生长 ( h o l l o w a y a c e ta l ，1 9 9 8 ) ；提高饵料中蛋白质的转化效率，促进蛋白质 的合成( j o h n s s o nf l ，e ta 1 ，1 9 9 4 ：m a r k e r tj r ，e ta 1 ，1 9 7 7 ) ；对糖类代谢 的影响表现在可促进肝糖原的消耗( l e u l l gt c ，e ta 1 ，1 9 9 1 ) ，增强对碳水 化合物的利用能力。接受生长激素的鱼食欲增强，表现出更高的摄食率。 生长激素在鱼体内的多层次调节功能，有效地促进了鱼体的生长、发育 ( b j o r n s s o n ，b t ，1 9 9 7 ) 。鱼血液中生长激素含量的变化在l o 一1 0 0 n g m l ( w a g n e rg f , e ta 1 。1 9 8 6 ) ，注射外源生长激素导致受体鱼生长速度加快， 可能是通常情况下鱼体内尘长激索的量并没有达到饱和，以致外来的生长 激素有发挥作用的余地( d o n a l d s o ne m ，1 9 7 9 ) 。注射外源生长激素不仅能 加快受体鱼的生长。而且提高了对成水环境的适应l t ( k o m o u r a j i a nm e , e t a 1 ，1 9 7 6 ) ，其机制是提高了n a + 一k + a t p 酶的活性_ _ = 增加了氯化物细胞 的数目，抑制动物从淡水到海水迁移时引起的血浆渗透性和离予浓度的提 f f ：i ( s e d d i k i e ta 1 ，1 9 9 6 ) 。动物牛长激素和肝膜受体结合，健进j j i 。儿n ：一 肤 心川1 人学博l j 学位论文 岛素样生长因子一i ( i g f 1 ) m r n a 的表达，增加血液中i g f i 的含量 ( g r a ve s ，e ta 1 ，1 9 9 1 ) ，i g f i 直接促进细胞的分裂( s e h l e e h t e rn l ，e ta 1 ， 1 9 8 6 ) ，血液中i g f i 的含量同时对垂体g h 的分泌有反馈调节的作用。 生长激素与免疫细胞之间的关系密切：早在1 9 3 0 年，s m i t h 就发现大 鼠去除垂体后，胸腺即开始萎缩。后来越来越多的证据显示：( 1 ) g h 对t 淋巴细胞发育特别是在胸腺的发育阶段有促进作用；( 2 ) 在牛g h 转基因的 小鼠中，g h 的过量表达导致造血祖细胞的数量明显增加；( 3 ) 加入g h 的特 异性抗体或反义寡核苷酸能够阻止g h 对淋巴细胞的增殖作用。王辉等 ( 1 9 9 9 ) 和刘军喜等( 1 9 9 7 ) 还证实人淋巴细胞的g he d n a 及其启动子 的核苷酸序列与垂体的完全相同。 两栖爬行类生长内分泌学的研究主要是近1 0 多年来才发展起来的， 并且已经取得了一定的成就：但与哺乳类、鸟类和鱼类相比仍有很大差距。 在我国，目前尚少有这方面研究的报道。肖东和林浩然( 2 0 0 0 a ) 曾综述 了两栖和爬行类生长及生长激素分泌活动的调节研究现状。 目前还不清楚内源性g h 在两栖类幼体生长、发育和变态中的确切作 用。m c l e a ne 等( 1 9 9 3 ) 研究发现，在蝌蚪发育的后期，血液中内源性 g h 水平会不断升高，外源g h 可刺激变态前两栖类( 如林蛙、豹蛙、牛蛙 和肥责螈) 幼体一蝌蚪的生长，哺乳类来源的天然g h 也可以剂量依存的 方式促进变态后两栖类成体( 如皱蛙、海蟾蜍和西北蟾蜍等) 的快速生长； 并认为在幼体的生长发育( 尤其是肢的生长) 中g h 发挥特殊的作用。 k i k u y a m as 等( 1 9 9 3 ) 报道哺乳类g h 能促进蟾蜍幼体的生长，也 能促进牛蛙蝌蚪下肢的生长。同源性的牛蛙g h 对牛蛙下肢生长的影响没 有被证实，但纯化垂体来源的牛蛙g h 对变态后的牛蛙具有促生长作用， 而且还能促进去垂体小鼠的胫骨生长块的生长( f a r m e rs w e ta 1 1 9 7 7 ) 。 另外，p o l z o n e t t im a 等( 1 9 9 5 ) 发现g h 在控制蛙类卵黄发生方面也 起一定的作用。d a u g h a d a yw h 等( 1 9 8 9 ) 报道两栖类g h 的促生长作用 在很大程度上取决于肝脏和g h 的其它靶组织产生的类胰岛素生长因子 ( i n s u l i n - - l i k eg r o w t hf a c t o r s ，i g f s ) 。他们的研究显示：在两栖类同样存 在类似于其它脊椎动物的g h i g f 轴，i g f 至少能部分传递g h 的促生 长作用，s h u l d i n e r a r 等( 1 9 9 0 ) 在非洲爪蟾发现了两种非等位的i g f i 基因。 总体上讲，生长激素具有种属特异性，其它物种的生长激素对灵长类 包括人类不产生生物学效应，而人的生长激素普遍适用于其它动物( 包括 鱼类) 。生长激素的分泌受生长激素释放激素( g r o w t hh o r m o n e r e l e a s i n q h o r m o n e ，g h r h ) 匝调控，受生 激素释放抑制素( s o m a t o s t a i n ，s s ) 负渊控，呈脉冲式释放，在体内的半衰期为1 0 分钟左右。生长激豢的受 休除神经系统外，普遍存狰f 备利哆织内，尤其是j j t ：j l l i ! 组织特别丰富。此 外，它还能作用于 f i l i a l 素受体，i ，j 见生长激素是个多靶点的非常重要的 叫j 1 1 人学博l 学位论殳 ，卜物分子。 生长激素能引起一