（应用化学专业论文）罗丹明、荧光素、尼罗红及尼罗兰衍生物的合成及应用.pdf

摘要 本论文分别以罗丹明、荧光素、尼罗红和尼罗兰为母体，从改善罗丹明的荧 光量子产率、大斯托克斯位移和引入活性基团方面对其结构进行修饰；从改善荧 光素的荧光量子产率对p h 值的敏感范围、对光敏感的基团、特异选择性和大斯 托克斯位移方面对其结构进行修饰；从改善尼罗红和尼罗兰荧光量子产率和水溶 性方面对其结构进行修饰。利用紫外可见光谱和荧光光谱对这些衍生物进行性 能检测，从中筛选出性能优异的荧光探针，并应用在荧光微球的制备、亚硝酸根 离子的测定和细菌中聚羟基脂肪酸酯( p h a s ) 的检测方面。 设计合成了性能优异的烯丙基罗丹明b 、烯丙基荧光素、烯丙基尼罗红、不 对称罗丹明和吡咯烷基罗丹明s 五种荧光探针，并通过分散共聚和吸附的方法制 备了五种聚苯乙烯基质的荧光微球。通过环境扫描电子显微镜、激光扫描共聚焦 显微镜、荧光分光光度计、傅立叶转换红外光谱仪等仪器对制备的五种荧光微球 进行了表征，发现这五种荧光微球具有良好的分散性、高且稳定的荧光强度。研 究了这三种共聚荧光微球在四氢呋喃中的光谱性质，发现聚合在微球中的荧光探 针具有和自由荧光探针一致的性质。并对这五种荧光微球和相应的荧光探针在乙 醇中不同的荧光光谱，作了理论探讨。此外，在共聚荧光微球的表面引入了氨基 功能基团，并测定了氨基的含量。 设计合成了不对称结构的罗丹明衍生物，从中筛选出性能优异的荧光探针， 它是n 端刚化的7 羟基1 ，2 ，3 ，4 四氢喹啉不对称罗丹明。在酸性介质中，发现它 能和亚硝酸根离子进行反应，生成荧光强度低的产物，利用这种荧光淬灭的机理 建立了测定亚硝酸根离子的方法。此方法简单，具有良好的重复性、高的灵敏度 和选择性。使用此方法来检测水中痕量亚硝酸根离子，得到了满意的结果。 设计合成了两种具有活性基团的酰胺类荧光素衍生物，以期在生物分析方面 得到应用。光学性能研究的结果表明，酰胺类荧光素衍生物能提供多种吸收和发 射最大值，具有良好的特异选择性和光稳定性，大的斯托克斯位移，并适合在酸 性、中性和碱性环境下对生物体进行标记。 设计合成了底环上有氯、溴和羧基的罗丹明衍生物，在此基础上能设计出含 有活性基团、复杂结构和适合生物检测的罗丹明衍生物。合成了1 ( 5 荧光素) 2 ，4 ，6 三甲基吡啶筠高氯酸盐，由于其结构中含有阳离子可与生物体内负电中心 通过静电引力结合，有望通过进一步研究其荧光性能而在生物分析中得到应用。 设计合成了含有活性基羧基、氨基、羟基的尼罗红和尼罗兰衍生物，用来 标记生物分子。合成的水溶性尼罗红比文献报道的收率高，尼罗兰衍生物能用作 酸碱指示剂来测定细胞中的p h 值。此外，水溶性好的双羧基尼罗兰和尼罗红， 用来对细菌中的聚羟基脂肪酸酯进行染色，并通过荧光显微镜来鉴定聚羟基脂肪 酸酯的胶束，从而建立了简单、快速、高灵敏的染色方法。 关键词：荧光探针，荧光微球，不对称结构的罗丹明衍生物，亚硝酸根离子， 酰胺类荧光素衍生物，水溶性尼罗红和尼罗兰，聚羟基脂肪酸酯 a b s t r a c t b a s e do nr h o d 帅i n e ，f l u o r e s c e i n ，n i l er e da n dn i l eb l u ei nt h i st h e s i s ，r e s p e c t i v e ly ， r h o d a m i n ed e r i v a t i v e sw e r ed e s i g n e da n ds y n t h e s i z e di no r d e rt om o d i 6 c a t et h e i r f l u o r e s c e n c eq u a n t u my i e l d ，t h el a 唱es t o k e ss h i ra n di n c o r p o r a t er e a c t i v eg r o u p s f 1 u o r e s c e i nd e r i v “v e sw e r ed e s i g n e da n ds y n t h e s i z e di no r d e rt om o d i f i c a t e p h - s e n s i t i v er a n g e ，l i 曲t - s e n s i t i v eg r o u p ，b i n d i n gs p e c 讯c i 够a n dt h el a r 萨s t o k e ss h i r n i l er e da n dn i 】eb l u ed e r i v a t i v e sw e r ed e s i g n e da n ds y n t h e s i z e di no r d e rt o m o d i n c a t ef l u o r e s c e n c eq u a n t u my i e i da n dw a t e rs o l u b i i i 够t h e nf l u o r e s c e n c e p r o p e r i t i c so ft h e s ed e r i v a t i v e sw e r ei n v e s t i g a t e db yu v 二v i ss p e c t r aa n df l u o r e s c e n c e s p e c t r a ，a n dt h eb e t t e rf l u o r e s c e n tp r o b e sw e r es e l e c t e da n da p p l i e di nt h ep r e p a r a t i o n o ff l u o r e s c e n tm i c r o s p h e r c s ，t h ed e t e m i n a t i o no fn i t r i t ei nw a t e ra n dt h ed e t e c t i o no f p o l y h y d r o x y a l k a n o a t e so fb a c t c r i a a 1 1 y lr h o d a m i n eb ，a l l y lf 】u o r e s c e i n ，a l l y ln i l er e d ，a s y m m e t r i c a 】r h o d a f l u o ra n d p y n o l i d i n y lr h o d a m i n esw e r ed e s i g n e da n ds y n t h e s i z e d a n dt h e nt h e yw e r eu s e di n t h e p r e p a r a t i o no fp o l y s 够r e n e - b a s e df l u o r e s c e n tm i c r o s p h e r e sb yt h ed i s p e r s i o n c o p o l y m e r i z a t i o na n da b s o 叩t i o nm e t h o d t h e s en u o r e s c e n tm i c r o s p h e r e sw e r e c h a r a c t e r i z e db ye n v i r o n m e n t a ls c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y ，l a s e rs c a n n i n gc o n f o c a l m i c r o s c o p y ， n u o r e s c e n c e s p e c t r o p h o t o m e t 巧 a n df o u r i e r 仃a n s f o 珊i n f r a r e d s p e c t t o m t i t e r t h e y e x h i b i t e dg o o dd is p e r s i o na n ds t a b l ea n dh i g hf l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y s p e c t r a l p r o p e r t i e s o fc o p o l y m e r i z a t j o nf l u o r e s c e n tm i c r o s p h e r e si n t e n a h y d r o f u r a n i n d i c a t e dt h e s ei n d i v i d u a lc h a r a c t e r i s t i c so fl a b e 】ss h o u l db e m a i n t a i n e di nt 1 1 en u o r e s c e n tm i c r o s p h e r e s t h ed i f f e r e n c e so ft h ef l u o r e s c e n ts p e c t r a b e t w e e nf i v ef l u o r e s c e n tm i c r o s p h e r e sa n dt h e i r c o r r e s p o n d i n gp a r e n t l a b e l si n e t h a n o ih a db e e n i n v e s t i g a t e d f u r t h e r m o r e ， c o p o i y m e r i z a t i o n f l u o r e s c e n t m i c r o s p h e r e s w e r e 如n c t i o n a l i z e dw i t ha m i n og r o u p s ，a n dt h ea m o u n to f 狮i n o g r o u p sw a sd e t e 加i n e d as e r i e so fa s y m m e 仃i c a lr h o d a m i n ed e r i v a t i v e sw e r ep r e p a r e da n ds e l e c t e dt h e b e t t e rn u o r e s c e n tp r o b e s t h e yw e r ens t e e l e da s y m m e t r i c a lr h o d a m i n ec o n t a i n i n g 7 - h y d r o x y - l ，2 ，3 ，4 一t e 仃a h y d r o q u i n o l i n e ，w h i c hh a dah i g hf l u o r e s c e n c eq u a n t u my i e l d a n dl a r g es t o k e ss h 氘1 1 1 e yc a nr e a c tw i t hn i t r i t ei na na c i d i cm e d i u mt of o r n la n i t r o s op r o d u c t w h i c hh a dm u c hl o w e rf l u o r e s c e n c e t h e r e f o r e 。t h em e t h o df o rt r a c e n i t r i t e sw a sd e v e l o p e d ，w h i c hw a ss i m p l e ，s e n s i t i v ea n ds e l e c t i v e t h i sm e t h o dw a s a p p l i e dt ot h ed e t e m l i n a t i o no fn i t r i t ei nt a pw a t e ra n dl a k ew a t e rw i t hs a t i s f a c t o 巧 r e s u l t s 7 1 1 w ok i n d so fx a n t h a m i d ef l u o r e s c e i n d e r i v a t i v e sw i t ha c t i v e g r o u p sw e r e p r e p a r e d ，w h i c hc a nb eu s e di nb i o l o g i c a la n a l y s i s t h er e s u l t so ft h e i rf l u o r e s c e n t p r o p e r t i e ss h o w e dt h a tt h e yc a no f f e raw i d ev a r i e t yo fa b s o r p t i o na n de m i s s i o n m a x i m u m s a n dt h e yh a de x c e l l e n tb i n d i n gs p e c i 行c i 妙a n dp h o t o s t a b i l i t ya n dl a r g e s t o k e ss h i r i na d d i t i o n ，t h e yc a nb ee m p l o y e da sab i o l o g i c a lf l u o r e s c e n c et a gi n a c i d i c n e u 仃a la n da l k a li n ee n v i r o n m e n t s i 抽o d a m j n ed e r i v a t i v e sw i t hc h j o r i n e ，b r o m i n ea n dc a r b o x y lg r o u po nt h eb o t t o m r i n gw e r ep r e p a r e d o nt h i sb a s i s ，t h ec o m p l i c a t e dr h o d a m i n ed e r i v a t i v e sw i t h r e a c t i v eg r o u pc a nb ed e s i g n e df - r o mt h e m ，w h i c hw o u l db es u i t a b l ef o rb i o l o g i c a l d e t e c t i o n 1 一( f l u o r e s c e i n - 5 一y 1 ) - 2 ，4 ，6 一t r i m e t h y l p y r i d i n i u mp e r c h l o r a t ew i t hp o s i t i v ec h a 唱e w a sp r e p a r e d ，i tc a nc o m b i n ew i t hb i o m 0 1 e c u l e sw i t h n e g a t i v ec h a r 莎t h r o u 曲 e l e c t r o s t a t i ca t t r a c t i o n i tw o u l db e a p p l i e d i n b i o l o g i c a la p p l i c a t i o n sb y t h e f l u o r e s c e n c ea n a l y s i s n 订er e da n dn i l eb l u ed e r i v a t i v e sw i t hc a r b o x y lo r 踟i n o0 rh y d r o x y lg r o u pw e r e s y n t h e s i z e d ，w h i c hw e r eu s e dt ot a gb i o l o g i c a lm o l e c u l e s t h ed i c a r b o x y l i ca c i dn i l e r e dh a dt h eb e t t e ry i e l dt h a nt h a tw a sr e p o r t e d ，n i l eb l u ed e r i v a t i v e sw e r ef o u n dt ob e c l e a rp h d e p e n d e n ta n dc o u l db eu s e da sa c i d - b a s ei n d i c a t o r st om e a s u r ei n n i a c e u u l a r p h i na d d i t i o n ，t h ed i c a r b o x y l i ca c i dn i l er e da n dn i l eb l u ew i t hg o o ds o l u b i l i qi n a q u e o u sm e d i aw e r eu s e dt od e v e l o pas i m p l e ，q u i c k ，s a f e ，h i g h l ys e n s i t i v es t a i n i n g m e t h o dt od e t e c tp 0 1 y h y d r o x y a l k a n o a t e so fb a c t e r i a ，w h i c hw a sc o n f i n n e db y n u o r e s c e n c ei m a g e so f p 0 1 y h y d r o x y a l k a n o a t e sg r a n u l e so fb a c t e r i a k e yw o r d s ：f l u o r e s c e n tp r o b e ，f l u o r e s c e n t r h o d a m i n ed e r i v a t i v e s n i t r i t e d e r i v a t i v e s w a t e r s o i u b l e p o l y h y d r o x y a l k a n o a t e s m i c r o s p h e r e s ，a s y m m e 仃i c a l i o n x a n t h a m i d ef l u o r e s c e n t n i l er e dd e r i v a t i v e s 前言 1 l j l 日茜 荧光分析方法因其灵敏度高、选择性好和试样量少，在分析化学，特别是在 生物分析中有较广泛的应用。由于大多数生物分子本身无荧光或荧光较弱，检测 灵敏度较差，因此人们用强荧光的标记试剂或荧光生成试剂对待测物进行标记或 衍生，生成具有高荧光强度的共价或非共价结合的物质，使检出限大大降低，这 就是荧光探针技术。随着生物技术的不断发展，荧光探针技术已经在蛋白质、核 酸、细胞检测及免疫分析等方面显现出巨大的潜能。尤其近年来发展起来的荧光 化学传感器和分子信号系统更是使荧光探针技术的应用有了很大程度的提高和 扩充。如今，它的应用已深入到药物学、生理学、环境科学、信息科学等诸多领 域。随着生命科学的飞速发展，对活性高、特异选择性好、灵敏度高的新型荧光 探针的需求就显得越来越迫切了。 目前，用于标记或衍生的荧光探针主要有罗丹明类、荧光素类、嗯嗪类、邻 苯二甲醛类、香豆素类、萘酰亚胺类等，前三类荧光探针在生物研究领域中占有 极其重要的位置，一直是化学及生物分析领域中的研究热点。 作为广泛应用的标记物，罗丹明具有光稳定性好、对p h 值不敏感、波长范 围宽、荧光量子产率高等优点。但其缺少与生物分子结合的活性基、斯托克斯位 移小和亲脂性差。荧光素具有高的消光系数、激发和发射波长都在可见光区、在 水中具有较高的荧光量子产率、无毒、成本低等优点。但它的荧光量子产率对 p h 敏感、斯托克斯位移小、具有对光敏感的基团、特异选择性和亲脂性差。嗯 嗪类尼罗红和尼罗兰衍生物是近红外荧光探针，具有合成比较容易、分子较小等 优点，尼罗红是对溶剂敏感的脂溶性探针，尼罗兰有好的光化学稳定性和强的摩 尔吸收。但低的荧光量子产率和差的水溶性，限制了它们在生物技术上的应用。 本论文针对罗丹明类、荧光素类、尼罗红和尼罗兰类荧光探针的性能缺陷， 通过引入不同功能的化学基团对这三类荧光探针的结构进行了修饰，使其更有利 于对生物体进行分析检测。利用紫外可见光谱和荧光光谱对这些衍生物进行了 性能检测，从中筛选出性能优异的荧光探针，将其应用在荧光微球的制备、亚硝 酸根离子的测定和细菌中聚羟基脂肪酸酯的检测方面。并提供了新的研究方法和 理论，具有重要的研究价值。 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得墨注盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：烈赢痉 签字日期： 奶。7 年乡月弓) 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解墨壅盘堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权鑫注盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：焱赢窿 导师签名： 侈荔矽 签字日期：幺研年岁月司日签字日期：名斫年占月；j 日 第一章文献综述 第一章文献综述 分子荧光是激发态分子衰变到基态的过程中所伴随的一种发光现象，分子的 荧光光谱特性可用来作为定性和定量分析的手段。荧光分析法就是在此基础上发 展起来的一种分析方法，由于它具有灵敏度高、线性动态分析范围宽、所需试样 量少、方法简便快速且选择性好等种种优点，愈来愈受到人们的关注。二十世纪 7 0 年代以来，在其它学科的迅速发展和推动下，随着激光、计算机和电子学等 诸方面的新技术成就的引入，大大加速了各种新型荧光分析仪的问世和各种荧光 分析新方法、新技术的发展，例如荧光检测与色谱法联用、阴离子荧光光谱法、 微分或导数荧光法、多维荧光光谱法、同步荧光法、同步导数荧光法【l j 、偏振荧 光法、相分辨与时间分辨荧光光谱法、免疫荧光监测、固体表面检测、催化和非 催化动力学荧光、激光诱导荧光光谱法等。这些新兴复合联用方法和技术的出现 有力地推动了荧光分析法在理论和应用方面的发展，使荧光分析法不断朝着高 效、痕量、微观和自动化方向推进，不断地拓宽其应用领域1 2 j ，已广泛应用于化 学、化工、生物、医药、卫生、农业、轻工、冶金、地质以及环境保护等各个领 域中【3 】，尤其是在生物分析中有更广泛的应用【4 剖。 随着生物技术的不断发展，对蛋白质、核酸及细胞标记的要求越来越高，传 统的同位素标记方法己不能适应当今的发展。而发展起来的荧光探针技术已经在 蛋白质、核酸、细胞检测及免疫分析等方面显现出巨大的潜能【7 。2 1 。荧光探针技 术具备高度灵敏性和极宽的动态响应时间，可以使研究人员高灵敏和高选择性地 检测复杂生物分子，包括活细胞中的特定成分。尤其近年来发展起来的荧光化学 传感器和分子信号系统更是使荧光探针技术的应用有了很大程度的提高和扩充。 目前用于标记或衍生的荧光探针主要有罗丹明类、荧光素类、邻苯二甲醛类、 嗯嗪类等化合物。其中罗丹明、荧光素、嗯嗪及其衍生物在生物研究领域中占有 极其重要的位置，一直是化学及生物分析领域中研究的热点1 13 。1 9 j 。 1 1 荧光概述 当紫外或可见光照射到某些物质上时，这些物质就发射出波长和强度与照射 光不同的光线，停止照射光照射时，这种光线马上或逐渐消失，这就是荧光。 最早记录荧光现象的是1 6 世纪西班牙的内科医生和植物学家n m o n a r d e s 。 第一章文献综述 1 5 7 5 年，他提到在含有种称为“l i g n 啪n e p h r i t i c u m ”的木头切片的水溶液中， 有天蓝色出现。1 7 世纪，b o y l e 和n e w t o n 等著名科学家再次观察到荧光现象， 并且给予了更详细的描述。虽然在1 7 世纪和1 8 世纪中还发现了其他一些发荧光 的材料和溶液，但是在解释荧光现象方面却几乎没有进展，对荧光的产生原理和 条件直到1 9 世纪中期才清楚。s t o k e s 在1 8 5 2 年详细考察了奎宁和叶绿素的荧光 后，发现它们的荧光波长比照射光的波长要长，认定是物质吸收光后重新发射出 的光，并且波长不同，荧光是发射光就这样被证实了。根据“萤石”能发出这种 光，提出了“荧光这一名称。此外，s t o k e s 还对物质的荧光强度与浓度之间的 关系进行了研究。从18 6 7 年，g o p p l e s r o d e r 采用桑色素为荧光试剂通过荧光分 析检测铝。到2 0 世纪初，人们已经知道包括荧光素、稠环芳烃及曙红等在内的 6 0 0 余种化合物有荧光。随后，w a 、v w i l 】o u s 在19 2 4 年进行了荧光产率的测定， 1 9 2 6 年g a v i l a 又对荧光寿命进行了测定。时至今日，由于荧光的高灵敏度和高 选择性，荧光分析法及荧光检测已经成为分析化学中的一类重要方法【2 0 1 。 1 1 1 荧光的发光原理 荧光是处在激发态的分子和原子返回基态过程中伴随着放射出来的一种光 能。荧光产生的过程如图1 1 所利3 1 。一般来说，荧光试剂分子处于基态，吸收 光以后，试剂分子处于电子激发态，基态和激发态都有单重态和三重态两类，大 多数有机物分子的基态是处于单重态的。以s o 、s l 、s 2 分别表示分子的基态、第 一激发单重态和第二激发单重态，能量由低到高。用t l 、t 2 分别表示三重态的第 一激发态和第二激发态。分子中的电子从基态单重态s o 跃迁至激发单重态s 1 、 s 2 比较容易发生，进行很快( 约1 0 4 秒) ，而从基态单重态到激发态三重态却 不易发生。高能量的单重激发态分子( s 2 ) 可以与其它同类分子或溶剂分子碰撞 通过内转换( 无辐射跃迁) 回到激发态的最低能级s 1 ，这一过程为1 0 。1 2 秒，处于 激发态最低能级的分子寿命一般为1 0 4 l o 。8 秒，它们会放出光子返回基态，这时 产生的光就是荧光。即最低激发态单重态分子s l 回到基态s o 会产生荧光。从s 1 到 t 1 能量转化是体系间跨越( i n t e r s y s t e m c r o s s i n g ，i s c ) 。从t 1 回到s o 包括两种过程， 一种是体系间跨越，无能量释放：另一种是放出光子，即磷光，在1 0 4 1 0 秒内 完成。 第一章文献综述 单重态s三重态t j1 s 2 ，1 ，n1r n ”、 ， jl 厂： jl 1r 1 s c jl ，n 久。 3 0 0n m ) 使其在荧光免疫分析中被用来标识抗体或在d n a 杂交 中作d n a 探针。酞菁类染料的缺点是合成中溶解度小、体积大，会影响生物分 子其他性制3 8 j 。 ( 5 ) 咕吨类罗丹明、荧光素 罗丹明、荧光素类染料都属于咕吨类染料。罗丹明类染料是以罗丹明为母体， 经过多种官能团进行修饰的系列衍生物。罗丹明类染料的荧光量子产率较低，而 其最大吸收和发射波长较长，一般在6 0 0m 左右，受样品背景干扰相对较少， 是常用的荧光探针。荧光素类染料母体结构为荧光素，具有较好的荧光量子产率 以及良好的水溶性，荧光素最大激发波长在5 0 0n m 左右，适用于氩离子激光器 的4 8 8n m 光谱线，但存在斯托克斯位移小，容易光致褪色，光猝灭率高，p h 敏 感性强等缺点【3 圳。 ( 6 ) 噻嗪和嗯嗪类 目前常用的噻嗪和嗯嗪类探针主要有亚甲基蓝、尼罗红、尼罗蓝、嗯嗪7 5 0 等。亚甲基蓝是一种具有平面结构的碱性生物荧光探针，在医学临床诊断及化学 分析中已有较长的应用历史。常用的近红外荧光染料噻嗪类和嗯嗪类均含有可用 来进行标记的氨基基团，且嗯嗪类染料在水中溶解度较小。尼罗红类荧光探针受 溶液极性影响较大【4 0 1 ，如尼罗红衍生物氨基吩嗯嗪马来酰胺( a p m ) 就被用于 检测蛋白质中氨基酸残基微环境的变化；尼罗兰3 位氨基共价键合氨基酸后，可 检测胰岛素酶、亮氨酸氨肽酶等水解蛋白酶的活性1 4 。 在众多有机荧光探针种类中，用于标记或衍生的咕吨类和嗯嗪类荧光探针在 第一章文献综述 生物领域的研究中占有重要的位置，一直是化学及生物分析领域中的研究热点。 1 3 罗丹明、荧光素、尼罗红和尼罗兰类荧光探针概述 1 3 1 罗丹明类 罗丹明及其衍生物是一种以氧杂蒽为母体的碱性咕吨染料，是一类具有强荧 光，且有高激光输出效率的染料，它们的发色团是带有3 ，6 位取代氨基及其衍生 物的氧杂葸母体( 简称顶环) 。两个芳环由“氧桥 相连，碳与氧处在对位上形 成个六元环，分子中具有一个很长的共扼体系，具有刚性平面结构。这种结构 容易吸收入射光的能量而发射长波，并且可以减弱分子内部的热运动，使激发态 能量的耗损降低，从而产生强烈的荧光。氨基氧杂蒽型衍生物的发色团是铵离子 和氧箱的共振杂化体系( 1 6 ) ，核磁共振研究表明罗丹明探针中的氧杂蒽型分子 3 ，6 位的氮原子上带有不大的正电荷，9 位碳原子也参与共轭7 c 电子体系。 r 4 r 3 n o n r l r 2r 4 r 3 n - - - - - - - - - - - - - o r n r l r 2 1 6 3 ，6 位取代氨基及其衍生物的扭转运动会对染料的荧光量子效率产生较大 的影响。9 位上的碳原子与芳环相连，比较活泼，容易发生氧化、还原等反应， 它可有以下几种存在形式( 1 7 ) ： 弋z 占 iii 醌式隐色体内酯及其它 1 。7 第三芳环( 简称底环) 可通过活性基与蛋白质、核酸等生物大分子及组成 单体分子中的n h 2 ；o h ；s h 等形成共价键，其荧光特性发生变化，得到的标 记物具有稳定、选择性和灵敏度较好等优点，从而可反映有关大分子结构和性能 的信息，为荧光分析和光度分析奠定了理论基础。 有关罗丹明类荧光染料的合成、离子化及结构、光学特性及分析等方面的 报道已有很多4 2 。5 0 】。与其它常用的荧光染料相比，罗丹明类荧光染料具有光稳定 性好、对p h 不敏感和较高的荧光量子产率等优点，因此是分析化学和生物医药 科学等生物技术领域中最常用的荧光染料【5 1 枷1 。 第一章文献综述 1 3 2 荧光素类 荧光素及其衍生物也属于咕吨染料。荧光素1 8 ( n u o r e s c e i n ) 又称荧光黄， 化学名称为3 ，6 - 二羟基螺 异苯并呋喃1 ( 3 h ) ，9 一( 9 h ) 咕吨一3 一酮】或9 - ( 邻羧苯 基) 6 羟基一3 h 咕吨3 酮。由于氧桥键把两个苯环固定在一个平面上，使分子具 有刚性共平面结构，在激发光的作用下能产生强烈的荧光。 ho hh o 1 8 荧光素具有高的消光系数，激发和发射波长都在可见光区，在水中具有较高 的荧光量子产率，无毒，成本低等优点1 6 1 1 。白1 8 7 1 年b a y e r 首次合成出荧光素 至今一百多年的时间仍然被广泛地应用于研究蛋白质的结构特性，但其所具有的 特定属性也限制了它在许多研究领域中的进一步应用。如( 1 ) 较小的斯托克斯 位移，使得样品背景对荧光的干扰相对较大【6 2 】；( 2 ) 荧光量子产率对p h 值敏感 【6 3 1 ，在生物体内的生理环境下荧光量子产率降低；( 3 ) 具有对光敏感的基团，在 强光检测下容易分解【6 4 6 5 】；( 4 ) 亲脂性差，难以透过细胞膜，因而用于细胞的研 究效果差；( 5 ) 特异选择性差。 1 3 3 尼罗红和尼罗兰类 用n 原子取代咕吨类染料的中心碳原子，可得到嗯嗪类染料。由于n 原子 的吸电子作用，能使波长红移8 0n m ，但同时造成了量子产率和摩尔消光系数的 下降。探针的结构如下( 1 9 ，1 1 0 ) ： r 3 吣，二g r 3 2 0 h 。h n e r e d 1 9 叩，n 顾 n eb l u e 1 1 0 e r 3 艮c l 尼罗红和尼罗兰衍生物是近红外荧光探针，在生物技术上已得到广泛的应用 【舔7 3 1 。尼罗红是对溶剂敏感的荧光探针，常用来对细菌或细胞中的脂滴进行染色 【7 4 琊】，但差的水溶性，限制了它对大部分生物分子的标记。尼罗兰有好的光化学 第一章文献综述 稳定性和在红外区域有强的摩尔吸收，在生物分析中有潜在的应用价值。然而尼 罗兰在含水的环境中易团聚在一块，也限制了它在生物技术上的应用【4 4 1 。 1 4 罗丹明、荧光素、尼罗红和尼罗兰的结构修饰及在生物分析中的 应用 1 4 1 罗丹明的结构修饰及在生物分析中的应用 为了改善罗丹明的性能，人们通过引入不同的官能团对罗丹明的结构进行修 饰，设计合成了许多罗丹明类衍生物( 其中r 1 ，r 2 ，r 3 ，r 5 ，r 6 ，r 7 ，可以为氢、 烷基、氨基、卤基、羟甲基、磺酸基、烯烃基、杂环化合物等各种基团；r 9 ，r l o 可以为羧基、酯基、酰胺基、异硫氰酸酯基、琥珀酰亚胺酯基、酰卤基等活性基 团) 。这些修饰弥补了罗丹明的某些功能缺陷，使其更有利于分析检测生物体。 下面针对罗丹明不同性能的改进及其在生物分析中的应用进行简要介绍。 r 4 r 1 0 1 1 1 1 4 1 1 罗丹明亲脂性的改进及在生物分析中的应用 j a r o m i r 等人【7 7 1 发现罗丹明探针与d n a 或蛋白质的结合与其亲脂性线性相 关。由于罗丹明结构中两个氨基斥电子能力强，在极性溶剂中易形成氢键，易溶 于水，亲脂性差【2 0 ，7 8 1 。为了提高罗丹明的亲脂性，国内外学者进行了大量的研究， 设计合成了许多具有强亲脂性的罗丹明衍生物。 研究表明，酯化的罗丹明能显著提高其亲脂性，容易被细胞所吸收，更适于 研究细胞特性及细胞内环境。在罗丹明c ：位引入憎水基团，如将罗丹明b 中 c o o h 酯化成乙基罗丹明b 中的c o o c 2 h 5 ，可使缔合物的亲脂性和稳定性大为 增加，有实验证明憎水基团的亲脂性随其重量的增加而增加，即所谓的“加重效 应”【7 9 1 。 通过对罗丹明氨基进行修饰也可以提高其亲脂性，如烷基取代可以提高其衍 生物穿透细胞膜的能力【8 0 8 。如下图所示，罗丹明1 1 0 ( 1 1 2 ) 穿透细胞的能力 比较弱，s u i 等人【8 2 吲入了亲脂性烷基，得到其衍生物1 1 3 和1 1 4 ，其具有很好 第一章文献综述 的亲脂性和细胞穿透性。 h i r n _ n r 1 1 2r ：h ，1 1 3r 1 c h 2 ) 书h3 - 1 1 4r 、o 一( c h 2 h c h 3 o 1 4 1 2 罗丹明荧光量子产率的提高及在生物分析中的应用 荧光量子产率对生物分析的灵敏度和精确度有很大影响，是衡量荧光探针的 一个重要的参数。罗丹明取代基的位置和数量对其荧光量子产率有很大影响。只 有一个推电子取代基，且处于空间位阻最小或无空间位阻的位置时，可使荧光增 强，光量子产率提高。 l o u i s 等人【8 3 1 合成了光敏化的罗丹明衍生物1 1 5 ，它既保持了罗丹明特点， 又提高了荧光量子产率。 h 2 n 1 1 5 c l a u d i n e 等人【8 4 】合成了罗丹明6 g 衍生物1 1 6 ，这种衍生物在咕吨骨架的c l 和c 8 位各引入了一个甲基来增加罗丹明6 g 的荧光产率。在罗丹明衍生物中， 结构刚性弱是非发光失效的主要原因，在c 1 和c 8 位引入甲基，可以抑制非发光 过程的进行，从而获得高的荧光产率。 o h 哗 e 1 1 6 2 d r e ) 【h a g e 等人例把亚甲基桥链与w 天线2 ，5 苯基嗯唑( p p o ) 相连，合成 了双发色团罗丹明染料。通过亚乙基和酯基，t i a n 等人把1 ，8 一萘酰亚胺天线 与罗丹明1 0 1 或罗丹明b 激光发射体相连，合成了另一类双发色团染料1 1 7 ， 第一章文献综述 它们都比罗丹明1 0 l 或罗丹明b 的荧光辐射高。t i a n 等人8 7 1 又以两个l ，8 一萘酰 亚胺衍生物作天线、以罗丹明6 g 或罗丹明d r 2 1 作激光单元并通过亚乙基桥相 连，合成了新型三元罗丹明激光染料1 1 8 。从天线到罗丹明单元分子内能量传递 增大了多发色团染料的荧光量子产率。 e te t 1 1 7 h 2 c h e t m e e t 、n i c h 2 g h 2 e t i g h 2 g h 2 醪醚 1 1 8 1 4 1 3 罗丹明最大发射波长的改进及在生物分析中的应用 一般来说罗丹明类染料的波长范围比较窄，由此研究者合成了1 1 9 1 2 4 。 这些化合物有宽的波长范围( 6 0 0 6 7 0n m ) ，能与通用二极管激光器相匹配，并 应用在生物分子的标记方面陋8 9 1 。 m e m e 铲o h e te t 1 1 9 c h 2 0 h 1 2 1 m e m e 9 h 2 早h 2 c o o h e t 2 n c h ， i c h ， i - c o o h 固 1 2 2 c h 2 c 第一章文献综述 e t 2 n o c o o n h c h 2 c h 2 b r 1 。2 3 1 2 4 另外，r a i e w 等人i 删证明在罗丹明6 g 中加入适量罗丹明b ，可以加宽罗丹 明6 g 光谱范围。通过加入罗丹明b ，罗丹明6 g 的光谱范围从5 6 4 6 0 9n m 加 宽到了5 6 4 6 4 5n m 。这样罗丹明6 g 即保持了较高的荧光量子产率又有较宽的 荧光波长范围，其适用性大大增加了。 1 4 1 4 罗丹明特异选择性的改进及在生物分析中的应用 由于罗丹明自身活性基团的特异选择性差，已不能满足不断发展的生物分析 要求，含活性基的罗丹明衍生物因能与生物分子发生某些特异反应而显示出巨大 的吸引力。目前含活性基的罗丹明衍生物中罗丹明b 异硫氰酸酯( 1 2 5 ) 、四甲 基罗丹明异硫氰酸酯( 1 2 6 ) 、丽斯胺罗丹明b ( 1 2 7 ) 、德克萨斯红( 1 2 8 ) 等 在生物分析中已得到广泛的应用。 国0 e t 2 n e t s 0 2 c i 12 7 m e 2 n n c s 1 2 6 s 0 2 c l 1 2 8 x a v i e 等人f 9 l 】合成了罗丹明b 异硫氰酸酯和四甲基罗丹明异硫氰酸酯。它们 亲脂性强，用来分析研究粘度比较大、分子量大于4 1 0 6 的蛋白质取得了很好 的效果。罗丹明b 异硫氰酸酯的分析速度快且不会污染蛋白多糖结构，被广泛 用于d n a 测序和免疫荧光染色。d o v i c h i 等人【9 2 1 采用单荧光试剂四甲基罗丹明 第一章文献综述 异硫氰酸酯激光荧光检测，对d n a 序列分析，灵敏度达到了2 zm o l ( 1 2 0 0 分 子) 。 罗丹明马来酰亚胺是具有较长发射波长和较大吸光系数的荧光探针。虽然斯 托克斯位移较小，荧光量子产率对p h 值敏感，在碱性条件下荧光量子产率较低， 且含有光敏感基团，很容易分解。但它与s h 反应后有较高的荧光量子产率，因 此被广泛应用于研究蛋白质的结构、性能、内部的相互作用和抗体的标记等方面 阳，舛j 。另外，活性基罗丹明n 羟基琥珀酰亚胺酯常被用作分析氨基酸和多肽的 h p l c 柱前衍生试剂【9 4 ，9 5 】。 1 4 2 荧光素的结构修饰及在生物分析中的应用 为了改善荧光素的性能，国外许多化学及生物学家通过在荧光素的项环或底 环上引入不同功能的化学基团对其结构进行修饰，已开发研制出许多的荧光素衍 生物1 2 9 ( 其中r 1 ， r 2 ，r 3 ， r 4 ，r 5 ，r 6 可以为氢、烷基、氨基、卤基、 羟甲基、磺酸基、烯烃基、杂环化合物等各种可能的基团；r 7 为羧基、氨基、异 硫氰酸酯基、琥珀酰亚胺酯基、酰卤基等活性基团) ，在很多方面弥补了荧光素 的缺陷，使其更有利于对特定生物体进行分析检测。下面针对荧光素结构修饰及 其在生物分析中的应用进行简要的综述。 r 1 0o r 2 1 z 9 1 4 2 1 荧光素酚羟基修饰的衍生物 因荧光素的结构中具有两个酚羟基，所以它的亲水性强，与脂膜的亲和力差， 无法通过细胞膜进入细胞内部，制约了它在细胞及酶的活性分析中的应用m 】。且 酚羟基很活泼，在和生物分子发生共价键和时，有副产物生成，影响检测。为了 提高荧光素的疏水性能和反应的专一性，国内外研究者们进行了大量的研究工 作，发现对荧光素酚羟基进行酯化或烃基化修饰所得衍生物，其亲脂性和反应的 专一性都得到了很大改善。 结果表明，酯化的荧光素衍生物能显著提高其亲脂性，容易被细胞所吸收， 因而可用于研究细胞的特性及细胞环境。j a c o b s e n 等人【9 。7 】研制得到羧基荧光素二 醋酸酯1 3 0 ( c f d a ) ，具有细胞渗透性，通过胞内非特异性脂酶水解成羧基荧 光素( c f ) 。与传统的荧光素不同，c f 带有特殊的负电荷，能延长其在细胞内 的存留时间，所以它在检测细胞