（材料学专业论文）耗氧型光纤dcp传感器敏感材料的制备与性能研究.pdf

武汉理工大学博士论文 摘要 2 ，4 二氯苯酚( 2 ，4 d i c h l o r o p h e n o l ，d c p ) 是一种毒性较强且难降解的环境污染 物。已被美国环保局和我国政府列为必须首先控制的有毒化合物，因此检测d c p 含量对环境保护和人类健康具有重要的意义。 本学位论文分别以磁性壳聚糖纳米复合粒子( m a g n e t i cc h i t o s a nn a n o p a r t i c l e s m c n ) i 司定化漆酶、酞菁铜仿生酶为生物识别元件，构建了基于固定化漆酶、仿 生酶催化的耗氧型光纤d c p 传感器，实现了对环境污染物d c p 的检测。 本学位论文在以下几个方面进行了系统的研究。第一，对杂色云芝茵漆酶 的培养和纯化条件进行了研究，制备了比活力为2 8 4u m g 的漆酶；第二，采用 反相悬浮聚合法制备了m c n ，以其为载体固定漆酶，研究了固定化的最优条件， 以2 ，27 连氮双( 3 乙基苯并噻吡咯啉一6 磺酸) ( a b t s ) 为底物研究了游离漆酶和 固定化漆酶的催化性能；第三，分别研究了漆酶催化d c p 和漆酶一介体体系中 漆酶催化d c p 的机理，确定了漆酶和固定化漆酶催化d c p 的最适条件以及漆酶 介体体系中漆酶和固定化漆酶催化d c p 的最适条件；第四，制备3 种金属酞菁， 对金属酞菁催化氧化d c p 的最适条件和机理进行了研究；第五，设计和构建了 基于固定化漆酶、仿生酶催化的光纤d c p 传感器，研究了传感器的性能。 本学位论文的主要结论包括以下几个方面： ( 1 ) 采用液体发酵法对培养杂色云芝菌漆酶的培养条件进行了优化，分离和 纯化了杂色云芝菌漆酶，以a b t s 为底物研究了其酶学性质。 最优培养条件为：土豆汁2 0 ，p h 值为5 0 ，葡萄糖2 0 0g l ，蛋白胨4 o g l ，c u s 0 41 0m m o l l ，l 2 p 0 43 0g l ，m g s 0 41 5g l ，z n s 0 40 5g l ，m n s 0 4 o 5 l ，a b t s1 0m m o l l ，t w e e n - 8 00 1 0 ，2 8 ，1 3 0r p m m i n 摇瓶培养1 3 d 。 采用超滤、硫酸铵分级、d e a e s e p h a r o s ef a s tf l o w 及s e p h a d e xg 1 00 柱 层析对漆酶粗酶液进行分离纯化，分离纯化的漆酶酶粉的比活力为2 8 4u m g ， 分子量为6 4 4k d ，其同工酶分子量为3 5 8k d 。 该漆酶催化a b t s 的最佳p h 值为2 0 ，最佳温度为5 5 。c ，2 5 时漆酶催化 a b t s 的值为7 7 8l 上m o l l ，为5 1 l x l 0 一l m o l m i n 。该漆酶储存稳定 性能良好，在1 8 放置1 个月其酶活仍保持9 0 2 。 武汉理工人学博士论文 ( 2 ) 采用反相悬浮法制备了平均粒径约为1 0 4 5n i n 的m c n 。采用t e m 、 f i i r 对m c n 的结构进行了表征。研究了m c n 的磁性能及抗氧化性能。结果 表明，m c n 具有超顺磁性，矫顽力为1 0 2 7o e ，抗氧化性良好，易于磁分离。 以m c n 为载体固定漆酶，研究了m c n 固定漆酶的最适条件。固定化过程 分为戊二醛活化和漆酶交联两步。戊二醛活化的最优条件为：5 0m gm c n 在p h 7 0 的磷酸缓冲液浸泡1 2h ，2 5 时，在1 的戊二醛中活化2h ；漆酶交联的最 优条件为：将活化好的m c n 磁分离后，置于漆酶浓度为1 0m g m l 的p h6 0 的磷酸缓冲液，40 c 交联4h 。最优条件下制备的固定化漆酶固载率为2 8 ，比 活力为6 7 0u g 。以a b t s 为底物研究了固定化漆酶的酶学性质，结果表明，固 定化漆酶催化a b t s 的最适p h 值为2 0 ，最适温度为5 0 ，2 5 时g i n = 2 3 3 8 t m o l l ，双= 3 5 3 x1 0 一t o o l l - 1 m i f f l ，固定化漆酶具有良好的热稳定性、操作稳 定性和储存稳定性。 ( 3 ) 研究了漆酶催化氧化d c p 的机理以及漆酶和固定化漆酶催化氧化d c p 的最适条件，漆酶和固定化漆酶催化d c p 的最佳p h 均为5 0 ，最佳温度分别为 4 5 和5 5 。动力学研究结果表明，漆酶对d c p 的催化氧化符合一级反应动力 学方程。 在漆酶a b t s 介体体系中，a b t s 起到了电子传递的作用，加入介体以后， d c p 的氧化速度明显提高。游离漆酶催化d c p 氧化的机理研究表明催化反应是 由四个化学反应组成的，醌式中间体的生成速度与每个反应的速度常数有关， 亦即与漆酶、介体、底物的浓度有关。在漆酶介体体系中，游离漆酶和固定化 漆酶催化d c p 的最适p h 和最适温度分别为4 5 和5 0 。 ( 4 ) 制备了3 种金属酞菁( c u p c 、m n p c 、c o p c ) ，研究了金属酞菁对d c p 的催化性能。金属酞菁催化d c p 的最适p h 为8 0 的磷酸缓冲液，最适温度为 5 5 ，最佳金属酞菁用量为5 0m g m l 。 ( 5 ) 分别以固定化漆酶、酞菁铜为生物识别元件，采用锁相放大技术构建了 两种光纤d c p 传感器，研究了传感器的性能并对d c p 含量进行测定。结果表明， 基于固定化漆酶催化的光纤d c p 传感器的线性检测范围为1 0 x 1 0 7 9 0 x 1 0 弓 m o l l ，检测下限为4 4 x 1 0 一m o l l ，响应时间为4 0s ；基于酞菁铜仿生酶催化的 光纤d c p 传感器线性检测范围在1 0 x 1 0 - 6 9 0 x 1 0 一m o l l ，检测下限为7 4 x 1 0 。7 m o l l ，响应时间为6 0 0s 。两种传感器均有较好的重复性和长期稳定性。 i i 武汉理工大学博士论文 将两种传感器应用于长江水和加入d c p 的长江水的检测，并与高效液相色 谱的测定结果进行了比较研究。结果表明，2 种传感器的检测效果好，精度高。 对于基于固定化漆酶催化的光纤d c p 传感器，m 9 2 + 、c a ：+ 的加入使得检测结果 偏高，加入e d t a 作螯合剂，能消除m 9 2 + 、c a 2 + 的影响。在基于酞菁铜催化的 光纤d c p 传感器中加入m 9 2 + 、c a 2 + 对检测结果没有影响。 关键词：杂色云芝菌，漆酶，磁性壳聚糖纳米复合粒子，固定化，d c p ，金属酞 菁，光纤d c p 传感器 i i i 武汉理j f 大学博士论文 a b s t r a c t 2 , 4 c h l o r o p h e n o l ( d c p ) i sak i n do fv e r yt o x i cs u b s t a n c ea m o n gt h ep o l l u t a n t s i nt h ee n v i r o n m e n ta n dt h e ya r ew i d e s p r e a d ，d i f f i c u l tt od e g r a d er e s i s t a n ta n dt o x i c r e f r a c t o r y i t h a db e e n r e g a r d e db yu n i t e d s t a t e se n v i r o n m e n t a lp r o t e c t i o n a g e n c y ( u se p a ) a n d0 1 1 1 g o v e r n m e n t a st h et o x i co r g a n i cs u b s t a n c et ob es p e c i a l l y c o n t r o l l e d t h e r e f o r e ，t h ed e t e c t i o no fd c pc o n c e r n t i o ni so fc r u c i a li m p o r t a n c et o e n v i r o n m e n t a lp r o t e c t i o na n dh u m a nh e a l t h t h em a i ng o a lo ft h i st h e s i si st oi n v e s t i g a t et h ef i b e ro p t i cd c pb i o s e n s o r st o d e t e c td c pc o n c e n t r a t i o n i m m o b i l i z e dl a c c a s ea n dc o p p e rp h t h a l o c y a n i n ew e r eu s e d r e s p e c t i v e l y a s t h e b i o r e c o g n i t i o ne l e m e n tt o c o n s t r u c t e df i b e r o p t i c a ld c p b i o s e n s o r sb a s e do no x y g e nc o n s u m p t i o n ，a n dt h ed e t e c t i o no fd c pb yf i b e ro p t i c d c pb i o s e n s o r sw a sr e a l i z e d i nt h i st h e s i s ，t h ef o l l o w i n ga s p e c t sh a v eb e e ns t u d i e ds y s t e m a t i c a l l y f i r s t l y , t h e c u l t u r ea n dp u r i f i c a t i o nc o n d i t i o n so fc o r i o l u sv e r s i c o l o rh a db e e ni n v e g i g a t e d l a c c a s ew i t ht h es p e c i f i ca c t i v i t yo f2 8 4u m gw a sp r e p a r e d s e c o n d l y ，m a g n e t i c c h i t o s a nn a n o p a r t i c l e s ( m c n ) w e r ep r e p a r e db yr e v e r s e d - p h a s es u s p e n s i o nm e t h o d a n du s e dt oi m m o b i l i z el a c c a s e t h eo p t i m u mc o n d i t i o n so fi m m o b i l i z a t i o nw e r e s t u d i e da n dt h ec a t a l y t i cp r o p e r t i e so ff r e el a c c a s ea n di m m o b i l i z e dl a c c a s ew e r e s t u d i e db yu s i n ga b t sa s t h es u b s t r a t e t h i r d l y , t h em e c h a n i s m so ft h ed c p o x i d a t i o n c a t a l y z e d i nl a c c a s e s y s t e m a n dl a c c a s e - a b t s 2 ，2 - a z i n o b i s 一( 3 - e t h y l b e n z t h i a z o l i n e 一6 一s u l f o n a t ) 】m e d i a t o rs y s t e mw e r es t u d i e d ，t h eo p t i m u m c o n d i t i o n sf o rd c po x i d a t i o nc a t a l y z e db yf r e el a c c a s ea n di m m o b i l i z e dl a c c a s ew e r e i n v e s t i g a t e d f o u r t h l y , t h r e et y p e so fm e t a lp h t h a l o c y a n i n ew e r es y n t h e s i z e db y b e n z e n eb i t t e rw i n e u r e al a w , t h em e c h a n i s m sa n dt h eo p t i m u mc o n d i t i o n so fd c p o x i d a t i o nc a t a l y z e db ym e t a lp h t h a l o c y a n i n ew e r ei n v e s t i g a t e d f i n a l l y ，f i b e ro p t i c d c pb i o s e n s o r sb a s e do ne n z y m ec a t a l y s i sw e r ed e s i g n e da n dc o n s t r u c t e d t h e p r i n c i p l ea n d t h ep e r f o r m a n c eo ft h eb i o s e n s o r sb a s e do nd c p c a t a l y s e db yl a c c a s eo r c o p p e rp h t h a l o c y a n i n ew e r ei n v e a i g a t e d ，r e s p e c t i v e l y 武汉理工大学博十论文 t h em a i nc o n c l u s i o n so ft h i st h e s i si n c l u d et h ef o l l o w i n gf i v ea s p e c t s ： ( 1 ) b ym e a n so fl i q u i df e r m e n t a t i o n ，t h ec u l t u r ec o n d i t i o n s o f c o r i o l u s v e r s i c o l o rw e r eo p t i m i z e d t h el a c c a s ew a si s o l a t e dw i t ht h es p e c i f i ca c t i v i t yo f2 8 4 u m g t h ec a t a l y t i cp r o p e r t i e so fl a c c a s ew e r es t u d i e du s i n ga b t sa st h es u b s t r a t e t h eo p t i m a lc o n d i t i o n sw e r ed e t e r m i n e da s - p o t a t oj u i c e2 0 ，g l u c o s e2 0 0g l ， p e p t o n e4 0g l ，c u s 0 41 0m m o f l ，k h 2 p 0 43 0e d l ，m g s 0 41 5g l ，z n s 0 40 5 l ，m n s 0 40 5g l ，a b t s1 0m m o l l ，t w e e n 一8 00 10 ，p h5 0 ，13 0r p m m i n ， 2 8 0 c ，1 3d a y s l a c c a s ew a si s o l a t e da n d p u r i f i e dt h r o u g hu l t r a - f i l t r a t i o n ，f o l l o w e db y a m m o n i u ms u l p h a t ef r a c t i o n a t i o n ，d e a e s e p h a r o s ef a s tf l o wa n ds e p h e d a xg - 10 0 c o l u m nc h r o m a t o g r a p h y t h es p e c i f i ca c t i v i t yo fl a c c a s ew a s2 8 4u m ga n dt h e m o l e c u l a rm a s so fl a c c a s ew a se s t i m a t e dt ob e6 4 4k d ab ys d s p a g e t h e m o l e c u l a rw e i g h to fi s o e n z y m e sw a s3 5 8k d t h ec a t a l y t i cp r o p e r t i e so fl a c c a s ew e r es t u d i e du s i n ga b t sa st h es u b s t r a t e t h eo p t i m u mp hv a l u ew a s7 0a n dt h eo p t i m u mt e m p e r a t u r ew a s5 5 0 c t h ek ma n d v a l u e so fl a c c a s eo na b t sa t2 5 0 cw e r e7 7 8 i _ t m o l la n d5 11 10 一l m o l m i n 一，r e s p e c t i v e l y t h ep u r i f i e dl a c c a s er e p r e s e n t se x c e l l e n ts t o r a g es t a b i l i t ya n d c o u l dm a i n t a i n9 0 2 o fi t si n i t i a la c t i v i t ya f t e rs t o r e da t 18 0 cf o r2 8d a y s ( 2 ) m c nw e r ep r e p a r e db yr e v e r s e d p h a s es u s p e n s i o nm e t h o da n dw e r e c h a r a c t e r i z e db yt e m ，n m r , f t - i r t h em a g n e t i cp r o p e r t i e sa n do x i d a t i o n r e s i s t a n c ew e r ei n v e s t i g a t e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tm c nw e r ea l m o s t s u p e r p a r a m a g n e t i cw i mh co f10 2 7o e t h eo x i d a t i o nr e s i s t a n c eo fm c n w a sg o o d w i t hs m a l lh c ，m c nw r e re a s yt ob es e p a r a t e df r o ms o l u t i o na n dr e u s e d t h el a c c a s ew a si m m o b i l i z e do nt h es u r f a c eo fm c nb yc r o s s l i n k i n gm e t h o d a n dt h ep r o c e s si n c l u d e dt w os t e p s ：m c na c t i v a t i o n b yg l u t a r a l d e h y d ea n d c r o s s - l i n k i n gb yl a c c a s e t h ea c t i v a t i o np r o c e s sb yg l u t a r a l d e h y d ew a su n d e rt h e f o l l o w i n gc o n d i t i o n s ：5 0m gm c nw e r ed i p p e di nt h ep b s ( p h7 0 ) b u f f e rf o r1 2 h o u r s ，t h e na c t i v a t e dw i t l ll g l u t a r a l d e h y d ef o r2 ha t2 5 0 c a f t e ra c t i v a t i o na n d t r e a t m e n tb ym a g n e t i cs e p a r a t i o nm e t h o d ，t h ec r o s s l i n k i n gr e a c t i o nw i t l ll a c c a s ew a s c a r d e do u ta t4 0 c t h eo p t i m u mp h ，l a c c a s ec o n c e n t r a t i o na n dr e a c t i o nt i m eo f c r o s s l i n k i n gr e a c t i o nw e r e6 0 ，1 0m g m la n d4 h ，r e s p e c t i v e l y t h ei m m o b i l i z a t i o n v 武汉理工大学博士论文 y i e l da n dt h ea c t i v i t yo ft h ei m m o b i l i z e dl a c c a s ew e r e2 8 ，6 7 0u g ，r e s p e c t i v e l y t h ec a t a l y t i cp r o p e r t i e so fi m m o b i l i z e dl a c c a s ew e r ei n v e s t i g a t e db yu s i n g a b t sa st h es u b s t r a t e t 1 1 ei m m o b i l i z e dl a c c a s e se x h i b i t e dt h em a x i m u me n z y m e a c t i v i t ya tp h2 0a n da t5 0 0 c n l e a n d 瓢v a l u e so fi m m o b i l i z e dl a c c a s ea t 2 5 0 cw e r e2 3 3 8l _ t m o l la n d3 5 3 x 1 0 m o l l m i n 1 。r e s p e c t i v e l y a l s o t h e i m m o b i l i z e dl a c c a s e sh a dg o o dt h e r m a l ，s t o r e ，o p e r a t i o ns t a b i l i t i e s ( 3 ) t h em e c h a n i s mo ft h ed c p o x i d a t i o nc a t a l y z e db yl a c c a s ea n dt h eo p t i m u m c a t a l y t i cc o n d i t i o n sb yf r e el a c c a s ea n di m m o b i l i z e dl a c c a s ew e r es t u d i e d f o rb o t h f r e el a c c a s ea n di m m o b i l i z e dl a c c a s e ，t h e o p t i m u mp hw a s8 0 t h eo p t i m a l t e m p e r a t u r eo ff r e el a c c a s ea n di m m o b i l i z e dl a c c a s ew e r e4 5 0 c ，5 5 0 c ，r e s p e c t i v e l y t h ek i n e t i cs t u d yi n d i c a t e st h a tt h ed c po x i d a t i o nc a t a l y z e db yl a c c a s ec o i n c i d e d w i t hf i r s t - o r d e rk i n e t i ce q u a t i o n i nt h el a c c a s e - a b t sm e d i a t o rs y s t e m ，a b t si se m p l o y e dt os h u t t l ee l e c t r o n s f r o mt h ed c pt ol a c c a s e i tw a ss h o w nt h a tb yu s i n ga b t sa sam e d i a t o r ，l a c c a s e f r o mc o r i o l u sv e r s i c o l o rw a sa b l et oi n c r e a s et h er a t eo fd c po x i d a t i o n t h em e c h a n i s mo fd c po x i d a t i o nc a t a l y z e db yl a c c a s ei n d i c a t e dt h a tt h e c a t a l y z ep r o c e s s c o n t a i n e df o u r r e a c t i o n s t h e p r o d u c i n g r a t eo f 2 - c h l o r o - 1 ，4 一b e n z o q u i n o nh a dr e l a t i o n s 诵t 1 1e a c hr e a c t i o n sr a t ec o n s t a n t ，n a m e l yi t w a si n f l u e n c e db yt h ec o n c e n t r a t i o no fl a c c a s e ，m e d i a t o ra n ds u b s t r a t e f o rb o t hf r e e l a c c a s ea n di m m o b i l i z e dl a c c a s ei nt h el a c c a s e a b t sm e d i a t o rs y s t e m ，t h eo p t i m u m p ha n dt e m p e r a t u r eo fd c po x i d i a t i o nc a t a l y z e db yl a c c a s e w e r e8 0 ，5 0 0 c ， r e s p e c t i v e l y ( 4 ) t h r e et y p e so fm e t a lp h t h a l o c y a n i n ew e r es y n t h e s i z e db yb e n z e n eb i t t e r w i n e - u r e al a w t h em e c h a n i s ma n dc a t a l y t i cp r o p e r t i e so fd c po x i d a t i o nc a t a l y z e d b ym e t a lp h t h a l o c y a n i n ew e r es t u d i e da n dt h eo p t i m u mc a t a l y t i cc o n d i t i o n sw e r e 舔 f o l l o w s ：p h8 0 ，t e m p e r a t u r e5 5 0 c ，a n a o u n to fm e t a lp h t h a l o c y a n i n5 0m f f m l ( 5 ) t w ot y p e so fn o v e lf i b e ro p t i cd c pb i o s e n s o r sb a s e do nt h ed c po x i d a t i o n c a t a l y z e db yi m m o b i l i z e dl a c c a s e o rc o p p e rp h t h a l o c y a n i n ew e r ed e s i g n e da n d f a b r i c a t e d t h ep e r f o r m a n c eo ft h eb i o s e n s o r sw a si n v e s t i g a t e d t h el i n e a rd e t e c t i o n r a n g e ，d e t e c t i o nl i m i ta n dr e s p o n s et i m eo ft h ef i b e ro p t i cd c p b i o s e n s o rb a s eo nt h e v i 武汉理t 大学博士论文 c a t a l y s i so fi m m o b i l i z e dl a c c a s ew e r e1 0 x i 0 7 9 0 1 0 一m o l l ，4 4 x 1 0 一m o l l ，4 0s r e s p e c t i v e l y t h el i n e a rd e t e c t i o nr a n g e ，d e t e c t i o nl i m i ta n dr e s p o n s et i m eo ft h e b i o s e n s o rb a s eo nt h ec a t a l y s i so fc o p p e rp h t h a l o c y a n i n ew e r e1 0 1 0 。6 - 9 0 x 1 0 。 m o l lm o l l ，7 4 x10 7m o l l ，6 0 0s ，r e s p e c t i v e l y b o t ho ft h e ms h o w e dg o o d r e p r o d u c i b i l i t ya n ds t a b i l i t y b o t ho fb i o s e n s o r sw e r eu s e dt od e t e c tt h ed c pc o n c e n t r a t i o ni nt h ew a t e rf r o m y a n g t z er i v e r , a n dt h er e s u l t sw e r ec o m p a r e dt h o s ed e t e r m i n e db yh p l c ，i n d i c a t i n g t l l a tt h ed e t e c t i o no fd c pc o n c e n t r a t i o nb yt h e s eb i o s e n s o r sw e r er e l i a b l e t h e i n f l u e n c e so fi n t e r f e r e n c ei o n sm 9 2 + a n dc a + o nt h ed e t e c t i o no fd c pc o n c e n t r a t i o n b yt h e s eb i o s e n s o r sh a v eb e e ns t u d i e d f o rt h ef i b e ro p t i cd c p b i o s e n s o rb a s eo n i m m o b i l i z e dl a c c a s e t h er e s u l t sw e r eh i g h e rt h a nt h et r u ev a l u e s t h ei n f l u e n c e so f m 9 2 + a n dc a + w e r ee l i m i n a t e dw h e ne d t aw a sa d d e d f o rt h ef i b e ro p t i cd c p b i o s e n s o rb a s eo nc o p p e rp h t h a l o c y a n i n e ，t h er e s u l tw o u l d n tb ei n f l u e n c e db y i n t e r f e r e n c ei o n sm 9 2 + a n dc a 2 + k e y w o r d s ：c o r i o l u sv e r s i c o l o r ，l a c c a s e ，m a g n e t i c c h i t o s a n n a n o p a r t i c l e s ， i m m o b i l i z e d ，2 , 4 一d i c h l o r o p h e n o l ，m e t a lp h t h a l o c y a n i n ，f i b e ro p t i cd c p b i o s e n s o r v i i 独创性声明 本人声明，所呈交的论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表的和撰写过的研究成果，也不包含为获得武汉理工大学或其它教育 机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所作的贡献 均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：毕日期：立俨 关于论文使用授权的说明 本人完全了解武汉理工大学关于保留、使用学位论文的规定，即学校有权保 留、送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或 部分内容，可以采用影印、缩影或其他复制手段保存论文。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 研究生签名：年导师签名： 日期：旌投呈：堇，堵 i 武汉理工大学博士学位论文 第1 章绪论 2 , 4 二氯苯酚( 2 ，4 d i c h l o r o p h e n o l ，d c p ) 是一种内分泌干扰物质，具有致畸、 致癌、致突变性【l 。3 1 ，其苯环上的7 c 电子和氯原子上的p 电子能形成p 兀共轭， 这种超共轭体系的形成使得d c p 更稳定，具有很强的抗降解能力，而且，d c p 还能通过食物链在生物圈中累积，从而大大加剧其对人类健康的危害，因此， 研究检测灵敏度高、操作简便、特别是能进行实时在线监测的检测方法，准确 而迅速地测定水体、土壤中d c p 的含量，对保护人类健康具有十分重要的意义。 采用光纤酶生物传感器对d c p 含量进行检测具有操作简便、检测精度高、选择 性好、不引入第二次污染、无需参比电极、可实时在线监测等优点，具有潜在 的应用价值。 光纤生物传感器主要由产生信号的敏感元件、光学换能器( 又称为“光极”) 和 信号处理仪器等几部分组成。光纤生物传感器的光极多种多样，有吸收光谱、 反射、折射率变化、荧光、磷光、散射、消失波和表面等离子共振【4 ，5 j 等各种形 式。生物敏感元件是光纤生物传感器的核心部分，光学生物敏感材料的性能直 接决定光纤生物传感器的性能。基于酶催化的光纤酶生物传感器以酶为敏感元 件，然而游离酶易溶于水，其本身也不稳定，需要固定在各种载体上构成光学 生物敏感材料来延长生物活性物质的使用寿命，因此，研制高性能的敏感材料 是高性能光纤生物传感器的关键技术之一。 1 1 基于酶催化的光纤生物传感器的特点与分类 1 1 1 基于酶催化的光纤生物传感器的特点 光纤酶生物传感器是采用酶促反应来进行生物识别，利用酶的高选择性， 当待测物质( 相应的酶的底物) 从样品溶液中扩散到生物催化剂层，在酶的催化下 生成产物；经过分子识别后产生的生物信号经过换能器将生物信号转变为光信 号，信号大小与底物浓度成比例关系。再经过光电转换装置转化成电信号( 数据) 输出【6 1 。 武汉理1 = 大学博上学位论文 光纤酶生物传感器主要具有以下特点【7 8 】： ( 1 ) 光纤传输功率损耗小，传输信息容量大，抗电磁干扰，耐高温、高压， 防腐蚀，阻燃防爆，可用于远距离遥测和一些特殊环境的分析。 ( 2 ) 酶是一种高效的生物催化剂，能催化低浓度的底物，提高检测下限。其 催化底物的专一性强，可同时选择多种酶及固定方法，实现对多种底物的同时 检测。 ( 3 ) 光纤及探头均匀可微型化，生物相容性好，加之良好的柔韧性和不带电 的安全性，使之特别适用于生物和临床医学上的实时、在体检测。 ( 4 ) 可采用多波长和时间分辨技术来提高方法的选择性，还可同时进行多参 数或连续多点检测，以获取大量信息。 ( 5 ) 不需要电位法的参比电极。采用廉价的光源照射样品，成本可大大降低。 ( 6 ) 一般而言，采用光纤酶生物传感器进行检测时不改变样品的组成，是非 破坏性分析。 1 1 2 基于酶催化的光纤生物传感器的分类 光纤酶传感器以生物酶作为分子识别器，常用的酶有氧化还原酶( 如葡萄糖 氧化酶等) 和水解酶( 乙酰胆碱酶等) 。根据换能器的能量转换方式可分为化学发 光型、荧光型、光吸收型、生物发光型等1 9 。1 2 1 。 1 1 2 1 化学发光型 某些化学反应会伴随着光子释放，释放的光子与被测物之间存在化学计量关 系，可用于传感器检测，因此这种传感器不需要外加光源。 h l a v a y 等【1 3 】设计了检测黄嘌呤( x ) 和次黄嘌呤( h x ) 的生物传感器，利用黄嘌 呤氧化酶氧化x 与h x 产生h 2 0 2 ，再加入3 氨基邻苯二甲酰环肼进行分析，x 和h x 的线性检测范围分别在3 1 3 1 6p m o l l ，1 - 3 1 6g m o l l 之间，次黄嘌呤的 检测下限为0 5 5g m o l l 。 c a t t a n e o 1 4 , 1 5 】设计了用于检测哺乳动物细胞组织谷氨酞胺的传感器，细胞组 织中谷氨酞胺在谷氨酸胺酶( ca n ) 催化下生成谷氨酸，然后与谷氨酸氧化酶 ( g l o ) 作用，再加入鲁米诺后即释放光子。g a h 和g l o 由戊二醛固定在多孔的 氨基玻璃珠上，样品、催化剂及缓冲液由蠕动泵自动注入，由于组织中本身存 在谷氨酸的影响，因此在反应体系的上游固定g l o 和催化剂，使其先行分解， 消除干扰。传感器的线性范围在1 0 6 1 0 。3m o l l ，检测时间在2 分钟内，固定的 2 武汉理工大学博士学位论文 生化酶可重复3 0 0 次而无活力丧失。 1 1 2 2 荧光型 荧光型光纤酶生物传感器是目前研究的比较多的一种类型。氧气为参与许 多生物氧化还原反应的重要物质，对钌等过渡金属络合物具有荧光猝灭作用， 因此可通过检测氧的消耗量来间接检测待分析物。 m a r a z u e l a 等人【16 】将荧光指示剂4 ，7 二苯基1 ，1 0 邻菲咯啉合钌( i i ) 吸附在硅 胶等物质上，构建了检测胆固醇含量的光纤胆固醇传感器。该传感器可动态检 测0 1 5 3 0m m o l l 游离的胆固醇，检测下限为o 1 5m m o l l ，但血样品中的抗坏 血酸氧化会对分析检测产生错误响应，而样品中其它物质不产生干扰，因此分 析检测时必须屏蔽抗坏血酸的干扰。 闰玉华【1 7 】以钌( i i ) 邻菲咯啉为荧光试剂制备荧光薄膜，醋酸纤维素为载体固 定胆固醇氧化酶，研制了基于荧光猝灭原理的光纤胆固醇传感器。用于检测溶 液中胆固醇的含量。该传感器灵敏度高、响应时间快、重复性和稳定性较好。 j i a n g 1 8 】等人研究了基于荧光猝灭原理