（环境科学与工程专业论文）臭氧固定化生物活性炭饮用水深度处理效能研究.pdf

classified index: x703 u.d.c: 614 dissertation for the masters degree in engineering research on ozone-immobilized biological activated carbon used in advanced drinking water treatment candidate： pang changlong supervisor： prof. ma fang assistant supervisor: associate prof. yang jixian academic degree applied for： master of engineering speciality： environment sci. and eng. affiliation： school of muni. 炭柱进水中硝基苯控制 26g/l 以下时可保证出水检不出硝基苯；加入硝基苯会明显增加水的毒性， ibac 出水毒性低于 gac 出水；ibac 上细菌总量较高，沿水流方向，炭柱上 的菌量都是先增加后减少。 o3-ibac 工艺在饮用水深度处理以及直饮水系统实际工程中有很明显的效 果。研究表明74，在进水高锰酸盐指数、doc 和浊度分别为 3.05.8mg/l、 3.546.35 mg/l 和 1.104.70 ntu 时，出水高锰酸盐指数、doc 和浊度基本 在 1. 5 mg/l、1.3 mg/l 和 0.5 ntu 以下，o3-ibac 对水中有机污染物的去除效 果明显，能够有效提高饮用水的生物稳定性。多项研究表明73-76，该工艺的生 物去除效能明显高于 o3-bac 工艺，而工程造价及运行费用低于其它深度净化 工艺，因此是实现饮用水深度处理的最佳选择。 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 12 但目前，o3-ibac 工艺运行控制参数尚不够完善，还需对其应用于饮用水 深度处理整体工艺系统及运行控制状态进行优化，以使其更好的应用于实际工 程。针对于不同源水水质，不同运行工况，尤其是在寒冷地区低温运行条件保 持系统高效运行， 其工程菌剂的合理构建方式需要深入研究。 另外， 对 o3-ibac 的有机物降解途径、生物相的变化以及影响因素，还需要从微生物生理学和生 态学角度在理论上进行深入的探讨和解释，对活性炭上附着的菌种、菌量及优 势菌群的形成过程进行生物学调控，以更好地解决了水源水富营养化引起的氨 氮、亚硝氮、微污染有机物含量高，水体腥臭味浓烈等问题，实现对目标污染 物的深度去除。此外，o3-ibac 出水的生物稳定性和安全性也需要建立完善的 评价体系。 1.4 课题来源、研究目的和内容 1.4.1 课题来源 黑龙江省青年基金. 供水系统微生物消长规律及其控制策略（qc07c11， 2008.1-2009.12） 。 大庆石油管理局供水公司. 2008 年重大科研项目“饮用水安全风险分析及 水质保障技术研究” 。 1.4.2 研究的目的和意义 我国现有的自来水厂大部分，大部分仍采用混凝、沉淀或澄清、过滤和消 毒的常规给水处理工艺，其主要去除对象是水中的悬浮物、胶体杂质和细菌。 但面对水源水质污染日益严重，尤其是可能具有三致作用的有机污染物，常规 饮用水处理工艺已不能保证饮用水的安全性和健康性。 以大庆中引水厂为例，该厂于 1999 年全部建设投产，当时按国家生活饮 用水卫生标准(gb5749-85)进行设计，根据设计工艺流程，其主要作用为去除 色、浑浊度（度） 、嗅和味、肉眼可见物，无法达到 2006 新标准中对有机物、 微生物、 “两虫” 、 “三致” 物质的要求。 同时， 中引水厂以龙虎泡水库为水源地， 近年来水库受嫩江来水污染和周边农牧区径流的面源污染影响，水源污染的问 题日益严重。据报道，大庆市居民中癌症发病率较高，其中肝癌与胃癌患者占 癌症患者近 30，饮用水安全问题应引起足够重视和关注。 因此， 对现有的常规工艺水厂进行升级改造， 开展饮水深度处理技术研究， 实施分质供水，提高饮用水净化能力，尤其是对有机污染物的去除能力保证饮 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 13 水安全具有重要的意义。 1.4.3 主要研究内容 针对大庆中引水厂现有工艺的存在的问题， 提出采用 o3-ibac 技术对其滤 后出水进行深度处理的方案。在大庆中引水厂现场对其滤后出水进行现场试验 研究， 滤池出水进行臭氧化后， 采用 ibac 滤柱过滤， 进行各项水质指标检测， 分析其对常规污染物去除、微量有机污染物去除及对水生物安全性的影响等方 面，并对 ibac 的有机污染物去除机理进行探讨，同时对其在实际生产中的可 行性进行研究。 在相同处理状态下， 滤柱分别装填煤质、 木质活性炭进行过滤， 对比其处理的差异性。针对上述问题将主要研究以下几方面内容： (1) 工程菌剂的构建 针对原水水质及污染物特征， 同时重点考察 o3-ibac 工艺在低温期的运行 效果，筛选能够在低温及贫营养条件下生存并且处理水中有机物的高效适贫营 养菌种，并运用生理生态学原理，对不同的工程菌种进行合理的复配组合，构 成用于 ibac 工艺的高效工程菌剂。 (2) ibac 净化效能及影响因素分析 考察 o3-ibac 工艺对于滤后出水的净化效果， 分析其对不同污染物的净化 机理，研究影响生物活性炭净化效能的因素。考查低温期臭氧-固定化生物活性 炭处理效能，分析温度对对生物活性炭处理效果影响。 (3) ibac 饮用水生物稳定性和安全性分析。 通过对细菌总数和 gc/ms 微量有机污染物检测，分析 o3-ibac 工艺出水 的生物稳定性和安全性，及其对毒理性有机污染物的去除能力，作为 ibac 饮 用水深度处理工艺的可行性和可靠性。 (4) ibac 工艺系统优化 优化 ibac 滤池的运行状态，包括炭滤池结构、炭层厚度、最佳运行滤速 范围、运行周期及滤池冲洗参数,通过系统优化给出最佳运行工况，指导 o3-ibac 在实际工程中的应用。 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 14 (5) ibac 微生物生理生态学研究 利用 pcr-dgge 技术对 ibac 反应器内的微生物群落结构进行解析， 分析 ibac 内微生物群落结构的变化规律和 ibac 工艺中微生物的净化机理。 图 1-1 课题研究技术路线 技术路线 ibac 现场 中试验 工程菌剂 构建 菌种的筛选 驯化和鉴定 菌种特性 研究 菌种的复配 和组合 工艺运行参 数确定 净化效果及 影响因素分 工艺系统优 化及改进 工艺系统 可行性论证 饮用水用固 定化菌剂 微生物生理 生态学研究 微生物群落 结构解析 高效工程菌 种鉴定 微生物活性 变化规律 生物强化与 生态调控 微量有机污染 检测 ibac 出水可 靠性可行性 净化效果及降 解机理分析 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 - 15 - 第 2 章 实验材料与方法 2.1 试验装置 ibac 运行效果实验在大庆中引水厂现场进行，试验流程见如图 2-1，实际 装置如图 2-2 所示。滤后水经臭氧接触柱臭氧化后，采用 ibac 滤柱过滤净化。 臭氧接触柱直径 200mm，高 1.8m，臭氧投配率为 4.06.0mg/l，o3氧化接触时 间为 8min。两 ibac 柱均采用上向流，直径 d=200mm，总高度 h=3.0m，1 号柱 填装木质活性炭，2 号柱填装煤质活性炭，活性炭装填高度 1.5m，承托层高度 0.1m，总填料高度 1.6m，滤速为设计 46m/h，空床停留时间为 1522.5min。 1. 臭氧发生器；2. 臭氧接触柱；3. 配水箱；4. 水泵 5. 1 号 ibac 柱；6. 2 号 ibac 柱 图 2-1 o3-ibac 实验工艺流程 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 - 16 - 图 2-2 o3-ibac 现场试验装置 2.2 实验主要的仪器设备 本实验研究中所涉及的主要相关仪器和设备如如表 2-1 所示。 表 2-1 实验仪器与设备一览表 仪器名称 型号 生产厂家 臭氧发生器 cfs-1a 瑞士 ozonia 公司 真空干燥箱 dzf-6030b 型 上海-恒科学仪器有限公司 电热恒温水浴锅 dk-98-i 型 天津市泰斯特仪器有限公司 全自动压力蒸汽灭菌器 8037-dms 超型 长春百奥 全温振荡器 hzq-qx 哈尔滨东联电子技术有限公司 双层全温度恒温振荡器 zhwy-2112b 上海智城分析仪器制造有限公司 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 - 17 - 续表 2-1 实验仪器与设备一览表 仪器名称 型号 生产厂家 生化培养箱 lrh-250 上海一恒科学有限公司 低速大容量离心机 dl-5 型 上海安亭科学仪器厂 旋转蒸发器 r-205 上海申胜生物技术有限公司 分光光度计 722e 上海光谱仪器有限公司 紫外/可见分光光度计 t6 型 北京普析通用仪器有限责任公司 显微数码成像系统 奥林巴斯光学工业株式会社 发酵罐 bioflo-110-7.5l 美国 nbs 公司 ph 计 phs-25b 上海雷磁科学仪器有限公司 ph 计 delta320a 梅特勒-托利多仪器有限公司 溶解氧测定仪 ysi 5000 ysi仪器有限公司 浊度测定仪 hach2100 美国 hach 仪器有限公司 gc/ms 色谱-质谱仪 mp5890 美国惠普公司生产 固相萃取小柱 supel clean envi-carb spe 2.3 实验的检测方法 2.3.1 水质分析方法 试验采用的水质分析方法依照水和废水分析检测方法(第四版)中的测试 方法进行，主要试验分析项目及方法见表 2-2 所示。 表 2-2 实验主要分析项目与分析方法 序号 项 目 测 定 方 法 1 高锰酸盐指数 酸式高锰酸盐法 2 浊度 美国 hach2100 型浊度仪 3 uv254 紫外分光光度法 4 nh4+-n 纳氏试剂光度法 5 no3- n n-(1-萘基)-乙二胺光度法 6 no3-n 酚二磺酸分光光度法 7 细菌总数 平板计数法 8 总大肠菌群数的测定 多管发酵法 9 水中有机物 色谱-质谱联用技术 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 - 18 - 2.3.2 gc/ms 有机物分析方法 采用色谱-质谱联用仪对水中有机物分析，首先采用固相萃取(solid phase extraction)分离和富集目标化合物，制备 gc/ms 分析样品。固相萃取的预处理 步骤： 活化富集碳柱，用 2ml 甲醇从碳柱上方滴入，自然从下方漏出后，用蒸 馏水清洗； 用 0.45m 滤膜对 1l 水样进行抽滤，将获得的 1l 水样用 h2so4调节 ph 值至小于 2； 用蠕动泵将上述水样打入已经活化的碳柱进行富集，调节流量，使进水 流量略小于出水流量，一般以不超过 5ml/min 为宜，收集滤后水； 将滤后水用 naoh 调节 ph 值至大于 11，用另一碳柱进行富集，方法 同第步； 将富集好的两组碳柱先后用 1.5ml 的二氯甲烷和 1.5ml 的乙醚进行洗脱 至茄形瓶中，获得 3ml 样品； 将样品用氮气吹脱至剩下 1ml，移至进样瓶待测。 制备好的样品送 gc/ms 分析，分析条件见表 2-3。 表 2-3 gc/ms 分析条件 项目 条件 仪器条件 gc hp 6890/ms hp 5893 柱箱温度条件 程序升温 40（保持 5min） ，然后以 4/min，升温至 280（保持 5min） 色谱条件 hp-5ms 30m250m0.25m 进样口温度 280 gc/ms 接口温度 280 进样方式 手动进样 载气流速 1ml/min 离子源类型 ei 离子源温度 230 四级杆温度 150 质量扫描范围 50-600 阈值 100，扫描 2 次/秒 调谐 标准物质调谐方式 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 - 19 - 2.3.3 ttc-脱氢酶活性的测定方法 从活性炭柱相应部位取样，分别装在无菌平皿中。称取一定重量的活性炭 放入含有 50ml 无菌水的三角瓶中，加盖无菌棉塞，扎紧后置于振荡器上振荡 60min，振荡频率 240 次/min，所得生物膜混合液便可作为显微镜镜检、活菌计 数以及 ttc-dha 活性测定的试验样品。 样品浓缩。 将经振荡脱膜后所得到的生物絮体悬液转移到 50ml 离心管内， 以 4000r/min 的速度离心 10min，弃去上清液，反复用纯水洗涤离心处理 3 次， 最后将沉淀物用 10ml 蒸馏水洗入 25ml 比色管中，再分别加入 7.5ml tris-hc1 缓冲液 （ph =8. 4） ， 2.5ml 0.36%的 na2so3溶液， 2.5ml 0.4%的 ttc 溶液和 2.5ml 蒸馏水，混合均匀，并立即从上述混合液中吸取 5ml 于具塞试管中，加入 0.5ml 甲醛溶液，以终止酶反应，作为样品对照。 样品培养。将 25ml 比色管连同样品对照管一起置 37恒温水浴振荡培 养箱内培养 2-4h， 以便样品中微生物细胞内进行生化反应， 还原 ttc 生成红色 triphenyl formazone，即 tf。达到反应时间后，向各培养管中加入 2.0ml 甲醛 溶液，混合均匀，并以 5.5ml 为 1 份将其分装于 4 个具塞试管中，再连同样品 对照管一道离心 5min，弃去上清液。 比色分析。向上述试管中各加入 5.0 ml 丙酮，并将试管底部沉淀物搅拌 混合均匀，于 37恒温水浴振荡培养箱中保持 l0min，将萃取完毕的试管于 4000r/min 条件下离心 5min，取上清液于 485nm 处(lcm 杯)进行比色，记录吸光 值。然后根据样品显色液与样品对照萃取液的吸光值之差，查标准曲线，进而计 算出检测样品的 ttc-dha.测定结果以每立方厘米生物活性炭每小时还原 ttc 所生成的 tf 微克 g tf/（ml h）表示。 2.3.4 pcr-dgge 操作方法 2.3.4.1 细菌基因组总 dna 的提取 细菌基因组（dna）的提取根据破壁方法的不同可分为物理、化学和生物 等多种破壁方法，而不同的破壁方法裂解细胞，释放 dna 的效率是不相同的. 由于活性污泥中除具有带有代谢活性的微生物群体外，还具有内源代谢、自身氧 化的残留物;石化废水带入的难降解的石油烃类、芳香烃类、酚类等物质有机物 和无机物等物质， 参照苏俊峰等人的提取方法79， 采取试剂盒法提取样品 dna： (1)将活性炭进行前处理，取大约 30ml 活性炭样品，加入 pbs buffer 充分旋 涡，离心收集沉淀，再加入 pbs buffer 反复振荡悬浮样品，再离心收集沉淀， 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 - 20 - 反复这个过程两次， 去除大量阴离子及部分腐殖质， 降低 dna 提取的影响背景。 (2)将 1ml的浓缩后的菌悬浮液离心 30s， 在细菌沉淀中加入 40l db 溶液， 160l lysozyme 和 8l rnasea。彻底悬浮。37 温浴 30-60 分钟，期间来回颠倒 离心管数次。 (3)水浴完毕，加入 200l dlt 液和 25l proteinasek，迅速温和的来回颠倒 离心管彻底混匀。置 65温浴至少 30min，期间来回颠倒离心管数次。离心后去 将上清移入一个干净的离心管。加入 200l 无水乙醇，混匀后全部移入吸附柱 中，离心后，将吸附柱移入一个干净的收集管。 (4)将如 500l w1 液，静置离心后，倒掉收集管内液体，将吸附柱放回收集 管中，重复此步 2-3 次，将吸附柱移入一个 1.5ml 的离心管中。在吸附膜中央加 入 100l t1 液，65 静置 5min，离心将收集管低温(-20)保存。 2.3.4.2 基因组总 dna 的 pcr 扩增 (1) 为减少 pcr 扩增过程中非特异性条带的产生， 采用对大多数细菌和古细 菌 的16srdna基 因v3区 扩 增 的 通 用 引 物 对 ： f338gc ： (5-cgcc cgccgcgcgcggcgggcggggcgggggcacggggggactcctacgggag gcagcag-3)，r518：(5-attaccgcggctgctgg-3)。 (2) pcr 反应体系 （50 l） ： 针对污水处理系统中污染物的复杂性、 多样性。 按照优化后的体系进行扩增， 此反应体系可加入 0.1 l的 bsa （小牛血清蛋白） ， 用以去除少量的腐殖酸，去除对 pcr 扩增产物不显现的影响. (3) pcr 反应条件:采用降落式 pcr 扩增策略，95预变性 5min，94变性 1 min，65退火 1min，72延伸 30s，每个循环退火温度降低 0.5直至 55， 30 个循环，72最终延伸 8min，pcr 反应的产物用 2%琼脂糖凝胶电泳检测。 2.3.4.3 变性梯度凝胶电泳(dgge) 采用 bio-rad 公司 dcodetm 的基因突变检测系统对 pcr 反应产物进行分离。 使用梯度混合装置， 制备 6%12%的聚丙烯酰胺凝胶， 变性剂浓度从 30%到 60% 和 40%到 60% （100%的变性剂为 7mol/l的尿素和 40%的去离子甲酰胺的混合物） 。 上样量为纯化后的 pcr 样品 6l 和上样缓冲液 6l 混合后加入上样孔。仪器温 度设定为 60，f338/r518 引物的选择 150v 的电压下，电泳时间 6h。电泳结 束后，将凝胶进行银染。将染色后的凝胶用 imagescanner透射扫描仪扫描后保 存。 操作程序如下：试剂的配制和操作过程参见分子克隆。 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 - 21 - (1) 变性梯度胶的制备：使用梯度混合装置，制备 6%和 8%的聚丙烯酰胺凝 胶，变性剂浓度从 40%到 60%（100%的变性剂为 7mol/l 的尿素和 40%的去离 子甲酰胺的混合物） ， 其中变性剂和丙烯酰胺的浓度从胶的上方向下方依次递增。 (2) pcr 样品的加样：待变性梯度胶完全聚合后，将胶板放入装有电泳缓冲 液的电泳槽中，取 pcr 样品 8l 和 10加样缓冲液混合后加入上样孔。 (3) 电泳及染色：150v 的电压下，60电泳 6h 和 7h。电泳结束后，将凝胶 进行银染。 (4) 胶图扫描：将染色后的凝胶用 imagescanner透射扫描仪扫描后获取胶 图。 (5) 切胶回收：切下目的条带置于 1.5mleffendorf 管中捣碎，加入溶解液， 置于 37恒温水浴锅中 1-3 小时，取溶解后的 dna 做模板；随后进行 pcr，反 应体系及反应条件按照正交优化后的参数进行， 所得产物均用胶回收试剂盒进行 回收； 用 pmd19-t 连接产物， 数小时后转化与感受态细胞混合一起冰浴 30min， 再 42水浴 1min30s，再置于冰上 5min；所得产物加入 lb 液体培养基，37摇 床培养；取浑浊菌悬液与 lb 固体培养基中涂布培养，37培养 16 小时，待克 隆菌落长出，挑取进行 pcr，用引物 m13 检测，测序。 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 - 22 - 第 3 章 固定化菌种的筛选及菌剂构建 3.1 固定化菌剂构建策略 工程菌(engineering bacterium)的概念可以分为狭义工程菌和广义工程菌。 狭 义工程菌是指将已确定的多种降解性的目的基因分离出来， 通过基因操作获得集 多种微生物 dna 质粒于一身，可同时降解多种有机物的新型微生物。而广义工 程菌是指将从自然环境、污染环境或处理系统中分离、筛选和鉴定获得的高效降 解菌，并加以合理组合，从而能够高效降解多种有机物的混合菌群。二者对有机 物降解的角度来讲并无本质区别。 人工筛选细菌就是要筛选出具有优良基因的细 菌，使它们更能很快适应生境，并能始终占有一定生态位，进而能够至始至终地 完成人们需要的降解目的。 3.1.1 工程菌构建的一般原则 工程菌构建时考虑的因素包括生态位、生态幅、生境、生物因子、共氧化、 共代谢、内平衡与反馈调节及高效工程菌系统稳定性等问题。 构建工程菌可以显著提高污染物在低温下的降解效率， 为解决生物处理难解 有机污染物问题提供了崭新的途径。环境微生物，尤其是细菌中的污染物降解基 因、 降解途径等许多污染物降解机制的阐明为构建具有高效降解性能的污染物降 解工程菌提供了可能。 通过对污染物生物降解机制以及阻碍污染物降解的相关因 素进行分析，提出高效工程菌构建策略。 3.1.1.1 菌源重组策略 特征污染物在降解菌酶催化作用下， 逐步从复杂大分子化合物降解成简单的 无机小分子化合物。一些难降解有机污染物特别是人工合成化合物(xenobiotics) 需要不同降解菌之间的协同代谢或者经过共代谢等复杂机制才能最终得以降解， 这无疑降低了污染物的净化效率。 由于污染物代谢产物在不同降解菌间的跨膜转 运是耗能过程，所以对细菌来说这是一种不经济的营养方式。同时，某些污染物 的中间代谢产物还可能是具有毒性或对代谢活性有抑制作用， 如不能迅速被代谢 利用，其积累后将对整个代谢过程产生明显的抑制。不同种属和来源的细菌降解 污染物的种类、方式以及降解活性都存在显著差异，因此对这些细菌进行生态重 组， 将分属于不同生境的工程菌株组合起来以构建具有特殊降解功能的超级降解 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 - 23 - 菌群，可极大地拓展污染物降解范围以及增强细菌对难降解污染物的降解能力， 从而有效提高工程菌的生物降解效率。 3.1.1.2 生态位分离策略 根据 em（effective microorganisms）原理，不同的工程菌共存于同一环境 中时，如果相互之间生态位分离，形成了互生关系，就能产生协同作用，相互提 供营养及其它生活条件，双方互为有利，相互受益，促进彼此的生长繁殖和高效 低温工程菌的产生。 3.1.1.3 自适应构建策略 污染物降解过程中， 由于生成抑制性中间代谢产物或中间产物进入截止式代 谢产物途径(end product pathways)导致污染物降解酶活性受到抑制，使得污染物 降解效率不高或降解不彻底。 因此可以考虑对污染物中间代谢产物的流向进行某 些改进，使抑制性中间产物不生成或尽快转化，以提高污染物降解效率。污染物 的降解速度还与污染物的摄取速率有关， 提高微生物细胞对污染物的摄取速度有 利于提高污染物的降解速度。同时，要充分发挥污染物降解菌在生物修复应用中 的降解性能就必须提高其对环境毒物的抵抗能力。例如，多种芳香烃类化合物进 入降解细菌内部需要依靠细胞膜上的透性酶载体蛋白， 这类酶蛋白不仅对不同的 底物具有特异性，甚至对化合物分子的空间构象也有选择性。因此，通过将不同 菌源，不同代谢途径的同一污染物降解菌进行混合培养，在低温条件下进行反复 驯化，使之通过相互影响，自适应机制提高其在污染环境中的耐受能力，是提高 细菌降解能力的有效途径。 综上所述， 污染物的生物可利用性在多数情况下决定了生物降解的可行性及 降解效率。工程菌构建策略可以概括为重组、自适应、筛选三个阶段，通过以上 步骤的反复进行直至得到所希望的重组工程菌群。 3.1.2 饮用水深度处理的工程菌剂构建策略 对于构建用于饮用水深度处理的高效工程菌群，其方法和原理如下所述： (1) 对于处理饮用水的工程菌来说，高效工程菌群应该能够在营养物质含量 极低的微污染水环境下生存，并且能够高效的降解污染物。 (2)微污染水的另一特点是有机物种类繁多，因此所需高效工程菌群应该由 能够高效降解不同有机物的多种微生物来构成。 (3) 高效工程菌群应具备长的群体倍增时间的特点，保证出水中不会由于游 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 - 24 - 离细菌过多而导致细菌总数超标。 (4) 高效工程菌群中不能含有病原微生物，这可以从菌种筛选来源上进行来 控制，以保证所得菌株不含有病原微生物。 (5) 高效工程菌群的构建在最终获得高效工程菌群的过程中占有重要地位， 能否构建出高效工程菌群是决定整个工程菌系统效能的关键， 构建应根据微污染 水源有机物浓度低而种类繁多的特点进行。 构建在整个过程中占据了很大的工作 量。 (6) 高效工程菌群可以通过正交试验设计来进行构建。 3.1.3 实验工程菌剂菌种来源 根据工程菌剂构建的策略和原理， 针对本实验装置为水厂滤后水的深度处理， 菌种筛选需要能够在低温及贫营养条件下生存，并且处理水中有机物。为了能使 工程菌尽快适应反应环境，我们所选构建工程菌剂的菌种来源包括三部分： (1) 从中引水厂冬季冰封期的低温原水中分离筛选耐低温贫营养菌株； (2) 从已运行的处理微污染水源水的生物陶粒反应器中分选贫营养菌； (3) 从已运行的臭氧-固定化生物活性炭装置中分选高效工程菌种。 3.2 贫营养菌的筛选和菌剂构建 3.2.1 工程菌的筛选方法 工程菌的筛选是通过工程菌的分离和纯化来实现的。 人工筛选工程菌就是要 筛选出具有优良基因的微生物，它们更能适应生境，并能始终占据生存空间。高 效工程菌的筛选在整个工程菌组建中占有重要地位， 能否筛选出高效工程菌是决 定整个工程菌系统效能的关键，同时也占据了过程中很大的工作量。 生物法水处理的效果主要取决于三个要素：菌种、工艺和设备。优良菌种的 选育与驯化是高效水处理的前提和保障。自然界中微生物资源十分丰富，土壤、 水、空气、腐败的动植物残骸都是微生物寄居和生长繁衍的场所。 3.2.1.1 工程菌的分离 从混杂生长或生存着很多微生物的环境中， 把要研究的某一微生物分离出来， 这一过程称为“分离” 。微生物的分离和纯化的方法很多，常用的有平板稀释分 离法（包括混均法和涂布法）以及平板划线分离法。另外，还有单细胞挑取分离 和培养条件控制法等，其中培养条件控制法包括选择培养基法、好氧与厌氧培养 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 - 25 - 分离以及 ph、温度等控制分离法。菌种分离过程中需考虑以下主要因素： 菌 种的营养特性，要求其在水处理过程中能高效利用水中污染物； 生长温度； 菌种的遗传和处理能力的稳定性； 菌种的转化能要高； 菌种易从处理 水中分离，且菌种本身无毒性，也不产生有毒产物。分离的具体过程如下： 首先，将所采集的样品（水样）10ml 接入事先已灭菌，内装玻璃珠和 90ml 无菌水的三角瓶中，必要时加吐温 80，使细胞呈单细胞状态分散于水中，之后 进行倍比稀释将样品稀释成不同的稀释度。 具体的稀释倍数要根据样品的情况而 定，目的是为了得到更多的单一菌落，接着，采用混均法或涂布法进行培养得到 单一的菌落。见图 2-1（分离、纯化用的培养基为牛肉膏蛋白胨培养基） 。 图 3-1 菌种分离示意图 3.2.1.2 工程菌的纯化 根据平板分离得到的菌落，进行菌落形态特征的观察，找出不同形态特征的 菌落，用接种环挑落单菌落，接种到斜面培养基上，进行培养，整个过程均为无 菌操作。在挑取单菌落时应注意，要确定适当的培养条件和时间；选择单独的菌 落；接种时应在菌落边缘挑取少量菌苔移入斜面；尽量不要带入原来的基质。 将斜面培养的菌落再进一步纯化，其方法有稀释平板法和平板划线法，其中 后者应用最为普遍。平板划线法的具体操作为：从斜面培养基上挑取少量生长的 菌，然后在事先制好的平板上划线（注意不要划破琼脂表面） 。划线时，从边缘 10-1 1 2 4 6 3 5 10-21010 -3-4 10 10 -5-6 10-7 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 10ml 1稀释倒平皿；2挑取典型菌落转管；3平皿划线分离；4挑取典 型菌落转管；5平皿划线分离；6挑取典型菌转管 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 - 26 - 开始，向着中心，由密到疏快速划线。第一组线条约占平板的 1/5。接着第一组 线条划出第二组线条，两组线条约成 120 角。第三组又由第二组线条划出，两 组线条约成 120 角。经过培养，在线条稀疏的地方就会出现单菌落。将单菌落 转接到斜面上，如此反复几次后，当平板上仍没有出现异样菌落时，便可认为获 得纯菌种，用斜面培养基保存作为菌种鉴定或其他试验研究的材料。 3.2.2 工程菌的初步筛选 根据工程菌剂构建的原则和策略， 确定实验构建固定化工程菌剂的菌种来源 包括三部分：一是从中引水厂冬季冰封期的低温原水分选；二是从已运行的用于 处理微污染水源水的生物陶粒反应器中分选； 三是从已运行的 ibac 装置中分选。 其中，已运行的 ibac 装置中分选的菌种为已成形的工程菌剂，选取的高效菌种 为 z1、z3、z6、z10。 由前期已稳定运行的生物陶粒反应器中，经过分离、纯化过程筛选出了 13 株处理效果较好的贫营养菌种，分别编号为 t1t13。并以这此为基础，对这 13 株贫营养菌进行了进一步的复筛、复配和驯化。 由大庆中引水厂冬季冰封期的低温原水中经过分离、纯化过程筛选获得 5 株优势细菌，分别编号为 l1、l2、l3、l4、l5。同样，以此为基础进行进一 步的复筛和驯化过程。 3.2.3 工程菌的复筛和特性研究 分别针对前期稳定运行的生物陶粒反应器中筛选出 13 株贫营养菌和由大庆 中引水厂冰封期原水中筛选获得 5 株优势细菌，进行低温下的耐饥饿试验，并比 较其对有机物和氨氮的去除效果，以筛选驯化获得高效工程菌。 3.2.3.1 耐饥饿试验 为考察细菌的耐饥饿程度，本试验通过梯级转驯化的方法，即每隔一段时间 将菌顺次转接到稀释倍数成指数递增的培养基中， 来考核各菌株在贫营养环境的 适应能力，同时也是一个对菌种耐饥饿能力的驯化过程。 实验中从斜面培养基上挑取适量菌体到富营养液体培养基中， 18摇床转数 140r/min 条件下培养，培养一段时间后，以 10%的接菌量顺次转接到稀释倍数分 别为 10、100、1000、10000 的培养基中依次进行驯化。开始 2 次间隔 5d 转接， 之后间隔 7d 转接，定期用血球计数板进行细菌总数计数。这 13 株菌依次转接至 不同稀释倍数的培养基中培养一定时间后菌数的变化情况如下表。 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 - 27 - 表 3-1 菌株转接至在不同稀释倍数的培养基中培养一定时间后菌数的变化(单位：cfu/ml) 培养基稀释倍数 有机质浓度 mg/l 转接后天数 1：10 1000 5d 1：100 100 5d 1：1000 10 7d 1：10000 1 7d t 1 107 106 105 105 t 2 107 107 106 106 t 3 107 106 105 105 t 4 107 107 106 106 t 5 107 107 106 106 t 6 107 107 106 106 t 7 107 106 105 105 t 8 107 106 105 105 t 9 107 106 105 105 t 10 107 107 106 106 t 11 107 106 106 106 t 12 107 107 106 106 t 13 107 107 106 106 由表 3-1 可以看出，随着培养基中有机质浓度的减少，菌的数量均有递减趋 势，但 t2、t4、t5、t6、t10、t11、t12、t13 的下降趋势小与 t1、t3、t7、 t8、t9，并且在有机质浓度只有 1mg/l 的情况下培养一周后，这 8 株菌的菌数 均保持在了 106 cfu/ml 的水平，证明了这 8 株菌相对于另外 4 株菌更容易在贫营 养的环境下生存生长，符合本实验的筛选目的，所以选取 t2、t4、t5、t6、t10、 t11、t12、t13 这 8 株菌进行下一步的净化实验的筛选。 3.2.3.2 净化实验 为满足饮用水深度处理技术的要求， 获得在贫营养状态下对水中有机物具有 高效降解能力的菌株， 对通过饥饿试验筛选出的 8 株菌和由大庆中引水厂冰封期 原水中筛选获得 5 株优势细菌的净化能力分别进行了考察。 实验用水为松花江水源水，取来的松花江水用滤纸过滤，以除去水中较大的 颗粒物质和小型的水生动植物，得到有机质均一水样作试验用水，每瓶分装 250ml。在试验期用水情况如下： 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 - 28 - 表 3-2 净化实验用水水质情况 项 目 最高值 最低值 高锰酸盐指数(mg/l) 7.92 6.04 氨氮（mg/l） 4.65 3.91 浊度(ntu) 4.24 4.07 实验中以不投加任何菌株的水样为空白对照， 便于在相同条件下和投菌处理 过的水样作进一步的对比。对于由饥饿试验筛选出的 8 株菌，取适量备用菌液接 种到装有处理后水样的三角瓶中，保证投菌量在 106 cfu/ml，与对照组一同在 18，摇床转数 140r/min 下培养，48 小时后分别测定水样的高锰酸盐指数和氨 氮。而对于大庆中引水厂冰封期原水中筛选获得 5 株菌，以相同的实验方式，但 培养温度为 10，摇床转数 140r/min 下培养 48 小时，考察其在低温条件下对水 样的高锰酸盐指数和氨氮净化情况。每组实验设置两个平行样。得到结果见图 3-2 和图 3-3 所示。 图 3-2 饥饿试验筛选出的 8 株菌对高锰酸盐指数和氨氮的去除效果 由图 3-2 可以看出， 饥饿试验筛选出的 8 株菌对高锰酸盐指数和氨氮均有一 定的去除效果，但对高锰酸盐指数的去除效果并不是特别理想，因为细菌以悬浮 状态存在于三角锥形瓶中，不能在载体表面挂膜，因而不利于菌株的生长发育。 而在实际反应器中，载体可以截留有机物，以便附着生长于载体表面的微生物对 截流有机物进行降解。 因而单株细菌通过摇床处理原水样的效果不如实际反应器 对有机物的去除效果。但是仍然可以对以上数据进行处理，确定出对有机物去除 0.0% 10.0% 20.0% 30.0% 40.0% 50.0% t2t4t5t6t10t11t12t13 去除率 菌株编号 高锰酸盐去除率氨氮去除率 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 - 29 - 率相对较高的菌株。 衡量高锰酸盐指数和氨氮两方面的去除效果， 最终确定 t4、 t5、t6、t13 为高效菌株。 图 3-3 水厂冰封期原水中筛选的 5 株菌对高锰酸盐指数和氨氮的去除效果 由图 3-3 可以看出， 由水厂冰封期原水中筛选的 5 株菌在 10的培养温度下 对高锰酸盐指数和氨氮表现出了一定去除效果。 综合考虑高锰酸盐指数和氨氮两 方面的去除效果，最终确定 l2、l3、l4、l5 为优良菌株。 3.2.4 工程菌剂构成 根据要实验装置为水厂滤后水的深度处理要求，确定工程菌剂筛选来源， 并通过初筛、 复筛和净化效果比较， 最终确定三部分共 12 株菌构成固定化工程 菌剂工程优势菌，分别为： (1) 由大庆中引水厂冬季冰封期的低温原水中分离筛选获得 5 株优势细菌， 再通过 5 株菌低温贫营养条件下在单菌和复配条件下对有机物和氨氮的去除效 果比较，确定四株优良菌种分别为 l2、l3、l4、l5。 (2) 由前期稳定运行的生物陶粒反应器中分离筛选出 13 株贫营养菌，同样 通过对这 13 菌株在低温下的耐饥饿试验及对有机物和氨氮的去除效果比较， 得 到了四株优良菌种分别为 t4、t5、t6 和 t13。 (3) 由已运行的 ibac 装置中分选获得的高效菌种 z1、z3、z6、z10。 0.0% 5.0% 10.0% 15.0% 20.0% 25.0% 30.0% 35.0% 40.0% l1l2l3l4l5 去除率 菌株编号 高锰酸盐去除率氨氮去除率 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 - 30 - 3.3 工程菌的生理生化特性及鉴定 3.3.1 工程菌形态特征 培养特征是指某种微生物生长在特定的培养基上所表现的菌体形态和生长 情况。由于每种细菌在一定的培养基上都能产生固有的菌落形态和生长特征，因 此，他们是细菌分类鉴定的重要依据之一。 革兰氏染色是细菌鉴定的重要方法之一。根据细胞壁结构的不同，细菌可分 为革兰氏阳性菌 g+(紫色反应)和革兰氏阴性菌 g-(红色反应)两类。 g+细菌的的细 胞比较厚(10-80nm)，由肤聚糖和磷壁酸组成。这两种成分形成一层层重叠的网 状结构。而 g-细菌的细胞壁较薄(10-15nm)，肤聚糖含量低，而且为单分子层结 构。在染色过程中，细胞内形成了大分子的深紫色结晶紫-碘的复合物。由于 g+ 细菌细胞比较厚，网络结构紧密，脂类含量低，当用酒精脱色时，细胞壁肤聚糖 层网状结构孔径缩小以致关闭， 阻止了不溶结晶紫-碘复合物的浸出也随之容出， 菌体呈紫色，反之，g-细菌的细胞肤聚糖层较薄，脂类含量较高。当被脱色时， 脂类物质溶解，细胞壁透性增强，结晶紫-碘复合物也随之溶出，菌体呈复染色 的红色。 将分离出的工程菌菌株在平板固体培养基上培养，32下培养 24h，待长出 单菌落后，观察菌落的形状、大小、颜色、光泽、透明度、状况等。然后进行革 兰氏染色，在显微镜下，鉴定菌株是革兰氏阳性菌还是阴性菌，同时记录菌的形 态、大小。结果见表 3-3。 表 3-3 细菌琼脂平板菌落特征 菌号 t4 t5 t6 t13 l2 l3 l4 l5 大小 中等 较大 中等 中等 中等 中等 中等 中等 形状 圆 圆 圆 圆 圆 圆 圆 圆 表面 光滑 粗糙 光滑 光滑 粗糙 光滑 光滑 光滑 边缘 整齐 整齐 整齐 整齐 整齐 整齐 整齐 整齐 隆起 凸 平 凸 凸 平 凸 凸 凸 透明度 不透明 不透明 不透明 不透明 不透明 不透明 不透明 不透明 革兰氏染色 + + + + + + + + 形态 短杆菌 杆菌 短杆菌 杆菌 杆菌 短杆菌 短杆菌 短杆菌 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 - 31 - 3.3.2 工程菌生理生化特性 由于各种细菌的新陈代谢类型不同， 对不同物质利用后所产生的代谢产生有 差异，所以常用生理生化反应来鉴别在形态或其他方面不易区别的细菌。细菌的 生理生化反应是细菌分类鉴定的重要依据之一，通过细菌形态特征的观察，细菌 培养特征的观察和细菌的生理生化反应， 可以将所筛选到的工程菌鉴定到属的层 次上。实验选取的工程菌的生理生化反应结果见表 3-4。 表 3-4 生理生化鉴定结果 菌株编号 z1 z3 z6 z10 t4 t5 接触酶 + + + + + + 发酵葡萄糖 + + + + + + 发酵蔗糖 + + + + - + 发酵乳糖 - - - - - - 甲基红（m.r） + + + + + + 乙酰甲基醇（v.p） + + + + - - 油脂水解 - - - - - - 吲 哚 + + + + + + 硝酸盐还原 + + + + - + 柠檬酸盐利用 - - - - + + 明胶液化 + + + + - - 革兰氏染色 + + + + + + 菌体形态 无芽胞 无芽胞 中生芽胞 无芽胞 无芽胞 无芽胞 产 氨 + + + + + + 石蕊牛奶 酸凝固 酸凝固 酸凝固 酸凝固 还原 无变化 菌 属 产碱 菌属 产碱 菌属 芽孢杆 菌属 产碱 菌属 沙门氏 菌属 假单胞 菌属 续表 3-4 生理生化鉴定结果 菌株编号 t6 t13 l2 l3 l4 l5 接触酶 + + + + + + 发酵葡萄糖 + + + + + + 发酵蔗糖 + + + + + + 发酵乳糖 - - - - - - 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 - 32 - 续表 3-4 生理生化鉴定结果 菌株编号 t6 t13 l2 l3 l4 l5 甲基红（m.r） + + + + + + 乙酰甲基醇（v.p） - - - + + + 油脂水解 - - - - - - 吲 哚 + + + + + + 硝酸盐还原 + + - + + + 柠檬酸盐利用 - + - - - - 明胶液化 + - - + + + 革兰氏染色 + + + + + + 菌体形态 中生芽胞 无芽胞 无芽胞 中生芽胞 中生芽胞 中生芽胞 产 氨 + + + + + + 石蕊牛奶 酸凝固 产碱 产碱 酸凝固 酸凝固 酸凝固 菌 属 芽孢杆 菌属 假单胞菌 属 假单胞 菌属 芽孢杆 菌属 芽孢杆 菌属 芽孢杆 菌属 通过细菌的生理生化反应结果、革兰氏染色结果，并结合其表面形态特征， 依据常见细菌系统鉴定手册和污染控制微生物学实验 ，对实验中分离的 菌种进行对照，初步得到结果为：z1、z3、z10 为产碱菌属，z6 为芽孢杆菌属， t4 为沙门氏菌属， t6 为芽孢杆菌属， t5、 t13 为假单胞菌属， l2 为假单胞菌属， l3、l4、l5 为芽孢杆菌属。 3.3.3 工程菌的 16srrna 鉴定 对 12 株工程菌菌株提取其总 dna， 进行 16srrna 的鉴定， 鉴定结果如下： (1) z1 为产碱菌属(alcaligenes)；(2) z3 为产碱菌属(alcaligenes)；(3) z6 为芽孢 杆菌(bacillus)； (4) z10 为产碱菌属(alcaligenes)； (5) t4 为沙门氏菌(salmonella)； (6) t5 为假单胞菌属(pseudomonas)；(7) t6 芽孢杆菌属(bacillus)；(8)t13 均为假 单胞菌属(pseudomonas)；(9) l2 为假单胞菌属(pseudomonas)；(10) 经鉴定 l3 和 l5 应为同一种菌，为芽孢杆菌属(bacillus)，(11) l4 为芽孢杆菌属(bacillus)， 3.4 本章小结 (1) 根据工程菌剂构建的策略和原理，针对实验装置为水厂滤后水的深度处 理，菌种筛选需要能够在低温及贫营养条件下生存，并且处理水中有机物。为了 哈尔滨工业大学工学硕士学位论文 - 33 - 能使工程菌尽快适应反应环境， 分别选取三部分来源工程菌种构成固定化工程菌 剂。 (2) 由中引水厂冰封期的低温原水中经过分离、纯化过程筛选获得 5 株优势 细菌， 再通过低温贫营养条件下在单菌和复配条件下对有机物和氨氮的去除效果 比较，确定四株优良菌种分别为 l2、