（生物医学工程专业论文）重组类人胶原蛋白基因工程菌发酵动力学.pdf

硕士论文 a b s t r a c t c o l l a g e ni sw i d e l yu s e di nv a r i o u sf i e l d s ，s u c ha sf o o d ，h a i r d r e s s i n g ，m e d i c a la n d h e a l t h ，e t c ，b e c a u s eo fi t sg o o db i o l o g i c a lc o m p a t i b i l i t y ，d e c o m p o s a b i l i t ya n dl o w i m m u n o g e n i ci d i o s y n c r a s y r e s p o n s e s u r f a c em e t h o d o l o g y ( r s m ) w a su s e dt o o p t i m i z et h ef e r m e n t a t i o np r o c e s so fr e c o m b i n a n tp i c h i ap a s t o r i s ( g s l15 p p i c 9 k g 6 ) e x p r e s s i n gh u m a n - l i k ec o l l a g e nw h i c hw a sc o n s t r u c t e di no u rl a b o r a t o r y b o x - b e h n k e nd e s i g nw a si n t r o d u c e dt oe s t i m a t et h ei m p a c to fi n i t i a li n d u c e m e n t p h ，t e m p e r a t u r ea n dt h ea c c e s s i o nq u a n t i t yo fm e t h a n o lo i le x p r e s s i n gh u m a n - l i k e c o l l a g e ni nr e c o m b i n a n tp i c h i ap a s t o r i s t h er e s u l to fr s ma n a l y s i ss h o w e dt h a tt h e o p t i m a ls c a l eo ff a c t o r si s ：i n i t i a li n d u c e m e n tp h4 7 ，t e m p e r a t u r e2 8 a n dt h e a c c e s s i o nq u a n t i t yo fm e t h a n o l2 1 2 4 h t h ek i n e t i c so ff e d b a t c hf e r m e n t a t i o ni n 3 7 lf e r m e n t e r ( b i o e n g i n e e r i n gk l f 2 0 0 0 )o fr e c o m b i n a n tp i c h i ap a s t o r i sw a s i n v e s t i g a t e d a n dan o n s t r u c t u r em o d e lo fm i c r o o r g a n i s mg r o w t h ，ap r o d u c t i o n f o r m a t i o nm o d e la n dal i m i t e ds u b s t r a t e ( g l y c e r o la n dm e t h a n 0 1 ) c o n s u m p t i o nm o d e l w e r eo b t a i n e dt oo p t i m i z et h ef e r m e n t a t i o np r o c e s s s d s - p a g ea n a l y s i so ft h ei n t r a c e l l u l a ra n de x t r a c e l l u l a rp r o d u c t i o ns h o w e dt h a t h u m a n l i k ec o l l a g e nc o u l db ee x p r e s s e db o t hi na n do u to ft h ec e l l f u r t h e r m o r e ， e l e c t r o p h o r e s i sd e g r e eo fh u m a n - l i k ec o ll a g e nw a so b t a i n e dt h r o u g hp u r i f y i n gt h e f e r m e n t a t i o ns u p e r n a t a n tb ya n i o ne x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y a n d g e l f i l t r a t i o n c h r o m a t o g r a p h y t h r o u g ha n a l y z i n gt h eu l t r a v i o l e t - v i s i b l es p e c t r o s c o p ya n df t i ro f r e c o m b i n a n th u m a n - l i k ec o l l a g e n ，w ep r e s u m et h a tp u r i f i e dp r o d u c ti ss i m i l a rt on a t i v e c o l l a g e ni np r o t e i ns t r u c t u r e k e yw o r d s ：r e c o m b i n a n tp i c h i ap a s t o r i s ；h u m a n l i k ec o l l a g e n ；r e s p o n s es u r f a c e m e t h o d o l o g y ；h i g hc e l l d e n s i t yf e r m e n t a t i o n ；k i n e t i c s 声明 本学位论文是我在导师的指导下取得的研究成果，尽我所知，在 本学位论文中，除了加以标注和致谢的部分外，不包含其他人已经发 表或公布过的研究成果，也不包含我为获得任何教育机构的学位或学 历而使用过的材料。与我一同工作的同事对本学位论文做出的贡献均 已在论文中作了明确的说明。 研究生签名： 砌7 年6 月弓。日 学位论文使用授权声明 南京理工大学有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可以借阅 或上网公布本学位论文的部分或全部内容，可以向有关部门或机构送 交并授权其保存、借阅或上网公布本学位论文的部分或全部内容。对 于保密论文，按保密的有关规定和程序处理。 研究生签名：妒9 年6 月茹日 硕士论文重组类人胶原蛋白基因工程菌发酵动力学 1 绪论 1 1 胶原蛋白概述 胶原蛋白( c o l l a g e n ) 又称胶原，其英文名源自希腊语，意为“生成胶的产物 。 胶原蛋白是一类重要蛋白质，广泛存在于从低等脊椎动物的体表到哺乳动物机体 的一切组织中，是哺乳动物体内含量最多的一类蛋白质，占动物体蛋白质总量的 2 5 3 0 1 1 。 1 9 4 0 年，o r e k h o v i c h 等用柠檬酸缓冲液从大鼠皮中溶解出不溶于水的蛋白质， 其中含有角蛋白及弹性蛋白，此外还有一种是胶原的前躯体，这种从酸性盐溶液 中提取的胶原被命名为“前胶原 。后来经过许多研究者的努力，发现从中性盐和 碱性盐溶液中也能提取出胶原。1 9 5 3 年，g r o s s 把这种构建胶原的蛋白质单体命 名为“原胶原 ，它是胶原的基本结构单位，原胶原分子经过多级聚集形成胶原【2 l 。 胶原是细胞外基质( e x t r a c e l l u l a rm a t r i x ，e c m ) 的一种结构蛋白质，一般难溶于 水、稀酸、稀碱水溶液及盐溶液。胶原蛋白种类较多，目前已确认的胶原蛋白多 达2 7 种【3 】，常见类型为i 型、型、型、v 型和型，其中i 型胶原蛋白约占全 部胶原蛋白含量的9 0 以上。 胶原蛋白具有独特的组织分布和功能，广泛分布于结缔组织、皮肤、骨骼、 内脏细胞间质及肌腔、韧带等部位。胶原是结缔组织极其重要的蛋白质，起着支 撑器官、保护机体的功能，另外胶原还与组织的形成、成熟、细胞间信息的传递、 细胞增生、分化、运动、细胞免疫、肿瘤转移以及伤口愈合、钙化作用和血液凝 固等有密切关系，因此对胶原及其基因结构的研究越来越引起人们的重视。 1 1 1 胶原蛋白的结构 动物体内胶原蛋白以胶原原纤维( c o l l a g e nf i b r i l ) 或胶原纤维( c o l l a g e nf i b e r ) 的 形式存在。其基本结构单位是原胶原( p r o t o c o l l a g e n ，t r o p o c o l l a g e n ) 分子，长度约为 3 0 0 r i m ，直径约1 5 n m ，分子量约为3 0 0 k d a ，由三股缠绕的多肽链组成，每股链 自身是一种左手螺旋构型，三股左手螺旋链又相互缠绕成右手螺旋结构( 如图1 1 所示) 。在电子显微镜下，胶原纤维呈现特有的横纹区带，区带间距为6 0 7 0 n m ， 这取决于胶原的类型和生物来源。 胶原分子中一级结构的关键部位是氨基酸，也是蛋白质分子的活性中心，胶 原蛋白的氨基酸组成有如下的特点： ( 1 ) 多肽链中甘氨酸几乎占氨基酸残基的三分之一，即每隔两个其他氨基酸残 1 1 绪论 硕士论文 基( x ，y ) 就有一个甘氨酸，故其肽链可用( g l y x - y ) n 来表示。 图1 1 胶原蛋白右手超螺旋结构 f i g 1 1t h er i g h th a n d e ds u p e r - s c r e ws t r u c t u r eo fc o l l a g e n ( 2 ) 含有较多在其他蛋白质中少见的羟脯氨酸和羟赖氨酸残基，也有较多脯氨 酸和赖氨酸。羟脯氨酸残基可通过形成分子内氢键稳定胶原蛋白分子。例如，正 常胶原在3 9 变性，而在缺乏脯氨酸羟化酶条件下合成的胶原在2 4 变性成为白 明胶( g e l a t i n ) 。 ( 3 ) 胶原中缺乏色氨酸，所以它在营养上为不完全蛋白质。 蛋白质的二级结构是指肽链主链的局部空间结构，即肽链中相邻氨基酸形成 的局部有序的空间排布( 0 【螺旋，p 折叠，p 转角) 或无规则的空间排布( 如空间卷 曲) 。胶原蛋白分子是由原胶原首尾相接按顺序排列的，由肽链组成的三螺旋构象 被称为“胶原域 ，胶原蛋白分子中至少应有一个胶原域。除了三螺旋结构以外， 胶原蛋白还含有非三螺旋结构的结构域，这些非三螺旋的结构域可成为细胞外基 质构建的模块( b u i l d i n gb l o c k ) 引。胶原肽链间存在离子键、氢键、范德华力及非极 性基团产生的疏水键等作用力。同时，胶原分子内和分子间还存在醇醛缩合交联、 醛氨缩合交联和醛醇组氨酸三种交联，使得胶原肽链牢固地连接而具有很高的抗 张强度。胶原分子间按四分之一错列方式超分子聚集形成稳定的韧性很强的原纤 维，原纤维进一步聚集形成胶原纤维。此外，分子内及分子间的共价交联赋予胶 原较高的物理化学稳定性和很多实用的特性，如高拉伸强度、生物降解性能、生 物相容性、低抗原性、低刺激性和低细胞毒性以及促进细胞生长等性能。 1 1 2 胶原蛋白的类型 胶原蛋白是一组由多糖蛋白分子组成的大家族，有着丰富的多样性和组织分 布的特异性，是与各种组织和器官功能相关的功能性蛋白。根据研究，皮肤里含 有胶原4 0 ，骨和软骨里含有1 0 2 0 ，血管里含有7 8 i5 。 胶原蛋白的主要类型为如下： i 型胶原，三螺旋组成为 0 l i ( i ) h a 2 ( i ) ，在骨、皮肤、肌腱和角膜中含量高， 具有很强的抗张能力；i i 型胶原，组成为 q l ( i i ) 】3 ，存在于软骨、椎间盘和玻璃体 中，具有较强的抗压能力：型胶原，组成为 仅l ( i ) 】3 ，广泛分布于伸展性大的组 织中，如疏松结缔组织等，具有伸展性及应变性；i v 型胶原参与基底膜组成，分 2 硕士论文重组类人胶原蛋白基因工程菌发酵动力学 子形式有 a z ( i v ) h a 2 ( 1 v ) 、 a l ( i v ) 3 、【a 2 ( ) 】3 三种；v 型胶原发现于细胞表面和细 胞外骨架，由三条各不相同的a 链组成o l i ( v ) a 2 ( v ) a 3 ( v ) 。不同类型的胶原蛋白由 于肽链的初级结构、即氨基酸组成和顺序不同以及含糖量不同而具有自己特有的 形态和生物学性能的差异。 1 1 3 胶原蛋白的生产 目前，胶原蛋白的生产主要是利用酸碱法或者酶法处理动物来源的组织，从 中提取胶原蛋白 6 1 。但此类动物提取胶原蛋白为水不溶性蛋白，可加工性很弱，并 且提取过程中会或多或少丧失其部分的生物活性，提取的产品有动物疾病( 如口蹄 疫、禽流感等) 或人体传染病( 如病毒性肝炎和艾滋病等) 等病毒隐患，应用于人体 时通常情况下都会产生异体或者异种的排异反应，使移植部位发生无菌性炎症， 从而很大程度限制了胶原蛋白的生产应用【7 j 。 从鱼类等水产品提取胶原蛋白近年来多有报道1 9 d 们。但是，与脊椎动物相比， 鱼类胶原在基本的氨基酸序列上有所差异，鱼胶原的总氨基酸含量较低，导致鱼 胶原的热变性温度较低，并且鱼胶原蛋白很容易引起过敏反应，影响了其应用。 综上所述，异种和异体胶原在人体中的应用具有局限性，并且其提取方法存 在着成本高、污染重、来源受限制和提取量有限的缺点【1 1 l 。鉴于此，人们又考虑 其他生产类人胶原蛋白的方法，其中利用基因工程技术生产重组胶原蛋白是近几 年来该方面的研究热点。随着分子生物学的发展，利用转基因技术和基因重组技 术可以在动物1 2 , 1 3 】、植物1 4 , 1 5 和微生物【1 6 。1 9 1 表达体系获得重组人胶原蛋白明胶， 解决了传统提取方法存在的如疯牛病病毒隐患等缺点，同时也改善了胶原蛋白的 亲水性、免疫排异性等。n o k e l a i n e nm 等【2 0 】使用两种杆状病毒转染的昆虫细胞生 产类人特异性软骨胶原i i 型，表达出具有稳定三维结构的蛋白，产量达到了 5 0 m g m l 。西北大学的范代娣等【2 1 】采用构建基因工程菌技术，将人类胶原蛋白的 段基因重组进e c d ，f 内，再高密度发酵培养生产人源性胶原蛋白，所得重组胶原 蛋白表达量高达2 9 4 。 应用基因工程方法生产类人胶原蛋白具有成本低、速度快、技术简单的优点， 在实际操作中易于实施，将具有更好的性能及更广阔的应用前景。 1 1 4 胶原蛋白的功能 胶原蛋白的功能研究可以追溯到十九世纪初，在整个研究历程中其扮演的重 要角色被一步步阐明和修正【2 2 1 。 胶原蛋白具有很强的生物活性及生物功能，能参与细胞的迁移、分化和繁殖， 使结缔组织具有机械强度，同时胶原蛋白还能促进细胞生长，具有止血、生物相 容性和生物降解性能等。基于这些特性，胶原蛋白在烧伤、创伤、眼角膜疾病、 l 绪论硕士论文 美容、矫形、硬组织修复、创面止血等医药卫生领域有着广泛的应用【2 3 1 。另外， 胶原蛋白也可作为饲料添加剂、絮凝剂、表面活性剂和固定化酶载体材料等应用 于各个工业和实验室领域。 近2 0 年来，随着胶原化学的发展，人们对胶原的结构和性质有了更为清楚的 认识，这使得许多研究者致力于胶原基生物材料的研制，尤其是能应用于医学领 域的生物材料。目前胶原蛋白在生物医学材料中的应用已成为现实，并展示出了 令人鼓舞的发展前景。 生物医学材料是一类对人体细胞、组织、器官具有增强、替代、修复、再生 作用的新型功能材料。生物医学材料的基本要求是：具有生物相容性，要求材 料在使用期间，同机体之间互不产生毒害作用，不引起中毒、溶血、凝血、发热、 过敏等现象；具有生物功能性，在生理环境的约束下能够发挥一定的生理功能； 具有生物可靠性，无毒性，不致癌、不致畸，不引起人体细胞的突变和组织细 胞的反应，有一定的使用寿命，具有与生物组织相适应的物理机械性能；化学 性质稳定，抗体液、血液及酶的作用； 胶原蛋白属于细胞外基质的结构蛋白质，其复杂结构对其独特的生物功能起 决定性作用。胶原蛋白作为生物医学材料应用于医药领域主要是由于以下几方面 的特点【2 4 - 2 7 】： ( 1 ) 低免疫原性 胶原蛋白虽是大分子物质，但其结构重复性大，与其它具有免疫性 ( i m m u n o g e n i e i t y ) 的蛋白质相比，胶原的免疫原性非常低，在l9 5 4 年以前，甚至认 为胶原不具有抗原性。胶原以胶原组织和纯化胶原形式使用时，这一优势更为明 显。最近的研究表明，胶原有3 种类型的抗原因子：第1 类是由胶原肽链非螺旋的 端肽引起的：第2 类是由胶原三股螺旋的构象引起的；第3 类是由a 链螺旋区的氨基 酸顺序引起的。第2 类抗原因子仅存在于天然胶原分子中，第3 类只出现在变性胶 原中，而第1 类抗原因子在天然和变性胶原蛋白中均存在。 研究还发现，i 型胶原的免疫原性比i 型、v 型、型胶原都要低得多，其 组织胶原端肽的免疫原性比螺旋微区以及其它微区都要强，这也是i 型胶原应用 最广的原因之一。因而，在制备可溶性胶原医用产品时，应除去胶原的端肽；但 应用于组织基的胶原材料，则应保留端肽，目的是保存交联位点，赋予组织材料 所需要的完整结构。研究发现用戊二醛交联，可部分降低胶原材料的免疫原性。 ( 2 ) 可生物降解性 胶原蛋白紧密的螺旋结构使得大多数蛋白酶只能打断胶原侧链，削弱胶原分 子的交联，只有在胶原酶的水解作用下胶原肽键才会被打断。肽键一旦断裂，胶 原螺旋结构随即被破坏，断裂的胶原多肽就被蛋白酶彻底水解。胶原酶就是在胶 4 硕士论文重组类人胶原蛋白基因工程菌发酵动力学 原三螺旋区的特殊位点具有切割作用的一类酶，它的作用方式非常专一，切得的 两个片段t c a 和t c b 分别为原来分子长度的3 4 和1 4 ，即胶原酶是在n 端1 4 处切割 的。被切割成的胶原片段，在体温条件下很快自发地变性，这些变性的片段( 肽段) 便能进一步被其它一些酶降解成寡肽或氨基酸，被机体重新利用或代谢排出。胶 原这种能被蛋白酶降解的特性，即可生物降解性，是胶原蛋白能作器官移植材料 被利用的基础。 ( 3 ) 生物相容性 胶原材料与宿主细胞及组织之间良好的相互作用即生物相容性。因胶原蛋白 本身就是构成细胞外基质的骨架，胶原分子特有的三股螺旋结构及其交联形成的 纤维或网络构成细胞重要组成成分，故胶原材料无论是在被吸收前作为形成新组 织的骨架，还是被吸收同化进入宿主，成为宿主组织的一部分，都与细胞周围的 基质有着良好的相互作用，表现出相互影响的协调性，并成为细胞与组织正常生 理功能整体的一部分。 ( 4 ) 机械性能 胶原的机械性能主要是由它的化学组成、交联和螺旋结构所决定。天然胶原 的螺旋结构对胶原高强度的力学性能起重要作用。应力一应变试验表明：天然胶 原表现出弹性态和粘弹态2 个阶段的力学行为；而变性胶原( 没有螺旋结构) 仅表 现出少许弹性态性质，其断裂拉力仅为天然胶原的一半。由此可见，胶原的天然 结构是维持胶原力学性能的关键。 在生物体中，胶原是为结缔组织提供强度的主要蛋白组分，因而可在广范围内 满足肌体对机械强度的要求。 ( 5 ) 止血作用 胶原的止血功能通过两方面发挥作用：促进血小板凝聚和血浆结块。胶原与 血小板之间的作用机理还未完全清楚，但是有关其相互作用的许多现象已经得到 证实。胶原使血小板凝聚的能力似乎来源于游离氨基，尤其是赖氨酸侧链氨基。 封闭胶原羧基，不会造成凝血能力的明显下降，不过却削弱了胶原促使血浆结块 的作用。所以，胶原的天然结构尤其是足够发达的四级结构，是胶原具有凝聚能 力的基础。胶原的止血作用使其可以用作凝血材料，物理形态可以是粉状、片状、 海绵状等。 1 1 5 胶原蛋白在生物医学材料领域的应用 生物医学材料是材料科学的一个重要分支，是生物医学工程学的四大支柱之 一。根据国际标准化组织i s o 在1 9 8 7 年1 0 月专门讨论后的定义，生物医学材料就是 以医疗为目的，用于和活组织接触以形成功能的无生命材料，包括那些具有生物 5 1 绪论 硕士论文 相容性或生物降解性的材料。 生物医学材料研究的最终目的代替和修复人体器宫和组织，并实现其生理功 能。人工器官从1 9 4 0 年开始用于临床至今，除大脑之外几乎对所有的人工器官都 已进行了研究和应用。在经济发达的国家利用生物医学材料制造医疗用品和人工 器官已分普遍，在我国也越来越受到重视。但是，生命体的器官具有生长、再生 和修复的能力，从这个基点出发来评价目前的生物医学材料和人工器官都显得很 不完善，因为它们仅能代行或模拟生物体的某些性能。为了使生物医学材料与机 体组织界面能在长期功能作用下保持稳定并参予物质代谢，充分发挥正常生理作 用，生物医学材料和人工器官的生物活化的研究具有十分诱人的发展前景。 止血材料：胶原蛋白与血小板结合，可激活血液凝固因子，形成血栓阻止流 血，是很好的止血剂。其止血产品主要有胶原海绵、微晶胶原、粉状及片状的胶 原止血剂等。胶原海绵是由胶原蛋白溶液经发泡、固化、冻干和灭菌而制成的一 种海绵状固体制剂【2 引，其中胶原溶液质量浓度一般为0 1 5 ，可通过其浓度来 控制冻干胶原海绵的多孔结构，通过加入交联剂、强性蛋白、纤维结合素或氨基 多糖来增加胶原海绵的弹性。胶原海绵的临床应用已包括普通外科、心血管外科、 整形外科、泌尿外科、骨科、皮肤科、烧伤科、妇产科以及口腔科、耳鼻喉科、 眼科等几乎所有的手术。国内过去多采用明胶海绵止血，但明胶海绵仅能提供一 个人工止血表面，吸收血液后膨大，然后破坏血小板促进凝血块的形成，从而达 到止血目的。所以其止血时间长、黏附性差、较易脱落。明胶海绵需要机体的凝 血因子参与才能获得最后的止血效果，故合并凝血功能障碍时，止血效果往往不 理想。而胶原蛋白海绵中的胶原纤维结构能有效地吸附血小板、诱导血小板聚集、 产生释放反应，从而激活生理性止血机制；形成的凝块粘着在渗血的创面上，对 损伤的血管起填塞作用。其次，胶原的纤维结构有利于血细胞黏附，在其上面形 成血栓凝块和血痂，在破损的创面血管上堆积了障碍物，有效地防止血流冲开破 损的伤口而达到止血目的。另外，胶原蛋白海绵还能诱导生长因子移行，促进上 皮细胞和内皮细胞分化，有利于受损组织的再生和功能恢复。所以现在临床上已 较多使用胶原海绵。 叶春婷等【2 9 l 以壳聚糖、胶原为主要原料，研制一种新型的创伤敷料，并对其 在临床上的应用进行初步的探讨。首先制备高纯度的胶原蛋白溶液，使之与壳聚 糖溶液键合，冷冻干燥成为海绵体。然后进行毒理学检测，包括急性毒性试验、 刺激性试验、过敏性试验和溶血性试验，并在骨科的开放性创面上进行了临床试 验。壳聚糖胶原海绵的毒理学试验均呈阴性，在临床上有促进创面愈合，阻止渗 液溢出的功效。因此，所研制的壳聚糖胶原海绵无毒副作用，具有良好的临床疗 效，具备推广应用的前景。 6 硕士论文重组类人胶原蛋白基因工程菌发酵动力学 易石坚等【3 0 】探讨医用胶原蛋白海绵对重度肝破裂创面的治疗作用。其方法是： 将重度肝破裂患者以入院先后为序随机分成治疗组( 6 8 例) 和对照组( 6 4 例) ，分别用 医用胶原蛋白海绵片和明胶海绵片对肝创面进行止血和填塞。结果显示胶原蛋白 海绵对肝创面止血效力强于明胶海绵，与创面的黏附力强，术后并发症少，恢复 快，是一种治疗肝破裂的有效、安全而可靠的生物材料。 缓释材料：目前比较成功的应用除作一般体内药物缓释载体外，主要用作眼 科的药物缓释载体，以及有生物活性的多肽蛋白类药物的载体，如生长因子等。 胶原作为缓释材料与骨形成蛋白( b o n em o r p h o g e n e t i ep r o t e i n ，b m p ) 结合，可明显 促进b m p 活性的发挥，对机体硬组织修复有重要意义。胶原还可作为其他活性物 质的缓释载体，比如激素、疫苗等。 胶原膜作为眼内的药物递质、缓释药库的作用也备受关注。为了在眼内达到有 效的药物浓度和维持一定的作用时间，需要适合的缓释载体。将药物分子嵌入胶 原膜中，药物能完全有效地通过胶原膜和角膜相接触，随着胶原膜的逐步降解， 药物也就逐步释出，起到缓释作用【3 1 1 。载药胶原膜常用于眼科手术后、角膜炎症 及创伤等。 组织工程：胶原蛋白广布于人体各组织中，是各组织的重要成分，其性质是 一种天然的组织支架材料。组织工程的实质是研究开发具有生理功能的组织器官， 然后植入机体作为修复、维持或改善受损组织器官的替代物，它涉及的范围包括 人工皮肤替代物、可移植的细胞聚合物基质、骨组织、血管支架及人工器官等。 其基本方法是：将正常组织细胞扩增后在体外培养，随后吸附于一种生物相容性 良好，可生物降解吸收的生物材料上，形成具有三维空间结构的复合体，然后将 细胞一生物材料复合体植入体内受损的部位，细胞在生物材料逐渐被机体降解吸 收的过程中仍然继续生长繁殖，形成新的具有相应形态和功能的组织器官，达到 修复创伤和重建的目的【3 2 】。成洪泉等【”】探索胶原海绵作为骨组织工程支架材料的 可行性。其采用的方法是将人骨髓基质成骨细胞以1 1 0 7 m l 的密度接种于胶原海 绵上进行体外培养，用相差显微镜、光镜、扫描电镜观察细胞在胶原海绵上的生 长、增殖情况。结果：体外复合培养l d 后，成骨细胞即开始粘附于胶原海绵上， 培养7 d 后，分布于胶原海绵上的细胞增殖并分泌e c m 。实验结果表明胶原海绵 可作为成骨细胞体外复合培养的支架材料。 胡葵葵等【3 4 】探讨了利用胶原海绵膜构建人工真皮的可行性，方法是从大鼠鼠 尾肌腱中提取胶原，然后将胶原和6 硫酸软骨素冷冻干燥，重度脱水及戊二醛交 联后制得胶原海绵膜，将成纤维细胞种植于该支架上并埋藏在b a l b e d 、鼠皮下，术 后定期取出观察组织学变化。结果显示，构建的支架孔径均匀，孔径在5 0 1 0 0 u m ， 具有良好的组织相容性，并逐渐降解，成纤维细胞于其上生长良好，所以该支架 7 l 绪论硕士论文 适合成纤维细胞生长，可作为组织工程皮肤的支架。 除以上介绍的3 个方面的应用外，胶原蛋白在生物医学材料领域还有其它的 应用，如人工骨、美容、降血压剂及癌症诊断等【3 5 1 。 1 2 毕赤酵母高密度发酵概况 巴斯德毕赤酵母表达系统l j 沪川1 是近年发展起来的一种优秀的真核表达系统， 在表达异源蛋白上具有诸多优点：第一，外源基因不是存在于自主复制的表达载 体中，而是和表达载体一起整合在酵母染色体上，随染色体一起复制和遗传，不 会发生外源基因的丢失现象；第二，毕赤酵母为单细胞真核生物，生长快，易于 分子遗传学操作；第三，毕赤酵母细胞的过氧化物酶体中含有甲醇代谢途径的必 需酶( 醇氧化酶、二羟丙酮合成酶和过氧化氢酶等) ，其中醇氧化酶( a o x ) 是甲醇 利用途径中的第一个酶，它催化甲醇氧化成甲醛和过氧化氢，有a o x l 和a o x 2 两 个基因编码，毕赤酵母表达系统使用的醇氧化酶i ( a o x l ) 基因的启动子具有强诱导 性和强启动性，可有效调控外源基因的高效表达：第四，毕赤酵母具有强烈的好 氧生长偏爱性，可进行细胞高密度培养，利于大规模工业化生产；第五，毕赤酵 母可高水平分泌表达外源蛋白，发酵产物的累积不会对其产生毒副作用，并且毕 赤酵母自身分泌到培养基中的蛋白很少，纯化方便。这些优点注定了毕赤酵母具 有可用于高密度发酵的巨大潜力。 高密度发酵是基因工程菌提高外源蛋白表达量的重要策略之一。山根恒夫【3 8 j 认为酵母细胞在发酵液中理论最大密度为2 8 0 9 d c w l ( d r yc e l lw e i g h t ，d c w ) ，在 工业发酵时细胞浓度j 妊u 3 0 9 l 以则认为是高密度发酵，目前发酵过程中一般认为 酵母细胞密度为1 0 0 - 一2 0 0 9 0 c w l 1 则为高密度发酵。摇瓶及发酵罐高密度发酵表达 外源蛋白的影响因素主要有培养基成分、搅拌速度、通气量、温度、p h 值、溶氧、 甲醇流加等工艺。 1 2 1 高密度发酵的影响因素 高密度发酵条件下的培养基组成及含量直接影响细胞的生长及外源基因的表 达。在毕赤酵母高密度发酵时，大多数采用i n v i t r o g e n 公司提供的b m g y b m m y 、 b m g b m m 培养基，其中含有磷酸盐缓冲液，常用来表达分泌蛋白，适用于外源 蛋白活性受p h 影响较大的情况，可以维持在一定p h 范围内获得最佳的蛋白表达 量。对于容易受蛋白酶降解的分泌型表达蛋白。一般就要在培养基中添加含有蛋 白胨或者酵母粉的培养基，以防止或减少目的蛋白的降解。培养基中营养物质的 含量也要保持在适当的范围内，基质浓度过低菌体得不到充足营养，就达不到高 密度发酵的目的。而基质浓度过高则有可能抑制目的产物的表达，导致生产效率 8 硕士论文重组类人胶原蛋白基因工程菌发酵动力学 下降。优化培养基中的组分( 碳源、氮源等) 及其配比可以满足细胞旺盛的生长 对基质的消耗，最终获得高密度发酵表达的理想结果。刘彦丽等 3 9 1 研究了毕赤酵 母基因工程菌高密度培养条件，在全合成培养基的基础上考察了诱导过程中添加 微量元素p t m l 、油酸、甲醇加量及p h 等因素对重组人血清白蛋白表达的影响。发 现p t m l 能显著提高白蛋白的表达，6 m l l 。1 时蛋白表达量最大添加，添加0 0 5 的 油酸( 作消泡剂) 也有效提高了蛋白表达量。 培养基的p h 值不论对茵体生长还是对目的蛋白的分泌表达都是相当重要的。 发酵培养基的p h 对微生物的生长繁殖和产物合成的影响有以下三个方面：一，影 响酶的活性，当p h 值抑制菌体中某些酶的活性时，会阻碍茵体的新陈代谢：二， 影响微生物细胞膜的通透性，使微生物对营养物质的吸收及代谢产物的排泄产生 阻碍作用；三，影响培养基中某些组分和中间代谢产物的状态，使微生物对这些 物质的利用受到影响。毕赤酵母在p h 值3 7 的范围内均可生长，当控f 1 l j p h 恒定( 5 0 ) 时菌体量及表达量都达到最高，都p h 值超过7 ，即培养基呈碱性时菌体生长和表达 外源蛋白均很不理想。一般b m m 培养基的初始p h 为5 5 ( 自然状态) ，当p h 在5 0 左右改变1 个单位或以上，菌体诱导后对目的蛋白的表达量就能受很大影响。毕赤 酵母高密度发酵过程中p h 的调控是通过在线补加氨水和盐酸来平衡酸碱性进行 的。在基因工程菌的分泌表达外源蛋白过程中，有些蛋白对p h 值比较敏感，容易 受到蛋白水解酶的水解，此时就必须选择合适的p h 值，既可以使菌体高效表达目 的蛋白又能抑制蛋白酶的水解。 温度对毕赤酵母的影响主要涉及发酵产物的活性、发酵液的物理性质( 溶解 氧量、基质的分解吸收速率等) 及酵母对产物的合成等。从酶动力学角度看，温 度升高，反应速率加大，生长代谢加快，生产期提前。但温度过高，又易使酶因 热而失去活性，表现在菌体易于衰老，发酵周期缩短，影响产物的产量。据报道， 毕赤酵母的最适生长温度为2 8 ，表达外源蛋白的最适温度为3 0 ，若温度超过 3 2 ，则对蛋白表达非常不利。 发酵培养基中溶氧量( d o ) 对于好氧微生物生长来说是非常重要的，在发酵过 程中提供充足的氧气供应，满足生产菌对氧的需求，这是提高菌体发酵表达量的 重要因素。高密度发酵过程中，有报道认为如果用发酵罐进行培养，外源蛋白的 表达水平要比普通摇瓶高出1 0 1 0 0 倍，其原因主要有：在试管或摇瓶中培养时 缺乏有效的p h 值调控；通气量不足，氧气的供应不能满足菌体生长及代谢的需 要：不能控制碳源的供给速度使其达到最佳浓度水平。这些原因中最主要的就 是因为普通摇瓶发酵的通气不理想，氧气供应不足，影响了菌体的高密度生长， 自然表达量也就很低。毕赤酵母是好氧微生物，它的生长代谢过程需要氧气的参 与，溶解氧浓度的浓度过高或过低都会影响毕赤酵母的代谢，使后期的生长变得 9 l 绪论硕士论文 极为缓慢。所以在生长初期就应保证足量的氧供应，一般在菌体生长扩增阶段， 发酵罐内溶氧水平要保持在3 0 左右为佳，最多不超过6 0 ，否则细胞就会发生氧 中毒，影响菌体的生长及外源基因的表达。而在诱导表达阶段，一般要维持溶氧 水平在2 0 左右，同样，过高或过低的溶氧水平都不利于菌体对外源蛋白的高效表 达。茵体大量扩增时会耗氧进行氧化分解代谢，随发酵时间的延长，菌体密度增 加迅速，溶氧浓度随之下降，提高发酵罐内溶氧水平的方式主要有：增加通入发 酵体系的空气量、增大罐压、增加搅拌转速、甚至直接通入纯氧。因为高密度发 酵的后期，由于菌体密度的指数型扩增，对氧气的需求量极大，此时通过提高空 气流量和搅拌转速对溶氧水平提高的贡献已经微乎其微了，此阶段只有通过向发 酵罐内通入纯氧的方式来提高溶氧水平，否则菌体的生长繁殖就会受到很大抑制。 张建勇等【4 0 】考察了发酵液中不同的溶氧浓度对重组毕赤酵母高密度发酵生产腺苷 蛋氨酸( s a m e ) 的影响，当溶氧控制在3 0 左右时，细胞生长迅速，并且甘油得到 充分氧化，在腺苷蛋氨酸合成酶的作用下合成了腺苷蛋氨酸，从而获得了腺苷蛋 氨酸的高浓度表达，最终发酵结束时s a m e 产量达到了2 1 3 9 l 。由此可见，使溶 氧保持在有利于外源蛋白高效表达的范围对于高密度发酵来说是非常重要的。 毕赤酵母高密度发酵常采用两阶段培养法。第一阶段为积累生物量的间歇生 长期，以甘油作为碳源来扩增茵体，当培养基中甘油消耗殆尽时，就转入甘油的 流加阶段来继续增大菌体浓度至一定值。当菌体处于“甘油饥饿状态约半小时 后开始进入第二阶段一一甲醇的流加阶段。毕赤酵母是甲醇营养型酵母，能在以 甲醇为唯一碳源和能源的培养基中生长和表达，甲醇做碳源可诱导毕赤酵母表达 外源基因，但甲醇流加不足或过量都会影响到毕赤酵母表达外源蛋白的水平，高 浓度的甲醇抑制细胞的生长和产物表达，合适的策略来控制甲醇流加是提高外源 蛋白表达量的关键，一般调控甲醇的流加有以下几种方法：首先是最常见的根据 溶氧控制甲醇流加的方法。微生物发酵过程中，溶氧是反映碳源消耗情况的一项 很重要的指标。当发酵罐内碳源消耗殆尽，溶氧就呈上升状态，此时向发酵罐补 加碳源，微生物利用碳源会消耗氧，使得溶氧下降。依照此原理，可根据发酵体 系内溶氧的变化来判断碳源的消耗情况，以做出是否向系统流加营养基质的决定。 如果某一时刻甲醇流加过量导致细胞的生长受到抑制，则菌体的耗氧速率下降， 表观上d o 会上升，使人误以为是甲醇浓度较低，从而增大流加速率，结果使甲醇 浓度越来越高。因此利用溶氧控制毕赤酵母发酵过程中甲醇的流加不是一种非常 有效的方法。 所以产生了一种甲醇一甘油混合流加的方法，此方法对诱导阶段甘油的流加量 有严格的控制，一般要使流加的甘油的量刚好用于菌体生长，而发酵液中的甘油 没有残留时为最佳。因为只有这样甘油才不会对a o x 启动子的表达产生抑制作用， 1 0 硕士论文重组类人胶原蛋白基因工程茵发酵动力学 同时又增加了毕赤酵母用于生长的营养，使毕赤酵母在表达外源蛋白的同时还在 继续进行扩增。目前国外有很多成功使用此方法获得了各种外源蛋白在毕赤酵母 中的高效表达的报道。此法的关键是要实时监测发酵系统中甘油的含量，根据监 测到的培养基中的甘油残留量及时调整甘油的流加速率。国外一些学者对毕赤酵 母发酵体系中甘油含量的监测方法主要是随时取样进行h p l c 、狈0 定，这种方法工作 量大，且难以获得最好的表达效果。四川农业大学的谢子文等【4 1j 在用毕赤酵母工 程菌高密度产植酸酶的研究中，对甘油残留浓度的测定采用高碘酸钠氧化法，原 理是高碘酸定量将甘油氧化为甲醛，甲醛可与变色酸发生特定反应，生成红色化 合物，在一定浓度下颜色深浅与甲醛浓度成正比，在煮沸避光下充分显色，然后 用7 5 2 型分光光度计在波长6 7 0 n m 下比色。经过1 2 d , 时甘油补料，菌体密度o d 6 0 0 达到了1 4 5 。 此外还有通过气相色谱监测控制甲醇流加的方法。从开始流加甲醇后每隔1 h 取样，然后用气相色谱离线检测甲醇浓度。若甲醇浓度超过设定值，则降低甲醇 的流加速率，使甲醇浓度控制在设定值以下。在毕赤酵母发酵水蛭素过程中，用 此法控制甲醇流加比通过d o 控制流加时细胞量增加了2 0 5 。由于整个过程中没 有出现过量甲醇的抑制，相对于d o 控制流加，通过气相色谱控制甲醇流加水蛭素 产量提高了4 7 4 。但由于离线检测的滞后性，很难精确控制甲醇的流加，导致甲 醇浓度的波动较大，时高时低。文献报道，毕赤酵母m u t + 菌株对瞬间甲醇浓度的 变化非常敏感，这些变化会使甲醇氧化酶失活，a o x 的失活会影响细胞对甲醇的 利用，甚至导致细胞死亡。因此使发酵液中的甲醇浓度维持恒定非常重要。另外， 离线检测需经常取样分析，这也限制了这种方法的实际应用。 谢静莉等【4 2 j 在采用m u t 8 表型基因重组巴斯德毕赤酵母( p i c h i ap a s t o r i s ) 发酵生 产血管生长抑制因子( a n g i o s t a t i n ) 的过程中，诱导表达阶段甲醇时按文献方法流加 甲醇时，甲醇逐渐积累达3 0 9 l ，血管生长抑制素表达水平仅4 m g l 一。采用甲醇 检测与控制系统对甲醇流加进行反馈控制后，甲醇质量浓度可稳定控制在设定范 围。采用此系统控制诱导阶段的甲醇流加，同时手动流加适量甘油以促进细胞生 长，血管生长抑制因子表达水平量最高可达8 9 m g l 。 1 2 2 高密度发酵动力学 生物反应动力学是有关生物的、化学的与物理过程之间的相互作用，诸如生 物反应器中发生的细胞生长、产物生成、传递过程等。生物反应过程的效率决定 于以下几个方面：生物催化剂的性能，反应过程的工艺控制和操作条件，以及反 应器的性能，对生物反应动力学特征的研究和分析，是生物过程研究的重要内容。 生物反应动力学研究 4 3 - 4 5 j 主要包括细胞生长、底物( 营养物) 消耗和产物生成 l 绪论硕士论文 之间的关系和特点，其中底物消耗和产物生成受微生物生长状态及代谢途径的影 响很大。被摄入到微生物细胞内的底物中，一部分转化为代谢产物，还有一部分 转化为新生细胞的组成物质。因此对微生物反应动力学进行研究至少要对底物、 菌体和产物三个状态变量进行数学描述。在推导这三个状态变量的变化速率方程 时，依据普通化学反应的简单质量作用定律很难解决问题，因为微生物细胞的生 长、繁殖及代谢是一个极其复杂的生物反应过程，该过程既包括细胞内的生化反 应，也包括胞内与胞外的物质交换，还包括胞外的物质传递及反应。该体系具有 多相、多组分、非线性的特点。同时细胞的培养和代谢还是一个复杂的群体生命 活动，每个细胞都经历着生长、成熟直至衰老的过程，因此要对这样一个复杂的 体系进行精确的描述几乎是不可能的。为了工程上的应用，首先要进行合理的简 化，在简化的基础上建立过程的物理模型，再据此推出数学模型。 主要简化的内容有下述几点： 第一，细胞反应动力学是对细胞群体的动力学行为的描述，而不是对单一细 胞进行描述。所谓细胞群体是指细胞在一定条件下的大量聚集。 第二，不考虑细胞之间的差别，而是取其性质的平均值，在此基础上建立的 模型称为确定论模型；如果考虑每个细胞之间的差别，则为概率论模型。 第三，细胞的组成也是复杂的，含有蛋白质、脂肪、核酸、碳水化合物等， 而且这些成分的含量大小随环境条件的变化而变化。如果考虑细胞组成的变化而 建立的模型为结构模型，该模型能从机理上描述细胞的动态行为，但由于细胞反 应过程的复杂性，加上检测手段的限制，给动力学的研究带来了困难，致使此模 型的应用受到限制。 如果把细胞视为单组份，则环境的变化对细胞的影响可忽略，在此基础上建 立的模型称为非结构模型。它是在实验研究的基础上，通过物料衡算建立起来的 经验或半经验的关联模型。 在细胞的生长过程中，如果细胞内各种成分均以相同比例增加，则成为均衡 生长。如果由于各组分的合成速率不同而使各组分增加的比例也不同，则称为非 均衡生长。从模型的简化考虑一般采用均衡生长的非结构模型。 第四，如果将细胞作为与培养液分离的生物相处理所建立的模型称为分离化 模型，一般在细胞浓度很高时常采用此模型。若把细胞和培养液视为均相一一 液相，则在此基础上建立的模型为均一化模型。 生物反应动力学研究的目的是为描述细胞动态行为提供数学依据，以便进行 数量化处理，有助于制订合理的工艺控制策略，提高反应的效率，达到对发酵过 程进行优化的目的。一般优化应遵循的基本原理和步骤有：简化、定量化、分离、 建模型，最后把分离开的现象重新组合起来。其中定量化需要系统、准确地检测 1 2 硕士论文重组类人胶原蛋白基因工程菌发酵动力学 各种参数，对发酵过程分析方法的选择可以保证测定结果的可用性和代表性能够 满足优化的要求。数学建模以简化的形式表征过程行为，其主要目标有：预见系 统转化率或生产率；检查各种操作条件下的工厂操作的性质和行为，检查模型适 用的范围( 包括外推性) ；进行工艺优化和计算机模拟；检测出可能重要但被忽 略了的参数；有助于阐明反应机理。 1 3 类人胶原蛋白的分离纯化 生物技术产品的分离纯化方法多种多样1 4 扣驯j ，但是分离提纯流程具有共同的 特点，一般包括预处理，细胞破碎( 对胞内产物) 、初步分离、提纯及成品加工等步 骤。大多数生物产品下游加工过程都需要经过多步分离纯化手段才能得到最终理 想纯度的产品，过程中的每一个分离步骤都会带来一定的产品损失。为了提高总 回收率