（遗传学专业论文）银杏中gbmecps基因与荠菜中cbcax51基因的克隆与研究.pdf

摘要 银杏内酯被认为是目前最有临床应用前景的天然血小板活化因子( p l a t e l e t a c t i v a t i n gf a c t o r , p a n 受体拮抗剂，对心脑血管疾病有良好的疗效，其独特的生理 作用和治疗价值在世界范围的医疗行业引起了极大兴趣。然而，银杏内酯在银杏 中含量较低，且银杏的细胞培养系很少产银杏内酯。因此，在分子水平上阐明银 杏内酯的生物合成途径，对今后利用代谢工程技术提高银杏中银杏内酯的含量具 有重要意义。 本文利用r a c e 。p c r 技术，成功地克隆了银杏内酯合成途径中催化第五步 反应的酶2 c 一甲基赤藓醇2 ，4 环焦磷酸合成酶( m e c p s ) 的基因，并对其进 行了研究。g b m e c p s 基因全长c d n a 为8 7 4b p ，含有一个7 2 0b p 的开放阅读框 ( o r f ) ，编码一个由2 3 9 个氨基酸残基组成的蛋白质；预测的分子量约为2 6 0 3 k d a ，等电点( p i ) 为8 8 3 。同源比对与生物信息学分析表明，g b m e c p s 蛋白与 其它物种的m e c p s 蛋白具有较高的同源性，并且具有m e c p s 蛋白家族的保守 区域。系统发生树分析表明，g b m e c p s 蛋白在进化上比其它绝大多数植物的 m e c p s 蛋白更为古老。组织表达分析表明，g b m e c p s 基因在根中表达量最高， 叶中其次，在果实中表达量最低。功能验证试验表明，g b m e c p s 蛋白能够促进 b 类胡萝b 素的产生与积累。g b m e c p s 基因的克隆与研究为进一步了解g b m e c p s 在银杏内酯生物合成途径中的作用打下了基础。 c a 2 + 是植物细胞中重要的“第二信使”，在植物的许多生理过程中起着重要 的作用，精确地调控c a 2 + 在细胞质中的浓度是植物抵御生物或非生物逆境的基本 手段，而c a 2 + 小+ 反向转运予是调节c a z + 信号持续时间的重要元件之一。 本文利用r a c e p c r 技术，从荠菜中克隆了一个钙氢泵基因c b c a x 5 。该 基因的e d n a 全长为1 7 5 4b p ，含1 3 9 8b p 的开放阅读框，编码个由4 6 6 个氨 基酸残基组成的蛋白，预测其分子量为5 0 5k d a ，等电点为5 6 9 。同源分析表明， 荠菜的c b c a x 5 1 蛋白与其它植物的c a x 蛋白同源性较高。生物信息学分析表 明，荠菜的c b c a x 5 1 蛋白与拟南芥的c a x l 蛋白相似，具有1 1 个跨膜区。冷 诱导实验表明，c b c a x 5 1 基因的表达随冷处理时间而增强，提示c b c a x 5 1 基因可 能与植物抗冻有关。c b c a x 5 1 基因的克隆为进一步研究c b c a x 5 1 在植物抗逆中的 作用打下了基础。 关键词：功能互补试验，银杏，2 - c - 甲基赤藓醇- 2 ，4 - 环焦磷酸合成酶( m e c p s l 基因，r a c e ，r t - p c r ，荠菜，钙氢反向转运子 a b s t r a c t g i n k g o l i d e sa r et h em o s tp o t e n ta n t a g o n i s t so fp l a t e l e t a c t i v a t i n gf a c t o rr e c e p t o r s w h i c hh a v e b e e nw i d e l yu s e da s p l a t e l e t a c t i v a t i n g f a c t o r r e c e p t o r s t oc u r e c e r e b r o v a s c u l a ra n dc a r d i o v a s c u l a rd i s e a s e s g i n k g o l i d e sh a v ea t t r a c t e dg r e a t c o m m e r c i a li n t e r e s t sa sp h a r m a c e u t i c a l so rn u t r a c e u t i c a l s h o w e v e rt h ec o n t e n t so f g i n k g o l i d e sa r ev e r yl o wi nt h en a t i v eg i n k g op l a n tm a t e r i a l sa n dt h eg i n k g oc e l l c u l t u r e sh a r d l yp r o d u c eg i n k g o l i d e s t h e r e f o r e ，t os t u d yt h eg i n k g o l i d e sb i o s y n t h e t i c p a t h w a ya tm o l e c u l a rl e v e lm a yl e a dg i n k g o l i d e sp r o d u c t i o nt oab r i g h tp a t h 2 c m e t h y l d e r y t h r i t o l2 ，4 - c y c l o d i p h o s p h a t es y n t h a s e ( m e c p s ，e c ：4 6 1 1 2 ) i s t h ef i f t he n z y m eo ft h en o n - m e v a l o n a t e t e r p e n o i dp a t h w a yf o ri s o p e n t e n y l d i p h o s p h a t eb i o s y n t h e s i sa n di si n v o l v e di nt h em e t h y l e r y t h r i t o lp h o s p h a t e ( m e p ) p a t h w a y f o r g i n k g o l i d eb i o s y n t h e s i s t h ef u l l l e n g t hm e c p sc d n as e q u e n c e ( d e s i g n a t e da sg b m e c p s ，g e n b a n ka c c e s s i o nn o ：a y 9 7 1 5 7 6 ) w a sc l o n e da n d c h a r a c t e r i z e df o rt h ef i r s tt i m ef r o mg y m n o s p e r mp l a n ts p e c i e s ，g i n k g ob i l o b a ，u s i n g r a c e ( r a p i da m p l i f i c a t i o no fc d n ae n d s ) t e c h n i q u e t h ef u l l l e n g t hc d n ao f g b m e c p sw a s8 7 4b pc o n t a i n i n ga7 2 0b po p e nr e a d i n gf r a m e ( o r e ) e n c o d i n ga p e p t i d eo f2 3 9a m i n oa c i d sw i t hac a l c u l a t e dm o l e c u l a rm a s so f2 6 0 3k d aa n da n i s o e l e c t r i cp o i n to f8 8 3 c o m p a r a t i v ea n db i o i n f o r m a t i ca n a l y s e sr e v e a l e dt h a t g b m e c p sh a de x t e n s i v eh o m o l o g yw i t hm e c p s sf r o mo t h e rs p e c i e sa n dc o n t a i n e d c o n s e r v e dr e s i d u e so w n e db yt h em e c p sp r o t e i nf a m i l y p h y l o g e n e t i ca n a l y s i s i n d i c a t e dt h a tg b m e c p sw a sm o r ea n c i e n tt h a no t h e rp l a n tm e c p s s e x p r e s s i o n p a t t e r na n a l y s i si n d i c a t e dt h a tg b m e c p se x p r e s s e dt h eh i g h e s ti nr o o t s ，f o l l o w e db yi n l e a v e s ，a n dt h el o w e s ti ns e e d s t h ec o l o rc o m p l e m e n t a t i o na s s a yi n d i c a t e dt h a t g b m e c p sc o u l da c c e l e r a t et h ea c c u m u l a t i o no fb - c a r o t e n e t h e c l o n i n g ， c h a r a c t e r i z a t i o na n df u n c t i o n a la n a l y s i so fg b m e c p sw i l lb eh e l p f u lt ou n d e r s t a n d m o r ea b o u tt h er o l eo fm e c p si n v o l v e di nt h eg i n k g o l i d e sb i o s y n t h e s i sa tm o l e c u l a r l e v e l c a 2 + i s 缸i m p o r t a n ts e c o n dm e s s e n g e ri nc e l l so fp l a n t s c a l c i u m ( c a 2 + ) l e v e l si n t h ec y t o s o lf l u c t u a t ei n r e s p o n s e t o g r o w t h ，d e v e l o p m e n ta n de n v i r o n m e n t a l p e r t u r b a t i o n s r e g u l a t i n gc a l c i u m ( c a “) l e v e l si nt h ec y t o s o la c c u r a t e l yi si m p o r t a n t f o rp l a n t st os u r v i v ei ne n v i r o n m e n t a lp e r t u r b a t i o n s ，a n dt h ec a 2 + h + a n t i p o r t e rh e l p s t or e g u l a t et h el e v e l so fc a l c i u mi o ni nt h ec y t o s 0 1 an e wc a 2 + h + a n t i p o r t e rg e n ew a sc l o n e da n dc h a r a c t e r i z e df o rt h ef i r s tt i m e n f r o mc a p s e l l ab u r s a - p a s t o r i sb yr a c e t h ef u l l l e n g t he d n ao fcb u r s a - p a s t o r i s c o xg e n e ( d e s i g n a t e da sc b c o x 5 1 ，g e n b a n ka c c e s s i o nn o ：a y 6 6 0 8 7 0 ) w a s1 7 5 4b p c o n t a i n i n ga1 3 9 8b po p e nr e a d i n gf r a m ee n c o d i n ga4 6 6 - a m i n o - a c i dp r o t e i nw i t ha c a l c u l a t e dm o l e c u l a rm a s so f5 0 5k d aa n da ni s o e l e c t r i cp o i n to f5 6 9 c o m p a r a t i v e a n db i o i n f o r m a t i ca n a l y s e sr e v e a l e dt h a tc b c a x 5 1h a de x t e n s i v eh o m o l o g yw i t h c a x sf r o mo t h e rp l a n ts p e c i e s c o l da c c l i m a t i o na s s a yi n d i c a t e dt h a tc b c a x 5 1c o u l d b ea c t i v a t e db yc o l dt r i g g e r i n ga n dw a sr e l a t e dt ot h ec o l da c c l i m a t i o np r o c e s s t h e c l o n i n ga n dc h a r a c t e r i z a t i o no fc b c a x 5 1p r o v i d e sb a s i sf o rf u r t h e rs t u d y i n gi t s f u n c t i o n si np l a n t ss t r e s st o l e r a n c ei nt h ef u t u r e k e y w o r d s ：c o l o rc o m p l e m e n t a t i o na s s a y , g i n k g ob i l o b a ，2 c m e t h y l d - e r y t h r i t o l2 ， 4 - c y c l o d i p h o s p h a t es y n t h a s e ( m e c p s ) g e n e ，r a c e ，r t - p c r ，c a p s e u a b u r s a - p a s t o r i s ，c a 2 * n + a n t i p o r t e r 1 i i 复旦大学硕士学位论文 银杏中g b m e c p s 基园与荠菜中c b c a x 5 1 基凼的克隆与研究 缩写词表 l i s to fa b b r e v i a t i o n 复臼大学硕士学位论文银杏中g b m e c p s 基因与齐椠中c b c a x 5 1 基因的克隆与研究 第一章文献综述 第一部分萜类物质银杏内酯的研究进展 1 1 萜类物质生物合成途径研究进展 萜类化合物( t e r p e n o i d s ) ，又称为异戊烯类化合物( i s o p r e n o i d s ) ，是植物天然 产物中最大的一类化合物，至今已有3 0 0 0 0 多种萜类化合物为人们所了解。它们 有着诸多重要的生物学功能，不仅调控植物的生长发育，影响植物的光合作用， 参与氧化还原反应，而且是植物中重要的次生代谢物质。有很多萜类化合物都有 着重要的经济价值，例如银杏内酯、紫杉醇、青蒿素等在临床上有着巨大的应用 价值；松香、橡胶、树脂等是重要的香料和化工原料的来源。 所有天然萜类，包括二萜烯类物质银杏内酯在内，都来自于两个基本的5 碳 通用前体：异戊烯基焦磷酸0 p p ) 和二甲基烯丙基焦磷酸( d m a p p ) 。按照参与组 成萜类5 碳单位前体数量的不同j 可以把萜类分为不同类型：只有一个5 碳单位的 半萜( 5 c ) ，2 个5 碳单位组成的单萜( 1 0 c ) ，3 + 5 碳单位的倍半萜( 1 5 c ) ，4 个5 碳单 位的二萜( 2 0 c ) ，6 + 5 碳单位的三萜( 3 0 c ) ，以及更多碳单位的多萜等( d e w i c k ， 2 0 0 2 ) 。虽然植物萜类都来源于异戊烯焦磷酸0 p p ) 和二甲基烯丙基焦磷酸 ( d m a p p ) ，但植物可以利用两条截然不同的途径来合成萜类：一条是经典的m v a 途径，位于细胞质，一般主要合成固醇、倍半萜和三萜等；另一条是既m 、a 途 径之后，新近发现的m e 咖) ( p 途径，位于质体，主要合成半萜、单萜、二萜及 四萜类，例如胡萝b 素、质体醌等等。虽然这两条途径在植物细胞中的定位不同， 所涉及到的基因和酶也不同( b i c ke ta 1 ，2 0 0 3 1 ，但是前体之间具有一定程度的交 流，这种交流与植物种类、外部前体的存在及其浓度有关( e i s e n r e i c he ta 1 ，2 0 0 1 ： r o d r f g u e z c o n c e p c i 6 na n db o r o n a t2 0 0 2 ) 。 1 1 1 萜类物质的m v a 生物合成途径 细胞质中的萜类衍生自通过c 0 2 固定得来的乙酰c o a 。两个乙酰 c o a ( a c e t y c o a ) 分子在乙酰c o a ：乙酰c o ac 一酰基转运酶( a c e t y l c o a ： a c c t y l c o ac a c e t y l t r a n s f e r a s e ，a a c t ，e c2 3 1 9 1 催化下缩合生成乙酰乙酰 c o a ( a c e t o a c e t y l c o a ) ( g u a le a 1 ，1 9 9 2 ) ，乙酰乙酰c o a 与乙酰c o a 在3 一羟基一3 一 甲基戊二酰c o a 合成酶o - h y d r o x y - 3 一m e t h y l g l u t a r y l - c o as y n t h a s e ，h m g s ，e c 4 1 3 5 ) 作用下缩合生成3 一羟基一3 一甲基戊二酰 c o a ( 3 一h y d r o x y - 3 - m e t h y l g l u t a r y l c o a ，h m g c o a ) ( l u s k e ye ta 1 ，1 9 8 5 ) ，h m g c o a 复旦人学硕士学位论文银杏中g b m e c p s 基困与荠菜中c b c a x s l 基因的克降与研究 在3 一羟基一3 甲基戊二酰c o a 还原酶( 3 一h y d r o x y 3 - m e t h y l g l u t a r y l - c o ar e d u c t a s e ， h m g r ，e c1 1 1 3 4 ) 作用下还原为甲瓦龙酸f m e v a l o n a t e ，m v a ) ，该反应是m v a 途径上的限速反应f m s s o n ，e l a l ，1 9 8 8 ) ，所以该条途径被命名为m 、，a 途径。m v a 经由甲瓦龙酸激酶佃e v a l o n a t ek i n a s e ，m ke c2 7 1 3 6 ) ( l l u c he ta 1 ，2 0 0 0 ) 和磷酸 甲瓦龙酸激酶( p h o s p h o m e v a l o n a t ek i n a s e ，p m k , e c2 7 4 2 ) ( t s a ye ta l ，1 9 9 1 ) 依次 分别催化的两步磷酸化生成5 焦磷酸甲瓦龙酸( m e v a l o n a t e5 d i p h o s p h a t e ) ；最后， 5 焦磷酸甲瓦龙酸在5 一焦磷酸甲瓦龙酸脱羧酶( m e v a l o n a t e5 - d i p h o s p h a t e d e c a r b o x y l a s e ，m d c ，e c4 1 1 3 3 ) 作用下生成i p p ( d h e p a g a n o ne ta 1 ，1 9 9 4 ) ，i p p 和其异构物d m a p p 在i p p 异构酶( i p pi s o m e r a s e ，i p i ，e c5 3 3 2 ) 作用下可以相 互转化( w o u t e r se ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 在古细菌、真菌和动物中不存在m e i 佃x p 途径，只能通过m v a 途径还合成 萜类物质的中心前体m p ( r o d d g u e z c o n c e p c i 6 na n db o r o n a t2 0 0 2 ) 。这条途径 被称为经典的甲瓦龙酸途径，其分子遗传学与生物化学已经研究的比较清楚，这 条途径已经成为治疗癌症的重要靶标，通过调节途径上基因的表达来改变固醇以 及r a s 相关蛋白的合成情况( s w a n s o na n dh o h l ，2 0 0 6 ) 。 1 1 2 萜类物质的m e p 巾x p 生物合成途径 从二十世纪六十年代开始，在很长一段时间内，m v a 途径曾被认为是萜类 物质生物合成的唯一通用途径。直到近年来，人们才发现，在细菌( r o h m e re ta 1 ， 1 9 9 3 ) 用f l 植物( s c h w a r z ，1 9 9 4 ) 中还存在另一条独立的萜类生物合成途径。这条途径 位于质体中，其最原初的前体物质是丙酮酸( p y r u v a t c ) 和3 磷酸甘油醛 ( g l y c e r a l d e h y d e3 - p h o s p h a t e ，g 3 p ) 。丙酮酸和g 3 p 在1 一脱氧一d 木酮糖5 一磷酸合 成酶( 1 d e o x y d x y l u l o s e5 - p h o s p h a t es y n t h a s e ，d x p s ，e c4 1 3 3 7 ) 作用下生成1 一 脱氧一d 一木酮糖- 5 一磷酸( 1 - d e o x y d x y l u l o s e5 - p h o s p h a t e ，d x p ) ( s p r e n g e re ta 1 ， 1 9 9 7 ) ，该反应是质体中萜类生物合成的第一个限速反应( e s t d v e ze ta 1 ，2 0 0 1 ) ，正 因为如此，这条途径被命名为d x p 途径；然后，在d x p 还原异构酶 n d e o x y d x y l u l o s e5 - p h o s p h a t er e d u c t o i s o m e r a s e ，d x r ，e c1 1 1 2 6 7 ) 作用下， d x p 经原子重排和还原生成2 c 一甲基一d 。赤藓醇一4 一磷酸 ( 2 一c m e t h y l - d e r y t h d t o l - 4 _ p h o s p h a t e ，m e p ) ( t a k a h a s h ie ta l ，1 9 9 8 ) ；m e p 和c d p 在2 - c 一甲基一d 赤藓醇4 磷酸胱氨酰转移酶( m e pc y t i d y l t r a n s f e r a s e ，m c t , e c 2 7 7 6 0 ) 作用下缩合生成4 一( 5 焦磷酸胞苷) 一2 一c 甲基d 一赤藓醇( 4 ( c y t i d i n e 5 - d i p h o s p h o ) - 2 c - m e t h y l e r y t h r i t o l ，c d p - m e ) ( r o h d i c he ta 1 ，2 0 0 0 ) 。( 5 一焦磷酸胞 苷) 一2 一c 甲基一d 赤藓醇激酶( 4 ( c y t i d i n e5 一d i p h o s p h o ) 2 一c m e t h y l e r y t h r i t o lk m a s e ， c m k ，e c 2 7 1 1 4 8 ) ( s t e i n b a c h e re ta 1 ，2 0 0 3 ) 催化c d p m e 而磷酸化生成4 f 5 复日- 大学硕十学位论文银杏中g b m e c p s 基因! 。荠菜中c b c a x 5 1 基因的克隆与研究 。焦磷酸胞苷) 2 一c 甲基d 赤藓醇一2 一磷酸( c d p m e p ) 。c d p m e p 在2 - c - 甲基赤 藓醇一2 ，4 - 环焦磷酸合成酶f 2 - c m e t h y l e r y t h r i t o l2 , 4 - c y c l o d i p h o s p h a t es y n t h a s e ， m e c p s ， e c4 6 1 1 2 ) 作用下转化为2 c 甲基赤藓醇。2 ，4 一环焦磷酸 ( 2 c m e t h y l e r y t h r i t o l2 , 4 c y c l o d i p h o s p h a t e ，m e c p p ) ( h e r z ，e la 1 ，2 0 0 0 ) 。d x p 途径 上最后两步反应是羟甲基丁烯基一4 一磷酸合成酶( h y d r o x y m e t h y l b u t e n y l 4 - d i p h o s p h a t es y n t h a s e ，h d s ) 催化m e c p p 生成羟甲基丁烯基4 磷酸 ( h y d r o x y m e t h y l b u t e n y l4 - d i p h o s p h a t e ，h m b p p ) ( b a k e r , e t 以，1 9 9 2 ) ，最后h m b p p 在异戊烯基焦磷酸二甲基烯丙基焦磷酸合成酶0 p p d m a p ps y n t h a s e ， i d s ) ( c u n n i n 曲a m ，e t 以，2 0 0 0 ) 作用下转化为i p p 和d m a p p ( 5 ：1 ) 。 研究表明，m e p d x p 途径在植物中，不仅对于萜类物质的合成起着基础作 用，而且也是细胞分裂素如异戊烯腺嘌呤衍生物等的前体的合成途径。由于 m e p d x p 途径不存在于古细菌、真菌和动物中，且m e p d x p 途径中的酶高度 保守并与哺乳动物中的蛋白同源性很低，使得通过特异性地抑制m e p d x p 途径 来杀死病原菌成为可能。事实上，自从m e p d x p 途径被发现以来，它已经成为 最有潜力的除草剂与抗菌剂之- - ( r o d r i g u e z c o n c e p i o n ，2 0 0 4 ) 。 1 1 3 m e p d x p 途径中的2 c 甲基赤藓醇2 ，4 环焦磷酸合成酶( m e c p s ) 植物中的m e p d x p 途径首次发现于1 9 9 4 年( s c h w a r z ，1 9 9 4 ) 。近年来， m e p d x p 途径( 图1 1 ) 的分子遗传学和生物化学研究取得了很大进展，该途径中 的一些基因已经被克隆得到，例如，1 9 9 8 年在薄荷中克隆到编码d x s 酶的基因 ( l a n g e e la 1 ，1 9 9 8 ) ；2 0 0 2 年在拟南芥中克隆到编码d x r 酶的基因 ( c a r r e t e r o p a u l e te la 1 ，2 0 0 2 ) 等等。 2 c 甲基赤藓醇2 ，4 环焦磷酸合成酶f 2 一c m e t h y l e r y t h r i t o l 2 , 4 c y c l o d i p h o s p h a t es y n t h a s e ，m e c p s ) 是位于m e p d x p 途径上的第五个酶，催 化c d p m e p 生成m e - c p p 。m e c p s 具有一致性氨基酸识别模式： s 一( d n ) 一( g 舢- d 一( l i v a ) 一( l i v a g ) 一x h 一( s t a ) 一x ( 2 ) 一( d n ) 一( s a ) - x ( 2 ) - ( s g ) 。m e c p s 基 因在拟南芥、长春花、水稻等植物中有见e d n a 序列登录在g e n b a n k 中( 表1 1 ) ， 然而，有相关研究报道的，只有长春花的m e c p s 基因。长春花中m e c p s 基因全长 c d n a 序列为9 9 4 个碱基，其o r f 编码一个分子量为2 5 k d 的2 3 6 个氨基酸残基 的多肽，该多肽的氨基酸序列与大肠杆菌m e c p s 的同源性为4 8 ，其n - 端有 引导该酶定位于质体的转运肽。实验研究表明，长春花m e c p s 基因的表达量与长 春花中单萜吲哚生物碱( m o n o t e r p e n o i di n d o l ea l k a l o i d s ，m i a s ) 的积累而增加，而 此时m v a 途径中的h m g r 基因表达量并无明显变化，提示m e c p s 表达增强有 利于代谢流向更下游的方向流动，也提示长春花主要通过m e p d x p 途径来合成 复旦大学硕士学位论文银杏中g b m e c p s 基因与荠菜中c b c a x 5 1 基因的克隆与铆f 究 单萜吲哚生物碱( v e a u ，e ta 1 ，2 0 0 0 ) 。银杏内酯是二萜烯类化合物，而有研究表明 单萜、二萜类化合物主要都是通过m e p d x p 途径合成的，因此我们推测银杏中 g b m e c p s 基因的表达增强也有利于银杏内酯的生成。然而，迄今为止，尚未见到 有包括银杏在内的裸子植物中有关于m e c p s 基因的报道。 卜d e o x y 。d 。x y u l o s e5 - p h o s p h a t e ( d0 ) c p ) l 上d x r 12 一乎m e t h y l d - er y t hr il0 1 4 一p h 。s p h a t e ( m e p ) l 山c h s 4 - d ip h o s p h o c y t id y l 一2 一o - s e t h y l o er y t h r t o i ( o d p 一- e ) i 嘣k d ip h o s p h o c y t i d y l - 2 一乎m e t h y 卜d - s r y t hr i t o i2 - p h o s p h a t e ( c d p - # e - 2 p ) jm e c p s 2 - o - m e t h y l _ o - e r y t hr i t o t 2 ，4 - c y 6 lo d i p h o s p h a t e ( 1 i e - 2 4 c p p ) “ i p i l 图i im e p d x 途径中的酶。 f i g 1 ml it h ee n z y m e si n v o l v e di nt h em e p d x pp a t h w a y g e n e sp l a n ts o u r c eg e n b a n ka c c e s s i o nn o a t m e c p sa r a b i d o p s i st h a l i a n a q 9 c a k 8 c r m e c p s c a t h a r a n t h “sr o s e u s燃6 5 1 5 5 o s m e c p so r y z as a t i v a b a d 2 9 3 8 4 g m m e c p s g l y c i n em a x a w 2 0 2 2 7 0 表1 1 已克隆的植物m e c p s 基因。 t a b l e1 1t h em e c p sg e n e sc l o n e df r o mp l a n t ss of a r 1 2 银杏中萜类物质银杏内酯的研究进展 1 2 1 银杏内酯的药理活性与临床应用 银杏( g i n k g ob i l o b al ) 为落叶乔木，树皮灰色，叶扇形，雌雄异株，种子核 复旦人学硕士学位论文银杏中g b m e c p s 基圳与荠菜中c b c a x 5 1 摹团均克隆与聊f 究 果状，是我国古老树种之一，仅一科一属一种，被达尔文称为“活化石”。作为 株罗纪的孑遗植物，银杏基本保持了1 5 亿年前的生态特征，是种独特的集科 学研究、观赏、生态防护、提供木材及医疗保健等多种价值为一体的树种，特别 是它在医疗方面价值巨大o a c o b sa n db r o w n e l2 0 0 0 ) 。 银杏种子作为“白果”入药已有6 0 0 多年的历史，但直至二十世纪六、七十 年代发现了银杏叶提取物对心脑血管疾病有良好的疗效，银杏的药用价值才受到 了广泛的关注。大约在1 9 6 5 年，银杏叶的粗制品首次由德国公司d r w i l l m a r s c h w a b e 引入西方，它的商品名是t a b a n i n ，之后，s c h w a b e 公司与法国 b e a u f o u r - l p s e n 公司合作，共同开发了银杏叶提取物的标准制剂，命名为e g b 7 6 1 。 在此之后，大量的银杏制品开始进入市场，银杏提取物也成为世界上最畅销的植 物药之一。1 9 9 8 年，美国在植物医药的总投入为4 0 亿美元，其中在银杏方面 的投入居植物药的首位。现已证明：银杏的活性成分主要是黄酮类化合物和内酯 类化合物。其中内酯类化合物包括银杏内酯a 、b 、c 、m 和j ，它们独特的生理 作用和治疗价值在世界范围的医疗行业引起了极大兴趣( s t r c m g a a r da n d n a k a n i s h i ，2 0 0 4 ) 。 1 ) 对血小板聚集的作用 血小板活化因子( p a t e l e ta c t i v a t i n gf a c t o r , p a f ) 是由血小板和多种炎症组织分 泌产生的一种内源性磷脂，是迄今发现的最有效的血小板聚集诱导剂。p a f 能 减少b 肾上腺素受体的数量，使b 一受体激动剂的舒张气管作用减弱，而银杏内 酯对p a l ：受体有强大的特异性抑制活性，目前被认为是最有临床应用前景的天 然p a f 受体拮抗剂，可以拮抗p a f 的作用，用于治疗哮喘，其中以银杏内酯b 的活性最强。动物实验表明( 李树钧，孙滨，1 9 9 5 ) ，银杏内酯b 对实验性哮喘有 明显的保护作用；对豚鼠抗原诱发的肺过敏反应有抑制作用；对内毒素诱导的支 气管对组胺的高反应性有逆转作用，抑制多种过敏反应( n i j k a m pa n dk e s s e l s ， 1 9 9 2 ) 。 2 ) 对糖皮质激素的调控作用 体内糖皮质激素过量可导致多种疾病，如免疫抑制、神经血管内膜损害等。 糖皮质激素可影响免疫反应的多个环节，抑制巨嗜细胞吞噬功能，降低网状内皮 系统消除颗粒或细胞的作用，可使淋巴细胞溶解，导致淋巴结、脾及胸腺中淋巴 细胞耗竭。垂体促肾上腺皮质激素( a c t n ) 可刺激肾上腺皮质合成和分泌糖皮质 激素，加速糖皮质激素前体一胆固醇转运至线粒体并生成类固醇；银杏内酯可调 控胆固醇转运过程的关键成分p b r ，抑制外周p b r 的m r n a 表达，从而降低体 复旦大学硕士学位论文银杏中g b m e c p s 基因与荠菜中c b c a x 5 1 基因的克隆与研究 内糖皮质激素的含量o h n r i e ta 1 ，1 9 9 6 ) 。 3 1 对神经系统的保护作用 k r i e g l s t e i n 等发现，银杏内酯a 和银杏内酯b 在大鼠大脑局部缺血病灶模型 中，对大脑有保护作用；银杏内酯b 可以保护谷氨酸盐引起的海马神经元的损 伤( k r i e g l s t e i n1 9 9 5 ) 。肖建如等最新临床研究显示，银杏内酯对颈髓损伤后神经 功能具有较好的保护作用，并是早期治疗脊髓损伤的理想药物( 肖建如等，1 9 9 8 ) 。 李明等利用n a c n 及缺糖引起的p c i 2 细胞的损伤模型，研究了银杏内酯对神经 系统的保护作用，结果表明银杏内酯对p c i 2 损伤细胞的功能有显著的改善作用， 并能降低凋亡细胞比率，在神经系统的保护机制中起重要作用( 李明等，2 0 0 0 ) 。 4 1 对缺血损伤的保护作用 在缺血组织中，由于血小板聚集使组织血流量减少，阻碍着细胞机能的恢复。 而脑组织的血流量不足，则有可能导致多发性脑缺血或中风。银杏内酯b 能阻 止局部缺血引起的心律不齐，但对心率、冠脉循环和心肌功能均无作用，从而提 示银杏内酯b 可抗心律不齐而不干扰心脏的正常功f l ( w i t t w e r ，2 0 0 1 ) 。b o r o b i a 等 发现银杏内酯可改善缺血再灌注损伤肝的恢复，提高肝缺血大鼠的存活率，显 著降低肝缺血损伤( b o r o b i a ，1 9 9 3 ) 。 5 ) 抗炎和抗休克作用 临床期研究发现，银杏内酯b 对于革兰氏阴性细菌感染引起的脓毒血症 有治疗作用( g u i n o te ta 1 ，1 9 9 4 ) 。注射银杏内酯b 可以明显改善蛙皮缩胆囊肽诱 导的大鼠体内急性胰腺炎，降低大鼠急性胰腺炎死亡率，减轻胰组织病理损伤。 研究表明，银杏内酯b 的抗炎作用可能是通过抑制中性白细胞内 c a 2 + 】的升高、 花生四烯酸代谢酶如p l a 2 和5 i x ) 的活性、减少炎症介质如a a 和l t b 等的生 成而实现的r 周龙恩等，2 0 0 0 ) 。 内毒素感染是一种常见但死亡率极高的感染性疾病。动物实验表明，内毒素 引起家兔休克时平均动脉压、左室收缩压、左室压力最大上升和下降速率，等容 收缩压、心肌收缩向量环面积等显著降低，此变化与血中p a f 水平呈显著的负 相关，银杏内酯b 处理后能有效逆转内毒素引起的心血管功能紊乱的表现，说 明银杏内酯b 对内毒素引起的休克有明显的预防保护作用( 杜文华等，1 9 9 6 ) 。此 外，有实验表明，内毒素休克时，n 0 2 n 0 3 也显著增加，而银杏内酯b 对n 0 2 n 0 3 的产生有显著的抑制作用，提示银杏内酯b 抗休克作用的机理可能与其选择性 地影响休克介质( 如p a f 、n 0 2 n 0 3 i ) 的释放等作用有关( 杜文华等，1 9 9 7 ) 。 复旦大学硕士学位论文银杏中g b m e c p s 基因与荠菜中c b c a x 5 1 基因的克隆与研究 6 ) 对耳、眼的作用 银杏内酯能阻止p a f 引起的内耳电位( 尤其内淋巴位) 的变化，抑制速尿灵 导致的耳蜗变化。p a f 能引起兔眼内压的增加，而银杏内酯能消除其过高压力， 同时也降低眼房水中因激光照射虹膜而增加的p g e 2 和蛋白含量。对兔眼角膜损 伤的炎症研究发现，银杏内酯对免疫综合角膜炎和角膜水肿有潜在治疗作用。 7 1 其它作用 除上述作用外，研究还表明，银杏内酯可降低鼠肝硬化肝门静脉压，提高全 身血管耐受性，对肝硬化有一定疗效；能够抑制p a f 、内毒素及肌注甘油等引起 的鼠肾小球过滤速度和肾血流量的减少；能提高抗癌化疗剂的效果，减少不良反 应，使得耐细胞毒药物的癌细胞对化疗剂更为敏感有效；银杏内酯可应用于肺移 植的供体和受体中，使远距离肺移植成为可能；银杏内酯还以显著改善p a f 和 内毒素所致鼠胃肠溃疡，对局部肠缺血引起的粘膜损伤也有显著改善。此外，白 果内酯有抗孢子原虫作用，能杀灭卡氏肺囊虫。 1 2 2 银杏内酯的制备方法 迄今为止，银杏内酯的制备方法主要有天然提取法、化学合成法、细胞培养 法以及基因工程法几种。 1 1 天然提取法 银杏内酯在原植物中含量较低，且杂质干扰严重，因此其分离制备有一定难 度。目前用于银杏内酯提取的方法主要有：溶剂法，经h p l c 检测含银杏内酯 8 1 5 ，产率为0 6 ：树脂吸附法，经h p l c 检测含银杏内酯1 0 6 ( 李新岗等， 1 9 9 8 ) 。由于溶剂提取法的工艺比较繁琐，溶剂损失也比较大，因此难于工业化。 而树脂吸附法虽然工艺相对简单，但树脂使用寿命有限，因此工业化