（发酵工程专业论文）酱油生产菌菌种改良及其工艺的研究.pdf

摘要 摘要 酱油属于传统的发酵食品，菌种是发酵的基础，优良菌种选育是现代发酵工业的核 心技术之一。米曲霉作为酱油酿造的核心和基础，其性能的好坏直接影响到酱油的产量 和质量。紫外诱变作为最常用、最有效的诱变方法，由于它诱变频率高且不易发生回复 突变的优点，一直受到众多微生物工作者的青睐。但是，由于基因突变具有不定向性， 诱变选得的突变株往往各具优势但很难得到综合酶系优良的菌株，从而使得诱变育种工 作量大，而又具有很大的不确定因素。因此，如何快速高效地进行微生物遗传育种，一 直是微生物研究工作中的重点。 在当今酱油行业中，普遍采用的工艺有以日本为代表的高盐稀态发酵工艺和我国多 数企业采用的低盐固态发酵工艺。但是，不论是哪种工艺，都存在着不可避免的问题， 即食盐对酶活力的抑制作用和发酵过程的污染控制问题。而液态发酵能够在无杂菌污染 的条件下最大程度发挥酶系的活性，具有很大的应用前景。 基于以上几个问题，本论文主要进行了以下四个方面的研究： 1 紫外诱变育种。以米曲霉1 7 3 为出发菌株，通过紫外诱变，采用含有不同制霉 菌素药物浓度的p d a 培养基，初筛得到生长速度快、孢子颜色和菌落形态发生变化的 突变菌株1 2 5 株。通过制曲进一步复筛，得到了一株综合酶系优良的目标菌株8 0 1 1 0 ， 其酸性蛋白酶活力和中性蛋白酶活力较出发菌株分别提高2 3 0 1 0 和1 7 5 0 ，糖化酶 活力较出发菌株有所下降，但仍较传统生产菌株3 0 4 2 高出1 5 1 0 ；对于诱变得到的菌 株能否用于工业生产进行评价，用8 0 1 1 0 、1 - 7 3 和3 0 4 2 三株菌株进行酱油发酵比较。 结果表明8 0 11 0 所发酵的酱油无论在总氮含量、氨基态氮含量还是氨基态氮生成率方面 都较1 7 3 有所提高，且明显优于3 0 4 2 ，其他理化指标无异常： 2 原生质体融合育种。以诱变育种中得到的两株酶系各具优势且孢子颜色各异的 突变菌株3 0 0 1 和3 0 0 2 3 为亲本进行原生质体融合育种。通过孢子颜色差异和双亲灭活 技术，快速高效地筛选得到了一株酶系优良的融合菌株r 1 0 。r 1 0 的中性蛋白酶活力和 酸性蛋白酶活力都较亲本菌株有所提高，且高于3 0 4 2 ，尤其是酸性蛋白酶活力方面提 高幅度特别大，虽然糖化酶活力不如双亲，但仍明显高于3 0 4 2 ；用r 1 0 与3 0 4 2 进行 低盐固态发酵比较，结果表明，同条件下r 1 0 发酵1 5 d 得到的酱油，总氮含量低于3 0 4 2 ， 氨基态氮含量和3 0 4 2 不相上下，氨基态氮生成率和总酸都高于后者；发酵2 0d 时，r 1 0 得到的酱油不论是总氮、氨基态氮、总酸含量还是氨基态氮生成率，都明显高于3 0 4 2 ； 3 纯培养液态发酵新工艺的探索。在酱油传统生产工艺的基础上，将固态发酵与 液态发酵相结合，试图探索一种高质量、高原料利用率、低成本的酱油发酵新工艺。确 定了摇瓶培养的最佳工艺条件：培养基为豆浆：麸皮浸出液- - 1 ：1 ，培养温度3 0 ， 摇床转速1 6 0r p m ，装液量1 2 ，培养时间8 4h ；在此条件下，进行了两种方式的无盐 液态酱油发酵实验。 关键词：紫外诱变，低盐固态发酵，原生质体融合，无盐液态发酵 a b s t r a c t a b s t r a c t s o ys a u c ei sat r a d i t i o n a lf e r m e n t e df o o d s t r a i ni st h eb a s i so ff e r m e n t a t i o n s t r a i n s m u t a g e n e s i sa n ds e l e c t i o ni so n eo ft h ec o r et e c h n o l o g i e so fm o d e mf e r m e n t a t i o ni n d u s t r i e s a st h ec o r ea n db a s i so fs o ys a u c ep r o d u c t i o n ，a s p e r g i l l u so r y z a ed i r e c t l ya f f e c t st h eq u a n t i t y o ft h eo u t p u ta n dq u a l i t yo fs o ys a u c e u vm u t a g e n e s i si sn o to n l yt h em o s tc o m m o n l yu s e d m e t h o di nm u t a t i o nb r e e d i n g ，b u ta l s ot h em o s te f f e c t i v e 弱i t sh i g l lm u t a t i o nf r e q u e n c ya n d n o t e a s y o fr e v e r s em u t a t i o n i th a sb e e no n eo ft h ef a v o r i t em e t h o d so fm a n y m i c r o o r g a n i s m sw o r k e r s h o w e v e r ，d u et og e n em u t a t i o n w i t hv a r i a b l et r o p i s m ，i ti sd i 伍c u l t t oo b t a i nag o o ds t r a i n 、析t hc o m p r e h e n s i v ee n z y m es y s t e mb ym u t a t i o n t h u sm u t a t i o nh a sa h e a v yw o r k l o a da n dal o to fu n c e r t a i n t i e s t h e r e f o r e ，h o wt oc a l t yo u tm i c r o b i a lg e n e t i c b r e e d i n gq u i c k l ya n de f f i c i e n t l yh a sb e e nt h ef o c u so fg e n e t i cb r e e d i n g i nt o d a y ss o ys a u c ei n d u s t r y , t h ec o m m o n l yu s e dt e c h n o l o g i e sa r et h eh i g h - s a l t l i q u i d - s t a t ef e r m e n t a t i o nw h i c hi s u s e dm o s t l yi nj a p a na n dt h el o w - s a l ts o l i d s t a t e f e r m e n t a t i o np r o c e s sr e p r e s e n t e db yo u rc h i n a ss t a t ee n t e r p r i s e s h o w e v e r , n om a t t e rw h a t k i n do f t e c h n o l o g yt ob eu s e d ，t h e r ea r eu n a v o i d a b l ep r o b l e m s m s a l ti n h i b i t i o no fe n z y m e a c t i v i t ya n dt h ec o n t a m i n a t i o nc o n t r o li nf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s w i t h o u tt h ec o n t a m i n a t i o n o fu n c o r r e l a t e db a c t e r i a , l i q u i df e r m e n t a t i o nc a nb ec a r r i e do u ti np u r ec u l t u r ea n dm a x i m i z e t h ea c t i v i t yo fe n z y m e s ，s oi th a sg r e a ta p p l i c a t i o np r o s p e c t s b a s e do nt h ei s s u e sa b o v e ，t h ef o l l o w i n gf o u rm a i nr e s e a r c h e sh a v eb e e nd o n ei nt h i s p 印e l 1 u vm u t a g e n e s i sa n db r e e d i n g a s p e i g i l l u so r y z a e1 - 7 3 嬲t h eo r i g i n a ls t r a i nw a s m u t a g e n i z e db yu vr a y sa n ds c r e e n e dw i t hp d a m e d i u mc o n t a i n i n gd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n s o ft h en y s t a t i n 弱s e l e c t i n gp r e s s u r e w ea c h i e v e dp r i m a r ys c r e e n e d12 5m u t a n t sw h i c hg r o w f a s t e ra n dc h a n g ei nt h ec o l o ro fs p o r ea n dc o l o n i a lm o r p h o l o g y am o d i f i e do b je c t i v em u t a n t 8 0110i nm u l t i e n z y m es y s t e mw a so b t a i n e db yt h es e c o n d a r ys c r e e n i n go fk o j i - m a k i n g ， w h o s ea c t i v i t i e so fa c i d i cp r o t e a s ea n dn e u t r a lp r o t e a s ei n c r e a s e db y2 3 0 10 a n d17 5 0 t h a no r i g i n a ls t r a i n , r e s p e c t i v e l y i t sg l u c o a m y l a s ed y n a m i cd e c r e a s e dt h a n1 - 7 3 ，b u tw h i c h s t i ui n c r e a s e db y1 5 1 0 t h a n3 0 4 2 、h e t h e rt h es t r a i no b t a i n e dc o u l db eu s e df o rt h e i n d u s t r i a lp r o d u c t i o n , w ee v a l u a t e di tt h r o u g ht h ec o m p a r i s o no ft h r e es t r a i n s8 0110 ，i - 7 3 a n d3 0 4 2i nt h el e v e lo fs o ys a u c ef e r m e n t a t i o n t h cr e s u l ts h o w e dt h a tn om a t e ri nt e r m so f t o t a ln i t r o g e n , a m i n on i t r o g e no ra m i n on i t r o g e ng e n e r a t i o nr a t e ，s o ys a u c ep r o d u c e db y 8 0110w a sb e t t e rt h a n1 - 7 3a n d3 0 4 2 ，n oo t h e ra b n o r m a lp h y s i c a la n dc h e m i c a li n d i c a t o r s 2 p r o t o p l a s tf u s i o nb r e e d i n g t w om u t a n t s3 0 0 2 3a n d3 0 0 1o b t a i n e di nu vm u t a t i o n b r e e d i n gw h i c hh a v ed i f f e r e n ta d v a n t a g e si ne n z y m e sa n d 、析t hd i f f e r e n ts p o r ec o l o rw e r e u s e d 硒t h ep a r e n t sf o rp r o t o p l a s tf u s i o n b yu s i n gs p o r ec o l o rd i f f e r e n c ea n dp r o t o p l a s t s i n a c t i v a t i o nt e c h n i q u e w eh a v es c r e e n e da l le x c e l l e n tf u s i o ns t r a i nr 10f a s ta n d e f f i c i e n t l y r 10c a np r o d u c en e u t r a lp r o t e a s ea n da c i d i cp r o t e a s ei nh i g h e rl e v e lt h a nt h ep a r e n t s t r a i n sa n d3 0 4 2 i t sa c i dp r o t e a s ea c t i v i t yi n c r e a s e sp a r t i c u l a r l yl a r g e a l t h o u g hi t s g i u c o a m y l a s cd y n a m i ci sn o ta sg o o d 笛p a r e n t s ，b u ts i l ls i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a n3 0 4 2 l o w s a l ts o l i d s t a t ef e r m e n t a t i o nc o n t r a s tb e t w e e nr 1 0a n d3 0 4 2 t h er e s u l t ss h o w e dt h a t a b s t r a c t u n d e rt h es a m ec o n d i t i o n , a f t e r15d a y st h es o ys a u c ew a sf e r m e n t e db yr 10 ，w h o s et o t a l n i t r o g e nc o n t e n ti sl o w e rt h a n3 0 4 2 ，t h ec o n t e n to fa m i n on i t r o g e ni sa l ls q u a r e 淅t h3 0 4 2 ， t h ep r o d u c t i v i t yo fa m i n on i t r o g e na n dt o t a la c i dc o n t e n ta r eb o t hh i g h e rt h a n3 0 4 2 ；a f t e r2 0 d a y s ，t h es o ys a u c ew a sf e r m e n t e db yr io ，w h o s et o t a ln i t r o g e nc o n t e n t ，t h ec o n t e n to fa m i n o n i t r o g e n , t h ep r o d u c t i v i t yo fa m i n on i t r o g e na n dt o t a la c i dc o n t e n ta r ea l ls i g n i f i c a n t l yh i g h e r t h a n3 0 4 2 3 t h ee x p l o r a t i o no ft h en e w p u r ec u l t u r ea n dl i q u i d s t a t ef e r m e n t a t i o nt e c h n o l o g y i no r d e r t od e v e l o pah i g h q u a l i t y , h i g l lr a wm a t e r i a lu t i l i z a t i o na n dl o w - c o s ts o ys a u c ef e r m e n t a t i o n p r o c e s s t h es o l i d s t a t ef e r m e n t a t i o nw a sc o m b i n e dw i t ht h el i q u i d s t a t ef e r m e n t a t i o nb a s e d o nt h et r a d i t i o n a ls o ys a u c ep r o d u c t i o np r o c e s s t h eb e s ts h a k e f l a s kc u l t u r ec o n d i t i o n sw e r e i d e n t i f i e da st h em e d i u mm i l k ：b r a ne x t r a c t = 1 ：1 ，t e m p e r a t u r e3 0 ，s h a k i n gs p e e do f16 0 r p m t h ev o l u m eo fl i q u i d12 。i n c u b a t i o nt i m e8 4h u n d e rt h i sc o n d i t i o n , t w of o r m so f n o n s a l ts o ys a u c el i q u i df e r m e n t a t i o ne x p e r i m e n tw e r ep e r f o r m e d k e y w o r d s ：u v - m u t a g e n e s i s ，l o w - s a l ts o l i d s t a t ef e r m e n t a t i o n , p r o t o p l a s tf u s i o n , s a l t - f r e el i q u i df e r m e n t a t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名：# 韭生盖一日期：2 i 年6 月l 五e l 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：囝兰叠 导师签名： 日期：刈月钼 第一章引言 第一章引言 1 1 酱油概述 酱油是一种富有营养价值的常用调味品，它是以蛋白质原料和淀粉质原料为主料经 微生物发酵酿制而成。酱油营养成分丰富，我国生产的酿造酱油每1 0 0m l 中含可溶性 蛋白质、多肽、氨基酸达7 5 - 1 0g ，含糖分2g 以上，此外，还含有较丰富的维生素、 磷脂、有机酸以及钙、磷、铁等无机盐。酱油中含有多种调味成分，有酱油的特殊香气、 食盐的咸味、氨基酸钠盐的鲜味、糖及其他醇甜物质的甜味、有机酸的酸味、酪氨酸等 爽适的苦味，还有天然的红褐色色素，可谓咸、酸、鲜、甜、苦五味调和，色香俱备的 调味佳品【1 1 。 i i 1 酱油的历史与发展 我国各类酿造调味食品都有着悠久的历史。最迟在两千多年前的秦汉时期，在全国 范围内就已普及豆酱和酱油了。到了南宋，已经出现酱油的称谓【2 】。中国历史上最早使 用“酱油”名称是在宋朝，林洪所著山家清供中有“韭叶嫩者，用姜丝、酱油、滴醋 拌食”的记述。明代又增加了豆油的异称。清代以后才通称酱油。作为调味品，酱油比 豆酱食用起来更方便，所以，随着人们生活水平的不断提高，酱油酿制行业逐渐发展、 壮大。2 0 0 3 年中国酱油生产厂家2 0 4 7 家，年产酱油5 0 0 万吨。酱油生产相对集中于主 要的一些大企业，全国最大的2 0 0 家酱油生产厂的年产量占全国产量4 2 4 5 。目前全 国最大的酱油企业是广东佛山海天调味食品公司，年产酱油超过1 0 0 万吨，其产品以高 档和中高档为主，适合瓶装或出口。但中国目前9 0 的消费者还是以低盐固态发酵工 艺生产的中、低档酱油为主，而且在每个区域都有一个主导产品在支撑、满足着当地的 调味品市场的需要。 公元7 5 5 年后，酱油生产技术随鉴真大师传至日本。后又相继传入朝鲜、越南、泰 国、马来西亚、菲律宾等国。日本2 0 0 2 年酱油产量约9 9 9 ，0 0 0k l ，日本酱油向全世界 一百多个国家及地区出口，出口量为1 2 ，3 0 0k l 。其中，美国进口量最多，约占总出口 量的2 5 。日本最大的酱油生产企业有5 家，其中，龟甲万酱油有限公司年产万字牌 酱油占全国总产量的三分之一【3 】。 目前在国际市场上，日本酱油占据主导地位。因此，在中国企业现有生产条件下， 通过菌种改良和进行具有我国特色的新型工艺的创新，提高酱油的质量和产量，具有重 要意义。 1 1 2 米曲霉 酱油的酿造从“采黄子 时期到现在的纯种制曲，涉及的微生物种类繁多【4 羽，主要 种类有米曲霉( a s p e r g i l l u so r y z a e ) 、酱油曲霉( a s p e r g i l l u ss o j a e ) 、酵母菌( s a c c h a r o m y c e s i ) 和乳酸菌( l a c t o b a c i l l u s ) 等。其中，米曲霉是酱油酿造的基础和核心。 江南大学硕士学位论文 米曲霉是曲霉属的一种，它的变种很多，茵落一般为黄绿色，成熟后为黄绿色或绿 褐色。米曲霉生长的最适温度为3 7 左右，低于2 8 生长过慢，高于3 7 生长则影 响酶的活力。湿度对米曲霉生长影响很大，当培养基水分低于3 0 时，菌丝生长稀少， 水分在5 0 左右比较合适，菌丝生长期湿度要求较高，需保持在9 8 1 0 0 ，米曲霉 生长的最适p h 是6 0 左右，偏高或偏低，均不利于米曲霉的菌体中酶的分泌，也影响 酶的活力【_ 7 8 1 。米曲霉是好氧微生物，空气不足时，生长受抑制，因此在繁殖阶段应通入 较多的新鲜空气。图1 1 为米曲霉的个体形态。 米曲霉含有多种酶类，有较强的蛋白质分解能力，同时又具有糖化能力，所以，自 古以来我国就已经利用自然界中存在的米曲霉来制造酱类和酱油。应用于酱油生产的米 曲霉菌株应符合如下要求：1 ) 不产黄曲霉毒素；2 ) 蛋白酶、淀粉酶活力高；有谷氨酰 胺酶活力；3 ) 生长快速、培养条件粗放、抗杂菌能力强；4 ) 不产生异味，制曲酿制的 酱油香气好【9 ，1 们。 目前我国的酱油酿造已广泛使用纯粹培养的米曲霉【1 1 , 1 2 】。常用的米曲霉菌株有： a s 3 8 6 3 ，沪酿3 0 4 2 ，u e 3 3 6 ，u e 3 2 8 ，9 6 1 ，9 6 1 2 ，渝3 8 1 1 ，1 0 b l 等。沪酿3 0 4 2 是 目前国内酱油生产厂家普遍使用的优良菌株，其来源是福建省永春县酱园中筛选的米曲 霉，中科院编号为a s 3 8 6 3 ，经上海酿造科学研究所诱变选育最终获得，中科院保藏号 为a s 3 9 5 1 。u e 3 3 6 和u e 3 2 8 ，系上海酿造科学研究所以沪酿3 0 4 2 为出发菌株诱变而 成。此外还有米曲霉9 6 1 和9 6 1 2 1 渝3 8 1 1 ；米曲霉1 0 b l 等。 ( a ) 3 f 一 毕鹚秽 1 分生孢子l i t2 分生把子攫、厦t 与小皇 3 - 5 分生穗子梗厦蒿分生把子的产生 6 小夏7 1 1 1 出, 1 分生鬼子 ( b ) 图卜1 米曲霉 f i g 1 - 1a s p e r g i l l u so r y z a e 1 1 3 酱油曲中主要的酶 酱油的发酵过程，是一系列复杂的酶水解反应及美拉德反应的过程，酶系的种类和 组成决定了酱油的产量和质量。酱油曲中主要的酶包括蛋白酶、淀粉酶、氨基转移酶和 谷氨酸脱氢酶、脂肪酶、纤维素酶、酚氧化酶、果胶酶和谷氨酰胺酶等。其中，蛋白酶 和淀粉酶对原料利用率和产品风味形成尤为重要。 1 ) 蛋白酶 米曲霉所产生的蛋白酶，根据作用最适p h 可以分为3 类：酸性蛋白酶( 最适p h 3 ) 、 2 第一章引言 中性蛋白酶( 最适p h7 ) 和碱性蛋白酶( 最适p h9 - 1 0 ) 。一般酱油曲中，中性、碱性 蛋白酶活力较强，酸性蛋白酶活力较弱。制曲时，曲料的p h 在4 7 ，在此范围内，p h 越高，曲中碱性蛋白酶活力越高，酸性蛋白酶活力越弱；反之，则酸性蛋白酶活力增高， 碱性蛋白酶活力下降。曲中蛋白酶的组成受到曲料中蛋白质原料与淀粉质原料比例的影 响，原料碳氮比小，曲料中蛋白酶以碱性和中性蛋白酶为主；碳氮比大，酸性蛋白酶活 力增强，碱性和中性蛋白酶活力下降。原因是碳源高时易产生有机酸、二氧化碳，使曲 料p h 下降，从而有利于酸性蛋白酶的生产。酱油曲不但要求有较高的蛋白酶活力，而 且要求曲中的蛋白酶有一定的耐盐性，以适应酱醅中较高的实验浓度。一般米曲霉产生 的蛋白酶耐盐性不强，但应用于酱油生产的米曲霉菌株产生的酶都有一定的耐盐性。当 酱醅盐浓度过高时会抑制酶的活力，特别是碱性蛋白酶的活力。 蛋白水解酶系是一切能使蛋白质水解的各种酶的总称。根据其作用机理可以分为两 类：一类称为肽酶，又称外肽酶或端肽酶。肽酶包括羧肽酶、氨肽酶、二肽酶三种，能 从蛋白质或肽链一端水解下氨基酸；第二类为蛋白酶，又名内肽酶，其作用是在蛋白质 多肽链的非末端特定部位切断多肽链，产生相对分子质量较小的肽链。蛋白质原料在蛋 白酶和肽酶的共同作用下，产生各种可溶性蛋白质、胨、肽、氨基酸。一般酱油中，氨 基氮占全氮的5 0 嗡0 。 2 ) 淀粉酶 米曲霉分泌的淀粉酶可使原料中的淀粉糖化，除提供制曲时米曲霉生长的碳源外， 在酱醅发酵阶段，淀粉酶继续淀粉糖化，成为酱油的甜味成分。同时，一部分糖作为酵 母菌和乳酸菌的发酵基质转化为乙醇和有机酸，是构成酱油风味的重要成分。米曲霉产 生淀粉酶有一定的耐盐性，在酱醅中它的活性虽受到部分抑制，但仍能发挥作用。如果 长时间处于高浓度食盐环境中，活性会明显减弱。曲中存在的淀粉酶主要包括q 淀粉 酶、淀粉1 ，4 葡萄糖苷酶、b 淀粉酶、淀粉1 ，6 糊精酶和麦芽糖酶。 q 淀粉酶可催化水解淀粉分子中的q 1 ，4 糖苷键，不能水解淀粉链分支点的1 ， 6 糖苷键。a 淀粉酶是内切酶，可任意地切断淀粉链成短链糊精，对长链底物水解迅速， 随底物链的变短水解速度减慢，对麦芽糖不能水解，所以对直链淀粉的水解终产物是葡 萄糖和麦芽糖，对支链淀粉的水解终产物是麦芽糖及少量界限糊精和葡萄糖。淀粉受到 a 淀粉酶作用时，黏度很快下降，表现出强液化能力，所以该酶也称液化型淀粉酶。 淀粉1 ，4 葡萄糖苷酶可催化水解q 1 ，4 糖苷键，作用方式是从淀粉链的非还原性 末端，将葡萄糖单位一个一个水解下来，对支链淀粉中的q 1 ，6 糖苷键不作用，但能 绕过q 1 ，6 糖苷键继续切断q 1 ，4 糖苷键，所以水解产物除葡萄糖外，还有异麦芽糖。 1 3 淀粉酶能够水解直链淀粉生成麦芽糖，支链淀粉受到该酶作用时，在分支点之前 可水解成麦芽糖，但遇到q 1 ，6 糖苷键无法分解，在以q 1 ，6 糖苷键连结的二条直链 淀粉的连接点之前，b 淀粉酶就提前停止水解，留下具有q 1 ，6 糖苷键的界限糊精。 淀粉1 ，6 糊精酶又称异淀粉酶，此酶作用于支链淀粉的分支点切断q 1 ，6 糖苷键， 而麦芽糖酶主要是将麦芽糖水解为葡萄糖。 江南大学硕士学位论文 1 1 4 生产工艺 1 ) 工艺简介 酱油的酿造主要包括种曲的制备、大曲的制作、制醪发酵、压榨淋油及成品处理等 工艺过程。 种曲是一个酿造用菌种扩大培养的环节，一般采用固体培养的方法( 其熟料水分在 5 0 左右) 。其目的主要是培养米曲霉使其大量产生孢子，作为大曲扩大培养的种子。 质量优良的种曲除了具备酱油酿造的必要性能以外，还应具有以下特点：单位种曲的米曲 霉孢子数要达到一定的数量级，孢子的耐久性要强，发芽率高，杂菌污染少，易干燥， 这与米曲霉本身的生物特性有很大的关系。 大曲所用的原料是脱脂大豆、小麦和麸皮。其中对于脱脂大豆的粒度有一定的要求， 有的厂家把小麦做成糖化液，在成曲后添加盐水时一并加入的，也有的使用炒麦，但是 比较普遍的是使用麸皮。国内的酱油生产厂家一般原料配比是豆粕：麸皮= 6 ：4 ( 此比例可 根据原料蛋白质含量的差异进行适当的调整) ，其混合料的水分含量为5 0 的左右。制 曲的方法有曲盒制曲法、通风池制曲法和圆盘制曲机法等，目前国内的大多数酱油生产 厂家采用的是通风池制曲法。成曲的优劣主要是以曲菌生长过程中产生的酶活性高低为 评价标准，酱油酿造用米曲霉主要是以蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶等的酶活力来判断。 将制成的大曲与适当浓度的盐水混合制成酱醪，从而进入发酵阶段。酱醪发酵的过 程也是酱油所特有的芳香、味道、色泽的形成过程，因此发酵也是决定酱油质量和收率 的重要工艺。发酵从本质上讲就是利用米曲菌产生的各种酶分解原料，形成酱油有效成 分及重要香气组分的过程。首先是米曲菌产生的蛋白酶，特别是中性和酸性蛋白酶对原 料中的大豆蛋白进行降解，产生各种可溶性的氨基酸、肽、胨等含氮物质。此外，曲料 中的淀粉也被米曲菌产生的淀粉酶分解，形成糖、糊精等糖类物质，并成为耐盐性酵母 酸菌的营养来源，促使这些微生物快速生长，开始发酵，产生酱油的各种营养成分。同 时，存在于酱醪中的菌体，尤其是米曲菌和杂菌通过其自身的消化所溶出的成分对酱油 的风味也有很大的影响 酱油发酵完成后，通过压榨或淋油将各种有效成分提取出来，得到生酱油，方法主 要有浇淋法、浸淋法、压榨法等。浇淋法和浸淋法一般用于固态发酵的酱醅，又分原池 浇淋法和移池浸淋法两种，是在发酵成熟的酱醅中加入一定温度的盐水，在水浴保持一 定温度的条件下，浸泡酱醅，第一次抽出的液体称为头油，第二次抽出的液体成为二淋 油，第三次抽出的液体成为三淋油。头油一般与二淋油配兑形成成品，而三淋油替代盐 水用于其他批次的发酵酱醅的头淋。 2 ) 工艺分类 在制醪发酵中，依据加入盐水的浓度和酱醪的含水量可分为以下几种发酵工艺：无盐 固态发酵、低盐固态发酵、高盐稀态发酵等，目前比较常用的是低盐固态发酵和高盐稀 态发酵法。 在我国，低盐固态发酵法应用最为广泛。低盐固态发酵法是在2 0 世纪6 0 年代研究 成功的，采用7 左右的盐水拌曲，酱醅的水分在5 5 左右，最后用浸出法滤取酱油。 4 第一章引言 该方法与高盐固态发酵法相比发酵周期较短，与无盐固态发酵法相比改善了酱油产品的 风味。其特点是工艺成熟、投资较小、生产周期短、劳动强度低，操作简便，技术不复 杂，管理方便、成本较低，成品色泽较深、滋味鲜美、后味浓厚，多少年来一直受到酿 造行业人士的欢迎。自应用至今近4 0 年，一直为大多数企业所采纳，目前利用该工艺 生产的酱油在我国占酱油总产量的7 0 以上。但是，它也存在工艺本身所带来的缺点： 生产出来的酱油风味相对还是较差，酱油香气不及天然晒露发酵和高盐稀态发酵【1 3 ，1 4 1 。 高盐稀态发酵主要应用于生产高质量酱油，日本大多数企业采用此工艺生产酱油。 高盐稀态发酵法的特点是发酵时间长，占地面积大，设备复杂，投资巨大，但能生产出 品质优良的酱油。它主要包括高盐稀醪淋浇浸出法、高盐稀醪发酵法和稀醪堆积淋浇浸 出法。 1 2 国内外酱油菌种研究现状 1 2 1 国外酱油菌种研究现状 酱油主产于亚洲国家，消费于世界。对酿造技术的研究目前以亚洲国家为多，其中 日本的酱油酿造技术处于国际领先地位，菌种技术目前被公认为最高水平，酱油发酵过 程中蛋白质利用率已达到9 2 ，我国台湾地区和韩国的酿造技术也较先进【15 1 。日本研 究人员利用现代生物技术，采用分子改良的手段对米曲霉和酱油曲霉中的蛋白酶、淀粉 酶、纤维素酶、果胶酶、脂肪酶、谷氨酰胺酶等酶进行定向改良，并已取得显著成绩。 c h e e v a d h a n a r a ks ，等【l6 】基于文献发表的c d n a 序列，设计特定寡核苷酸探针，从一 工业菌株的基因库中分离出了编码米曲霉碱性蛋白酶( a l p ) 的基因；s h o uts ，等【1 7 】 以米曲霉为宿主构建出了t r i c h o d e r m ar e e s e i 纤维素酶的表达系统；k i t a m o t ony ，等【l s 】 从米曲霉的k b n 6 1 6 酱油曲霉菌株中分离出果胶裂解酶i i ( p e l 2 ) 基因并鉴定，发现结 构基因由1 3 0 6 b p 组成，其间包含三个内含子；m a s a y u k imd ，等【1 9 j 最近成功破译米曲 霉的基因组，为酿造更具风味的酱油奠定了基础。米曲霉基因组大于有3 8 0 0 万个碱基 对，共有8 条染色体，包含约1 2 万个基因。以上这些，从某一角度说明了国外利用分 子生物学技术手段对米曲霉进行性状改良的现状和所取得的成绩，展示了现代生物技术 在菌种改良方面的独特魅力。 1 2 2 国内酱油菌种研究现状 目前我国酱油生产绝大多数采用米曲霉沪酿3 0 4 2 ，虽然它具有生长快、较粗放和蛋 白酶活力较高等特点，但是该菌种产生的酸性蛋白酶和淀粉酶的活力相对偏低，导致原 料中的各种成分如蛋白质、淀粉等不能被高效水解。 为此，多数研究机构和规模较大的相关企业对3 0 4 2 进行了反复的理化诱变和筛选， 获得了许多新菌株。陈亚光，等【2 0 】以3 0 4 2 的孢子为对象，对其进行紫外诱变，利用酪 蛋白平板对2 2 6 1 株再生株进行初筛，得到了3 4 株蛋白酶活力提高的菌株，复筛得到一 株蛋白酶活力高且遗传稳定的突变株l y 0 6 ；党敏娜【2 l 】以沪酿3 0 4 2 为出发菌株，采用 紫外诱变，用透明圈进行初筛，借助实际生产操作进行复筛，与生产同步制曲，从大量 江南大学硕士学位论文 突变株获得优势稳定菌株y b 1 ；姚开，等【2 2 】使用3 0 4 2 进行筛选，得到了酸性蛋白酶 活力较高的菌株，将其与原始菌株混合制曲和发酵，可有效提高全氮利用率和氨基态氮 生成率。 为了提高大曲中的各种酶活，国内学者还研究了多菌种分别制曲、混合制曲等【2 3 瑚】 工艺，目的在于调整酱醪中各种酶类的比例，从而提高酱油的出品率和产品质量，还有 学者研究了通过复方发酵促进剂【3 l 】提高3 0 4 2 的产蛋白酶活性。这些措施虽然可以在一 定程度上提高原料利用率和改善酱油风味，但不同菌种之间存在一定的抑制作用，以及 对温度、含水量等发酵条件的要求也不相同，效果不一定好。马学曾，孔卫【3 2 】的实验结 果就表明多菌种制曲发酵生产的酱油质量反而不如单菌种。目前国内酱油企业大多数外 购曲精作为菌种，曲精是多种菌株的孢子粉混合制备而成，因此使用曲精制曲属于混合 制曲工艺，而混合制曲由于不同菌种生长的不同步性，从而导致了生产出来的酱油质量 不稳定。 除了理化诱变外，原生质体融合技术在工业微生物菌种选育方面也显示了良好的效 果，它的优点是将两亲本的整个基因组强迫性混杂在一起，为异源d n a 片段交叉互换 创造了一个优良的环境。唐澍3 3 j 对生长速度较快但产酶能力较低的a o r y z a ec i c c 2 3 3 9 的原生质体采用7 0 0 w 微波灭活1 2 s ，对产酶能力较高但生长速度较慢的a o r y z a e 菌株 原生质体采用1 5 w 紫外灭活5m i n ，然后对灭活双亲用p e g 作融合剂进行原生质体融 合，融合率达到了7 6 。通过测定h c ( 菌落直径与透明圈直径之比值) 以及蛋白酶活 力大小，最终筛选得到融合株c a w 2 0 2 和c a w 2 1 0 的蛋白酶活力比亲本菌株c i c c 2 3 3 9 分别提高7 8 和1 1 2 5 。 1 3 诱变育种 诱变育种是指选择合适的诱变因素、处理剂量及处理方法，人为地对出发菌株进行 诱变处理，然后运用合理的筛选程序及适当的筛选方法把优良的变异菌株筛选出来。它 是用物理和化学等因素使诱变对象细胞内的遗传物质发生变化，引起突变，并通过筛选 获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。 1 3 1 诱变方法简介 微生物的诱变方法有很多，常用的方法有物理诱变法和化学诱变法。物理诱变法是 利用紫外线、y 射线、x 射线、q 射线、快中子、激光、超声波等，其中使用比较多的 是紫外线和y 射线诱变。化学诱变法主要是利用一些化学诱变剂对微生物的d n a 发生 作用引起突变，常用的化学诱变剂有五氯苯酚、硫酸二乙酯、亚硝基胍、吖啶黄等。此 外，也可以将物理和化学方法结合起来对微生物进行复合诱变，效果更加明显。 1 3 2 紫外诱变作用机理 紫外线是一种使用最早、沿用最久、应用最广泛、效果最明显的物理诱变剂。它诱 变频率高，而且不易回复突变。在工业微生物育种史上曾发挥过极其重要的作用，迄今 仍然是微生物育种中最常用和有效的诱变剂之一。 6 第一章引言 紫外线被d n a 吸收后引起突变的原因，有的是d n a 与蛋白质的交联，有的是胞嘧 啶与尿嘧啶之间的水合作用，有的是d n a 链的断裂，还有的是形成嘧啶二聚体。而形 成嘧啶二聚体是产生突变的主要原因。嘧啶二聚体不仅可以由单链上相邻的两个胸腺嘧 啶之间形成，也可以产生于双链相对应的两个胸腺嘧啶之间。 紫外线的光谱范围在4 0 3 9 0n l i l ，而d n a 可以吸收的紫外线光谱通常为2 6 0n l n ， 因此，能诱发微生物突变的紫外线的有效波长范围是2 0 0 - - 3 0 0n n 。最有效的波长为 2 5 3 7n l i l 。这一波长的诱变相当于波长2 6 01 1 i i l 的紫外线。当紫外线照射微生物细胞时 d n a 大量吸收2 6 0n l l l 光谱而引起突变或杀伤作用。一般用来灭菌消毒的3 0w 紫外灯 管，光谱分布范围广，较平均，诱变效率较差。而1 5w 紫外灯管，放射出来的紫外线 大约有8 0 波长集中在2 5 3 7n m ，因此诱变效果比3 0w 好。 1 4 原生质体融合 原生质体融合( p r o t o p l a s tf u s i o n ) 是用水解酶除去遗传物质转移的最大障碍细 胞壁，制成由原生质膜包被的裸细胞，然后用物理、化学或生物学方法，诱导遗传特性 不同的两亲本原生质体融合，经染色体交换、重组而达到杂交的目的，经筛选获得集双 亲优良性状于一体的稳定融合子。 1 4 1 原生质体融合技术简介 原生质体融合技术是起源于2 0 世纪6 0 年代，于7 0 年代发展起来的基因重组技术。 1 9 6 0 年法国的b a r s k i 研究小组在混合培养两种不同类型的动物细胞时发现了自发融合 现象。f o d o r 和s c h a e f f e r 于1 5 7 6 年分别报道了巨大芽抱杆菌和枯草芽孢杆菌种内原生 质体融合，微生物原生质体融合现象得到证实，并建立起了相应的实验体系。匈牙利的 p e s t i 于1 9 7 9 年首先提出了融合育种提高青霉素产量的报告，进而开创了原生质体融合 在实际工作中的应用。 相对于诱变技术和基因工程技术，原生质体融合技术具有以下优点： 1 ) 去除了细胞壁的障碍，使得没有有性过程、没有转化和转导系统的微生物，或 者是相同接合型的真菌细胞也能发生原生质体的相互融合，而且可以冲破种、属的界限， 广泛地在有生产价值的微生物种间以至属间进行杂交育种； 2 ) 原生质体融合后，两个亲株的整套基因组相互接触，可以有机会发生多次交换， 产生各种各样的基因组合而得到多种类型的重组子； 3 ) 重组频率高； 4 ) 可以和其他育种方法相结合，把从其他方法得到的优良性状通过原生质体融合 再组合到一个单株中，又可以多个亲株融合一体； 5 ) 可以进行包含非活性原生质体的融合，即用温度、