（发酵工程专业论文）原生质体融合构建直接转化淀粉产燃料酒精的菌株.pdf

湖北工业大学硕士学位论文 摘要 k 氏酵母及酿酒酵母可利用可发酵性糖产酒精，糖化酵母则可以产糖化酶， 分别以k 氏酵母与糖化酵母、酿酒酵母与糖化酵母为亲本，采用先紫外线单亲灭 活糖化酵母原生质体，再用高渗缓冲液配制的p e g 化学促融剂促融的原生质体融 合技术进行属间融合，以构建可直接转化淀粉产酒精的菌株。同时对酵母原生质 体形成和再生条件进行了探索：取培养6 8 h 的单倍体，在3 0 。c 下，2 0 的蜗牛酶 酶解1 o h 时，均可获得高于9 2 的形成率及6 5 的再生率。依此条件制备好原生 质体，经紫外线灭活糖化酵母后用p e g ( 6 0 0 0 m w ) 促融，k 氏酵母与糖化酵母融合 频率为7 3 1 0 ，酿酒酵母与糖化酵母融合频率为8 4 1 旷。融合后涂布选择性再 生平板，筛选多次共获得1 3 株稳定融合子。对融合子作进一步的鉴定，包括细胞 大小、d n a 含量、淀粉利用率及产酒精能力等方面的测定，并与亲株作比较，最 终获得一株性状稳定、酒精转化率高的融合子k s 一5 ，在含1 8 o 的可溶性淀粉发 酵液中，酒度可达7 0 f v v 1 。同时确定其基本最适生长条件为：接种量2 0 1 0 7 个 m r ，温度3 0 ，p h 5 0 ；而在发酵阶段最适发酵条件为：接种量2 0 1 07 个m l ， 发酵温度3 2 ，p h 4 0 。最后对k s 一5 的生料发酵工艺条件进行了初步的研究，最 佳发酵温度为3 2 0 c ，最佳p h 为4 0 ，最佳发酵时间为1 4 4 小时，发酵周期与k 氏 酵母相同，在最佳条件下发酵，酒分达到7 2 ( v v ) ，残总糖为1 0 8 ，淀粉出 酒率为5 8 6 ，在生物发酵生产酒精方面，具有良好的应用前景。 关键词：燃料酒精，原生质体融合，糖化酵母，酿酒酵母，k 氏酵母 湖北工业大学硕士学位论文 a b s t r a c t s c e r e v i s i a ek 量c e r e v i s i a ec o u l dt r a n s f o r mf e r m e n t a b l ea m y l a s ei n t o e t h a n o la n dsd i a s t a t i c u se x c r e t e ss a c c h o r g e na m y l a s e t a k e nsc e r e v i s i a ek w i t hs d i a s t a t i c u sa n ds c e r e v i s i a ekw i t hs d i a s t a t i c u sa sp a r e n t s ，u s i n 瞿 p r o t o p l a s tf u s i o nt e c h n o l o g yo fi n a c t i v a t i n g 量d i a s t a t i c u st oc o n s t r u c tn e w s t r a i n s w h i c hc o u l dd i r e c t l yt r a n s f o r ms t a r c hi n t o r u e le t h a n 0 1 w h i l et h e p a r e n t sh a p l o i d yp r o t o p l a s tf o r m a t i o nr a t ea n dr e g e n e r a t i o nr a t ew e r ea l s o b e e ns t u d i e d ，t h eo p t i m a lc o n d i t i o ni st h a tb r e e d i n gh a p l o i d yw i t h 5 8 h o u r s ，u s i n g2 0 s n a i l l a s et oe n z y m o l y s i sp a r e n t sf o rlh o u ri n 3 0 ”cw a t e r ，t h e nt h ef o r m a t i o nr a t ea n dt h er e g e n e r a t i o nr a t ec o u l dr e a c h 9 2 0 a n d6 5 a tl e a s t t h ef u s i o nf r e q u e n c yw a s7 3 1 0 1 ( s c k + s d ) a n d8 4 1 0 1 ( s c + s d ) b e c a u s e & d i a s t a t i c u sc o u l dp r o d u c e s a c c h o r g e na m y l a s eb u ts c e r e v i s i a ec o u l d n o tg r o wo nt h es e l e c t i n g m e d i u mw h i c ht a k e ss t a r c ha st h eo n l yc a r b o nr e s o u r c e ，p r o t o p l a s t so f s d i a s t a t i c u sj n a c t i v a t e db vu va n ds c e r e y i s i a ekf u s e dj n 3 5 p e g ( 6 0 0 0 m w ) ，s oo n l yn e wf u s a n t st h a tc o u l dp r o d u c es a c c h o r g e n a m y l a s ea n dt r a n s f c i r mf e r m e n t a b l ea m y l a s ei n t oe t h a n o lc o u l dg r o wu po n s e l e c t i n gm e d i u m 1 3f u s a n t sw h i c hc o u l dk e e pi t sm a i nc h a r a c t e r ss t a b l y o v e r1 0g e n e r a t i o n sh a v eb e e ns e l e c t e d c o m p a r e dw i t hi t sp a r e n t sc h a r a t e r s ， as e r i e so fd e t e c t i o n sa n di d e n t i f i c a t i o n so ft h ef u s a n t si n c l u d i n gc e l l v o l u m e 、d n ac o n t e n t 、f e r m e n t a t i o na b i l i t ya n ds oo nh a sb e e nd o n e t h e b e s tf u s a n tk s 一5h a sb e e ns c r e e n e do u t ，w h i c hc o u l dp r o d u c e7 o ( v v ) e t h a n o li n l 8 0 s o l u b l es t a r c hf e r m e n t a im e d i u m t h e nt h ek s 一5 sb e s t g r o w t h c o n d i t i o na n df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o nw e r ea l s ob e e ns t u d i e d ， k e e p i n gp h 4 0 、f e r m e n t a it e m p e r a t u r e3 2 i n1 4 4h o u r s w ec a ng o t7 2 ( v v ) e t h a n o li ns t a r c hf e r m e n t a ll i q u i d k e y w o r d s ：f u e le t h a n o l ，p r o t o p l a s t ，s d i a s t a t i c u s ，s c e r e v i s i a e ，s c e r e v i s i a ek l i 诹l 3 l 亡工繁火港 学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工 作所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个 人或集体己经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体， 均己在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：名晌崭日期：哆彩车多月岁日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有 权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和 借阅。本人授权湖北工业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 学位论文作者张孱一闰彳 日期：诉 月岁f 日 指删雠：剃乡 日瓤：蕊每s 目31 日 湖北x - 业大学硕士学位论文 第1 章引言 1 1 燃料乙醇工业的发展前景 酒精是一种应用广泛的有机化合物，在国防工业、医药工业、食品卫生、化学 工业等行业都有广泛的用途“1 。所谓燃料酒精，是指没有添加变性剂的、可以作为 燃料使用的无水乙醇，它具有和矿物质相似的燃烧性能”1 ，被称为2 l 世纪最清洁的 能源“1 。燃料酒精添加变性剂后，与无铅汽油按一定的比例混配，可以形成一种新 型绿色燃料：乙醇汽油“1 。由于燃料乙醇的生产原料为玉米、薯干、糖蜜及植物秸 秆等可再生的生物资源，所以使用乙醇或乙醇汽油作为汽油的替代品，不仅可以 节省石油这种不可再生资源，还可降低污染排放百分之二十以上。3 。因此，关于燃 料乙醇的开发和研究在国内外都受到了重视，各国政府都出台相应措施以实现能 源的再生“。 从世界乙醇汽油的发展历史以及我国的能源战略考虑，燃料乙醇作为可再生 能源，其发展的背景和动因都是源于缓解石油资源短缺，改善大气环境，稳定粮 食生产，促进农业生产与消费的良性循环和可持续发展等因素【9 】。实践证明，在世 界石油资源紧缺、原油价格不断攀升、环境压力日益加重i ”】的情况下，推广使用 乙醇汽油具有重大的现实意义和深远的战略意义，是用科学发展观解决当前影响 我国社会经济全面协调持续发展的诸多制约因素的积极探索i l “。 中国作为一个发展中国家，能源( 主要是石油) 消费量比工业发达国家增长得快 “，而农作物资源较为丰富，特别是粮食作物，在近一段时期相对过剩，价格非 常低，使我们不得不重新考虑利用可再生的生物燃料。 我国石油年消费以1 3 的速度增长，而能源产量只能满足国内需求的7 0 i l ， 我国原发酵酒精生产能力达4 5 0 5 0 0 万t ，其中8 0 以上是小型企业年产量在万 吨以一f t l 4 l 。在目前中国人均石油开采储量仅有2 6 t 的低水平条件下，开发新能源 成为社会发展、推动经济增长的动力，燃料酒精作为国家战略部署的新型能源之 一，在我国具有广阔的市场前景。开发和利用燃料酒精既可以缓解我国石油供应 不足；又可以对我国农业保持稳定持续的发展，解决农村剩余劳动力，因此具有 十分重要的意义”。 可再生乙醇技术的发展所带来的益处是显而易见的1 16 l ： ( 1 ) 减少石油进口的要求。任何国家的收支平衡由其能源的依赖程度和自给自 湖北工业大学硕士学位论文 足状况的不同而大相径庭； ( 2 ) 改善农村地区生活条件的需要。在许多发展中国家，尤其是中国，农村人 口总是占大多数。乙醇工业提供了让农村地区繁荣的机会通过为发展和实现 工业现代化而供应大量的能源； ( 3 ) 减少来自不稳定地区的石油燃料依赖的需要； ( 4 ) 以经济可行的方式，消除温室气体和化学烟雾聚积的需要。 1 2 酒精发酵的菌种及发酵机理 所谓生料酿酒就是指酿酒原料不用蒸煮、糊化直接将生料淀粉进行糖化和发 酵。其技术关键就是生淀粉颗粒的水解糖化，与淀粉酶水解糊化淀粉不同，只有 能被生淀粉吸附的葡萄糖淀粉酶才具有水解生淀粉的能力。 生料糖化是原料中的生淀粉在葡萄糖淀粉酶的酶促作用下水解生成葡萄糖。葡 萄糖淀粉酶又称糖化酶，它能将淀粉以非还原性末端水解a l ，4 糖苷键，也能缓 慢水解a 一1 ，6 糖苷键，转化为葡萄糖，糖化酶的生淀粉水解速率与它能否被生淀 粉颗粒吸附以及吸附强度有关。 酒精发酵主要由酵母菌在厌氧条件下通过e m p 途径将葡萄糖降解为丙酮酸，然 后在丙酮酸脱氢酶的作用下，将丙酮酸脱梭形成乙醛，乙醛在乙醇脱氢酶的作用 下生成乙醇，表达式为： c 6 h 1 2 0 6 + 2 a d p + 3 h 3 p 0 4 一c h 3 c h 2 0 h + 2 c c i z + 2 a t p 淀粉和纤维素等多糖物质则需经过淀粉酶和糖化酶的转化，形成葡萄糖，再 经e m p 途径生成酒精，而细菌的酒精发酵主要是经过e d 途径形成酒精。 在酵母菌代谢生成酒精过程中，研究人员对何种条件下酵母菌能最大产量地 形成酒精以及在高浓度酒精中酵母菌的耐受性等问题极为关注。随着高浓度酒精 发酵技术在生产中的广+ 泛应用，尤其是出于对产品质量和经济效益的考虑，更增 加了人们对酵母菌在这两个方面的兴趣。目前工业生产中用酵母菌生产酒精的研 究重点集中在两个方面：一是拓宽酵母菌可利用的底物，找到更廉价的原料：二是选 育高产酒精酵母，培育出酒精产量高并能耐受高浓度酒精的新菌株。 目前，发酵生产工业酒精的菌种主要以酵母菌为主。通过糖酵解途径，酵母菌 将葡萄糖高效转化为乙醇和二氧化碳，生产的酒精占理论产量的9 0 一9 5 。酵母 菌的种类很多，包括有孢子酵母、产冬孢子的类酵母、掷饱酵母和无孢子酵母等， 含盖6 0 个属5 0 0 多个种( 在真菌分类系统中，它们分别隶属于子囊菌纲 ( a s c o m y t e t e s ) 、担子菌纲( b a s i d i o m y c e t e s ) 和半知菌纲( f u n g ii m p e r f e c t io 酒精工 业生产上常用的酵母菌属于真菌f ( e u m y c o t a ) ，予囊菌纲似s c o m y c e t e s ) 、半子囊菌亚 湖北工业大学硕士学位论文 纲( h e m i a s c o m y c e t e s ) ，酵母目( e n d o m y c e t a l e s ) ，酵母科( s a c c h a r o m y c e t a c e a e ) 。大多 数用于酒精发酵的酵母菌都属于酵母属( s a c c h a r o m y c e t a c e ) 的酿酒酵母 ( s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e ) 、卡尔斯伯酵母( s a c c h a r o m y c e s c a r l s b e r g e n s i s ) 、清酒酵 母( s a c c h a r o m y c e s s a k e ) 及其变种。其它的属如粟酒裂殖酵母( s h i z o s a c c h a r o m y c e s p o m b e ) 、脆壁克鲁维酵母( k l u y v e r o m y c e s e g i l i s ) 、树干毕赤酵母( p i c h i a s t i p i t i s ) 、 克劳森酒香酵母( b r e t t a n o m y x e s c l a u s s e n i i l 、热带假丝酵母( c a n d i d a t r o p i c a l i s ) 和管 囊酵母( p a c h y s o l e n t a n n t p h i l u s ) 等也有一定的应用【”i 。 工业上常用的酒精发酵菌株有k 字酵母、南阳1 3 0 0 酵母、南阳1 3 0 8 酵母、拉 斯2 号、拉斯1 2 号、古巴l 和古巴i i 等等，均属于酿酒酵母假c e r e v i s i a eo 酒精 生产中对酵母菌菌株的生理特性有一定的要求【1 9 】：f 1 ) 发酵力强而且迅速，有较强的 酒化酶；( 2 ) 繁殖速度快，有较强的增殖能力；( 3 ) 耐酒精能力强，能在较高浓度的酒精 发酵醪中发酵；( 4 ) 耐温性能好，能在较高温度下发酵；( 5 ) 抵抗杂菌能力强；( 6 ) 耐酸能 力强；( 7 ) 生产性能稳定，变异性小，发酵时产生泡沫小。 1 3 酒精生产的原料及育种研究进展 近年来，生淀粉发酵工艺在国内外受到高度重视，这种工艺可以大大节省蒸 煮淀粉所需的能源，简化发酵工艺。目前，己用d n a 技术做了大量工作，先后将 黑曲霉、泡盛曲霉、米根霉或米曲霉等的糖化酶c d n a ，糖化酵母或拟内抱霉的糖 化酶基因，地衣杆菌或解淀粉芽抱杆菌的a 淀粉酶基因克隆到酿酒酵母中，并获 得了表达。此外，人们也利用原生质体融合技术，完成了糖化酵母与酿酒酵母的 原生质体融合，或实现了酿酒酵母与出芽短梗霉的原生质体融合，获得了能发酵 淀粉的稳定融合子【2 0 】。另外，z a s t r o w 等人分离到能利用麦芽三糖发酵的酵母菌， 同样拓宽了酵母茵利用淀粉材料的范围【2 1 1 粮食供给不足仍然是世界上部分地区的重要问题，在这些地区人们把选择酒 精生产材料的着眼点集中到廉价且来源广泛的植物纤维素原料上。如，农业上产 生的废物，小麦秸秆，玉蜀黍的穗杆，麦壳，甘蔗渣，伐木及木材加工后的残留 物，木屑和锯屑，一些生产中的次品和食品加工中的废物以及城市的固体垃圾， 如废纸、纸板等等。利用生物技术，以可再生的植物纤维素为原料生产酒精是国 内外研究的重点课题。 纤维素类物质的主要成分是纤维素、半纤维素和木质素。尽管含在纤维素类 物质中的木质素、半纤维素在原料预处理过程中大部分己被除去，但半纤维素产 生的木糖却存留在水解液中，因此纤维素类物质水解的主要成分是纤维素水解产 生的葡萄糖和半纤维素水解产生的木糖。直到1 9 8 0 年前，人们一直认为木糖不能 湖北工业大学硕士学位论文 被微生物利用而发酵生成酒精。w a n 甙1 9 8 0 ) 等人指出，一些微生物可以利用木糖， 其中酵母菌的木糖发酵能力最强，酒精产较高。日前，具有工业应用前景，能利 用木糖发酵生成乙醇的三种酵母菌是管囊酵母( p u c h y s o l e n t a n n l p h i l u s l 、树干毕赤 酵母( e s t i p f 嘲和休哈塔假丝酵母( s s h e c h a t a e ) 2 2 】在筛选和培育戊糖发酵菌株方面， 科学家也取得了一定的进展。如张继泉m 】等从木糖固体培养基中筛选到一株能发 酵戊糖的管囊酵母但t a n r c l p h i l u s ) ，产酒精能力相当于理论产量的6 0 ，耐酒精能 力为1 4 ( v v 1 ，4 2 下能正常发酵。 应用生物技术手段改善酵母菌对植物性材料中的糖质利用率己取得了很大 的进展。王岳五【2 4 】等人以季也蒙假丝酵母( cg u i l l i e r m o n d i i ) 和酿酒酵母瓶 c e r e v i s i a e ) 为亲本，采用电融合技术获得了两株能利用木糖和纤维二糖产生酒精的 融合子f 一1 0 6 和f 一3 0 8 。这两种融合子细胞均能在含有2 木糖和纤维二糖的培养 基中生长，产生一定量的酒精。目前，应用基因工程技术极大地推动了这一领域 的进展，主要表现在以下4 个方面：( 1 ) 提高戊糖、己糖同时发酵的速率：( 2 ) 提高菌株 对毒素的抵抗性；( 3 ) 构建可同时产生多种纤维素酶的菌株；( 4 ) 提高菌株的耐高温、耐 高渗透压特性。例如n a n c y i 冽利用大肠杆菌一酵母菌穿梭质粒将树干毕亦酵母俾 s a p _ f t s ) 的木糖分解基因转入到酿酒酵母假c e r e v i s i a e ) 中，构建的工程菌既能利用葡 萄糖也能利用木糖发酵生产酒精。m o n i r u z z a m a n 2 6 】构建的1 4 0 0 酵母工程菌能高效 表达木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶，在含有8 0 9 l 葡萄糖和4 0 9 m 的木 糖的混合培养基中可产生5 2 9 a b 的酒精，理论转化率为8 5 有人对树干毕赤氏酵 母但s 却f 据) 和休哈塔假丝酵母( cs h e c h a t a e ) 进行了固定化研究，也取得了满意的效 果。另外，有人用利用葡萄糖与利用木糖的菌株混合发酵，比单纯用葡萄糖发酵 菌或单纯用戊糖发酵菌分别提高了酒精产量3 0 3 8 和1 0 3 0 ”l 。 1 4 生料发酵产酒精菌种选育研究方法及进展 1 4 1 原生质体融合技术 细胞融合或称原生质体融合，就是在高渗环境中使亲株的细胞壁分别通过酶 解作用加以去除，释放出只有原生质膜包被着的球状原生质体，然后将亲株的原 生质体在高渗条件下混合，通过物理、化学或生物学方法助融，使它们相互凝聚， 通过细胞质融合，接着发生基因组之间的接触、交换，从而发生基因组的遗传蕈 组，再通过合理的筛选程序从再生细胞中获得重组子口。 微生物原生质体融合技术由于可在种内、种问甚至属问进行，不受亲缘关系的 影响，遗传信息传递量大，不需要了解双亲详细的遗传背景，因而便于操作。 湖北工业大学硕士学位论文 微生物原生质体融合作为育种方法来说也有缺点，主要是工作量大、定向性差， 然而与其它几种方法相比，它也有许多优点1 2 9 】： f 1 ) 去除了细胞壁的障碍，使得没有有性过程、没有转化和转导系统的微生物，或 者相同结合型的真菌细胞也能发生原生质体的相互融合，而且可以冲破种、属的 界限，广泛地在有生产有价值的微生物种间以至属问进行杂交育种； ( 2 ) 原生质体融合后，两个亲株的整套基因互相接触，可以有机会发生多次交换， 产生各种各样的基因组合而得到多种类型的重组予； ( 3 ) 有p e g 电脉冲助融，重组频率高： r 4 ) 可以和其它育种方法相结合，把从其它方法得到的优良性状通过原生质体融合 再组合到一个单株中，又可以多个亲株融台体： f 5 ) 可以进行包含非活性原生质体的融合，即用温度、药物或紫外线照射处理钝化 亲株一方的原生质体，然后再与一亲株的活原生质体相融合，这样可以在筛选中 除去亲株一方，提高筛选效率： ( 6 ) 融合工作要求设备条件不高，一般实验室都可以进行。 灭活原生质体融合技术的一个可能用途，就是可以省去亲株细胞的遗传标记和 提高筛选效率。在杂交育种中，一般都需要对亲株进行遗传标记，这不仅需要许 多人力和时间，而且还往往影响一些有用的性状。更值得考虑的是，用营养缺陷 作为分离重组体的标记，所得到的重组体应是标记的重组体，与抗生素合成有关 的基因不一定发生了重组刚。 微生物细胞融合技术在育种上的应用： 微生物原生质体p f 技术起源于2 0 世纪5 0 年代。1 9 5 8 年，日本的o k a d a 发现并证明 了灭活的仙台病毒可诱发体内艾氏腹水癌细胞彼此融合，从而开始了细胞融合的 探索；1 9 7 7 年，s i p i c z k i 与f e r e n c z y t “”首次实现酵母菌的原生质体融合；1 9 7 8 年， 第三届国际工业微生物遗传学讨论会上，把原生质体融合作为一种新的基因重组 手段提出来，引起全世界的关注；1 9 8 0 年，z i i i l 【n e r m a n n 等报道了用电场诱导细胞 融合新技术；1 9 8 8 年张闻迪又报道了激光诱导动物细胞融合。1 9 9 9 。”1 年， g n i e w o s e z l 等人用电场诱导法获得一嗜杀性酵母菌株 构建糖化型或耐高浓度酒精及底物的酵母菌株： 选育耐高浓度酒精及底物的酵母，在超浓醪发酵生产高浓度酒精方面具有良好 的前景。这种工艺可以节省发酵和蒸馏过程中的能量消耗，提高设备利用率，减 少劳动强度和提高酒精产量。 l e g m a n n ”3 1 酿酒酵母( 不耐高渗) 与蜂蜜酵母( s 腓j j 曲( 能耐4 0 以上的葡萄糖) 作为亲株进行原生质体融合获得融合子在3 5 葡萄糖培养基中产乙醇的速度为亲 湖北_ t - 业大学硕士学位论文 株的3 倍和7 倍。国内侯红漫等。”人利用原生质体融合技术将清酒酵母 ( s a c c h a r o m y c e ss a k ey a b e ) 与k 氏酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ek ) 融合 也获得了耐较高酒精浓度的融合株： 近年来应用原生质体融合技术构建既能糖化又能发酵的酵母菌株已有不少成功 的例子，其转化淀粉能力可与添加酶进行糖化的方法媲美，如庞小燕等“以酒精 酵母和热带假丝酵母为亲本，通过单亲灭活原生质体融合技术，获得了既具有糖 化酶活性又能高产酒精的稳定的酵母融合株f - 1 和p - 5 ，两株融合子酒精发酵产量 分别达8 8 和l1 5 ： 耐高温酿酒酵母菌株的选育： 在地域环境高温，或季节因素，及发酵过程排放热能等很多情况下，普通酵母 难以进行正常的乙醇发酵1 ，或出酒率下降，或发酵速度减缓，甚至彻底丧失发 酵功能，必须配咀制冷设备才能维持正常生产，增加了设备投资和运行费用，每 年酿酒厂不得不支付大量的冷却设备及耗电的费用。由此可见，高温菌种的选育 具有重要的现实意义。 传统的高温菌株的选育主要集中于高温驯化和自然界筛选，但工作量都非常大， 而采用原生质体融合技术进行高温菌的选育的研究时有报道。女h s e d i 。7 1 等人采用 原生质体融合技术将酿酒酵母t j l 与某- - a w a m o r i 酿造菌株融合得到的融合株在4 0 下产酒精1 2 4 ( w v ) 且该菌株表现出良好絮凝性。国内另有研究者1 通过p e g 诱导碘乙酸灭活呼吸缺陷克鲁维酵母( e l u y v e r o m y c e s s p ) 原生质体与酿酒酵母 ( s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s f a e ) 原生质体融合，获得4 5 发酵产酒率高达8 7 的高 温酵母菌株：2 0 0 2 年国内孙君社等o ”利用电场诱导原生质体融合技术对产酒率高 的菌株s b l 和产酒率低但耐高温的n o 3 0 菌株进行融合，得到4 5 时产酒精能力达 7 2 8 的融合子，应用于纤维索的同步糖化发酵。 提高酿酒酵母絮凝性菌株的选育： 细胞絮凝性是选育啤酒酵母的一个很重要的指标。良好的絮凝性不仅可使啤酒 发酵液澄清速度加快， 降低酵母分离的能量消耗，而且可防i = 酵母细胞因长时州 悬浮于发酵液中致使细胞自融，有损啤酒风味。 j a v a d e k a d 等“人将经过紫外灭活的具有嗜杀特性的酿酒酵母n c i m3 5 7 8 与具有 高度絮凝特性的酿酒酵母n c m3 5 2 8 原生质体融合，获得的融合子既具有良好絮凝 特性，又具有嗜杀特性。这样在提取_ _ 序中容易沉淀分离，减少或避免离心、压 滤等工序，可缩短工艺流程，降低生产成本。 ( d 降解苹果酸的葡萄酒酵母的选育： 葡萄酒中过多的有机酸会使葡萄酒酸涩，酒味粗硬、品质下降。尤其是葡萄 i ! ! 湖北工业大学硕士学位论文 中的苹果酸酸味尖刻，且含量较高。目前，生产上多采用苹果酸一乳酸发酵进行 降酸“，在发酵后期添加或利用葡萄酒中本身的乳酸细菌使葡萄酒中的苹果酸转 变成乳酸和c o ：，从而降低酸度，但往往也使葡萄酒的新鲜果香味受到影响，并且 不易控制。若污染了乳酸腐败菌，对酒质有毁灭性的影响。选育降解苹果酸能力 强的葡萄酒酵母，成为了酿酒师们研究的方向。高年发等“用赖氨酸缺陷型酿酒 酵母原生质与肌醇缺陷型粟酒裂殖酵母原生质体融合，结果表明，融合子具有降 解苹果酸能力和葡萄酒发酵性能好的双亲优良特性。黑龙江的高玉容“”用原生质 体融合技术构建降酸葡萄酒酵母也获得了成功。 1 4 2 基因重组技术 现代酵母菌育种技术是以原生质体融合和d n a 重组技术为依托的。近年来， 运用原生质体融合和遗传工程等育种新技术来改良菌种，克服了远缘菌种间基因 重组的不亲和性，提高了重组频率，己培育出了一批工程菌，对于拓展酒精生产 原料和提高产量及质量有很大的促进作用。然而，在生产上这些工程菌仍然缺乏 良好的稳定性，因而大多数还没有达到工业应用的程度。此外，培育集两个或多 个优良性状于身的工程菌的研究也将是酵母菌选育工作的一个热门方向。如能 直接利用淀粉与耐高温性状于一体的酒精酵母必将在酒精工业上有广阔的应用前 景。 基因重组指用人工方法把所需的特定基因从供体生物的d n a 中切割下来，与 基因载体连接在一起，通过转化，把这- - # b 源d n a 片断引入新的生物体内，实现 生物遗传特性的转移，从而使生物的遗传性状发生改变的一项技术。随着d n a 重 组技术的发展，科学家己能将很多种其他生物的基因引入酵母菌，并在酵母菌基 因调节系统的控制下合成和分泌异源基因产物【“。自上世纪8 0 年代，黑曲霉、泡 盛曲霉，米曲霉等糖化酶基因先后以不同的方式和载体导入酿酒酵母，构建能直 接利用淀粉的工程菌【4 5 f 4 64 ”。唐国敏f 4 8 l 等人用黑曲霉糖化酶c d n a 构建整合型质粒 p k g i ，转化酿酒酵母y 3 3 ，得到转化子可以使淀粉转化率达到8 6 。用基因重组 技术，罗进贤1 4 9 j 等人将黑曲霉糖化酶g a ic d n a 重组到大肠杆菌一酵母菌穿梭质粒 上，并用原生质体转化法导入到酿酒酵母g r f l 8 中，实现了糖化酶的高度表达， 构建的工程菌在2 0 的淀粉培养基中培养4 8 小时，淀粉水解率达9 6 1 ，酒精产量 达8 4 ( v v ) 。同时，他们将黑曲霉糖化酶c d n a 重组到酵母整合型质粒y l p l a c l 2 8 上，转化酵母g r fi8 ，获得整合型酵母转化子g r f1 8 ( y i p1 2 8 d 1 7 n ) ，糖化酶基 因在该菌株可获得高效表达，淀粉转化率 9 8 ，在含2 0 淀粉培养基中培养2 4 h ， 可获得9 5 ( v v ) 的酒精；在含2 5 淀粉培养基中培养2 4 h ，可获得1 0 2 fv v ) f f j 酒 湖北工业大学硕士学位论文 精【5 0 】泡盛曲霉口s p e r g i l l u sa w a m o r i ) 产生的葡萄糖淀粉酶具有a 1 ，4 f t l a i ，6 糖苷酶活 性，广泛应用于淀粉的糖化工艺中。王永吉等人【5 l | 利用r t - p c r 技术克隆了泡盛曲 霉葡萄耱淀粉酶i 基因，将其置于酵母菌烯醇酶启动子与终止子之间，构建了表达 载体，并转化到酒精酵母a s 2 1 3 6 4 ，获得了能将淀粉转化为葡萄糖并可发酵产生 酒精的转基因酵母菌株。 1 4 3 代谢工程 传统的乙醇生产采用的菌种为酿酒酵母，由于乙醇对酵母细胞的毒性、酵母对 底物利用的局限性以及大量副产物的生成等原因使得乙醇的产率不高，生产效率 低下。因此，为了提高乙醇的产率、改善细胞对乙醇的耐受性、拓宽底物利用范 围和最大程度降低副产物的生成，采用代谢工程技术对乙醇代谢网络进行有目的 的改造已成为世界范围内研究热点。由于乙醇为酵母代谢的初级代谢产物，细胞 对于这些初级代谢途径具有极大的依赖性，如果采用改变原有的代谢流的代谢手 段就会严重干扰细胞正常的生理生化过程，所以对于乙醇的生产主要采用的代i 身十 工程手段有：代谢途径的扩展以及转移或构建新的代谢途径，并获得了重大进展 和突破。代谢工程中可以通过引入外源基因扩展、延伸原来的代谢途径，产生新 的末端代谢产物，提高产率，或者利用新的底物作为生物合成的原料。 1 5 生料发酵产酒精研究现状 生料酿酒始发于世界能源危机，以酒精发酵为切入点。自2 0 世纪2 0 年代 s t a m b e r g 等人提出d 一淀粉酶能水解4 l o 的小麦生淀粉以来，各国科学家在此 方面做了大量的研究工作”。 生料酿酒就是微生物利用生淀粉直接进行生长、繁殖及代谢的过程。生料酿酒 工艺与传统发酵工艺比较，具有节约能源、提高出酒率、操作简便、便于工业化 生产等优点，被誉为我国制酒工业发展的方向。国外有关生料糖化的研究始丁二2 0 世纪4 0 年代，随着对微生物酶作用的认识及淀粉结构的认识推动了生料酿酒的 进步和发展。日本在2 0 世纪7 0 8 0 年代也对生料酿酒进行了大量研究，但发展较 缓慢。我国对生料酿酒的研究始于2 0 世纪7 0 年代末，到2 0 世纪9 0 年代才进入快速 发展期。 生料酿酒生产工艺分固态法生料酿酒和液态法生料酿酒两种。固态法生料酿酒 采用原料粉碎，高温润料，配加辅料，固态发酵酒质较好，出酒率较高。液态 法生料酿酒是淀粉质原料直接加曲、加水糖化发酵、蒸馏而成，其特点是采用生 原料，不经蒸煮糊化，不需配糟，整个发酵过程是在液态中进行。此法投资省， 湖北_ t - 业大学硕士学位论文 操作简便，清洁卫生，出酒率高，是目前生料酿酒的主流。 n o b u y am a t s u m o t o 等1 9 8 2 年撰文阐述了以谷物为原料的无蒸煮酒精发酵的工业 化问题，其发酵效率等于或高于高温和低温蒸煮法。在以玉米等谷物为原料进行 酒精的工业化生产中，采用无蒸煮法可以节省大量能源。 1 9 9 2 年，黑龙江科学院应用微生物研究所王祥观等开始进行以普通糖化酶为 主，多种酶配合的无蒸煮玉米粉酒精发酵新工艺的试验研究，实验室和生产性试 验均获满意的结果并通过技术鉴定。 以淀粉质原料玉米生产酒精时，醪液中酒精浓度可达1 4 5 ，这对于通常的高 温蒸煮法来说是很难达到的。因此，采用无蒸煮法进行酒精生产，可以使每一发 酵罐的酒精产量大为提高。 高温蒸煮、低温蒸煮和无蒸煮的酒精发酵对比实验，三者发酵终点的p h ，酒精 含量以及发酵系数的对比采用无蒸煮的酒精发酵效果最好，酒精产量最高达 】4 2 。 1 6 原生质体融合的研究现状及选题目的和意义 虽然目前有关于这方面研究成功的报道，如庞小燕等以酒精酵母和热带假丝 酵母为亲本，通过单亲灭活原生质体融合技术，获得了既具有糖化酶活性又能高 产酒精的稳定的酵母融合株f 一1 和p 一5 ，两株融合子酒精发酵产量分别达8 8 和 1 1 5 ；而罗进贤等则用基因重组技术将黑曲霉中产糖化酶的d n a 片断导入酿酒酵 母构建出可直接水解淀粉生产酒精的工程菌株。总的来说，构建出的可直接水解 淀粉产酒精的菌株种类较少，且多数存在酒精转化率不高、淀粉质利用率较低的 问题。因而影响了这一类新型菌株的实际应用效能。发展生物酒精工业所遇到的 最大技术障碍，就是缺少可以有效转化原料为酒精的菌株。而要从技术上解决这 种困难，只有先在实验室获得高效率利用可溶性淀粉的菌株，才有可能在： 业化 生产中有效地转化生淀粉质为酒精。 课题的研究目的，即是构建出一株能够直接利用早籼稻生淀粉来发酵生产酒精 的工程菌，并且产酒精的能力要高，发酵性能良好，符合工业生产的要求。以此积极促 进乙醇汽油的生产和应用，以缓解国内对石油类能源的紧张需求。 湖北工业大学硕士学位论文 2 1 材料与方法 第2 章出发菌株性能检测 2 1 1 材料 2 1 1 1 菌种 糖化酵母阻d i a s t a t i c u s ) ：购自中科院微生物研究所( a s2 1 5 4 8 ) k 氏酵母圆c e r e v i s i a ek ) ：湖北省工业微生物重点实验室保藏 酿酒酵母佤c e r e v i s i a e ) ：购自中科院微生物研究所( a s2 5 4 1 ) 2 1 1 2 培养基 麦芽汁液体培养基：将麦芽粉碎过4 0 目筛，加入四倍质量的水6 5 恒温4 h ，过 滤，0 1 m p a 灭菌3 0 m i n 得到麦芽汁； p d a 活化培养基：麦芽汁液体培养基+ 2 o 琼脂； 固体麸蓝培养基：麸曲：淀粉：水= 3 ：l ：3 上述培养基的p h 值皆调节到6 0 ，在1 1 3 0 c 下灭菌3 0m i n 。 2 1 1 3 试剂 糖化酶：酶活力5 0 0 0 0u g ，无锡酶制剂厂 p h 4 6 醋酸一醋酸钠缓冲液 p h 6 0 磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液 斐林试剂：参考文献“3 3 2 1 1 4 主要仪器设备 超净工作台，l s 一2 ，苏州净化设备有限公司； 恒温旋转摇床，h q 4 5 z ，中科院武汉科学仪器厂： 显微镜，x s - 2 1 2 ，南京江南光电股份有限公司： 2 1 2 方法 酒精耐受性实验：接种液体活化2 4 h 的菌液至一定浓度的麦芽汁液体培养基中， 再用无水乙醇调节，使终酒精浓度( v v ) 成1 2 、1 3 、1 4 、1 5 、1 6 、1 7 、 1 8 、 1 9 、2 0 、2 1 、2 2 梯度变化。3 0 。c 恒温摇床培养4 8 h 后镜榆计数， 测菌液浓度。 亲株产酶能力测定：将待测菌经p d a 培养基活化一次，然后接种至固体麸曲培养 基上，3 0 ”c 恒温培养4d 后经常温干燥至恒重，即制成固体曲。称取5 o g 固体曲， 置入2 5 0 m i 烧杯中，, b h 9 0m l 水和1 0m l 的p h4 6 醋酸一醋酸钠缓冲液，搅拌均匀， 湖北工业大学硕士学位论文 于3 0 0 c 水浴中保温浸取l h ，每隔1 5m i n 搅拌一次。用脱脂棉过滤，所得滤液即为5 o 固体曲浸出液。用斐林试剂法快速测定糖化酶活力。糖化酶酶活力单位定义：lg 干固体曲，在3 0 。c ，p h4 6 ，l h 内水解可溶性淀粉为葡萄糖的量( m g ) 。 糖化酶活力= ( v 。一v ) x c x1 0 2 0 xl w x1 0 0 0 式中：v o - - 5 m l 空白液消耗0 1 标准葡萄糖溶液的体积( m 1 ) v 一5 【l l 糖化液消耗o 1 标准葡萄糖溶液的体积( m 1 ) c 一标准葡萄糖溶液浓度( g m 1 ) w 一绝干曲称取量( 5 o g ) a 一淀粉酶活力测定：即a l ，4 糊精酶，又称液化型淀粉酶，能水解淀粉中a 一1 ， 4 葡萄糖苷键，并使淀粉迅速被液化。测定原理：淀粉遇碘呈蓝色反应，添加淀粉 发酵培养基后，酵母分泌的a 一淀粉酶能将淀粉分子任意切断成长短不一的短链糊 精以及少量麦芽糖及葡萄糖，从而使淀粉对碘所呈蓝色反应逐渐消失。以该颜色 消失的速度来衡量a 一淀粉酶活力的大小。 同上制得固体曲，准确称取曲粉2 0 9 ，用p h 6 0 磷酸氢二钠一柠檬酸缓冲液稀释 至一定体积( 使其测定时酶解反应控制在2 3 m i n 之内) ，于4 0 水浴浸取3 0 h ， 纱布过滤，滤液即为供试酶液，然后按碘量法测定其酶活力。u 一淀粉酶酶活力单 位定义：l g 干固体曲，在6 04 c ，p h6 0 ，l h 液化可溶性淀粉的量( g ) ： a 一淀粉酶活力- - - - 2 0 x 0 0 2 x 6 0 t x i 0 5 n x l w 式中：t 一酶解反应时间( m ir 1 ) n 一稀释倍数 w 一曲粉取样量( g ) 酵母质量性能测定： 酵母细胞数：是成熟酒母醪质量的主要指标，在培养基的组成一定的时候，酵母 细胞数增加到一定数量就停止了。所以可以根据它来判断酒母醪的成熟度。一般 成熟酒母醪的酵母细胞数在o 8 t o x1 0 9 个m l 。如果酵母细胞数太低，则说明酒 母糖化醪营养不足，或是培养条件没有掌握好或是受到杂菌污染。 出芽率：酵母出芽率是衡量其繁殖旺盛与否的一项指标，也是表明酵母醪成熟 程度的参数。出芽率高，说明酵母处于旺盛繁殖期，但也不能过高，否则既明酵 母醪较嫩。如果出芽率过低，则说明酵母过老。 酵母死亡率：用美蓝对酵母细胞进行染色，酵母细胞被染成蓝色者，说明该细胞 已经死亡。正常培养的成熟酒母醪中不应有死细胞。 耗糖率：耗糖率= ( 醪液原始糖度一酒母成熟醪糖度1 醪液原始糖度x1 0 0 酒精含量：用蒸馏方法测定。浓度一定的情况下，发酵醪中酒精含量愈高，发酵 湖北2 r _ 业大学硕士学位论文 愈彻底，酒精生产全过程的质量愈好。 发酵控制：将酵母活化后按1 0 的量接种于含2 5 0 m l1 4 。的麦芽汁发酵培养基的三 角瓶中，调节温度至3 2 、1 5 0 r m i n 转速进行发酵4 d ，然后测各种指标 2 2 结果与讨论 2 2 1 亲株的酒精耐受性 接种酵母菌至无水乙醇配制的培养基之后，立即镜检计数，记录下此时的菌液 浓度。4 8 h 后再测菌液浓度，并与初始浓度作比较，浓度增加的记为“+ ”浓度减 少则记为“”，每组实验做3 个平行，所得结果记录如表2 - 1 ： 表2 - 1不同酵母的酒精耐受性测试验 实验结果表明，糖化酵母在低于1 6 的酒精发酵液中均能正常生长增殖，而在 高于此浓度的培养基中则不能继续增殖，糖化酵母的酒精耐受性为1 6 ；相同地， k 氏酵母和酿酒酵母的酒精耐受性则为1 7 。 2 2 2 亲株产酶能力测定 用斐林试剂法快速测定所消耗的标准葡萄糖液的体积，取其平均值，代入式中， 即得a s 2 1 5 4 8 的糖化酶活力= ( 2 1 5 8 1 2 4 7 ) 1 0 1