（细胞生物学专业论文）斑马鱼中第二个纤连蛋白基因的识别与表达分析.pdf

硕士学位论文 孙璐：斑马鱼中第二个纤连蛋白基因的识别与表达分析 斑马鱼中第三不纤连蛋百墓因雨识剐写表达分析 摘要 纤连蛋白是一种高分子量的糖蛋白。作为胞外基质中最为主要的组分之一， 纤连蛋白能够与其它多种分子相互作用，参与诸如迁移、粘连、生长、凋亡和分 化等细胞活动，在发育和生理过程中发挥重要作用。目前对于哺乳动物、鸟类和 两栖类中纤连蛋白的分子和生化特征已有较为详细研究。作为一种重要的模式动 物，有关斑马鱼的各种分子生物学特征的描述受到了广泛的重视。 早前报道在斑马鱼中存在一个纤连蛋白基因( f n l a ) ，而现在我们在斑马鱼 中发现了第二个纤连蛋白基因( f n l b ) ，它编码的蛋白的预期初级结构与在其他 脊椎动物中发现的纤连蛋白相似，包含1 2 个i 型，2 个i i 型和1 7 个i i i 型重复 单元( 包括两个可变的剪接位点e i i i a 和e i i i b ) 和一个可变区( v ) 。斑马鱼f n i b 与斑马鱼f n l a 的氨基酸同源性为6 2 o ，与人类和爪蟾( x e n o p u st a e v i s ) 的纤 连蛋白的同源性分别为5 4 和5 5 。通过r t - p c r 分析，我们发现同一f n l b 转 录体的不同剪接会产生e i i i b - 和v 一异构体，但是在斑马鱼胚胎或成体组织中都 没有发现f n l b 的e i i i a - 异构体，也没有发现f n l a 的e i i i a ，e i i i b 或v 区的剪 接异构体。通过r t - p c r 检测从原肠胚期( 8 h p f 受精后8 小时) 到7 2 h p f 的胚 胎和不同成体组织中的f n l bm r n a ，发现e i i i b 一和v + 是斑马鱼胚胎期中出现 的主要形式。与f n l a 在原肠胚之前的胚胎期表达量相对较高不同，f n l b 在早 期卵裂期的表达量非常低。f n i b 的多种存在形式以及与f n l a 相比不同的表达 模式都表明这两个纤连蛋白基因在斑马鱼发育中所发挥的功能不同。 关键词：斑马鱼；纤连蛋白；基因复制；胞外基质：可变剪接；发育 硕士学位论文 孙璐：斑马鱼中第二个纤连蛋白基因的识别与表达分析 i d e n t i f i c a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fas e c o n d f i b r o n e c t i ng e n ei nz e b r a f i s h a b s t r a c t f i b r o n e c t i n ( f n ) i sah i g hm o l e c u l a rw e i g h t 出y c o p r o t e i n a b e i n gam a j o r c o m p o n e n to fe c m ，f i b r o n e c t i ni n t e r a c t sw i t hav a r i e t yo fo t h e rm o l e c u l e sa n di s i n v o l v e di nm a n yc e l l u l a rp r o c e s s e s ，s u c ha sm i g r a t i o n ，a d h e s i o n ，g r o w t h ，a p o p t o s i s a n dd i f f e r e n t i a t i o n , t h e r e f o r ei tp l a y si m p o r t a n tr o l e si nm a n yd e v e l o p m e n t a la n d p h y s i o l o g i c a lp r o c e s s e s m o l e c u l a ra n db i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i z a t i o n so ff n sh a v e b e e nw e l ls t u d i e di nm a m m a l s ，b i r d sa n da m p h i b i a n s i nz e b r a f i s h ，i tw a sr e p o r t e dt h a ti tp o s s e s sas i n g l ef ng e n e ( f n l a ) h e r ew e r e p o r tt h ep r e s e n c eo fa s e c o n dz e b r a f i s hf ng e n e ( f n ib ) t h a te n c o d e sap r o t e i n 淅t h ap r e d i c t e dp r i m a r ys t r u c t u r et h a ti ss i m i l a rt of n si d e n t i f i e di no t h e rv e r t e b r a t e s p o s s e s s i n g1 2t y p ei 2t y p ei ia n d1 7t y p ei i ir e p e a t si n c l u d i n gt w oa l t e m a t i v es p l i c e s i t e s ( e i i i aa n de i i i b ) a n dav a r i a b l er e g i o n ( v ) z e b r a f i s hf n l be x h i b i t s6 2 o a m i n oa c i di d e n t i t yw i t hz e b r a f i s hf n l a 5 4 w i t hh u m a na n d5 5 w i t hx e n o p u s l a e v i sf n sr e s p e c t i v e l y e m p l o y i n gr t - p c ra n a l y s i s ，w ed e m o n s t r a t et h a te i i i b - a n dv - - i s o f o r m sa r ep r o d u c e db ya l t e r n a t i v es p l i c i n go f a s i n g l ef n l bt r a n s c r i p t t h e f n l be i i i a - - i s o f o r mw a sn o td e t e c t e di nz e b r a f i s he m b r y o so ra d u l tt i s s u e sn o rw e r e e i i i a ，e i i i bo rvr e g i o ns p l i c ev a r i a n t so f f n l af o u n d f n l bm r n aw a sd e t e c t e db y r t - p c ri ne m b r y o sa tt h eg a s t r u l a s t a g e ( 8 h p f , 8 h o u rp o s tf e r t i l i z a t i o n ) t h r o u g h 7 2 h p fa n di nv a r i o u sa d u l tt i s s u e s e i i i b - - a n dv + a r e 也ep r e d o m i n a n tf o r m so ff n lb p r e s e n ti nt h ez e b r a f i s he m b r y o u n l i k ef n i a ，w h i c hi sp r e s e n ta tar e l a t i v e l yh i 曲 a m o u n ta tt h ee m b r y o m cs t a g e sb e f o r eg a s t r u l a t i o n ，t h ef n l bi s o f o r m sa r ep r e s e n ta t v e r yl o wa m o u n t sa tt h ee a r l yc l e a v a g es t a g e t h ep r e s e n c eo fm u l t i p l ei s o f o r m so f f n l ba l o n gw i t had i f f e r e n tp a t t e r no fe x p r e s s i o nc o m p a r e dt of n lai n d i c a t e st h a tt h e t w of ng e n e sh a v es e p a r a t er o l e si nz e b r a f i s hd e v e l o p m e n t ， k e y w o r d s ：z e b r a f i s h ；f i b r o n e c t i n ；g e n ed u p l i c a t i o n ；e x t r a c e l l u l a rm a r x ； a l t e r n a t i v es p l i c i n g ；d e v e l o p m e n t 5 学位论文独创性声明 本人郑重声明： i 、坚持以“求实、创新”的科学精神从事研究工作。 2 、本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究 成果。 3 、本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实的。 4 、本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构 已经发表或撰写过的研究成果。 5 、其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声明并表示 了谢意。 作者签名：盈：盛 日 期：逸! ：! i 学位论文使用授权声明 本人完全了解南京师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索；有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在 解密后适用本规定。 作者签名：鱼：盛 日期：d 丛：! ：生 硕士学位论文 孙璐：斑马鱼中第二个纤连蛋白基因的识烈与表达分析 第一章综述 1 1 前言 作为细胞胞外环境的主要组分之一，胞外基质是与细胞相连的网状结构，由 糖蛋白、蛋白聚糖及粘多糖聚集形成。细胞可能被胞外基质完全包被( 例如软骨 细胞) ，或者仅有一个表面与胞外基质接触( 例如上皮和内皮细胞) ( a d a m se t a 1 ，1 9 9 3 ) 。胞外基质不仅为细胞提供结构上的支持，而且对于诸如生长因子等可 溶性分子是一种天然的选择性滤膜( a d a m se ta l ，1 9 9 3 ) 。胞外基质能够结合生长 因子，并且调节生长因子的局部浓度和生物活性。细胞与胞外基质的连接还可以 调节编码特异生长因子以及生长因子受体的基因的表达( n a t h a ne ta 1 ，1 9 9 1 ) 。此 外，胞外基质蛋白可以通过分布在细胞表面的整合蛋白受体直接参与信号传导， 导致大量控制细胞发育和生长的基因的表达发生变化，从而影响增殖、凋亡、迁 移、分化等重要的细胞活动( a d a m se ta 1 ，1 9 9 3 ，h a d d e ne ta 1 ，2 0 0 0 ，h y n e se t a 1 ，1 9 9 4 ) 。 纤连蛋白( f i b r o n e c t i n ，f n ) 是一种高分子量的糖蛋白，是胞外基质中最为 主要的组分之一。纤连蛋白能够与其它多种分子相互作用，参与诸如迁移、粘连、 生长、凋亡和分化等细胞活动在发育和生理过程中发挥重要作用( h y n e s ，1 9 9 0 ) 。 目前对于哺乳动物、鸟类和两栖类中纤连蛋白的分子和生化特征已有较为详 细研究( d e s i m o n e e ta l ，1 9 9 2 ；h y n e s ，1 9 9 0 ) 。而先前的研究表明，斑马鱼中存 在一种与其它高等脊椎动物同源性很高的纤连蛋白分子( f n l a ) ，但其剪接性质 与其它高等动物的纤连蛋白不同( z h a oe ta l ，2 0 0 1 ) 。已知斑马鱼中大约2 0 以上 的基因在基因组中存在着双拷贝( d u p l i c a t i o n ) ( p o s t l e t h w a i te ta 1 ，2 0 0 0 ) ，因此斑 马鱼中可能存在着第二个纤连蛋白基因，发挥着在高等脊椎动物中是由不同纤连 蛋白剪接体发挥的作用。 1 2 纤连蛋白的分布 1 9 4 8 年首次在细胞质中发现了一种“冷不溶”蛋白组分，被命名为“冷不 溶球蛋白”。后来发现在脊椎动物中纤连蛋白具有可溶和不可溶两种形式。可溶 形式的纤连蛋白亦被称为血浆纤连蛋白( p l a s m af n ，p f n ) ，主要由肝细胞产生， 存在于各种体液中。一些培养的细胞，包括肝细胞、纤维原细胞、上皮和内皮细 硕士学位论文孙璐：斑马色中第二个纤连蛋白基因的识别与表达分析 胞、成肌细胞及神经胶质细胞，也可也分泌出血浆纤连蛋白。不可溶形式的纤连 蛋白又被称为细胞表面纤连蛋白( c f n ) ，存在于胞外基质和基底膜。血浆纤连 蛋白可以聚集结合成纤连蛋白基质，转化为不可溶形式的纤连蛋白( h y n e s ， 1 9 9 0 ) 。 细胞免疫化学研究证明，在诸如七鳃鳗、八目鳗( w r i g h t ，1 9 8 6 ) 、硬骨鱼( n a t a l i e ta 1 ，1 9 8 1 ，s a d a g h i a n ie la 1 m 1 9 9 4 ) 、两栖动物( n a t a l ie la 1 ，1 9 8 1 ， r e s p e s he t a 1 ，1 9 8 1 ) 、爬行动物( n a t a l ie ta 1 ，1 9 8 1 ) 、鸟类( m a y e re ta 1 ，1 9 8 1 ) 和哺乳动物 等多种脊椎动物( c o r m o re ta 1 ，1 9 8 4 ，n a t a l ie la 1 ，1 9 8 1 ) 的组织中，纤连蛋白分 布广泛。通过免疫反应，在诸如海胆( 1 w a t ae la 1 ，1 9 8 1 ) 、淡水海绵( l a b a te t a 1 ，1 9 8 1 ) 、海绵( h y n e s ，1 9 9 0 ) 及水螅( s a r r a se ta 1 ，1 9 9 1 ) 等非脊椎动物的中， 也发现了纤连蛋白类似物。人类纤连蛋白与其它脊椎动物的纤连蛋白可以发生抗 体交叉反应，表明该蛋白在进化过程中具有高度保守性。 1 。3 纤连蛋白的组织结构 通过直接的氨基酸测序或者d n a 重组分析，已经得到一些脊椎动物纤连蛋 白的氨基酸序列。通过直接地氨基酸测序确定了牛纤连蛋白的氨基酸序列 ( s k o r s t e n g a a r de ta 1 ，1 9 8 6 ) ( 基因库登陆号：p 0 7 5 8 9 ) 。而通过d n a 重组分析的方 法已经获得了人类纤连蛋白( w a n ge t a l ，1 9 9 1 ) ( 基因库登陆号：x 0 2 7 6 1 ) 、大鼠 纤连蛋白( d e s i m o n e e l a l ，1 9 9 2 ) ( 基因库登陆号：x 1 5 9 0 6 ) 、小鼠( s t r a u s b e r g e t a 1 ，2 0 0 2 x 基因库登陆号：p 1 1 2 7 6 ) 、斑马鱼( z h a oe la l ，2 0 0 1 ) 和爪蟾纤连蛋 i ! t ( s c h w a r z b a u e re ta 1 ，1 9 8 7 ) ( 基因库登陆号：m 7 7 8 2 0 ) 的完整氨基酸序列。此 外，其它些脊椎动物，包括、马( m a c l e o de ta 1 ，1 9 9 6 ) 、兔( l e s o te ta 1 ，1 9 9 2 ， s a d ye ta 1 ，1 9 9 5 ) 、狗( m a c l e o de ta 1 ，1 9 9 6 ，z h a n ge la 1 ，1 9 9 5 ) 、豚鼠( w a n ge t a 1 ，1 9 9 1 ) 、鸡( g e h r i se ta 1 ，1 9 9 6 ，h i r a n oe la 1 ，1 9 8 3 ，k u b o m u r ae ta l ，1 9 8 7 ，n o r t o n e ta 1 ，1 9 9 8 ) 、东方蝾螈( n a c ee la 1 ，1 9 9 5 ) 和有肋螈( c l a v i l i e re la 1 ，1 9 9 3 ) 纤连 蛋白的部分序列也已获得。 在脊椎动物当中，纤连蛋白高度保守且具有相同的组织结构( h y n e s ，1 9 9 0 ， m a g n u se ta 1 ，1 9 9 8 ) 。纤连蛋白以二聚体形式存在，由两条分子量约为2 5 0 k d 的 多肽链通过c 端的二硫键结合组成。每条链包含连串的重复单元：1 2 个i 型、 2 个i i 型和7 个i i i 型重复单元( 图1 1 ) 。i 型重复单元位于多肽链的n 一末端和 2 硕士学位论文 孙璐：斑马鱼中第二个纤连蛋白蕞困的识剐与表达分析 c 末端，每个i 型重复单元包含大约4 5 个氨基酸。2 个i i 型重复单元位于多肽 链n 一末端一侧附近，每个i i 型重复单元包含大约6 0 个氨基酸。i i i 型重复单元 位于肽链中间( 1 - 1 5 个i i i 型重复单元加上额外的i i i 型区域：e i i i a 和e i i i b ，在 人类中是e d a 和e d b ) ，每个i i i 型重复单元包含大约9 0 个氨基酸。e i i i b 位于 第7 和第8 各u i 型重复单元之间，而e i i i a 则位于第“和第1 2 个i i i 型重复单 元之间。通常e i i i a 和e i i i b 在p f n 中是缺失的，而c f n 则至少包含它们中的 一个。另外，纤连蛋白的第1 4 和第1 5 个i i i 型重复单元之间还存在一个可变区 v 。 通过序列分析发现各类型的重复单元之间是相似的。但是不同物种间i 型和 i i 型重复单元的保守性比不同物种间i i i 型重复单元的保守性更高。有趣的是， 不同脊椎动物之间重复单元的相似性( 8 0 - 9 0 ) 要高于所有物种间重复单元的 相似性( 1 0 6 0 ) ，这说明形成重复结构的( 核内) 复制发生在产生脊椎动物进 化分枝之前，随后通过选择将重复结构的序列稳固保留( h y n e s ，1 9 9 0 ) 。与i 型、 i i 型和i i i 型重复单元不同，纤连蛋白的可变区与纤连蛋白的其它部分不相似， 物种间保守性也较差，所以将该区域称为v 区，在人类中称之为i i i 型重复单元 连接片断：i i i c s 。 m l e r o o r g n l s m f i b r i n c e l lh e p m i nf i b r i n 口口b 一口口a 一口口v 0 口佃v 7 6 口棚 v 9 5 口佃v 9 5 口“口v 0 卜口v 8 9 皤口v 6 4 口口v 0 x e n o p u s c h i c k e n r a th u m a n 图1 i 纤连蛋白分子的组织结构示意图。纤连蛋白是由两个相同或相似的亚单位通过c 末 端的二硫键结合构成的二聚体。大多数蛋自由三种结构类似的重复单元( i 型、i i 型和i i i 型重复单元) 构成。这些重复单元组成不同的能够与纤维蛋白、胶原蛋白、明胶、细菌和 细胞结合的功能域。纤连蛋白的同一转录产物的不同剪接产生了多个异构体。在所有已被检 测的脊椎动物中，e i i i a 和e i i i b 可被完全保留或被完全剪接。v 区的剪接则产生了各种特 异模式的纤连蛋白a 在人中存在5 种v 区可变体大鼠中存在3 种，鸡和爪蟾中都存在2 种。( 引自z h a 0 博士论文，2 0 0 1 ) 填士学位论文 孙璐：斑马鱼中第二个纤琏管白基因自勺识g 与表达分析 1 4 纤连蛋白的多种异椅体形式 纤连蛋白具有多种不同的异构体，这些异构体是由同一转录本在e i i i a 、 e i i i b 和v 区域发生选择性剪接而产生的( 图i 1 ) 。e l i i a 和e i i i b 被完全剪切 或是完全保留，而v 区可在几个位置发生剪接。通过v 区的不同剪接，两栖类的 纤连蛋白可形成两种异构体( d e s i m o n ee ta 1 1 9 9 2 ) ，鸡纤连蛋白可形成两种 异构体( n o r t o ne ta 1 ，1 9 8 7 ) ，丈鼠纤连蛋白可形成三种异构体( s c h w a r z b a u e r e ta l ，1 9 8 3 ) ，人纤连蛋白形成五种异构体( 6 u t m a ne ta 1 。1 9 8 7 ) 。根据v 区 残留的氨基酸数目，人纤连蛋白的五种异构体而分别称之为i i i c s o ， i l i c s l 2 0 ，i i i c s 9 5 ，i i i c s 8 9 和i i i c s 6 4 。在大鼠中仅出现上述异构体的前三种 ( k o r n b l i h t te ta 1 ，1 9 9 6 ) 。鸡纤连蛋白v 区的一部分可被移除( v 6 3 ) 但不会 出现整个v 区的缺失( v 1 2 0 ) ( n o r t o ne ta l ，1 9 8 7 ) 。而在两栖类中，纤连蛋白 v 区会完全保留( v 1 1 5 ) 或完全缺失( v 0 ) ( d e s i m o n ee ta 1 1 9 9 2 ) 。总之，通 过e i i l 8 、e i i i a 和v 区的各自剪接，人纤连蛋白可产生2 0 种不同的异构体，大 鼠中产生1 2 种纤连蛋白异构体，鸡和两栖类都可各形成8 种纤连蛋白异构体。 另外m a c l e o d 等( m a c l e o de ta 1 ，1 9 9 6 ) 还发现了一种特殊的异构体，不仅缺 失了v 区，第1 5 个i i i 型重复单元和第l o 个i 型重复单元也被剪切掉了。仪在 马、犬和兔的软骨组织中发现了这种独特的异构体，而在其它组织中没有发现。 目前在斑马鱼中除了完整的纤连蛋白f n i a 以外，还发现了一个截短的纤连 蛋白异构体( f n l a 异构体2 ) 。f n l a 异构体2 的剪接发生在第1 8 个外显子( 编 码第3 个i l i 型重复单元) 和第1 9 个外显子( 编码第4 个i i i 型重复单元) 之间 的内含子中( z h a oe t a l ，2 0 0 1 ) 。在哺乳动物和其它鱼类中也发现了相同的纤连蛋 白剪接模式( l i ue la 1 ，2 0 0 3 ) 。而在培养的人纤维原细胞中述存在第二种截短的纤 连蛋白异构体，该异构体的剪接发生在位于第1 3 个外显于( 编码第一个m 型重 复单元的前半部分) 和第1 4 个外显于( 编码第一个i i i 型重复单元的后半部分； s c h o re ta 1 ，2 0 0 3 ) 之间的内含子中，因此这个独特的e d n a 包含了人纤连蛋白的 第1 3 个外显予并且继续通读了第1 3 个外显子之后的内含予。这聃截短的纤连蛋 白表达在源于胎儿组织和肿瘤的纤维原细胞中，在乳房癌病人的m 灌中也发现了 这种蛋白( s c h o re ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 硕量学位论文孙璐：斑马鱼中第二个纤连置白綦逛l 的识别与艘达分析 1 5 纤连蛋白基因的结辛句 对分离的基因组克隆进行分析+ 结果表明所有的纤连蛋自郏是出单个基医 编码的。该基因在大鼠中大约为7 1 k b ( p a t e le ta l ，1 9 8 7 ) ，在鸡中大约为5 0 k b ( h i r a n oe ta 1 ，1 9 8 3 ) ，在人中大约为7 3 k b ( h t t p ：w w w n c i b n l m g o v ) 。 纤连蛋白基因似乎是g i l b e r t i a n 基因的一个最佳实例( g i l b e r t 。1 9 7 8 ，p a t e le t a l ，1 9 8 7 ) ，它有明显的内含子- 外显子结构。斑马煎( f n i a ) 、大鼠( p a t e le t a l 1 9 8 7 ) 和人( h t t p ：w w w n c b ih i mg o v ) 等脊椎动物的纤连蛋白的基因结构相同。对它的 基因组d n a 进行分析表明，f n 基因的第一个辨显子编码5 - u t r 和n 一末端，第4 6 个外显子编码c 末端和3 - u t r 。除了第1 2 个i 型重复单元被一个内吉子分开，所 有的i 型和i i 型重复单元都正好是由个外显予编码。1 1 个i i i 型重复单元，包括第 1 3 个1 1 1 型重复单元、第6 8 个i i 【型重复单元和第1 0 1 4 个i i i 型重复单元，都通过内 含予与它们摺邻的， 显子分开。与i 型和l i 型重复单元不固，这些j 1 1 蓥! 重复单元都 是由两个甚歪两个以上的外显子编码的。但是i i l 型重复单元中的第4 、第5 和第9 个重复单元以及e i a 和e i i m 都是由单个的外盟予编码的。第4 0 个外显子编码v 区以及第1 5 个i i l 型重2 复单元的n 一端部分，第15 + i i i 型重复单元的其余部分则由第 4 t 个外显予缡碣。 1 6 纤连蛋白在脊椎动物生长和发商过程中的功能 纤连蛋自在迁移、桔连、生长、凋亡和分化等多种细胞活动中发挥着关键作 用，因而纤连蛋自在脊椎动物的发商过程中其有重要功能。 1 6 ，l 纤连蛋白在发育中的功驻 纾连蛋自足胚胎中最早出现的胞外基质蛋白之一，分布在基底膜和胞间隙中 ( t h o r s t e i n s d o t t i r ，1 9 9 2 ) 。纤连蛋南最早出现在原肠胚形成之前，或者在原肠胚 形成裙始( a d a m s e t a l ，1 9 9 3 ) ，例如在小鼠胚胎中，纤连蛋白最初表达在( 囊) 腥泡( t h o r s t e i n s d o t t k ，1 9 9 2 ，w a r t i o v a a r ae ta 1 。t 9 7 9 ) 。在所有已检钡4 的脊椎动 物中，纤连蛋自在原肠期的衷达位于外胚层之下，预期发生中胚层迁移的位翥 ( h y n e s ，1 9 9 0 ) 。豫了在中瓤层迁移中发挥作用外，纤连蛋自在其他类型细胞 ( a d a m se ta 1 ，1 9 9 3 ) ，包括神经嵴细胞、源始生殖细胞( p g c ) ( f f r e n c h ，c o n s t a n t e ta l + ，1 9 9 1 ，h e m a ne ta 1 ，1 9 8 1 、心蓠和心内垫层细胞( f f r e n c h 。c o n s t a n td a 1 ，1 9 8 9 ，f f r e n c h - c o n s t a n te ta 1 ，1 9 8 8 ，l i n a s ke ta 1 ，1 9 8 6 ，l i n n s ke fa 1 ，1 9 8 8 ， 硕士学位论文 孙璐：斑马鱼中第二个纤连蛋妇幕困的识刷与表达分析 m j a a t v e d te ta 1 m 1 9 8 7 ) 、以及血管细胞( r i s a ue ta 1 ，1 9 8 8 ) 的迁移位点的表达量 也很丰富。 胚胎的早期发育以及形态发生过程中细胞的迁移都需要细胞粘附于纤连蛋 白，其直接证据来自于体内试验。向两栖动物的囊胚腔中注射纤连蛋白的抗体， 会抑制原肠胚的形成( b o u c a u te ta 1 ，1 9 8 4 ) 。在有肋螈的囊胚腔中注射包含r g d 序列的肽，会抑制中胚层细胞与纤连蛋白纤丝的相互作用，并且阻断细胞粘连和 细胞迁移，抑制原肠胚的形成( b o u c a u te ta 1 ，1 9 8 4 ，w i n k l b a u e re ta 1 ，1 9 9 6 ) 。当 纤连蛋白的突变形式，诸如纤连蛋白( r g d - ) 、纤连蛋白( s y n - ) 或者纤连蛋白 a i i l l 7 被引入两栖动物胚胎的囊胚腔时，突变的蛋白会与正常的纤连蛋白共同 装配形成一种会干扰细胞粘连、分布和迁移的嵌合基质，从而导致中胚层的缺损， 抑制原肠胚的形成。在鸟类胚胎中，注射含有r g d 序列的肽会干扰神经嵴细胞 的迁移( b o u c a u te ta 1 ，1 9 8 4 ) ，而注射抗纤连蛋白的抗体会阻断原条( 原肠胚) 迁移( h a r r i s s o ne ta 1 ，1 9 9 3 ) 。 在小鼠中，通过敲除纤连蛋白基因可以证明纤连蛋白在胚胎发育过程中的重 要性。缺失了功能性纤连蛋白基因的( f n - n u l l ) 小鼠胚胎在发育到8 5 天时死亡， 并且它们在中胚层、神经管和血管的发育中都有缺陷( g e o r g ee ta 1 ，1 9 9 3 ，g e o r g e s e ta 1 ，1 9 9 6 ) 。缺失纤连蛋白的小鼠胚胎前后轴变短，不能发育出诸如脊索和体节 等中胚层来源的结构，且心脏和血管发育异常。 纤连蛋白对于器官发生也是必需的。纤连蛋白缺失的突变胚胎在发育到 1 0 l l 天时，发育畸形并停滞。突变胚胎可以形成神经褶，但是随后显示前后轴 变短，神经管畸形，脊索和体节缺失，心脏和胚胎脉管变异且畸形，卵黄囊、胚 胎外脉管系统和羊膜也有缺陷。脊索和体节的缺失说明纤连蛋白对于脊索前体细 胞的组织维持以及体节前体细胞的凝缩都具有重要意义( g e o r g e se ta 1 1 9 9 6 ) 。 此外，纤连蛋白缺失的胚胎中能发育出原始红血球，但不能发育出血管，指示纤 连蛋白是在血管发生而不是血细胞生成的过程中发挥功能( g e o r g ee t a l ，1 9 9 3 ) 。 在肺和肾脏的发育过程中，当上皮细胞间出现裂隙，形成肢芽分支时，上皮 细胞的细胞间连接转变为细胞与胞外基质之间的连接。用抗纤连蛋白的抗体降低 纤连蛋白浓度时，裂隙和肢芽的形成都被阻断了。同时，外源性的纤连蛋白则可 以加快裂隙和肢芽的形成。因而。在分支形态发生的过程中，纤连蛋白对于裂隙 6 硕士学位论文 孙璃：斑马鱼中第二个纤连蛋白基因的识别与表达分析 的形成是必需的( s a k a ie ta l ，2 0 0 3 ) 。此外，在斑马鱼心肌迁移的过程中，纤连蛋 白聚集在内胚层和心内前体细胞之间的中线上，而后则包被了心肌前体。在完全 缺失纤连蛋白的情况下，心肌前体间的粘着小带不能正常形成，说明纤连蛋白在 心管形成，心肌迁移的过程中也是必不可少的( t r i n hl a ，s t a i n i e rd y ，2 0 0 4 ) 。 1 6 2 纤连蛋白不同的剪接异构体体在胚胎发育中的功能 纤连蛋白具有e i i i b 、e i i i a 和v 区这三个可发生剪接的区域。同一纤连蛋 白基因转录体通过发生在e i i i a 、e i i i b 和v 区的不同剪接，产生了各种不同的 纤连蛋白异构体( f f r e n c h - c o n s t a n t ，1 9 9 5 ：f f r e n c h c o n s t a n te t a l ，1 9 8 9 ) 。在胚胎 发育中，不同的纤连蛋白异构体的表达模式随时空变化而发生变化，暗示它们可 能在形态发生、器官形成和细胞分化中发挥不同功能。 以软骨细胞的分化为例，来源于软骨发生前小鸡肢间质的纤连蛋白包含了 e i i i b 、e i i i a 和v 区，但是来源于小鸡软骨的纤连蛋白则仅包含e i i i b 和v 区而 不包含e i i i a ( b e n n e t te ta 1 ，1 9 9 1 ) 。原位杂交显示，纤连蛋白e i i i b + 异构体在肢 软骨发育的各个阶段都有表达，而纤连蛋白e i i i a + 异构体在软骨发生的凝缩期 后就消失了，且最终形成的软骨组织中也不存在e i i i a + 异构体。表明e i i i a + 异 构体对于软骨细胞凝缩是必需的( g e h r i se ta l ，1 9 9 6 ) 。 另一个例子是可变剪接体在平滑肌发育中的功能。在人类胎儿发育的早期阶 段，e i i i a 和e i i i b 在脉管平滑肌和内脏平滑肌细胞中都有表达( g l u k h o v ae t a 1 ，1 9 9 0 ，g l u k h o v a e t a l ，1 9 8 9 ) 。而当平滑肌细胞成熟后，e i i i a + 异构体和e i i i b + 异构体自脉管平滑肌中消失，但仅有e i i i b + 异构体自内脏平滑肌中消失 ( g l u k h o v ae ta 1 ，1 9 9 0 ) 。在成体中，内脏平滑肌细胞所产生的纤连蛋白包含 e i i i a ，而来自动脉中膜的分化型平滑肌细胞所分泌的纤连蛋白异构体同时缺失 e i i i b 和e i i i a ( g l u k h o v ae ta 1 1 9 8 9 ) 。 爪蟾、鸡、太鼠和小鼠的体内研究显示，胚胎发育和器官发生早期阶段的纤 连蛋白通常包含e i i i b 、e i i i a 和v 区，并且分布广泛( d e s i m o n ee ta 1 1 9 9 2 ， f f r e n c h c o n s t a n tce ta 1 ，1 9 8 9 ，g l u k h o v ae ta 1 ，1 9 9 0 ，l a i t i n e ne ta 1 ，1 9 9 1 ，n o r t o ne t a 1 ，1 9 8 7 ，p a g a n ie ta 1 ，1 9 9 1 ，p e t e r se ta 1 ，1 9 9 6 ) ，说明e i i i b + 、e i i l a + 和v + 异构 体有助于推动形态发生。 在小鼠发育中，e i i i a 、e i i i b 和v 在原肠期( 胚胎7 5 天) 及体节和脊索形 7 硕士学位论文 孙璐：斑马鱼中第二个纤连蛋白基因的识别与表达分析 态发生早期( 胚胎9 ，5 天) 表达共定位。然而，当发育继续进行时，包含e i i i b 、 e i i i a 和v 区的纤连蛋白异构体的表达量在纤连蛋白总量中所占的比例逐渐下 降。在肝脏等特定的腺性组织中，e i i i b 和e i i i a 表达量的下降尤为显著。表达 上最明显地差异出现在透明软骨的发育过程中，在胚胎1 2 5 天前轴向的骨骼前 体中以及胚胎1 5 5 天前贯穿整个胚胎对e i i l a 片断染色显示出明显地选择性减少 ( p e t e r se ta 1 ，1 9 9 6 ；p e t e r sa n dh y n e s ，1 9 9 6 ) 。这些观察结果暗示“纤连蛋白依赖” 的结构( 包括体节、脊索和脉管系统) 的形态发生过程中所需要纤连蛋白包含 e i i i b 、e i i i a 和v 片断。相反地，这些片断在一些特定组织诸如肝脏、软骨和胎 盘中发挥的生物学功能则有所不同( p e t e r se ta 1 ，1 9 9 6 ；p e t e r sa n dh y n e s ，1 9 9 6 ) 。 一旦发育完成，包含e i i i a 、e i i i b 和v 区的纤连蛋白异构体在各种组织中 大范围减少( d ee ta 1 ，1 9 9 9 ，f f r e n c h c o n s t a n te ta 1 ，1 9 9 5 ，f f r e n c h c o n s t a n te t a 1 ，1 9 8 9 ) 。例如，出生5 个月的大鼠中纤连蛋白主要以e i i i a 一异构体和e i i i b 一 异构体的形式存在( p a g a n ie ta 1 ，1 9 9 1 ) 。在大多数正常的成体组织中，e i i i a 和 e i i i b 的表达量明显较低( p e t e r se ta 1 ，1 9 9 6 ) ，例如成体肝脏中e i i i a 和e i i i b 的 水平几乎检测不到( d e s i m o n ee ta l ，1 9 9 2 ，o y a r n ae ta 1 ，1 9 8 9 ，m a g n u s o ne t a 1 ，1 9 9 1 ，p a g a n i e ta 1 ，1 9 9 1 ) ，并且肝脏中合成的纤连蛋白仅有5 0 包含v 区 ( d e s i m o n ee ta 1 ，1 9 9 2 ，h y n e s ，1 9 9 0 ) 。检测这包含e i i i b 、e i i i a 和v 区的异构 体在9 至1 5 周成年小鼠中的详细分布( p e t e r se t a l ，1 9 9 6 ) ，发现与胚胎中的表达 模式不同，这三种片段在成体中表达水平降低，且表达模式更加受到更加严格的 时空限制。 m a c l e o d 等( m a c l e o de ta 1 ，1 9 9 6 ) 还描述了一种独特的剪接异构体。这种 特异的异构体不仅缺失了v 区，还缺少第1 5 个i i i 型重复单元和第1 0 个i 型重 复单元。仅在软骨组织中检测到这种异构体，而在其它组织中没有发现。这个发 现意味着在发育过程中纤连蛋白的剪接模式可能比我们已知的更为复杂。 1 7 斑马鱼是研究脊椎动物发育的极好模型 斑马鱼最初来源于印度的热带河流，长久以来作为水族馆中一种观赏鱼而为 人们所喜爱。由于它的一些有利特征，斑马鱼又是一种可以用来研究脊椎动物发 育模式动物。斑马鱼是卵生的，体外受精，且每次产卵数目可达2 0 0 枚。它们的 胚胎发育相对较快，从受精卵发育成可以游动的鱼苗只需要3 至4 天，且不需要 8 硕士学位论文 孙璐：斑马鱼中第二个纤连蛋白基闪的识别与表达分析 亲鱼的照料。而且斑马鱼的胚胎几乎是透明的，使得研究者可以直接观察到从受 精到孵化的整个发育过程。 作为一种重要的模式动物，有关斑马鱼的各种分子生物学特征的描述受到 了广泛的重视。已经建立了一些方法对斑马鱼进行大规模的突变筛选 ( v o g e l ，2 0 0 0 ) 。因此，斑马鱼正成为研究脊椎动物发育、进行遗传学分析的极好 的模型。 参考文献 【1 】a d a m sj c a n dw a t tf m ，( 1 9 9 3 ) r e g u l a t i o no f d e v e l o p m e n ta n dd i f f e r e n t i a t i o n b yt h ee x t r a c e l l u l a rm a t r i x d e v e l o p m e n t1 1 7 ：1 1 8 3 - 1 1 9 8 ( n a t h a ne ta 1 ，1 9 9 1 ) 【2 】b e n n e t tvd ，p a l l a n t ek m a n da d a m ss l ( 19 9 1 ) t h es p l i c i n gp a t t e mo f f i b r o n e c t i nm r n ac h a n g e sd u r i n gc h o n d r o g e n e s i sr e s u l t i n gi na nu n u s u a lf o r mo f t h em r n ai nc a r t i l a g e j b i 0 1 c h e m 2 6 6 ：5 918 - 5 9 2 4 3 】b o u c a u tj c ，d a r r i b e r e 一，b o u l e k b a c h eh a n dt h i e r yj p ( 1 9 8 4 ) p r e v e n t i o no f g a s t r u l a t i o nb u t n o tn e u r u l a t i o nb ya n t i b o d i e st of i b r o n e c t i ni na m p h i b i a ne m b r y o s n a t u r e3 0 7 ：3 6 4 3 6 7 4 】c l a v i l i e rl ，r i o uj ，e ，s h id l ，d e s i m o n ed w a n db o u c a u tj c ( 1 9 9 3 ) a m p h i b i a np l e u r o d e l e sw a l t lf i b r o n e c t i n ：e d n ac l o n i n ga n dd e v e l o p m e n t e x p r e s s i o no fs p l i c e dv a r i a n t s c e l l