（生物化学与分子生物学专业论文）人类睾丸特异表达新基因mael的克隆和表达分析.pdf

摘要 精子生成是一个多基因参与的复杂过程，多个与精子发生相关的 基因已相继被鉴定。但这些已知的基因如何与其它的基因相互作用来 调控精子的生成过程，以及是否存在其它未知的基因参与精子的发生 目前尚不完全清楚。克隆新的睾丸发育、生精相关基因对进一步了解 精子发生机理具有重要意义。 本文利用数字差异显示( d i g i t a ld i f f e r e n t i a ld i s p l a y ) 方 法，从筛查人睾丸中高表达而在其他组织中不表达或低表达的差异 e s t ( 表达序列标签) 入手，成功克隆到一个在人睾丸中高表达的新 基因m a e l ( g e n b a n k 登录号为：d q 0 7 6 1 5 6 ) 。r l m - r a c e 结果表明，m a e l 基因的转录起始位点位于翻译起始位点上游第7 4 位核苷酸( n t ) ，m a e l 基因的m r n a 全长序列为1 7 5 1n t 。生物信息学分析显示：m a e l 基因位 于人类1 号染色体长臂上( 1 q 2 4 1 ) ，由1 2 个外显子组成和1 1 个内含 子所组成，编码4 3 4 个氨基酸，分子量约为4 9 2 k d 。 n o r t h e r n 印迹杂交结果表明，m a e l 基因的m r n a 只在睾丸组织中 高表达，而在卵巢、肺、肝脏、心、脑、脾脏、肾脏等组织中无表达。 r n a 原位杂交结果表明发现m a e l 基因的m r n a 在精母细胞、圆形精子和 早期伸长型精子中都有表达。e g f p m a e l 融合表达载体的细胞转染实 验发现m a e l 基因编码蛋白质主要定位于细胞质中。 为了进一步了解该基因表达调控机制，本文分析了m a e l 基因的 启动子。首先，将m a e l 基因的上游序列( 一1 5 1 0b p - + 1 5 0b p ) 克隆 到载体p t a l l u c 的荧光素酶基因上游并构建一系列缺失突变，然后 将包含全长序列和各种缺失突变的重组质粒转染人宫颈癌细胞系 h e l a 和小鼠精原细胞系g c 一1 ，通过比较荧光素酶的活性发现，m a e l 基因的基本启动子位于- 2 1 6b p 与+ 2 8 b p 之间，而+ 2 8b p 至+ 1 5 0b p 处有精原细胞系特异表达的增强子序列。生物信息学分析发现m a e l 基因启动子缺乏t a t a 盒，而存在3 个c a c c c 盒，1 个c c a a t 盒和1 个倒转的c c a a t 盒( a t t g g ) 、1 个g c 盒( g g g c g g ) ，在其起始密码子 周围存在一个c p g 岛，表明m a e l 基因的基本转录受s p l 家族转录因 子和d n a 甲基化的调控。 关键词：睾丸：m a e l 基因；基因克隆：基因表达；启动子 i i a b s t r a c t s p e r m a t o g e n e s i si sac o m p l i c a t e dp r o c e s si nw h i c hm u l t i p l e g e n e sa r ei n v o l v e d ，a n ds e v e r a lg e n e sh a v eb e e ni d e n t i f i e dt o p l a yr o l e si ns p e r m a t o g e n e s i s h o w e v e r ， i ti sn o tc l e a rh o w t h e s eg e n e sa r ei n v o l v e di ns p e r m a t o g e n e sisa n dw h e t h e rt h e r e a r eu n k n o w n g e n e sr e l a t e dt os p e r m a t o g e n e s i s t h e r e f o r e ， c l o n i n go fn o v e lg e n e sw h i c ha r ei n v o l v e di ns p e r m a t o g e n e s i s a n dt e s ti sd e v e l o p m e n ta r eak e yt of u r t h e ru n d e r s t a n d i n go f m e c h a n i s ma n dt h eb i o l o g i c a lp r o c e s so fg e r mc e l ld e v e l o p m e n t u s i n gt h ed i g i t a ld i f f e r e n t i a ld i s p l a yp r o g r a m ( d d d ) ，w e s c r e e n e dd i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e de s t s( e x p r e s s e ds e q u e n c e t a g s ) w h i c ha r eh i g h l ye x p r e s s e di nt e s t i s ，b u tn o to rl o w l y e x p r e s s e di no t h e rt i s s u e s ，a n dc l o n e dan o v e lh u m a ng e n e m a e l ( g e n b a n ka c c e s s i o nn o d q 0 7 6 1 5 6 ) b yr l m r a c em e t h o d ，w e f o u n dt h a tt h et r a n s c r i p t i o ns t a r ts i t eo fm a e lg e n ei s7 4 一n t u p s t r e a mo ft h es t a r tc o d o n b i o i n f o r m a t i c sa s s a ys h o w e dt h a t m a e lg e n el o c a t e si nc h r o m o s o m el q 2 4 1 ，c o n t a i n s1 2e x o n sa n d 1 1i n t r o n s ，a n de n c o d e sap r o t e i no f4 3 4a m i n oa c i d sw i t ha m o l e c u l a rw e i g h to fa b o u t4 9 2k d t h er e s u l to fn o r t h e r nb l o t t i n gh y b r i d i z a t i o ns h o w e dt h a t 1 1 1 m a e lg e n ew a se x p r e s s e ds p e c i f i c a l l yi nt e s t i s ，n o ti no v a r y ， l u n g ，li v e r ，h e a r t ，b r a i n ，s p l e e no rk i d n e y b yr n ai ns i t u h y b r i d iz a ti o n ，w ef u r t h e rf o u n dt h a tm a e lm r n aw a sp r e s e n ti n s p e r m a t o c y t e s ，r o u n d a n de a r l ye l o n g a t i n gs p e r m a t i d s t h e e g f p m a e lf u s i o np r o t e i ne x p r e s s i o np l a s m i dp e g f p c 3 m a e lw a s c o n s t r u c t e da n dt r a n s f e c t e di n t oh e l ac e l l sa n dg c - ic e ll s r e s p e c ti v el y ，t h ee g f p m a e lf u si o np r o t e i nw a sf o u n dt o l o c a li z ei nc y t o p l a s m t of u r t h e ru n d e r s t a n dt h em e c h a n is mo f e x p r e s s i o n r e g u l a ti o no fm a e lg e n e ， w ec h a r a c t e r iz e dt h em a e lp r o m o t e r f i r s t l y ，af r a g m e n t ( 一1 5 1 0b p + 1 5 0b p ) u p s t r e a mo fm a e lg e n e w a sc l o n e du p s t r e a mo fl u c i f e r a s eg e n ei np t a l l u cv e c t o r ，a n d t h e nas e r i so fd e l e c t i o np l a s m i d sw e r ec o n s t r u c t e da n d t r a n s f e c t e di n t oh e l ac e l l sa n dg c - 1c e l l s a f t e rt h e l u c if e r a s ea s s a y ，w ef o u n dt h a tt h eb a s a lp r o m o t e rl o c a t e si n 一2 1 6t o + 2 8b p ，w h il et h e r ei sa ne n h a n c e rr e s p o n s i b l ef o r e x p r e s s i o ns p e c i f i ci nm o u s es p e r m a t o g o n i a lc e l l sb e t w e e n + 2 8 t o + 1 5 0b p t h r o u g hb i o i n f o r m a t i c st o o l ，w ef o u n dt h a tm a e l p r o m o t e rl a c k sat a t ab o x ，b u tc o n t a i n st h r e ec a c c c b o x e s ，a c c a a t b o x ，ain v e r te dc c a a t b o x ( a t t g g ) a n dag c b o x ( g g g c g g ) ， a n dac p gisl a n dw a sd e t e c t e ds u r r o u n d i n gt h et r a n s c r i p ti o n s t a r ts i t e t h e s ec i s a c t i n ge l e m e n t sa r ec o n s e r v e da m o n g i v r a t ，m o u s ea n dh u m a nm a e lg e n e s t h ea b o v er e s u l t si n d i c a t et h a t t h et r a n s c r i p t i o no fm a e li sr e g u l a t e db ys p lf a m i i ya n dd n a m e t h y l a ti o n k e yw o r d s ：t e s t i s ，m a e lg e n e ：g e n ec l o n i n g ：g e n ee x p r e s s i o n ： p r o m o t e r v 湖南师范大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外， 本论文不合任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对 本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标 明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：f 目占劣乙 多矽年i l 月矽日 湖南师范大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权湖南师范大学可以将本学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密囹。 作者签名：阂面易u日期：二卯乡年卢7 月妒日 导师签名：认旺日期7 年i 月加日 人类睾丸特异表达新基因m a e l 的克隆和表达分析 1 前言 1 1 精子发生相关基因 育龄夫妇中约有1 0 1 5 的不育，其中一个重要的原因是男方 生精障碍，其中男性少精、弱精、无精子等不育因素约占4 0 5 0 n 3 。精子生成是一个复杂的过程，涉及精原细胞有丝分裂产生精母 细胞j 以及精母细胞经过两次减数分裂后由四倍体变成单倍体的圆 形精子细胞，这些精子细胞经历表型( p h e n o t y p e ) 的变化而成为成熟 的精子，所有这些过程均受基因的调控乜3 。细胞遗传学研究发现部分 无精子症患者有y 染色体长臂的缺失，推测y q l1 存在着“y 染色体 精子发生基因”，称为无精子因子( a z o o s p e r m i af a c t o r ，a z f ) 口1 。 近年来，控制精子发生的相关基因，主要包括位于y 染色体a z f a 区 的u s p 9 y ( c h r o m o s o m eyu b i q u i t i ns p e c i f i cp r o t e a s e9 ) 基因和 d b y ( d e a d hb o x3i nyc h r o m o s o m e ) 、a z f b 区的r b m ( r n a b i n d i n g m o t i f ) 基因、a z f c 区的d a z ( d e l e t e di na z o o s p e r m i a ) 基因已被 鉴定4 捌。 研究表明除了y 染色体外，常染色体上也有基因参与精子的 形成，如环a m p 反应元件调节子( c r e m ) 的1 、雄激素受体基因口3 、热 休克蛋白h s p 7 0 2 陋3 、o d f 2 阳1 、d a z l a 等n 引，因此诸多学者提出精子 生成是在多基因共同控制下完成的，这些基因可能既存在于性染色 体上，也存在于常染色体上。2 0 0 3 年1 月日本科学家发现，位于1 6 号染色体上的z f p l 4 8 基因是生成精子的关键基因，运用基因打靶技 高校教师在职硕士学位论文 术将小鼠的z f p l 4 8 基因敲除，结果发现小鼠发育成熟之后虽有睾丸， 但无法形成精原细胞，进而不能产生精子n 。同年美国科学家 p e n n i n g e r 等n 2 3 在( s c i e n c e 杂志上报道了另外一个基因一f k b p 6 基 因，他们认为f k b p 6 在心脏功能中起着十分重要的作用。敲除该基 因后，结果没有发现这个基因与心脏病有联系，却发现雄鼠无法繁 殖后代了，小鼠睾丸的大小显著减小，根本不产生精细胞。小鼠除 性别特异性的雄性不育外，没有其它缺陷。这些雄鼠的性行为完全 正常，性激素的分泌水平也正常，但它们完全不产生精细胞。因此 f k b p 6 或许是男性避孕药开发的一个靶点，进一步研究表明：f k b p 6 为减数分裂中连接来自父性和母性染色体的蛋白复合物( 联会复合 物) 中的一部分，研究小组发现去除小鼠的f k b p 6 基因后，染色体 无法识别其对应染色体而与其它染色体配对，导致非整倍体性。非 整倍体性为导致自发流产的主要原因且为许多人类肿瘤细胞的特 征。最近g u t t i 等人发现g r t h 基因在精子发生中起重要作用。g r t h 是一个睾丸特异表达基因，在粗线期、分裂中期的精母细胞和圆形精 子中大量表达，调控精子成熟相关蛋白，包括h 4 ，h m g 2 ，t p l ，t p 2 ， p g k 2 ，a c e 等。敲除g r t h 的小鼠精母细胞在进入减数分裂之前大 量凋亡，从而不能形成精子n 引。而敲除s i r t l 基因的小鼠虽然还能 产生精子，但精子数量显著减少n 钊。 在睾丸中表达的基因众多，这表明仍有许多未知的基因参与了 精子发生的调控。研究和发现这些基因，对于阐明精子发生的机制 和精子发生障碍病的诊治以及男性避孕具有重要的意义。 人类睾丸特异表达新基因m a e l 的克隆和表达分析 1 2 数字差异显示在基因克隆中的应用 基因的差异表达与组织细胞的生物学性状及功能密切相关，分离 疾病发生相关基因对于疾病的诊断、治疗具有重要意义。代表性差示 分析( r e p r e s e n t a t i o n a ld i f f e r e n c ea n a l y s i s ，r d a ) n 鼠z e 、抑制性 消减杂交( s u p p r e s s i o ns u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n ，s s h ) n l1 8 、差 异显示逆转录p c r 法( d i f f e r e n t i a ld i s p l a yr t - p c r ，d d r t - p c r ) n 引、 r n a 指纹法( f i n g e r p r i n t ) 晗们等技术已被广泛用于不同组织或细胞间 基因表达谱的比较研究和新基因的克隆。小鼠和人类基因组图谱公诸 于世后，以计算机和互联网为工具，利用现有的表达序列标签( e s t ) 和生物信息数据库，加速对小鼠和人类基因组未知功能新基因的发掘 和蛋白质功能分析己成为研究热点。生物信息资源的爆炸性增长和相 应软件的快速发展，也使得计算机分析在基因克隆中的作用越来越重 要。如新基因或已知基因的识别，e s t 序列的拼接，基因阅读框架的 确定以及蛋白性质与功能的预测等，都需要运用生物信息学。数字差 异显示( d i g i t a ld i f f e r e n t i a ld i s p l a y ) 乜卜2 别就是从上述的这些 差异表达基因的筛选技术中获得启发，利用n c b i 中的u n i g e n e 数据库 中大量的数据资源，借助转录本的拷贝数，分析和比较组织基因表达 谱，借此寻找组织特异表达基因和差异基因。目前，有不少基因是通 过数字差异显示克隆的乜卜2 刳。 1 3 真核生物基因的启动子分析 真核基因的顺式调控元件是基因周围能与特异转录因子结合而 影响转录的d n a 序列。其中主要是起正调控作用的顺式作用元件， 高校教师在职硕士学位论文 包括启动子( p r o m o t e r ) 、增强子( e n h a n c e r ) ；近年又发现起负调控 作用元件沉寂子( s i l e n c e r ) 2 3 o 真核生物基因启动子作为基因 表达所必需的重要序列信号和基因转录水平上一种重要的调控元件， 一直是现代分子生物学的研究热点。启动子是一段特定的能直接与 r n a 聚合酶及其转录因子相结合、决定基因转录起始与否的d n a 序 列，通常位于基因的上游。启动子是基因表达调控的重要顺式元件， r n a 聚合酶定位并结合在启动子上即可启动转录过程，启动子与r n a 聚合酶以及其他蛋白辅助因子等反式元件的相互作用是启动子调控 模式的实质乜川。真核生物有三类r n a 聚合酶( 即，r n a 聚合酶i 、 r n a 聚合酶i i 、r n a 聚合酶i i i ) 分别与启动子i 、启动子i i 和启 动子i i i 这三种不同的启动子相结合来决定基因转录起始与否，其中 只有启动子i i 指导m r n a 的转录。 r n a 聚合酶ii 的核心启动子一般位于转录起始位点约一4 0 到 + 5 0 范围内乜3 | 。核心启动子元件有三个基本特点：能与由p o li i 、 基本转录机构和共激活因子组成的前起始复合体结合并控制其装 配；单独起作用时只能确定转录起始位点和产生基础水平的转录 并控制转录方向；能够对细胞内邻近的或远距离的激活因子和抑 制因子作出应答。一个典型的核心启动子应包括下列d n a 序列元件： t a t a 框：t a t a 框的保守序列为t a t a a a 。t f i i d 中的t b p 亚基乜钔 和t a t a 框直接接触。t f i i d 与t a t a 框的结合会导致其他转录因子的 结合。但有的真核启动子不含t a t a 盒或不通过t a t a 盒就开始转录， 有的无t a t a 盒的启动子是靠t fi i i 和t fi i d 共同组成稳定的转录 人类睾丸特异表达新基因m a e l 的克隆和表达分析 起始复合体开始转录的。起始子( i n r ) ：在哺乳动物细胞中，i n r 的共有序列为p y - p y ( c ) - a + 。- n - t a p y - p y 乜5 侧。果蝇中i n r 的共有序 列为t c - a + 。- g t - t - c t 乜2 1 。起始子在指导前起始复合体的形成、 确定转录起始位点的位置和指导上游激活因子方面的作用，与t a t a 框相似，但不同的是它直接覆盖转录起始位点。i n r 在含有t a t a 框 和无t a t a 框的核心启动子中都有发现。下游核心启动子元件 ( d p e ) ：d p e 一般位于无t a t a 框的启动子中。b u r k e 等通过对1 8 个 果蝇的核心启动子研究发现，在无t a t a 框的核心启动子中，d p e 的 突变能导致启动子的基本转录活性降低1 0 到5 0 倍3 4 3 朝。现已发现 d p e 存在于许多( 但非全部) 果蝇启动子中，很可能也存在于许多哺 乳动物的启动子中汹3 。d p e 在启动子上的位置非常精确( 位于i n r 的a + ，下游的2 8 至3 2 b p ) 。在所有含d p e 的启动子中，d p e 和i n r 之 间的距离都是恒定的，d p e 和i n r 之间去掉或增加一个碱基都能使启 动子的基本转录活性降低几倍m 1 。 反式作用因子能够与启动子的顺式调控元件结合从而影响基因 的表达。以反式作用影响转录的因子可统称为转录因子。作为蛋白 质的转录因子从功能上分析其结构可包含有不同区域口6 1 ：q d n a 结合 域，多由6 0 - 1 0 0 个氨基酸残基组成。常见的d n a 结合域的形式有： 螺旋一转角一螺旋( h e li x - t u r n - h e li x ，h t h ) 、螺旋一环一螺旋 ( h e l i x l o o p - h e l i x ，h l h ) 、锌指、碱性一亮氨酸拉链( b a s i cl e u c i n e z i p p e r ，b z i p ) 等7 1 。转录激活域，常由3 0 1 0 0 氨基酸残基组成， 这结构域有富含酸性氨基酸、富含谷氨酰胺、富含脯氨酸等不同种 r 高校教师在职硕十学位论文 - _ 一- 类，酸性结构域最多见。连接区，即连接上两个结构域的部分。 不与d n a 直接结合的转录因子没有d n a 结合域，但能通过转录激活 域直接或间接作用与转录复合体而影响转录效率。 表卜1 真核生物启动子预测软件及其网络资源 c a u1 0 h t t p ：e p p c a u a c k r t s s c o r e p r o m o t e 暑三三芋s g e n e 。孟淼p r o m o t e c r s h l o r g t s s t o o ls g e n e f in d e r c p r o m o t e r 1 ) o p r o m o t e r i n s p e 卜h t t p ：w w w 一g e n o m a tix detor ：w w w ix p r o g r a m 。、7 一 p r o s c a n h t t p ：w w w g e n o m a t i x d e f i r s t e f e m b o s sp r o g r a m c p g p l o t p r o m o t e r i n s d e c t o tp r o g r a m m a ti n s p e c t o r p r o g r a m h t t p ：1 1r u l a i c s h l o r g t o o l s f i r s t e f h t t p ：w w w e b i a c u k h t t p ：| j 翮g e n o m a t i x d e h t t p ：w w w g e n o m a t i x d e p r o m o t e r r e g i o n p r o m o t e r r e g i o n c p g c p g t f b s 鸭】 t f b s p r o m o t e rs c a n ! t t p ，h ：? b l m a s d c r t nlhtfbsl5 0 v m o l d l o p r o s c a n 。 p r o m o s e r h t t p ：b i o w u l f b u e d u z l a b p r o m o s e rt s s t e s s h tt p ：w w w c bil u p e n n e d u t e s s t f b s t f b i n d h t t p ：t f b i n d i m s u t o k y o a c j dt f b s t f s e a r c h n tt p ，：w w w c b r c j p t f r r e s e a r c h d b t f s e a r c h h t m l 。 = 一一 一 a ：t r a n s c r i pt i o ns t a r ts i t e ：b ：t r a n s c r i p t i o nf a c t o rb i n d i n gs i t e 生物信息学和互联网的快速发展，使得启动子的预测研究进入 一个全新阶段，利用大型计算机作为服务终端和快速便捷的网络作为 服务通道，越来越多的在线启动子预测与分析工具被开发出来，取代 以往的离线软件，为科研人员提供服务，主要的真核生物启动子预测 软件资源详见表l 。目前预测启动子主要从鉴定启动子的转录起始位 6 人类睾丸特异表达新基l 天fm a e l 的克隆和表达分析 点、核心启动子区域、转录因子结合域和启动子的c p g 岛四个方面出 发矧。 真核生物启动子的预测软件和方法都基于现有的生物学数据 和已有的生物学知识，在不同模型或算法基础上开发的不同分析程 序有其一定的适用范围和相应的限制条件，因此预测启动子时应多 用几种分析软件，综合分析各种软件得到的结果和结果的可靠性。对 真核生物启动子进行计算机预测和鉴定也是一项具有挑战性的研究 工作，启动子的多样性和对转录调控机制认识的局限性，给相关的研 究开发工作带来很大的困难。但随着分子生物学、遗传学和生物信 息学的高速发展，更多的真核生物启动子序列将得到分析，各顺式作 用元件的功能也会逐渐明确，启动子的计算机预测研究工作因此也 将会有更广阔的发展空间。 在本文中，我们应用数字差异显示的方法结合实验手段，克隆 了一个在人类睾丸组织中特异性表达的新基因。在对新基因进行了 表达分析之后，我们还对该基因的启动子功能进行了初步的研究， 以期了解m a e l 基因表达调控机理。 高校教师在职硕士学位论文 2 材料与方法 2 1实验材料 2 1 1 实验材料 人睾丸组织标本来自中南大学湘雅二医学病理科。大肠杆菌 ( e c o l i ) 菌株d h 5q ，细胞株g c 一1 、h e l a 均为本实验室保存。人 多组织n o r t h e r n 印迹膜来自深圳伊诺金公司、人睾丸组织石蜡切片 购自陕西超英生物技术公司。 2 1 2 载体、工具酶及其它化学试剂 载体p m d l 8 一t 购自t a k a r a 公司，p t a l l u c 、p e g f p c 3 和p c m v b 为c l o n t e c h 公司产品。限制性内切酶和d n a 修饰酶、t 4d n a 连 接酶等购自n e we n g l a n db i o l a b s 公司。r l m r a c e 试剂盒购白a m b i o n 公司。逆转录酶、荧光素酶分析试剂盒( l u c i f e r a s ea s s a ys y s t e m ) 购自p r o m e g a 公司，凝胶回收试剂盒、微量质粒提取试剂盒、t a q 酶购自大连宝生物( t a k a r a ) 公司。中量和大量提取质粒试剂盒为 q i a g e n 公司产品。新生小牛血清为杭州四季青公司产品。其它化学 试剂均购自上海生工。 2 2 生物信息学分析的主要软件与数据库 美国国家生物信息中心n c b ie s t 数据库( h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v ) 和u n i g e n e 数据库( h t t p ：w w w n c b i n l m i h g o v u n i g e n e ) 。 人类睾丸特异表达新基因m a e l 的克隆和表达分析 核酸蛋白序列相似性比较：采用n c b i 中的b l a s t 程序 ( h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v b l a s t ) 。 阅读框架的识别：利用e x p a s y 服务器中的t r a n s l a t e 和n c b i 中的o r ff i n d e r 。 染色体定位：利用新基因的e d n a 全长与人类基因组序列b l a s t ， 可将新基因精细定位( h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v m a p v i e w e r ) 。 内含子和外显子分析：采用g e n e s c a n 、f g e n e h 和g e n i e 等基因 预测软件进行，并根据c h a m b o n 规则确定新基因的内含子一外显子交 界。 预测转录起始位点和启动子区域：用p r o m o t e r l n s p e c t o r 软件 ( h t t p ：w w w g e n o m a t i x d e ) 、t s s w 软件( h t t p ：w w w s o f t b e r r y c o m ) 、p r o s e a n 软件( h t t p t h r c i t n i h g o v ) 。 预测其转录结合因子结合位点：用m a t l n s p e c t o r 软件( h t t p ： 矾聊g e n o m a t i x d e ) 、t f s e a c h3 1 软件( h t t p ：m 聊c b r c j p ) 。 用c p g p l o t 软件( h t t p - b i o w e b p a s t e u r f r ) 分析是否存在c p g 岛。 2 3 数字差异显示 经互联网进入美国n c b i 的u n i g e n e 数据库，运用d d d ( 数字差异 显示) 的方法，进行两种平行材料之间的比较。我们以l o 个人的睾 丸e d n a 文库( e s t s 总数为8 3 6 7 7 个) 作为检测子，并将之归为p o o l a ：8 7 个其他组织或细胞株来源的e d n a 文库( e s t s 总数为2 4 3 8 3 0 个) 作为驱赶子，并将之归为p o o lb ，通过计算p o o la ：p o o lb 高校教师在职硕+ 学位论文 之间的比值来比较倍数差异，并以i 1 0 倍的差异为筛选标准，获得 可能存在表达差异的片段。 2 4r n a 的提取和反转录 按照传统的异硫氰酸胍一步法提取人的睾丸总r n a 。具体的提 取步骤如下：( 1 ) 将1 9 新取的组织材料放于1 0m 1 变性工作液中， 于冰上用组织匀浆机匀浆。( 2 ) 加入lm l3 m 的醋酸钠及等体积的水 饱和酚：氯仿：异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) ，用力震荡1 0s ，冰上放置1 5m i n 。 ( 3 ) 在4 c 环境下，1 0 0 0 0g 离心2 0m i n ，把上清液小心转到一个新的 用d e p c 处理过的5 0m l 离心管中，加等体积的异丙醇，- 2 0 环境 下至少沉淀1 小时。( 4 ) 在4 c 环境下，1 0 0 0 0 9 离心2 0 分钟，弃上 清，加入3 m l 变性工作液，轻轻吸打沉淀，直到沉淀全部溶解，再加 入3 m l 异丙醇，在- 2 0 。c 环境下至少放置1 小时以沉淀r n a 。( 5 ) 4 环境下，1 0 0 0 0 9 离心2 0 分钟，弃上清，加入2 m l 水，溶解r n a ，然 后平均转入到3 个1 5 m l 的e p 管内，加入和溶液等体积的水饱和酚： 氯仿：异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) ，轻轻摇匀，冰上放置1 5 分钟。( 6 ) 4 环 境下，1 0 0 0 0 9 离心1 0 分钟，取上清到新的e p 管，加入等体积氯仿： 异戊醇( 2 4 ：1 ) ，轻轻摇匀，4 c 环境下，1 0 0 0 0 9 离心1 0 分钟，取上 清到另外的1 5 m le p 管，再用酚：氯仿：异戊醇抽提一次。( 7 ) 在上清 中加入1 1 0 体积3 m 的醋酸钠，再加入0 6 - 1 倍体积异丙醇，轻轻 摇匀，在一2 0 c 环境下至少放置3 0 分钟，4 环境下以1 0 0 0 0 9 离心1 5 分钟，去上清，加3 0 0 l , tl7 0 预冷乙醇，轻轻吸打沉淀，室温下放 l o 分钟。( 8 ) 4 。c 环境下，1 0 0 0 0 9 离心1 0 分钟，弃上清，再把离心管 人类睾丸特异表达新基因m a e l 的克隆和表达分析 在离心机里轻轻甩一下，将管壁上的液体离心下来，再用l oi l1 的 枪头吸去液体，将离心管盖打开，插在冰上干燥1 5 分钟，根据沉淀的 多少加入5 0 - 2 0 0 u i 的d e p c 处理过的无菌水，待沉淀溶解后放入一8 0 冰箱中保存( 以上离心管和水均用d e p e 浸泡2 4 小时以上以使r n a 酶失活) 。 所提取的r n a 的浓度和纯度用e p p e n d o r f 公司的紫外分光光度 计检测仪进行分析。 采用是q i a g e n 公司的s e n s i s c r i p tr tk i t ，以所提取的人睾丸 总r n a 为模板，按照试剂盒中提供操作说明，反转录合成e d n a 的第 一条链。 2 5r l m - r a c e 我们采用r l m - r a c e ( p u q a1 i g a s em e d i a t e dr a c e ) 方法克隆m a e l 的全长c d n a 。r l m - r a c e 由日本东京大学铃木等人d 明开发，可以更精 确的定位转录起始位点。其原理是根据真核生物的m r n a 具有一个3 7 尾巴和一个57 帽子结构，该技术正是利用57 端的帽子特性对全长分 子进行富集和扩增。降解的m r n a 57 端都有一个磷酸基，用碱性磷酸 酶去掉该磷酸基，随后用烟草酸性焦磷酸酶去掉帽子结构，则全长分 子的57 端会暴露出磷酸基，随后的连接步骤中锚定引物将特意的加 在全长分子的57 端而不会和降解的分子连接( 全长分子的富集机 制) 。本实验以睾丸总r n a 为模板，根据m a e l 的阅读框序列设计2 条特 异性嵌套p c r 引物( 5 7 r a c e 引物：57 - c c t c c t c a g t g g t g t g a a a a c - 3 7 ，57 一c a g t c t g a g g a g c a g t a a g g g a 一37 ；5 7 r a c e 弓i 物： 高校教师在职硕七学位论文 57 一a a g c a t a t g g c a a a g g c a t c 一37 ，57 - a g c a a c a c a a g g t g c a a g t g 一37 ) ， 采用a m b i o n 公司生产的f i r s t c h o i c er l m - r a c ek i t 扩增出m a e l 的全长 e d n a 序列。 2 6e g f p - m a e l 融合蛋白表达质粒的构建 根据m a e l 基因m r n a 序列，设计一对引物( m a e l w f ，m a e l w r ) 和一对巢式引物( m a e l n f ，m a e l n r ) ( 见表2 1 ) ，为了便于亚克隆 到p e g f p c 3 载体上，在巢式引物( m a e l n f ，m a e l _ n r ) 的57 端分 别加上限制酶e c o r i 和k p n i 的酶切位点。首先，以睾丸e d n a 为模 板，用m a e l w f ，m a e l w r 两个引物，在e p p e n d o r f 梯度p c r 仪上进 行p c r 扩增。p c r 反应体系如下：1 9 8 7 5 “l 的水，2 5p 1 的l o x b u f f e r ，0 5 p 1 d n t p ( 2 5i i l m ) ，0 5 肛1 雌e l - w f ( 1 0 叫) ，0 5 p 1 m a e l w r ( i o 叫) ，1 “1e d n a ，0 1 2 5 肛1p y r o b e s td n ap o l y m e r a s e 。p c r 程序为：9 4 c 变性2m i n ，然后进行3 5 个循环，每个循环9 4 。c 变 性3 0 s ，5 5 c 退火3 0 s ，7 2 c 延伸1 5m i n ，最后7 29 c 延伸1 0m i n 。 p c r 合成后，取1 0 1 进行电泳。然后取l l a lp c r 产物，用巢式引 物( m a e l n f ，m a e l n r ) 进行第二轮p c r 扩增。第二轮p c r 反应体 系如下：1 9 8 5 l 的水，2 5 “1 的l o xb u f f e r ，0 5 “1d n t p ( 2 5 m m ) ，0 5 p l m a e l n f ( i o叫) ，0 5 p lm a e l n r ( i o p m ) ，l l a l c d n a ，0 1 5 “ll ad n ap o l y m e r a s e 。p c r 程序为：9 4 。c 变性2m i n ， 然后进行5 个循环，每个循环9 4 。c 变性3 0 s ，5 8 。c 退火3 0 s ，7 2 。c 延 伸1 5m i n ，接着进行3 0 个循环，每个循环9 4 。c 变性3 0 s ，6 3 。c 退 火3 0 s ，7 2 。c 延伸1 5m i n ，最后7 2 。c 延伸1 0r a i n 。 1 2 人类睾丸特异表达新基冈m a e l 的克隆和表达分析 用限制性内切酶e c o r l 和k p n i 酶切p c r 产物和载体质粒 p e g f p - c 3 ，将酶切产物分别在琼脂糖凝胶中电泳并回收，然后按常 规方法克隆到p e g f p c 3 ，形成e g f p - m a e l 融合蛋白表达质粒 p e g f p - c 3 f f i e l 。将p e g f p c 3 - m a e l 送到上海英骏公司测序。 2 7 细胞培养、转染和亚细胞定位 在3 7 c 温度条件下，在5 的c o 。培养箱中用d m e m 完全培养液 ( , b 2 n1 0 新生牛血清、2i i l ml 一谷氨酸和1 0 0u m l 青霉素) 培养 h e l a 细胞和g c 一1 细胞。待细胞密度达9 0 时，此时将p e g f p - c 3 - e a