（生物化学与分子生物学专业论文）香蕉与枯萎病病程相关基因的鉴定.pdf

论文作者签名： 笺p 炙 i e t 期：弘l 口年月p e t 学位论文版权使用授权说明 本人完全了解海南人学大丁收集、保存、使川学位论文的规定，即：学校有权保留并向 国家有关部| j 或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被有阅和借阅。本人授权海南人 学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。本人在导师指导卜完成的论文成果，知识产权归属海 南大学和中国热带农业科学院。 保密论文在解密后遵守此规定。 论文作者签名：彩之 日期：芦f 口年6 月切日 导师签名 日期：如1 9 年毛，月9e l 本人已经认真阅读“c a l l s 高校学位论文全文数据库发布章科”，同意将本人的学位论 文提交“c a ll s 高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可 权益。回意论文提窒后滞后：口1 二年；旦二生! 旦二生蕉鱼。 论文作者签名： 期乏 日期：i 口年6 月 ，e t 按“章程”中规定享受相关 导师签名：函他 日期：少l 口年月j de t 摘要 香蕉枯萎病又称香蕉镰刀菌枯萎病、香蕉巴拿马病，俗称香蕉黄叶病。香蕉 枯萎病是一种土传性的维管束病害，可以通过病苗、病土、带菌耕作工具、灌溉 水等途径传播。自1 8 7 4 年在澳大利亚被发现以来，已经在中、南美洲、亚洲等 世界各国发生，并对香蕉产业造成巨大损失。本研究通过研究香蕉枯萎病菌侵染 过程以及筛选与病程相关的基因为进一步研究侵染机制提供一定理论依据，对今 后利用香蕉枯萎病抗病基因工程手段培育抗病品种具有重要意义。 为研究香蕉枯萎病菌侵染香蕉根系过程，本实验利用转化g f p 基因的尖孢 镰刀菌4 号生理小种侵染巴西蕉( m u s aa c u m i n m el j u 姨g r o u p “b r a z i l i a n ) 苗根系， 通过荧光显微镜进行镜检观察，直观的观察到分生孢子在根系表面的附着、繁殖 及侵入过程。根据观察结果将枯萎病菌侵染根系的过程分为三个时期：侵染前期， 分生孢子吸附于根系表面，在适宜条件下萌发形成菌丝体，菌丝优先沿细胞间隙 伸长生长，没有菌丝侵染至根系内部；侵染中期，菌丝体在细胞间隙大量繁殖， 并在根系外围形成网络结构，菌丝开始侵入表皮细胞，一些分生孢子在细胞内部 大量繁殖，并填满整个细胞，少量菌丝开始侵入根系皮层；侵染后期，菌丝沿根 系表皮细胞生长扩大到更大范围，形成的网络结构已经将根系完全包裹住，并深 入根系内部，大部分菌丝由外向内侵入根系，直至维管束部分，有极少量的菌丝 会沿着根系导管生长，菌的侵染可由下至上转移至假茎中。所以，香蕉枯萎病菌 的侵染是菌丝由根系逐渐向内向上传播的过程，而非之前推测的是由于导管的运 输将菌的孢子运送至香蕉假茎中再进行增殖的过程。 在此基础上，选取发病不同时期的对照和侵染香蕉苗根系，提取总r n a ， 反转录为e d n a 第一链，并以此为模板，采用半定量r t p c r 的方法对本实验 室已经构建的香蕉e d n a 文库中的3 0 个基因进行差异表达分析，初步筛选与枯 萎病病菌侵染病程相关的基因。结果分析表明，相对于未经侵染的对照植株有 2 1 个基因有下调表达的趋势，4 个基因有上调表达的趋势，3 个基因无明显的变 化规律，2 个基因的表达没有明显变化。 几丁质酶基因是目前发现的具有明显抗真菌效果的基因。本实验通过几丁质 a b s t r a c t f u s a r i u mw i l ti sas o i l b o r n ev a s c u l a rd i s e a s ew h i c hk n o w na sf u s a r i u m o x y s p o r u m s p c u b e n s ed i s e a s e ，p a n a m ad i s e a s e ( c o m m o n l y k n o w na sb a n a n ay e l l o w l e a f d i s e a s e ) i tc a nb es p r e a d e db yd i s e a s e ds e e d l i n g s ，s o i l ，c o n t a m i n a t e dt o o l s ， i r r i g a t i n gw a t e ra n do t h e rw a y s f u s a r i u mw i l tw a sf a s tf o u n di na u s t r a l i ai n18 7 4 ， a n dt h e no c c u r e di nc e n t r a la n ds o u t ha m e r i c a , a s i aa n do t h e rc o u n t r i e si nt h ew o r l d c a u s i n gh u g el o s s e si nb a n a n ai n d u s t r y w es t u d i e dt h ei n f e c t i o np r o c e s sc a u s e db y p a t h o g e na n di d e n t i f i e dd i s e a s e - r e l a t e dg e n e sf o rf u r t h e rs t u d y t h ei n f e c t i o n m e c h a n i s m so ff u s a r i u mw i l t t h i ss t u d yi si m p o r t a n tf o rc u l t i v a t i n gr e s i s t a n tb a n a n a s b yu s i n gg e n e t i c se n g i n e e r i n g w eu s e df u s a r i u mo x y s p o r u mf s p c u b e n s er a c ef o u r ( f o c 4 ) t r a n s f o r m a t e dw i t h g f pg e n et oi n f e c tr o o t so f b a n a n as e e d l i n g s ( m u s aa c u m i n a t el a a ag r o u pc v b r a z i l i a n ) ，t h e no b s e r v e dt h ep r o c e s sv i s u a l l yb yf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p e ，s u c ha s c o n i d i aa t t a c h m e n tt or o o ts u r f a c e ，r e p r o d u c t i o na n di n v a s i v ep r o c e s s a c c o r d i n gt o o b s e r v a t i o n ，i n f e c t i o np r o c e s sw a sd i v i d e di n t ot h r e ep e r i o d s ：e a r l ys t a g e ，m i d d l e s t a g ea n dl a t e rs t a g e i ne a r l ys t a g e ，m i c r o c o n i d i aa d s o r b e do nt h er o o ts u r f a c e ，t h e n d e v e l o p e di n t oh y p h a e u n d e rp r o p e rc o n d i t i o n s h y p h a ep r i o rt oe l o n g a t ea l o n gt h e c e l lg a pa n dt h e r ew e r en oh y p h a ei n f e c t e di n t ot h ei n t e m a lo fr o o t i nm i d d l es t a g e ， h y p h a eg r e wf a s ti ns p a c e sb e t w e e nc e l l sa n df o r m e dan e t w o r k s t r u c t u r ei nr o o t s u r f a c e p e n e t r a t i o no fh y p h a ei n t oe p i d e r m a lc e l l sw e r ea l s oo b s e r v e d l a r g en u m b e r o fm i c r o c o n i d i ae v e nf i l l e dt h ew h o l ec e l la n do n l yas m a l la m o u n to fh y p h a e p e n e t r a t e di n t or o o tc o r t e x i nl a t e rs t a g e ，h y p h a ee x p a n d e dt oa w i d e rr a n g ea r o u n d t h er o o te p i d e r m a lc e l l sa n dt h en e t w o r ks t r u c t u r eh a sc o m p l e t e l ye n c a s e dr o o t s m o s t o ft h eh y p h a ep e n e t r a t e dt oi n n e ro fr o o tu n t i lt h ev a s c u l a r o n l yl i t t l eh y p h a eg r e w a l o n gt h ev a s c u l a ro fr o o t a tl a s th y p h a et r a n s f e r r e dt ot h ep s e u d o s t e m t h e r e f o r e ， t h ei n f e c t i o np r o c e s sw a st h a tf o c 4g r a d u a l l yi n f e c t e df r o mr o o t su pt op s e u d o s t e m r a t h e rt h a nm i c r o c o n i d i at r a n s p o r t e di nv a s c u l a rf r o mr o o tu pt op s e u d o s t e m i i i r o o t so fc o n t r o la n dt h r e ed i f f e r e n td i s e a s es t a g e sw e r es e l e c t e dt oe x t r a c tt o t a l r n a sw h i c hw e r er e v e r s e di n t oe d n af i r s ts t r a n du s e da st e m p l a t e t h i r t yg e n e si na b a n a n ae d n a l i b r a r yw e r ec h o s e nt od od i f f e r e n te x p r e s s i o na n a l y s i sb yu s i n g s e m i q u a n t i t a t i v er t - p c r m e t h o d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt w e n t y - o n eg e n e sw e r e d o w n r e g u l a t e de x p r e s s i o n , f o u rg e n e su p - r e g u l a t e de x p r e s s i o n ，t h r e eg e n e s d i d n t h a v es i g n i f i c a n tc h a n g i n gr u l e sa n dt w og e n e sd i dn o tc h a n g es i g n i f i c a n t l yc o m p a r e d w i t hc o n t r o lp l a n t sw i t h o u ti n f e c t i o n c h i t i n a s eg e n ew a sf o u n dt oh a v eas i g n i f i c a n te f f e c to na n t i - f u n g a l w eu s e d p r o m o t e ra n di n h i b i t o rt ot r e a tt h e r o o t so fb a n a n as e e d l i n g s c h i t i n a s eg e n e s e x p r e s s i o na n de n z y m ea c t i v i t yw e r em e a s u r e d a td i f f e r e n tp h a s e s t h er e s u l t s i n d i c a t e dt h a tc h i t i n a s eg e n e se x p r e s s i o ni n c r e a s e dw i t ht r e a t m e n to fs a l i c y l i ca c i d a n ds od i dt h ee n z y m ea c t i v i t y s y m p t o mo ff u s a r i u mw i l tw a sd e l a y e d t h e o p h y l l i n e i n h i b i t e dt h ec h i t i n a s eg e n e se x p r e s s i o na n de n z y m ea c t i v i t y s y m p t o mo ff u s a r i u m w i l tw a si na d v a n c e k e yw o r d s ：b a n a n a ，f u s a r i u mw i l t ，f u s a r i u mo x y s p o r u mf s p c u b e n s er a c ef o u r ( f o c 4 ) ，i n f e c t i o np r o c e s s ，s e m i - q u a n t i t a t i v er t - p c r ，p a t h o g e n r e l a t e dg e n e s i v 目录 摘要i a b s t r a c t i i i 1 月i j 吾1 1 1 香蕉的价值1 1 - 2 香蕉枯萎病病原菌及发病症状1 1 2 1 香蕉枯萎病侵染源1 1 2 2 香蕉枯萎病发病症状2 1 3 香蕉枯萎病的传播方式、分布及危害3 1 3 1 香蕉枯萎病的传播方式3 1 3 2 香蕉枯萎病的分布3 1 3 3 香蕉枯萎病的危害4 1 4 香蕉枯萎病研究进展5 1 4 1 病原菌与侵染机理研究进展5 1 4 2 香蕉枯萎病抗病与防治措施研究进展7 1 4 2 1 检疫防控措施7 1 4 2 2 化学防治7 1 4 2 3 生物防治8 1 4 2 4 抗病育种9 1 5 几丁质酶研究进展1 0 1 5 1 几丁质酶分类、分布及结构1 0 1 5 2 几丁质酶的功能1 1 1 5 3 几丁质酶促进剂、抑制剂研究进展1 1 1 5 4 几丁质酶在抗病基因工程中的应用1 2 1 6 本研究的目的意义1 3 1 7 技术路线1 4 2 材料、试剂、仪器1 5 2 1 植物材料1 5 2 2 菌种1 5 2 3 化学药品及生化制剂1 5 2 4 培养基1 5 2 5 主要仪器1 5 3 方法1 5 3 1 植株水培培养1 5 3 2 菌的培养和收集1 6 3 3 血球计数板计数1 6 3 4 香蕉根系侵染1 6 3 5 切片1 6 3 6 显微观察1 7 3 7 取材和冻样1 7 3 8 香蕉根系总r n a 提取1 7 3 9 半定量r t - p c r 。1 9 3 9 1c d n a 第一链的合成1 9 3 9 2r t p c r 的引物设计1 9 3 9 3r t p c r 的反应体系2 2 3 9 4r t p c r 的反应程序2 2 3 9 4 1 退火温度确定2 2 3 9 4 2 循环数确定2 2 3 1 0 香蕉根系针对几丁质酶抑制剂、促进剂的处理2 4 3 1 0 1 茶碱处理2 4 3 1 0 2 水杨酸处理2 5 3 1 0 3 对照处理2 5 3 1 1 抑制剂、促进剂处理基因表达分析2 5 3 1 2 抑制剂、促进剂处理几丁质酶活性测定2 5 3 1 2 1 胶体几丁质的制备2 5 3 1 2 2 酶液的提取2 5 3 1 2 3 标准n 一乙酸氨基葡萄糖的测定及标准曲线的制作2 6 3 1 2 4 几丁质酶活性测定2 6 4 结果2 6 4 1 供试菌种菌落、孢子、菌丝体观察2 6 4 2f o c 4 一g f p 侵染水培香蕉苗根系病程2 8 4 2 1f o c 4 一g f p 侵染水培香蕉苗根系各阶段显微镜观察2 8 4 2 1 1 侵染前期2 8 4 2 1 2 侵染中期2 8 4 2 1 3 侵染后期2 9 4 3f o c 4 一g f p 侵染水培香蕉苗外部形态特征变化3 0 4 4 香蕉中目的基因的半定量r t - p c r 3 2 4 4 1 香蕉根系总r n a 的质量3 2 4 4 2 上调表达的基因3 3 4 4 3 下调表达的基因3 4 4 4 4 相对表达量无明显变化的基因4 0 4 4 5 相对表达量变化无明显规律的基因4 1 4 5 香蕉根系水杨酸、茶碱处理4 3 4 5 1 香蕉根系水杨酸、茶碱处理外部形态观察4 3 4 5 2 香蕉根系水杨酸、茶碱处理r t - p c r 4 4 4 5 3 香蕉根系水杨酸、茶碱处理几丁质酶活性4 4 5 讨论4 5 5 1 转绿色荧光蛋白( g f p ) 的f o c 4 继代及侵染致病性分析4 5 5 2 香蕉枯萎病侵染病程4 5 5 3 病程相关基因的鉴定分析4 6 5 3 1 上调表达的基因4 7 5 3 2 下调表达的基因4 8 5 3 3 表达无明显规律的基因4 8 5 4 水杨酸、茶碱处理r t - p c r 及几丁质酶活性分析4 9 6 结论4 9 参考文献_ 5 0 缩 致 写词6 1 1 前言 1 1 香蕉的价值 香蕉和大蕉是热带、亚热带发展中国家的最重要作物之一，具有很高的营养 价值、经济价值及药用价值。香蕉的营养价值很高，含有丰富的维生素a 、c 、 b 6 以及大量的钙、钾和磷；香蕉果实除作水果外，非洲、亚洲、美洲热带地区 也作为粮食，被联合国粮农组织列为世界第四大粮食作物( p e n a r r u b i ae ta 1 1 9 9 2 ) ； 香蕉果实除鲜食外，还可以制成各种加工制品和提取香精原料：香蕉植株具有高 的药用价值：果实性寒，能滑大肠、通便，润肺；茎、叶可利尿，能治水肿、脚 气；根捣碎后可治疮毒、结热和痢疾；花和花苞可治吐血和便血。新鲜的干茎、 吸芽和雄芽也含丰富的营养物质，粉碎后可作猪饲料；假茎的纤维可制绳索、麻 袋和造纸。总之，香蕉作为水果、粮食能满足消费者的需要，对于南方农村起着 脱贫致富的作用，香蕉已成为热带农业的支柱产业。 。 据f a o 统计，2 0 0 5 年世界香蕉产量为72 6 2 4 6 万t ，比2 0 0 0 年增加8 0 4 8 2 万t ，年均增长2 4 9 。其中，亚洲为38 8 6 2 2 万t ，占世界总产量5 3 5 1 ：拉美 和加勒比海地区为24 5 8 3 4 万t ，占3 3 8 5 ；非洲7 6 0 1 1 万t ，占1 0 4 7 ；大洋洲 1 1 7 5 7 万t ，仅占1 6 2 。世界香蕉主要生产国的产量2 0 0 5 年超过1 0 0 万t 的1 3 个国家依次为印度、巴西、中国、厄瓜多尔、菲律宾、印度尼西亚、哥斯达黎加、 墨西哥、泰国、布隆迪、哥伦比亚、越南、危地马拉，其总和占世界总产量的 7 9 5 7 ；2 0 0 5 年香蕉产量最高的国家是印度，为l6 8 2 0 0 万t ，占世界香蕉总产量 的2 3 1 6 ；其次是巴西6 7 0 2 8 万t ，占9 2 3 。目前共有1 2 0 个国家和地区生产香 蕉，其中大部分属于发展中国家。在我国，香蕉植区主要分布在广东、广西、福 建、海南、云南等热区，2 0 0 5 年香蕉产量为6 3 9 0 0 万t ，占世界香蕉总产量的 8 8 0 ，居全球第三位，为我国国民经济的发展做出了重要的贡献( 杨培生等， 2 0 0 3 ；王强等，2 0 0 6 1 许林兵，2 0 0 6 ) 。 1 2 香蕉枯萎病病原菌及发病症状 1 2 1 香蕉枯萎病侵染源 香蕉枯萎病是一种毁灭性病害，是国际植物检疫对象，由尖孢镰刀菌古巴专 化型侵染引起。依据病菌在不同类型香蕉品系或者不同属种的致病程度，将香蕉 枯萎病菌划分为4 个生理小种：1 号小种属于世界性分布，感染香蕉的栽培种“大 蜜哈 【g r o s m i c h e l ( a a a ) 】、龙牙蕉( m u s a a a b ) 、粉蕉( a b b ) 以及a p p l e ( a a b ) ， s i l k ( a a b ) ，t a i w a nl a t t m d a n ( a a b ) ，i c 2 ( a a a a ) 等香蕉品系，但矮香蕉 ( d w a r f c a v e n d i s h ，a a a ) 较抗病； 2 号小种局部分布于中美洲的洪都拉斯、萨尔 瓦多、波多黎哥、多米尼加共和国和维尔京群岛等地，只感染三倍体杂种棱香蕉 【b l u g g o e ( a a b ) ，不侵染“大蜜哈”；3 号小种只感染芭蕉科野生的蝎尾蕉属 ( h e l i c o n i a ) ；4 号小种几乎能侵染所有香蕉种类( 高乔婉，1 9 9 6 ) ，1 9 6 7 年首先 在我国台湾省报道，在我省主要分布l 号和4 号小种，1 号小种主要为害粉蕉， 4 号小种为害粉蕉和香蕉。 1 2 2 香蕉枯萎病发病症状 香蕉的各个生长期，从幼小的吸芽至成株期都能发病。由于各个生长期土壤 类型等情况的不同，外部症状也有些差异；病原菌的不同小种，也会导致不完全 相同的症状。 1 外部症状感病的品种( 如大密歇尔，c r o sm i c h e l ) 所表现的外部症状如下： 成株期病株起初在下部的叶片及在外边的叶鞘先呈现特异的黄色，这种黄色病变 初表现于叶片边缘，后逐渐向中肋扩展，发病后的叶子迅速萎蔫，叶柄在靠近叶 鞘外折曲下来，在几天之内，其他叶子相继下垂，由黄色变呈褐色而干枯。也有 一些叶子没有变黄便垂挂下来，倒挂于假茎的四周。( 图1 ) 一般假茎中心的最 后一张顶叶，往往很迟伸出或不能抽出。经过一段时间后，整株枯死，形成一条 枯杆，倒挂着干枯的叶子。有些病株假茎外面近地面处起，还常表现一条或长或 短的纵裂缝。 2 内部症状香蕉枯萎病菌是侵染维管束的病害，当罹病初期在病株下部根 茎处横剖开观察，可见中柱髓部和皮层薄壁组织间，有黄色或红棕色的斑点。这 是被病原菌侵染后坏死的维管束。这种变色也有集中在髓部和外皮层之间的，内 皮层内面维管束形成一圈坏死。若纵向剖开病株根茎，可看到初发病的组织有黄 红色病变的维管束，近茎基部，病变颜色很深，越向上病变颜色渐渐变淡。在根 部木质导管上，常产生红棕色病变，一直延伸至根茎部：至后期，大部分根变黑 褐色而干枯。病茎旁所生吸芽的导管也会受侵染，纵剖球茎，可以看到红棕色的 维管束从母株延伸侵染的迹象。病害严重的植株，整个球茎内部明显地变为深红 色及棕褐色，中柱和内层的叶鞘变褐色：剖开病组织，有一种特异而不是臭的气 味。只有在其他微生物再次侵染后，才腐烂发臭。( 图1 ) 2 图1 香蕉枯萎病症状 f i g 1s y m p t o m so fb a n a n af u s a r i u l t l w i l t 1 3 香蕉枯萎病的传播方式、分布及危害 1 - 3 1 香蕉枯萎病的传播方式 香蕉枯萎病是土传性的维管束病害，带病蕉苗和病土是初侵染源，带菌耕作 工具、病区灌溉水、雨水等导致进距离的病菌传播和蔓延，带菌的香蕉种苗、土 壤和农机具等调运和搬移进行远距离传播。高温多雨、土壤酸性、砂壤土、肥力 低、土质黏重、排水不良、下层土渗透性差和耕作伤根等因素，有利于病害发生。 感病的春植蕉一般在6 7 月开始发病，8 - - 9 月加重，1 0 1 1 月进入发病高峰。 ( o r e n ，2 0 0 3 ；s t o v e r , 1 9 6 2 ；p l o e t za n dp e g g ，2 0 0 0 ) 1 3 2 香蕉枯萎病的分布 香蕉枯萎病最早于1 8 7 4 年在澳大利亚被发现，1 9 1 0 年巴拿马香蕉生产因该病 造成极大损失，2 0 世纪5 0 年代期间，该病在中、南美洲的巴拿马、哥斯达黎加、 洪都拉斯、哥伦比亚等地发生严重，约有4 万h m 2 遭毁灭。现在世界上除巴布亚 新几内亚、南太平洋群岛和一些地中海沿岸国家外，几乎所有的香蕉分布地域均 报道遭受该病的危害( 吴元立，2 0 0 3 ) 。在马来西亚该病的危害导致部分香蕉品 种不能大规模商业栽培。另外印度、印度尼西亚、越南、澳大利亚等国危害也很 严重( 魏岳荣等，2 0 0 5 ) 。我国的广东( 包括珠江三角洲地带、高州) ，广西( 包括 南宁、百色) ，福建( 漳洲) ，海南( 文昌、万宁、儋州、定安、澄迈) ，云南( 河口、 景洪) 和台湾均有分布( q ip ，2 0 0 1 ：谢艺贤等，2 0 0 5 ) 。其中广东省于2 0 世纪7 0 3 年代初发现于中山市，危害粉蕉，2 0 多年未见香蕉被害。1 9 9 6 年番禺万顷沙镇民 建村的巴西及广东2 号品种出现枯萎病( 戚佩坤，2 0 0 0 ) ，由香蕉枯萎病菌4 号小 种引起，后在局部地区发展较快，并向中山、珠海、东莞、肇庆、信宜等市县传 播，目前已有约10 0 0h m 2 农田弃耕香蕉。据调查统计，目前病园的发病率为 1 0 一1 0 ，严重的达9 0 以上( 林兰稳，2 0 0 3 ；刘景梅，2 0 0 4 ) 。台湾省于1 9 6 7 年首次发现该病，并在7 0 年代大面积流行，许多农户开始丢荒或者转种其他水果 蔬菜，从而造成近年香蕉的种植面积由1 9 6 5 年高峰期的5 0 0 0 0h m 2 减少至1 j 2 0 0 2 年 的49 0 8h m 2 ，其中有40 0 0 2 被感染( h w a n gsc2 0 0 1 ) 。经调查和综合鉴定，在 广西发生的香蕉枯萎病病原为香蕉镰刀菌枯萎病病原菌1 号生理小种引起，主要 为害西贡蕉、红蕉及大蕉。自2 0 0 1 年开始至今，通过在广西各产蕉区进行广泛调 查、采样、分离和接种试验，表明目前在广西境内还没有发现香蕉枯萎病病原菌 4 号生理小种为害( 莫贱友，2 0 0 8 ；郭堂勋，2 0 0 8 ) ，海南省存在香蕉枯萎病1 号和4 号两个生理小种( 漆艳香，2 0 0 6 ) 。 1 3 3 香蕉枯萎病的危害 香蕉镰刀菌枯萎病能对许多香蕉栽培种造成危害，其中包括a a b 型丝蕉类 的l a t u n d a n ( 菲律宾) 、m a e a ( 巴西) ，p i s a n gr a s t a l i ( 马来西亚) 、r a s t h a l i ( e p 度) ；属于 a a b 型波眉蕉亚组的l a d yf i n g e r ( 澳大利亚) 、p r a t a ( 巴西) 、v i r u p a k s h i ( 印度) ；属 于a b b 型的粉蕉品种。其他一些重要的地方品种，例如东非高地a a a 型香蕉 亚组的m u t i k a l u j u g i r a 和a a 型贡蕉中的一些栽培品种也报道在特定的环境 下易于感病。在南太平洋地区普遍种植的太平洋煮食蕉亚组( a a bm a i a m a o l i p o p o u l o u ) 其样本己经在田间实验中显示感病性。此外，a b b 棱指蕉和丸认 大蜜舍亚组中一些广泛栽培的品种也感病( 吴元立，2 0 0 3 ) 。 我国的危害品种主要有a a b 型的过山香龙牙蕉，a b b 型的粉蕉、粉大蕉， 和a 从型h i g h g a t e ( 高门) 等，野生蕉类的a a ( 云南) 和阿宽蕉( 龙f - i ) 等( q ip , 2 0 0 1 ； 曾惜冰等，1 9 9 6 ) ，以及在海南大面积栽培的巴西蕉( 谢艺贤等，2 0 0 5 ) 。目前， 由于大蕉对枯萎病表现有很强的耐病性，不少病园被改种大蕉( 魏岳荣等，2 0 0 5 ) 。 香蕉枯萎病是困扰全球香蕉产业发展的一大难题，世界香蕉生产国和地区均 受到这一病害的严重威胁。枯萎病病原菌在土壤中存活时间达数年之久，一般减 产2 0 以上，严重的田块甚至绝收。2 0 0 9 年世界最大国际农业研究中心联盟 国际农业研究磋商组织( c g i a r ) 近日发表的声明说，枯萎病正在肯尼亚、乌干达、 卢旺达、坦桑尼亚等l o 个非洲国家的香蕉作物中蔓延，而这些国家的很多民众是 以香蕉为主食的。国际农业研究磋商组织认为，这将导致很多人食物短缺。该组 织的声明还说，目前对抗这种香蕉传染病没有特别好的办法，蕉农可能不得不将 4 自己的作物燃烧并掩埋，否则这种传染病还有进一步流行的可能。国际农业研究 磋商组织表示，自2 0 0 1 年以来，世界第二大生产国乌干达，由于此病每年的损失 量达4 0 ，造成2 亿美元左右的损失。2 0 0 8 年在埃塞俄比亚召开的非洲科学会议 上指出，在过去5 年中，香蕉枯萎病已蔓延至乌干达的3 3 个地区，并蔓延至刚果 东部、肯尼亚、坦桑尼亚和卢旺达。截止2 0 0 9 年统计乌干达国内4 3 个地区的香蕉 正面临着枯萎病的威胁。由于香蕉是乌干达中部、西部几百万人口的主要粮食作 物，如果香蕉枯萎病不能及时防治，该国将面临着严重的食品危机。遭受枯萎病 袭击严重的地区有与萨卡、基博加、姆巴巴拉、布谢尼、恩通加莫。 巴西是世界第四大香蕉生产国，也由于此病发生每年减产达7 0 以上。广东 省于1 9 9 6 年首次在番禺和中山市发现对当前主要品种致病力更强的香蕉枯萎病4 号种以来，逐渐在全省香蕉香蕉种植地区扩展开来，不断威胁华南地区香蕉生产。 近两年珠江三角洲香蕉主产区该病发生已经达到了凡是种植香蕉必然发生一定 程度的枯萎病的地步，发生后失手率很高，很多农民跑到外地觅新植地种植香蕉 的程度。广东省是我国最大的香蕉生产省份，2 0 0 5 年，香蕉种植面积达1 9 2 万亩， 产量3 3 0 万吨，占全国香蕉产量的一半以上，产值达6 0 亿元。香蕉也是广东省具 有出口创汇优势的农产品。国家和广东省为控制此病投入的资金已经超过百万人 民币。香蕉枯萎病在福建省所造成的直接经济损失总价值为3 6 3 万元。其中，造 成的产量损失值为1 8 3 万元，投入的防治费用损失值为1 8 0 万元，香蕉枯萎病造成 的生态系统服务功能损失值约为1 6 5 万元( 刘炳钻，2 0 0 9 ) 。 通过建立香蕉枯萎病风险分析指标体系，分析香蕉枯萎病在中国的风险等级； 利用c l i m e x 软件预测香蕉枯萎病在中国的适生区。香蕉枯萎病菌的风险性 值为2 1 2 ，属于高度危险的检疫性有害生物( 病原物) 。表明香蕉枯萎病菌的侵染 力强，扩散迅速，根除难度大，其一旦侵入，破坏性极大，将造成毁灭性的损失， 对我国香蕉产业的发展和安全构成了严重威胁，应加强风险性管理力度( 谢梅琼， 2 0 0 8 ) 。 1 4 香蕉枯萎病研究进展 1 4 1 病原菌与侵染机理研究进展 非洲比勒陀利亚大学应用高通量a f l p 技术评估香蕉枯萎病菌的遗传多样 性，结果显示了枯萎病菌群体的多样性，并鉴定了7 种基因类型( g r o e n e w a l d ， 2 0 0 6 ) 。b e n t l e 、k i s t l e r 、漆艳香分别用d n a 指纹印迹法、基因克隆杂交法、i l i t 突变株做营养亲和性配对反应对香蕉枯萎病菌的营养亲和群和系统进化进行了 研究，初步弄清香蕉枯萎病菌亲和群的分布及其与生理小种的关系，为特定地区 抗病育种材料的筛选及香蕉枯萎病菌的检测和防治提供理论基础。( b e n t l e ， 1 9 9 8 ；k i s t l e r ，1 9 9 5 ；漆艳香，2 0 0 6 ) 陈雅平等利用基于r d n a 内转录间隔区( i t s ) 的p c r - - r f l p 标记和r a p d 技术对采自深圳的3 种野生蕉遗传背景进行了分 析，并采用与香蕉枯萎病连锁的r a p d 标记及苗期接种鉴定对其枯萎病的抗性 进行了研究。( 陈雅平，2 0 0 8 ) 2 0 0 9 年1 1 月，热科院联合中科院北京基因组研究所深圳华大基因科技有限公 司，启动了“香蕉枯萎病菌1 、4 号小种全基因组测序计划”，并于不久前顺利完成 此项工作。在第二届国际香蕉学术研讨会上，热科院生物所曾会才研究员正式宣 读了香蕉枯萎病菌1 、4 号小种全基因组测序已经完成的声明。据了解，在成功破 译香蕉枯萎病菌基因组的遗传密码的基础上，课题组下一步将开展香蕉枯萎病菌 致病功能基因组研究，以便尽早探明香蕉枯萎病菌致病机理，为有效防控香蕉枯 萎病提供理论依据。 美国美国哈佛麻省理工的博德研究所和剑桥大学通过对三个宿主选择范围 有宽有窄的镰菌属真菌( 其中两个刚完成测序) ：禾谷镰刀菌、轮枝样镰刀菌和 尖孢镰刀菌的基因组进行比较，试图从分子水平上揭示镰刀菌宿主选择范围有差 别的原因。后续实验工作表明，仅仅将两个菌种在标准生长介质上混合( 将来自 一个尖孢镰刀菌番茄病原体的两个完整染色体转移) ，就能将一个非致病菌种变 成一个致病菌种。这些发现为了解宿主范围及致病性的演化提供了线索。( m a l j ，2 0 1 0 ) 。 d ea s c e n s a o 等用香蕉枯萎病菌激发子侵染香蕉根系诱导防卫反应，对木质 素、胼胝质沉淀物、酚类化合物、苯丙氨酸裂解酶、肉桂酸乙醇脱氢酶、过氧化 物酶和多酚氧化酶等的变化进行了测定，结果表明木质素沉积引起细胞壁加厚是 起到防卫尖孢镰刀菌4 号生理小种的重要途径( d ea s c e n s a o ，2 0 0 0 ) 。 乌干达农业研究机构与国际热带农业研究所致力寻找可以抗香蕉枯萎病的 基因，最终从甜椒中筛选出了这种基因。目前该基因已在烟草、西红柿、花椰菜、 兰花和水稻中用于抗病。实验室初步试验结果表明，转基因香蕉可以抗香蕉枯萎 病。( 夏竹，2 0 0 8 ) 中山大学从抗尖孢镰刀菌4 号生理小种的香蕉叶片中分离得 到2 个具有抗性的基因w n b l 和w s t ( c h e n ，2 0 0 7 ) 。中国热带农业科学院南亚热 带作物研究所对“金手指 香蕉抗枯萎病基因同源序列进行了克隆与分析，这些 基因结构域均为n b a r c ，属于1 1 0 1 3 t i r n b s 类候选抗病基基酸结构域 g l p l ( g l p l a l k v l ) 等4 个保守氨基酸基元( s u nd c q u a n c ta 1 ，2 0 0 9 ) 。这些基 因水平上的抗病机理研究为今后进行基因工程育种，培育抗枯萎病新品种提供了 一定的理论依据。 目前对枯萎病菌具体的侵染机理尚无明确报道。 ， 6 1 4 2 香蕉枯萎病抗病与防治措施研究进展 1 4 2 1 检疫防控措施 对用于组培苗生产的吸芽要严格检疫，杜绝在病区及其邻近蕉区选取。 二级蕉苗大棚应选在地势高、远离蕉类作物的地方，需用无香蕉枯萎病病菌的土 壤培养，用无污染的水灌溉，采用福尔马林、多菌灵等药剂消毒出入大棚的工具， 进出口设消毒间，严禁非蕉苗生产人员进入棚内。隔离病区，毁灭病株如在蕉 园发现病株后，应将病区封锁，禁止带病材料及农具转移到附近无病的蕉区。已 发病的植株，应掘起烧毁。病区的蕉园要用石灰或多菌灵等药剂对病株周围的土 壤进行消毒处理。病区采用水旱轮作、改种其他非蕉类作物或作其他用途。( 陈 敦忠等，2 0 0 5 ) 1 4 2 2 化学防治 i 在香蕉枯萎病的防治上化学药剂主要用于三个方面：一是作为表面消毒剂，j 对被病原菌污染的工具、机器和衣服进行消毒处理，控制病害传播到新的地区； 二是作为诱导剂，引发激活植物防御系统，从而使植株具有抵抗病原菌侵染的能 力，使香蕉植株获得抗性；三是直接作为杀真菌剂。 迄今为止，还没有经济有效的化学药剂防治香蕉镰刀菌枯萎病。国外对香蕉1 镰刀菌枯萎病的化学防治研究较少。在国内，已有人筛选出了一些对枯萎病菌毒 力较强的农药或其他有抑菌效果的土壤添加剂。范鸿雁等选用1 1 种药剂对香蕉 枯萎病菌进行室内毒力测定，结果表明：1 8 保治达乳油和o 1 3 m g l e c s o 抑菌 效果最好( 范鸿雁等，2 0 0 4 ) 。杀菌剂绿亨1 号+ 多菌灵、五氯硝基苯+ 多菌灵、 多菌灵+ 普克、敌克松+ 普克等药剂，对香蕉枯萎病菌的抑制效果最佳，持效期 长，可作为防治香蕉枯萎病的土壤消毒剂使用( 林兰稳等，2 0 0 3 ) 。 尾叶桉( e u c a l y t u su r o p h y l l a ) 叶片、稻( o r y z as a t i v a ) 壳、松( p i n u ss p ) 针和香蕉 ( m u s an a n a ) 茎叶4 种土壤添加物施于土壤对香蕉枯萎病菌具有明显的抑制效果， 而其中又以添加稻壳的处理对该茵的抑制效果最好。( 谢梅琼，2 0 0 8 ) 王忠全等 研究表明对于接种了香蕉枯萎病的香蕉苗，在降水量较大的情况下，如能在土壤 中混入吸有抗菌药剂的保水剂可以起到减少香蕉枯萎病发病率的效果，同时病情 也能得到较好的控制。保水剂发挥了缓释作用，同时还能防止药物的局部浓度过 高而造成植物根系损伤，最终使香蕉枯萎病得到较好的防治效果。( 王忠全，2 0 0 7 ) 杜志勇、聂盛仙等研究采用恶霉灵和改性石灰氮综合措施，即土壤病原菌清除+ 病原菌接力消毒+ 病原菌传播途径切除措施可以防治香蕉枯萎病，保障健康植株 的收获面积。提高香蕉产量，增加香蕉产值和经济效益；同时也不同程度的改善 7 了香蕉果实的外观、品质、营养品质和食用品质；使