（材料学专业论文）生物功能化梳状聚乙二醇改性组织工程材料表面的研究.pdf

浙江大学硕士学位论文 生物功能化梳状聚乙二醇改性组织工程材料表面的研究 本文首先利用端基转化的方法将梳状聚乙二醇( c p e g ) 和线形聚乙二醇( l p e g ) 的末端羟基转化为反应活性更高的醛基，通过化学接枝的方法对p e t 表面进行修 饰，并固定生物细胞整合素配体多肽片段r g d 和细胞营养物质赖氨酸，构建了模 拟细胞糖质衣结构的生物材料表面。利用傅立叶红外，衰减全反射红外光谱，x 一射 线光电子能谱，接触角，原子力显微镜对c p e g 在p e t 表面的修饰过程进行跟踪。 结果显示，醛基化的c p e g 能够有效的对p e t 表面进行修饰。 通过测定材料表面的细胞黏附率，增殖率，蛋白质含量，和细胞形貌来对比 c p e g 的接枝改性表面和l p e g 的接枝改性表面的细胞相容性。细胞培养的研究显 示，梳状p e g ( c p e g ) 比线形p e g ( l p e g ) 具有更好的抗特异粘附性，并可利用 更多的活性反应基团固定r g d ，有效模拟细胞膜中蛋白质的特异性功能，实现在非 特异性阻抗基础上的特异性诱导过程。这种反应性梳状p e g 构建的细胞糖质衣结构 的表面和细胞选择性生长因子结合，将为形成原位诱导特种细胞生长的表面提供了 良好的选择。 其次，本文利用梳状聚乙二醇( c p e g ) 的特殊结构和性能，通过简单的涂层技 术在p e t 材料表面形成了生物惰性涂层。对涂层的抗血小板性能和抗菌研究结果显 示，经过c p e g 涂层改性的材料表面几乎没有血小板的黏附，极大的提高了材料表面 的血液相容性。涂层技术构建的血液相容性稳定化表面也被证明具有装载药物的功 能，模型药物罗丹明在c p e g 涂层中能够持续稳定的释放，为介入材料如血液透析装 置和药物涂层支架提供了潜在的应用。 研究迸一步采用赖氨酸末端接枝的梳状聚乙二醇，采用简单的涂层技术构建了 模拟细胞糖质衣结构的功能化表面，内皮细胞培养的数据显示，该生物功能化梳状 聚乙二醇改性表面可有效促进内皮细胞的黏附和增殖，提高植入材料的生物相容性。 另外，本文基于梳状聚合物的表面自迁移理论，利用c p e g 的两亲性，用溶液 挥发成膜的方法，构建了原位自修饰聚乳酸一氨基酸杂化体表面。表面衰减全反射红 外光谱，x p s 和动态接触角对生物功能化的c p e g 在c p e g p l a 的共混体系中的表 面自迁移行为进行了研究。结果显示，c p e g 的p e g 侧链在p l a 内部，当置于水 环境中，由于p e g 亲水侧链和疏水性的p l a 的不相容而产生的推动力，p e g 侧链 浙江大学硕士学位论文 向自由能低的表面迁移。 细胞黏附率，增殖率，m t r 活性以及扫描电镜观察的研究结果显示，成骨细胞 在2 的c p e g 共混改性p l a 材料上的细胞黏附和增殖有所改善，而含量为8 和 1 5 的c p e g 在自迁移过程中由于其体积排斥效应阻抗了细胞的黏附和增殖。 关键词：组织工程：梳状n l - - n ；表面自迁移；仿生；细胞相容性；血液相容性； 原子转移自由基聚合( a t r p ) t i s u r f a c et a i l o r i n go fm a t e r i a l sf o rt b s u e e n g i n e e r i n g v i ab i o f u n c t i o n a lc o m b - s h a p e dp e g a b s t r a c t p o l y ( e t h y l e n e g l y c 0 1 ) o rp e gh a sb e e nw i d e l yi n v e s t i g a t e di nb i o m e d i c a l b i o l o g i c a la n d p h a r m a c e u t i c a lf i e l d sd u et oi t sw a t e rs o l u b i l i t y , l a c ko ft o x i c i t y , w e a ki m m u n o g e n i c i t y a n dr e a d yc l e a r a n c e t h eb r a n c h e dp e g sh a v eb e e nr e p o r t e dt oh a v em u c hb e t t e r p e r f o r m a n c ei np r e v e n t i n gn o n s p e c i f i ca d s o r p t i o na n dt h ea b i l i t yt om a i n t a i np r o t e i n n a t u r a t i o nt h a nt h a to f 吐l et r a d i t i o n a ll i n e a rp e gi nt e r m so fi t sc h e m i c a ls t a b i l i t y , i n e r t n e s sa n du o n i n t e r a c t i n gn a t u r ea n dh i g h e re n t r o p i cr e p u l s i o n t h ec o m b s h a p e dp e g a n db i o f u n c t i o n a lc o m b s h a p e dp e gw e r ee x p l o r e dt os l l r f a c et a i l o r i n go fm a t e r i a l sf o r t i s s u ee n g i n e e r i n g s u r f a e em o d i f i c a t i o no fp e tw i t hl y s i n e ，r g dt e t h e r e dc o m b 1 i k ep e gf o r p r o m o t i n gc y t o c o m p a t i b f l i t y an o v e lc o m b l i k eh y d r o x y l - c a p p e dp e g ( c p e g ) w a ss y n t h e s i z e dt h r o u g ha t o mt r a n s f e rr a d i c a lp o l y m e r i z a t i o n ( a t r p ) t h eh y d r o x y l e n dg r o u p sw a st r a n s f e r r e di n t or e a c t i v ea l d e h y d e ，w h i c hw a sf u r t h e rc o v a l e n tb o n dt o a m i n o l y z i e dp e ts u r f a c e l y s i n ea n dr g d w e r et h e ni m m o b i l i z e da tt h ee n do fp e g c h a i no fc o m b l i k ep e gv i ar e a c t i o nb e t w e e na l d e h y d eg r o u p sa n da m i n og r o u p s a sa c o n t r 0 1 l i n e a rp e g sw i t hd i f f e r e n tm o l e c u l ew e i g h t ( m w = 4 0 0 0a n d1 0 0 0 0 ) w e r ea l s o i n v e s t i g a t e d t h er e s u l t so fa t t e n u a t e dt o t a lr e f l e c t a n c e - f o u f i e rt r a n s f o r mi n f r a r e d ( a t r - f t i r ) ，x - r a yp h o t o e l e c l r o ns p e c t r o s c o p y ( x p s ) a n dc o n t a c ta n g l em e a s u r e m e n t s h o w e dt h a tt h ep e g sw e r es u c c e s s f u l l yi m m o b i l i z e do n t op e ts u b s t r a t e t h et w ok i n d o fp e g sw e r ec o m p a r e dr e g a r d i n gt h e i ra b i l i t yt op r e v e n tn o n - s p e c i f i ci n t e r a c t i o na n d p r o m o t ec y t o - c o m p a t i b i l i t y d l i et oi t sh i g h l yb r a n c h e d - a r ms t d l c t u r e t h ec o m b 1 i k ep e g m o d i f i e ds u r f a c ea c h i e y e ds t r o n g e re n l r o p i cr e p u l s i o nt h a nt h el i n e a rp e g m e a n w h i l e m o r el i g a n d sw e r et e t h e r e do n t ot h ec o m b 1 i k ep e gm o d i f i e ds u r f a c ew i t ht h eg r e a t a m o u n to fr e a c t i v ee n dg r o u p s ，w h i c hi n c r e a s e dc e l l p r o l i f e r a t i o n e v a l u a t e db y a d h e r e n c e ，p r o l i f e r a t i o n ，c e l lp r o t e i nc o n t e n t ，t h eg l y c o c a l y xm i m i c k i n gs u r f a c ed e s i g n e d b yc o m b - s h a p e dp e ge n d - t e t h e r e db yr g dp e p t i d ew a sp r o v e dt op r e s e n tn o n s p e c i f i c r e s i s t a n c ea n de x c e l l e n tc y t o c o m p a t i b i l i t ys i m u l t a n e o u s l y t h es u r f a c em o d i f i c a t i o no f r e a c t i v ec p e gw i l lp r o v i d eag o o ds e l e c t i o nt o 钯t h e rl i g a n d sa n dc e l li n d u c ef a c t o r so n b i o m a t e r i a ls u r f a c e s i 浙江大学硕士学位论文 s t a b l e c o a t i n g s u r f a c ef a b r i c a t e d b yc o m b - l i k ep e g 一讪ec o m b s h a p e d p o l y ( e t h y l e n eg l y c 0 1 ) w a se x p l o r e dt of o r mas t a b l ep o l y m e rc o a t i n go np e ts u b s t r a t e v i aas i m p l ec o a t i n gt e c h n o l o g y a t r - f h r ，x p s ，c o n t a c ta n g l em e a s u r e m e n ta n dw e i g h t d e c r e m e n tt e s t i n gp r o v e dt h es t a b l ec o a t i n gs u r f a c eo fc p e go np e tc o u l db ed e v e l o p e d v i aas i m p l ed i p - c o a t i n g p l a t e l e t ，b a c t e r i a , e n d o t h e l i a lc e l la d h e r e n c eo n t ol i n e a rp e g g r a f t e ds u r f a c ea n dc p e gc o a t e ds u r f a c ew a sc o m p a r e d c p e gc o a t e ds u r f a c er e a c t e d e x t r e m e l yw e a k l yw i t hb i o c o m p o n e n t ss u c ha sp r o t e i n sa n dp l a t e l e ta n ds h o w e dm u c h m o r ee x c e l l e n tt h r o m b u sr e s i s t a n c et h a nt h a to fo nm ef i n e a rp e gg r a f t e ds u r f a c e l i g a n d so ra m i n oa c i dw e r ea l s ot e t h e r e do nt h ec o m b - l i k ep e gt a i l o r i n gs u r f a c e ，w h i c h e n h a n c e dt h ec e l la d h e r e n c e p r o l i f e r a t i o na n dm t ta c t i v a t i o nc o m p a r e dw i t hl i n e a rp e g m o d i f i e ds u r f a c ei m m o b i l i z i n gb i o a c t i v eg r o u p s m e a n w h i l e ，t h ec o m b s h a p e dp e g c o a t e ds u r f a c ew a sa l s od e m o n s t r a t e dt oh a v et h e c a p a c i t yi nl o a d i n gd r u g sa n ds h o w e dac o n t r o n e dd r u gr e l e a s ep r o p e r t y , t h er d 6 g w a s u s e da sm o d e ld r u gt op r e p a r ed r u g - c o n t a i n i n gc o a t i n gd u et ot h en e t w o r ko ft h ec p e g d r u g - r e l e a s i n gc u r v ea l s od e m o n s t r a t e dt h es t a b i l i t yo ft h ec p e gc o a t i n g t h eu n i q u e p r o p e r t yo ft h ec o a t i n gp r o v i d e dt h ep o t e n t i a la p p l i c a t i o ni nt h ei m m o b i l i z a t i o na n d r e l e a s eo fa q u e o u sd r u g ，i n c l u d i n gp r o t e i na n dp e p t i d e ，w h i c hh a dap o t e n t i a la p p f i c a f i o n i nm e d i c a la p p a r a t u s e ss u c ha sh e m o d i a l y s i sa p p l i a n c ea n dd r u g d u r i n gs t e n t n s i t uc o i l s t r u e t i o n o f c y t o c o m p a t i b l e s u r f a c eo i lp l as u r f a c ev i a a m p h i p h i l e - a m i n oa c i d ( r g d ) h y b r i ds e l f - s e g r e g a t i o n s o l v e n t c a s tf i l m so f a m p h i p h i l i cc o m b - l i k ep o l y ( e t h y l e n eg l y c 0 1 ) a n dp o l y ( 1 a c t i ca c i d ) ( p l a ) h a v ea l s ob e e n i n v e s t i g a t e do v e raw i d er a n g eo fc o m p o s i t i o n s t h er e s u l t so fa t r - f t m ，x p sa n d d y n a m i cc o n t a c ta n g l ew e r eu t i l i z e dt od e m o n s t r a t et h es e l f - m i g r a t i n go fa m i n oa c i d t e 血e r e dc p e gs i d ec h a i n s t h eo s t e o b l a s tc y t o c o m p a t i b i f i t yt e s to ua m p h i p h i l i cc p e g a m i n o a c i dh y b r i d m o d i f i e dp d l l am e m b r a n e ss h o w e dt h a tt h ee e l la t t a c h m e n t 、g r o w t ha n da c t i v i t yw e r e p r o m o t e do np l am e m b r f i n e sm o d i f l e db y2 c p e g ，w h i l e 血er e s u l tw a so p p o s i t eo n c o n t e n to f8 a n d1 5 c p e gd u et ot h ed y n a m i cs e l f - m i g r a t i n go ft h em o l e c u l a rc h i n s k e y w o r d s ：t i s s u ee n g i n e e r i n g ；c o m b - l i k ep e g ；s u r f a c es e g r e g a t i o n ；b i o n f i m i c ； c y t o c o m p a t i b i l i t y ；b l o o dc o m p a t i b i l i t y ；a t o mt r a n s f e rr a d i c a lp o l y m e r i z a t i o n ( a t r p ) ； 浙江大学硕士学位论文 构建细胞友好界面以支持和促进细胞的生长，调控和诱导细胞的分 化是发袅组织工程的关犍问题之一表文致力于研究与开发新型实用的 聚合物生物材料表面改性技术，以构建细胞相容的生物材料表面，使聚 合物作为细胞和组织生长的支架材料在组织工程这一领域中得到更广 泛的应用此项工作的关键在于细胞相容性表函的构建，以及对所构建 表面的细胞相容性的评价 1 文献综述 1 1 组织工程 1 1 1 组织工程的定义 组织工程( t i s s u ee n g i n e e r i n g ) 一词最早是由美国国家科学基金会正式提出和 确定的。它是“应用细胞生物学和工程学的原理，研究开发修复、改善损伤组织结 构和功能的生物替代物的- - f 7 科学”一它暗示了组织工程的三个要素，使用活细胞， 结合天然或合成细胞外基质组分，制备可植入的部件来重塑或替代缺失的功能。其 基本的原理和方法是将体外培养扩增的正常组织细胞吸附于一种生物相容性良好并 可被机体吸收的生物材料上形成复合物，将细胞一生物材料复合物植入机体组织、器 官的病损部分，细胞在生物材料逐渐被机体降解吸收的过程中形成新的形态和功能 方面与相应器官、组织相一致的组织，而达到修复创伤和重建功能的目的。它是继 细胞生物学和分子生物学之后，生命科学发展史上的又一新的里程碑，标志着医学 将走出器官移植的范畴，步入制造组织和器官的新时代。同时，组织工程学作为一 门多学科交叉的边缘学科，涉及细胞生物学、工程学、材料学和医学等，将带动和 促进相关高技术领域的交叉、渗透和发展，并由此演化出新的高技术产业。 自从1 9 9 3 年美国麻省理工学院l a n g e rr 和哈佛大学v a c a n t ij p 在科学上 提出组织工程这一概念以来，组织工程这一学科已引起了各个领域的专家学者们的 关注，目前更是成为了继器官移植和外科重建手术这两大临床治疗手段后的第三大 医学治疗技术 1 。所谓组织工程，是指应用生命科学与工程学的原理和方法来没计、 组建、维护人体细胞和组织的生长，以恢复受损的组织或器官的功能 2 。这是- - f 7 新兴的交叉学科，高度依赖于材料学、化学、细胞生物学、分子生物学、基因工程、 力学和医学等学科的发展，又独立于各个学科之外成为一门独特的技术。它的耳的 是：利用人体活细胞在适宜的支架材料上生长成天然的组织和器官以替代人体内受 损和缺失的组织和器官。 浙江大学硕士学位论文 世界上患有组织缺损或器官衰竭的病人很多，据美国国家保健中心调查显示， 美国每年花在组织缺损和器官衰竭的治疗费用超过4 0 0 0 亿美元( 见表1 1 ) 3 。而 全球人口老龄化带来的老年病增多使这些问题更加突出。目前，治疗这类疾病的主 要方法是器官移植，但由于完好的组织或器官的来源严重不足，导致很多急需的病 人因得不到及时的治疗而死亡。用生物材料制成人工器官将是一条可以弥补器官来 源不足这一缺限的非常重要的途径。图1 - 2 所列是由生物材料制成的人体植入器官的 例子，包括牙齿、药物控释、人工皮肤、人工关节、心脏瓣膜【4 和人工血管等 5 ， 6 ： f i g u r e1 as e l e c t e ds e to fd i f f e r e n tm e d i c a li m p l a n t s 1 1 2 组织工程的研究内容 组织工程的研究主要集中于以下三个方面 7 ，8 】： 1 种子细胞的研究 种子细胞的培养是组织工程的基本要素，细胞主要来源于自体、同种异体、异 种组织细胞等。自体组织细胞应为首选。由于组织工程细胞培养多需要高浓度的细 胞接种，自体组织细胞存在数量上的局限性及长期传代后细胞功能老化的问题。目 前的研究多集中在以下几个方面： 1 ) 微载体等技术用于细胞的快速增殖【9 1 3 】。 2 ) 干细胞工程干细胞工程 1 4 1 8 】是利用现代生物医学和组织工程技术，通过对 间充质干细胞、胚胎干细胞、血管，造血干细胞、神经干细胞和皮肤、肌肉等前体细 胞进行体外分离与纯化、定向诱导分化、转基因及核移植、大量扩增和整合构建， 在体外重构人骨、软骨、肌肉、肌腱、瓣膜、脂肪、真皮、基质、神经、血管、皮 浙江大学硕士学位论文 肤、角膜以及造血和免疫等组织。它作为组织工程的“上游”研究对未来的组织器 官修复和替代具有极其重要的作用和深远的影响。其在组织器官的细胞来源、细胞 扩增与定向诱导分化、重构组织器官的种类、重构效率、重构组织器官的植入等方 面与传统的组织工程相比均存在着明显的不同和优势。 3 ) 采用各种生长因子和端粒酶调节与延缓细胞的老化 1 9 2 4 】。 4 ) 采用各种方法( 包括自身转化、化学、物理、病毒等方法) 诱导细胞发生转 化，使其倍增时间减少，永生化或生命期延长。要建立适于组织工程需要的种子细 胞，需要解决以下问题： 1 ) 增加细胞的增殖能力； 2 ) 延长细胞的生命期； 3 ) 提高细胞的分泌能力； 4 ) 优选不同组织来源的同一功能的最佳细胞； 5 ) 建立标准细胞系，使研究工作者有更好的可比性和科学性： 6 ) 同种异体与异种移植的免疫学； 7 ) 细胞与人工细胞外基质的相互作用及影响因素。 2 组织工程支架的研究 组织工程支架是细胞附着的基本框架和代谢场所，其形态和功能直接影响所构成 的组织形态和功能。 理想的组织工程支架应具有以下特点 2 5 】： 1 ) 生物相容性好，在体内不引起炎症反应和毒性反应； 2 ) 可吸收性，能彻底的被自身组织所替代； 3 ) 可塑性，可塑为任意的三维结构，植入后在体内仍可保持特定形状： 4 ) 表面化学特性和表面微结构利于细胞的粘附与生长； 5 ) 降解速率可根据不同细胞的组织再生速度而进行调整。 3 组织工程化组织 目前研究主要集中于人工软骨、骨、肌腱、皮肤、肝脏 2 6 3 6 等，其中软骨的 研究最为活跃，组织工程软骨的植入已由裸鼠向中大型哺乳动物过渡。以曹谊林教 授为首的上海第二医科大学附属第九人民医院组织工程研究中心和以杨志明教授为 首的四川大学华西医院修复重建外科研究室在组织工程化组织方面有非常深入的研 究。在裸鼠背上成功复制“人耳”的上海第二医科大学附属第九人民医院曹谊林教 授为首的课题组，在组织工程研究方面获得了重大突破。他们应用组织工程技术， 采用体外诱导骨髓基质干细胞分化成骨细胞，在有正常免疫功能的羊身上进行自体 大块颅骨缺损的复制修复，同时采用体外培养、扩增肌腱细胞、关节软骨细胞，用 浙江大学硕士学位论文 于复制修复鸡自体肌腱、猪关节软骨缺损，结果表明修复后的颅骨、肌腱、关节软 骨的生物力学指标接近正常组织。另外，他们还首次将动物体外大量扩增的雪旺氏 细胞接种在可降解的聚乙醇酸( p g a ) 纤维上，复制出了非管状、开放的、含有雪 旺氏细胞的“人工神经”，并用来桥接大鼠1 5 毫米坐骨神经缺损取得成功，打破了 医学界“神经桥接物一定是管状材料”的传统观念。实践结果表明：“鼠神经”具 有高度仿真性、三维结构合理性和组织相容性。“鼠神经”的复制成功，对今后神 经桥接物的研究具有重要的理论意义和临床应用价值。 1 2 生物材料 生物材料在组织工程中占据了重要地位 3 7 】。生物材料能够提供细胞粘附增殖 的场所，能够作为特定细胞的载体移植入体内，也可以作为药物载体激发局部区域 细胞的特异性功能等 3 8 ，3 9 1 。近几年生物材料在组织工程中的应用发展方向主要集 中在设计能与周围组织发生生物识别的生物模拟材料 3 0 - 4 2 。当生物材料移植入体 内，首先发生的是细胞外基质蛋白非特异性的吸附在表面上，然后细胞通过吸附的 蛋自与材料表面发生相互作用。因此生物模拟材料的设计主要尝试如何能消除这种 非特异性吸附，但是又能通过特异性作用诱导新组织的形成。另外不同的组织器官 具有不同生物环境以及不同的力学强度等性能。如皮肤是相对比较软的组织，它要 承受比较大的剪切应力。而骨则是相对较硬的组织，具有比较高的压缩强度，能支 撑躯干的重量。因此在设计生物材料的时候，就应根据不同组织的特点设计不同性 能的材料以更好的满足应用。 如果组织工程材料缺乏促进细胞生长和粘附的因子，就会不利于组织的再生。 细胞外基质对促进细胞活性具有很好的作用，细胞会通过细胞外基质的信号粘附到 表面上进行增殖分化，因此组织工程材料通常需要加入外源性的细胞外基质以促进 组织再生。同时这类材料要求具有一定的力学强度能支持组织再生以及提供组织细 胞生长分化的空间。一般来说，组织工程材料可以分为两类：天然材料和合成材料。 1 2 1 天然大分子材料 天然大分子材料，如胶原、明胶、透明质酸、壳聚糖和海藻酸钠及其衍生物， 其优点在于可以作为组织填充物而长期存在，有较好的组织相容性和亲和性，完整 的天然大分子材料内可能存在着某些复合生长因子，可诱导调节细胞的生长、繁殖、 分化等。但生物大分子材料一般由植物、动物或人体组织分离获得，价格昂贵而且 不同批次材料之间的性质还会有所差异，因此不适于大规模的批量生产。另外生物 大分子材料的物理机械性能较差，不能满足根据组织工程需要而对降解时间等性能 4 浙江大学硕士学位论文 进行设计的要求。 1 2 2 合成聚合物材料 o 十一h 2 l 手 p g a p l a o 书啊：c h 2 c h ：4 q - 和c 通c t b _ p c l p e g 辅l 扣c h ，c h 瘴和一h c h r 和i 凰c 珏士 0 ：8 p = b o h 十h 2 占叶 w a h m o t f i c s p o l v p h o s p h a z a l e h g u r e2 c h e m i c a ls t r u c t u r e so fp o l y ( g l y c o l i ca c i d ) ( p g a ) ，p o l y ( 1 a c t i ca c i d ) ( p l a ) ，p o l y ( 6 一h y d r o x b u t y r a t e ) ( p h b ) ，p o l y ( 一c a p r o l a c t o n e ) ( p c l ) ，p o l y ( e t h y l e n eg l y c 0 1 ) ( p e g ) a n d p o l y ( p h o s p h a z e n e ) 合成聚合物材料的共同特点是：具有生物相容性及可塑性。合成聚合物材料的 性质通常可以通过分子设计得到精确的控制，还可以通过大规模的生产获得性质相 同的材料。针对不同的组织工程要求，合成聚合物材料的物理和机械性能可以很容 易的通过分子结构的变化而调整。 可降解的合成聚合物材料尤其适合于组织工程的实际应用。这些材料在组织再 生功能完成之后，可以降解被人体吸收或排除体外，从而避免长期异物反应，并形 成新的自然组织。p l a 和p g a 等聚酯类材料是组织工程应用最为广泛的合成可降解 聚合物材料。也是被f d a 批准应用最早的材料之一。聚乳酸用作骨折内固定材料， 如骨夹板、骨螺钉，应用于修复骨组织损伤方面始于1 9 7 1 年，k u k a r n i 等人f 4 3 】将p l a 制成柱状固定装置，用于狗下颌骨骨折内固定，结果表明用该材料固定骨折，其愈 合率与不锈钢对照组相同，而且八个月后材料在骨折部位自行消失。c u t r i g h t 和 g e t t e r 4 4 等也相继进行了可吸收性生物材料骨折内固定的动物实验研究。但早期的 材料强度不够，应用受到了限制。1 9 8 7 年l e a n s l a g 4 5 等研制出高分子量的p l l a ， 其机械强度有了很大改善。聚乳酸作为骨折内固定材料的研究开始显示出广阔的前 。 呼拄 十 。墓匙 c l p r 卜 ，h 浙江大学硕士学位论文 景。同时，p l a 还广泛应用于其它生物医用领域，如手术缝线，药物控制释放载体， 骨科植入物等。 聚乙二醇在生物材料中也得到较广泛的应用，由于p e g 界面张力低，较多的用 于提高材料表面亲水性，减少材料与血液组分之间的相互作用，从而提高材料血液 相容性。p e o 是一种柔性高分子聚醚，在水中，( c h 2 c h 2 0 ) 链节可以和三个水分 子结合成水合聚氧乙烯链。在固体，水界面，聚氧乙烯可以通过和水分子之问强烈的 相互作用，向水相扩散，形成水合聚乙二醇层 8 1 。对p e g 抗凝血性，n a g a o k a 8 2 提出了以下假设：由于p e g 是一种高度亲水性和柔顺性的分子链，因而p e g 一方面 与水结合形成水合p e g 链，以位阻排斥作用阻碍血液组分的吸附。另一方面，水合 p e g 链的快速运动可影响血液材料界面的微区流动力学性质，即与柔性p e g 链 段结合的水微流阻止了蛋白质在材料表面的停滞、粘附与变性。除了p e g 以外，聚 丙稀酰胺、聚乙烯吡咯烷酮等也是常用的亲水性物质。 其它合成可降解聚合物材料还包括聚氨基酸，聚原酸酯等等。虽然合成聚合物 材料具有优异的物理机械性能，但相对天然大分子材料来说，其生物相容性远远不 能满足组织工程和其它生物医用领域飞速发展的需要，尤其是一般的合成聚合物材 料上缺乏可用于键接生物活性因子的官能团，这为其进一步生物相容性化增加了难 度。合成聚合物材料一般通过表面改性的方法在材料表面引入活性官能团，并可进 步固定生物活性因子，如蛋白质、多肽和多糖等。通过对组织工程材料的表面改 性，在保持材料本身所具有的物理机械性能的同时赋予材料表面良好的组织和细胞 相容性。材料的表面改性对组织工程的发展正起着越来越重要的作用。 不可降解的合成聚合物以聚对苯二甲酸乙二醇酯( p o l y e t h y l e n et e r e p h t h a l a t e ， 商品名d a c r o n ) 和膨胀性聚四氟乙烯( e p t f e ) 为代表，己被广泛的用作为血管替 代物，也是目前应用最广的血管移植假体。这两种材料与血清和血细胞的相互作用 时，有利于促进内皮细胞在表面的黏附，从而在表面形成一层内皮细胞层，内皮细 胞化的表面被证明有良好的血液相容性。但是，要获得完全无反应的移植物还极不 现实，原因是d a c r o n j 1 1 e p i f e 与血清和血细胞的长时间相互作用时易致血管栓塞。 1 3 生物材料的细胞相容性 1 3 1 细胞在生物材料表面的粘附机理 当生物材料与m 液、组织液或体液接触时，材料的表面会迅速地吸附层蛋白 质分子，然后才是细胞到达材料的表面。图3 描述了某一生物材料在植入体内时短 时间内所发生的一系列变化 4 6 。首先在材料表面发生非特异性蛋白吸附，这种非 浙江大学硕士学位论文 特异性吸附在一分钟内即可完成，而且所吸附蛋白种类可达2 0 0 多种。然后是大量 巨噬细胞将其包围并开始吞噬，如果它们不能将其消化，它们会发信号给成纤维细 胞并让其分泌胶原将植入体包裹，形成一层较厚的与材料无结合的包囊组织( 厚约 5 0 2 0 0 1 1 m ) ，这种组织容易形成炎症或成痛 4 7 】。所以这种非特异性蛋白吸附对材 料表面的组织工程化是非常不利的。 f i g u r e3s c h e m a t i c a l l yi l l u s t r a t i o no f t h ef o r e i g nb o d y r e a c t i o nw h e n s y n t h e t i cm a t e r i a li si m p l a n t e di n t oah i g h e ro r g a n i s m f i g u r e4 i n t e r a c t i o n sb e t w e e nc e i l sa n d e x t r a - c e l l u l a r m a t r i xv i ai n t e g r i n l i g a n di n t e r a c t i o n si nv i v o 浙江大学硕士学位论文 理想的生物材料表面与细胞的作用是通过细胞膜表面的受体( r e c e p t o r ) 和细 胞外与其相对应的信号物质分子一配体( l i g a n d ) 的作用，即通过“生物识别” ( b i o r e c o g n i t i o n ) 来实现细胞在生物材料表面的粘附。细胞的表面存在一类叫做整 合素( i n t e g r i n ) 的跨膜受体。在动物体内，细胞外基质( e x t r a c e l l u l a r m a t r i x ，e c m ) 中的胶原蛋白( c o u a g e n ) 、纤维粘连蛋白( f i b r o n e c t i n ，f n ) 、玻璃粘连蛋白( v i t r o n e e l i n ， v n ) ，层粘连蛋白( l a m i n i n ，l n ) 等都是整合素的配体，统称为粘附蛋白( a d h e s i o n p r o t e i n ) 。 细胞与细胞外基质之间的粘连就是靠细胞膜表面的整合素与粘附蛋白的相互作 用来实现的，图4 为整合素与细胞外基质蛋白作用的示意图 4 8 】。在体外，细胞与 生物材料表面之间的相互作用也遵循同样的机理。血液、组织液以及含有血清的培 养基中含有多种水溶性的粘附蛋白如f n 、v n 、l n 等。当生物材料与血液、组织液 阻及含有血清的培养基接触时，材料的表面会迅速地特异吸附一层蛋白质分子，然 后才是细胞到达材料的表面。细胞在生物材料表面的粘附是依靠细胞膜表面的整合 素与吸附于材料表面的粘附蛋白的相互作用来实现。由此可见，细胞膜表面的整合 索在细胞对生物材料表面的生物识别与粘附的过程中起着重要的作用。 1 3 2 生物材料细胞相容性的影响因素 由于人工合成的高分子材料虽然具有生物材料所必需的物理机械性能、化学稳 定性、无毒性、生物可降解性等性能，但由于其表面缺乏有效的与细胞作用的活性 位点，即细胞相容性不好而使其在组织工程中的应用受到很大限制。改善材料的细 胞相容性成为高分子用作生物医用材料的必要条件。表面化学改性保持材料的 本体性能，改善材料表面的细胞和组织相容性，是高分子用作生物医用材料的重要 途径之一。 生物材料与人体接触时，必须充分满足与生物体环境的相容性，生物体不发生 任何毒性、致敏、炎症、血栓等生物反应，而这些生物反应的发生与否都取决于材 料表面与生物体环境的相互作用。因此，控制和改善生物材料的表面性质，是改善 和促进材料表面与生物体之间的有利相互作用、抑制不利的相互作用的关键途径。 细胞与生物材料表面的接触及相互作用贯穿于从细胞粘附、迁移、生物材料支 架培养至移植体内生物降解并排出这一全过程，因此影响生物材料细胞相容性的因 素非常多，概括起来主要有：材料的表面物理形貌( t o p o g r a p h y ) 、表面亲疏水性 ( h y d r o p h i l i c i t y h y d r o p h o b i c i t y ) 、表面能( s u r f a c ee n e r g y ) 、表面电荷( s u r f a c e c h a r g e ) 、表面化学官能团( f u n c t i o n a lg r o u p ) 和生物活性因子( b i o a c f i v em o l e c u l e ) 及表面的微图案化( m i c r o p a t t e m i n g ) 等。 s 浙江大学硕士学位论文 1 3 2 1 生物材料的表面化学结构 生物材料表面化学结构是影响细胞相容性的一个重要因素。一般认为，砜基、 硫醚、醚键等对细胞生长影响不大；刚性结构如芳香聚醚类则不利于细胞的粘附； 氨基、亚氨基、羧基、酰氨基、磺酸基等基团可以促进细胞的粘刚和生长 4 9 。 将生物活性因子固定在材料表面是提高材料细胞相容性的最有效手段之一。细 胞外基质( e c m ) 及血清中含有许多对细胞的粘附、生长和增殖有促进作用的活性 因子。把这些活性因子化学固定于材料表面，或对材料进行预吸附处理，可明显地 改善细胞的粘附和生长。常见的活性因子包括各种贴壁因子如f n 、l n 、v n 、胶原、 多聚赖氨酸，各种生长因子如成纤维细胞生长因子( f g f ) 和促进骨和软骨组织形 成的骨形态发生蛋白( b m p ) 等。 分子生物学的研究表明，细胞膜表面的整合素受体与其配体如f n 、v n 、l n 和胶 原等的相互作用，实质上是与配体分子中的某些肽段如f n 中的r g d 序列和l n 中的 y i g s r 序列的相互作用。正是整合素分子与具有特定空间构象的短肽序列介导了细 胞与细胞、细胞与基质材料间的粘附、迁移和分化。由于整合素和蛋白质之间仅相 互作用于这些较小的位点，因此可以通过相同的合成线性或环状多肽模拟这些位点 调节细胞与基材之间的相互作用。粘附蛋白的作用不仅是与整合索键合，还要粘接 于其它细胞外基质蛋白质上形成共价或非共价的交联网络。 蛋白质配体所含有的有效氨基酸序列及其功能如表1 所示 5 0 6 1 】。 t a b l e1 c e l l b i n d i n gd o m a i ns e q u e n c eo f e x l r a c e l l u l