（材料学专业论文）矿物元素对丝素磷酸钙盐纳米复合材料生成的影响.pdf

浙江理工大学硕士学位论文 摘要 体内骨组织是受细胞高度调节控制生长而成的生物矿化组织，它主要由骨胶原纤维束 ( 约占3 0 ) 和磷酸钙结晶( 约占7 0 ) 组成，另外还包括钾、钠、镁、锌、硅等矿质 元素。本论文研究了碱金属离子和硅离子对桑蚕丝素磷酸钙复合材料形成的影响。有机质 构成骨的网状支架，赋予骨的弹性和韧性：而无机质决定骨骼的硬度及刚性特征。本论文 研究了碱金属离子和硅离子对桑蚕丝素磷酸钙复合材料形成的影响。 我们以碱金属离子诱导桑蚕丝素蛋白溶液发生构象转变，研究了蛋白质初始结构对其 矿化作用的影响。f t - i r 、x r d 和s e m 等测试结果显示，未经任何处理的桑蚕丝素蛋白溶 液矿化后形成片状复合物，其无机相以二水磷酸氢钙( d c p d ) 为主；而经过不同浓度k + 和n d 金属离子浓度( 金属离子质量与丝素质量比为2 ：1 ，2 ：1 0 ，2 ：1 0 0 ，2 ：1 0 0 0 ) 处理后， 桑蚕丝素溶液的结构由s i l ki ( 即无规线团螺旋构象) 向s i l ki i ( b 折叠片层) 发生转变， 矿化后的桑蚕丝素磷酸钙复合材料成纤维状，并相互结合呈现纳米级的三维多孔结构，其 无机相以热力学稳定的羟基磷灰石( h a ) 为主。可以认为，丝素蛋白结构转化为较伸展的 b 折叠后，使得更多的亲水基团暴露在外面，在丝素蛋白分子不断凝聚成纤过程中，h a 结晶快速生长并附着在这些微纤上，最终形成纤维状的丝素蛋白h a 复合物。另一方面， f t - i r 、x r d 和s e m 结果显示，当矿化溶液体系中硅离子的质量百分比低于0 0 0 9 时， 矿化复合材料中的丝素蛋白仍然以s i l ki 结构为主，而无机相以无定型的二水磷酸氢钙 ( d c p d ) 为主，复合物形态呈现片状结构；反之，丝素蛋白的结构转变为s i l k i i ，其无机 相以热力学稳定的羟基磷灰石( h a ) 为主，复合物形态呈现相互结合纳米级的纤维，形成 三维多孔结构：t g 分析结果显示，后者比前者具有更高的热稳定性和更好的储水能力。 表明复合材料中丝素蛋白具有较高的结晶度和取向度，与h a 更加紧密结合，形成三维多 孔结构。 上述结果表明，通过改变丝素蛋白和无机质溶液体系的微环境，可以有效地调控丝素 蛋白的生物矿化过程及其终产物的结构和性能，一方面为阐明蛋白质的生物矿化过程及其 调控机理提供了理论依据，同时也可以从矿化复合物的形成来反映这些微量元素可能对骨 组织形成的影响，为l 临床骨组织的修复提供一定的参考。 关键词：碱金属离子，硅离子，丝素，羟基磷灰石，生物矿化 浙江理工大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h eh u m a nb o n ei sab i o m i n e r a l i z e dt i s s u er e g u l a t e db yt h ec e l l s ，w h i c hi sc o n s t i t u t e dm a i n l y b yt y p eic o l l a g e n ( a r o u n d3 0 ) ，c a l c i u mp h o s p h a t ec r y s t a l s ( a r o u n d7 0 ) ，a n ds m a l la m o u n to f o t h e re l e m e n t s ，s u c h 够c a r b o n a t e ，s o d i u m , m a g n e s i u m ，p o t a s s i u m ，z i n c ，f l u o r i n e ，c h l o r i n ea n d s i l i c o n g e n e r a l l y , t h en e ts c a f f o l df o r m e db yt h eo r g a n i cp a r tc o n t r i b u t e st h eh u m a nb o n ew i t l l l l i g he l a s t i c i t ya n dt o u g h n e s s w h i l et h ei n o b a n i cp a r tf o r t h er i g i da n dh a r d n e s s i nt h i ss t u d y , w es t u d i e dt h ee f f e c to fa l k a l im e t a li o n sa n ds i l i c o ni o no nf o r m a t i o no fb o m b y xm o r is i l k f i b r o i n c a l c i u mp h o s p h a t ec o m p o s i t e s w es t u d i e dt h ee f f e c to fi n i t i a lb o m b y xm o r is i l lf i b r o i ns t r u c t u r eo nt h ep r o t e i n b i o m i n e r a l i z a t i o n , w h e r et h es t r u c t u r a lt r a n s i t i o nw a si n d u c e db yt h ea l k a l im e t a li o nt r e a t m e n t t h er e s u l t sf r o mx r d ，f t i ra n ds e ms h o w e dt h a tt h ea s - p r e p a r e dc o m p o s i t e sf o r m e df r o mt h e s i l kf i b r o i nw i t h o u tm e t a li o nt r e a t m e n th a dt h es h e e t - l i k em o r p h o l o g y , w h e r et h ep r e d o m i n a n t i n o r g a n i cp h a s ew a sd i c a l c i u mp h o s p h a t ed e h y d r a t e ( d c p d ) i nc o n t r a s t ，as t r u c t u r a lt r a n s i t i o n o c c u r r e di nt h es i l kf i b r o i n ，f r o mr a n d o mc o i l h e l i c a ls t r u c t u r et o1 3 - s h e e t ，a f t e rt h et r e a t m e n to f d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fk + a n dn a + m e t a li o n s ( t h em a s sr a t i o so fa l k a l ii o nt o s i l kf i b r o i n 2 ：1 ，2 ：1 0 ，2 ：1 0 0 ，2 ：1 0 0 0 ) t h ea s p r e p a r e dc o m p o s i t e sh a dt h ef i b e r r o d - l i k em o r p h o l o g yw i t h t h ep r e d o m i n a n ti n o r g a n i cp h a s eo fh y d r o x y a p a t i t e ( h a ) ，w h e r et h ef i b e r s r o d sb u n d l e dt o g e t h e r t of o r mt h en a n o - s i z e ，3 dp o r o u sn e t w o r ks t r u c t u r e i ti s t h o u g h tt h a tt h e r ew e r em o r e h y d r o p h i l i cg r o u p s 、i t l lo u t s i d ee x p o s u r eo nt h ee x t e n d e dp - s h e e tm o l e c u l a rc h a i n s ，w h e r eh a c r y s t a l sg r e ww i t ht h ea g g r e g a t i o no fs i l kf i b r o i n , a n df u m i e ra c c r e t e do n t ot h es i l kf i b r o i nf i b r i l s t h r o u g ht h ei n t e r a c t i o nw i mt h eh y d r o p h i l i cg r o u p s o nt h eo t h e rh a n d ，t h es i l kf i b r o i n c a l c i u mp h o s p h a t ec o m p o s i t e sw e r ep r e p a r e dw i t hd i f f e r e m c o n c e n t r a t i o n so ft h ea d d i t i o n a ls i l i c o ni o nt oa s s e s s t h ee f f e c to fs i l i c o no nt h eh a ( h y d r o x y a p a t i t e lf o r m a t i o ni nt h ec o m p o s i t e s f t i ra n dx r dr e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt h e i n o r g a n i cp h a s ei nt h ea s - p r e p a r e dc o m p o s i t ew e r ec o n s t i t u t e dm a i n l yb yt h ea m o r p h o u sd c p d ( d i c a l c i u mp h o s p h a t ed e h y d r a t e ) w h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fs i l i c o ni o nw a sl e s st h a n0 0 0 9 a n dt h es i l kf i b r o i np r o t e i nw a si n s i l kis t r u c t u r ef o r m i nc o n t r a s t ，h aw a sf o r m e da st h e 浙江理工大学硕士学位论文 p r e d o m i n a n t o n ei nt h ea s - p r e p a r e dc o m p o s i t ew i t l lt h ec o n c e n t r a t i o n so fs i l i c o ni o nh i g h e rt h a n 0 0 0 9 ，a c c o m p a n i e dw i t hac o n f o r m a t i o n a lt r a n s i t i o ni nt h eo r g a n i cp h a s eo fs i l kf i b r o i n p r o t e i nf r o mr a n d o m c o i lo fs i l kf i b r o i ns o l u t i o nb yd i a l y s i st os i l ki i ，s e mi m a g e ss h o w e dt h e d i f f e r e n tm o r p h o l o g i e s 丽t l lt h es a m p l e s ，i e ，s h e e t - l i k ec r y s t a l so ft h ec o n c e n t r a t i o n so fs i l i c o n i o nl e s st h a n0 0 0 9 a n dr o d l i k eb u n d l e so ft b ec o n c e n t r a t i o n so fs i l i c o ni o nh i i g ht h a n0 0 0 9 a n dt h er o d l i k eb u n d l e sn e t w o r kw e r ec o n n e c t e dt o g e t h e rt of o r mt h e3 dp o r o u ss t r u c t u r e t g c u r v e si n d i c a t e dt h a tt h ec o n c e n t r a t i o n so fs i l i c o ni o nm o r et h a no 0 0 9 h a dt h eh i 【g h e rt h e r m a l s t a b i l i t yt h a no t h e r sb e c a u s eo ft h es i l kf i b r o i nh i 曲m o l e c u l a ro r i e n t a t i o na n dc r y s t a l l i n i t y ， s t r o n g e rb i n g d i n gf o r c e 谢t 1 1i n o r g a n i cs a l t sa n dh i 曲w a t e r - h o l d i n gc a p a c i t yd u et ot h ep o r o u s m i c r o s t r u c t u r e t h e s er e s u l t so b t a i n e di nt h i sr e s e a r c hs u g g e s tt h a ti ti sp o s s i b l et or e g u l a t et h es i l kf i b r o i n b i o m i n e m l i z a t i o na n dt h es t r u c t u r ea n dp r o p e r t i e so ft h ec o m p o s i t et h r o u g ht h ec h a n g e so ft h e c o n d i t i o n sa n d o rc o n t e n t so ft h es i l kf i b r o i n i n o r g a n i es o l u t i o ns y s t e m i tm a yp r o v i d es o m e i n f o r m a t i o no nt h ep r o t e i nb i o m i n e r a l i z a t i o na n di t sb i o - m o l e c u l a rc o n t r 0 1 m o r e o v e r ，t h er e s u l t s m a y r e f l e c tt h er o l eo f t h e s et r a c ee l e m e n t st ot h eb o n ef o r m a t i o n ，w h i c ha r es o m e w h a ti m p o r t a n t f o rt h eb o n er e p a i r i n go nc l i n i c a lp r a c t i c e k e y w o r d s ：a l k a l im e t a li o n ；s i l i c o n ；s i l kf i b r o i n ；h y d r o x y a p a t i t e ；b i o m i n e r a l i z a t i o n i i i 渐江蓬工大学学控论文愿剑性声鞲 夸人卸章声盟：零垮守学术道德，誊商严谨学风a 所呈交的学位论文，毒 本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已瞬确注职和 引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及 成果的内容。论文为本入亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声 孵的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：。肠匆加 ， 日期：矽年，崩矿自 浙江理工大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留 并商匡家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阕。 本人授权浙江理工大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口，在年解密后适用本版权书。 本学位论文属于 不保密日。 学位论文作者签名： ，j ， 胁阳 日期：w 年，2 ，月，d 日 指导教师签名：_ 务它细 日期：问年，溯厂一 浙江理工大学硕士学位论文 第一章绪论 骨组织是受细胞高度调节控制生长而成的生物矿化组织，主要含有有机成分胶原i 型 蛋白和羟基磷灰石以及微量矿物元素如金属离子、硅离子掣卜钔。近年来，对骨生物矿化过 程中的机理调控、基因控制机理的研究一直是骨组织疾病治疗领域的重要课题，在组织工 程技术的发展最有可能在骨组织领域取得突破的情况下，其重要性显得更加突出5 1 。 1 1 前言 组织工程学是一门融合了材料科学、生物技术和生命科学等的最新进展丽诞生的新兴 交叉学科，它应用生命科学和工程学的原理与技术，设计与制造生物代用品，以修复或重 建组织器官的结构，维持或改善组织器官的功能。组织工程学的兴起为解决临床治疗中器 官移植的供体缺乏问题带来了希望。其中，硬组织( 骨、牙) 替代材料是生物医学材料中 的一大类，具有量大面广的特点。美国国内每年涉及骨置换的外科治疗已超过1 0 0 万人次， 而对我国这样一个人口众多的发展中国家，潜在的巨大需求是不言而喻的。 自然界中骨、贝壳、珍珠、蛋壳以及磁性的铁蛋白矿化等都是自组装生物矿化的结果。 自组装生物矿化是一个天然存在的高度控制过程，该过程受到基因、细胞和细胞外基质调 制，在分子水平到介观水平上可对晶体性质、大小、结构、位向和排列实现精确控制和组 装。理解这一复杂系统中生物结构的高度选择性控制、以及有机基质与无机矿物的复合机 制是研究矿化自组装的关键问题。对这一生物组装过程的充分认识，可以使人们在分子层 次上设计与合成具有特定结构和功能的纳米器件和医用生物材料，为特定疾病的治疗提供 依据。 天然硬组织中存在钾、钠、镁、硅等微量矿物元素，其在矿化过程中对硬组织的形成 起到了一定作用。特别是硅离子，动物实验证明，硅与骨骼的成长及其结构的形成有关， 硅摄入量的不足，可使骨骼含硅量减少；补硅后骨骼中的硅含量显著增加，骨生成旺盛的 地方有硅渗入。在骨化过程中，硅与钙的含量正相关。缺硅后可使骨骼异常、畸形，牙齿 及釉质发育不良。c a d s l e 于1 9 7 0 年通过体内和体外的研究表明，硅对骨骼的形成和矿化 有重要的作用【“1 。电子探针分析表明，硅富集中于年幼骨狭窄生长活跃地区，该处与骨成 熟有关；年幼大鼠长骨与骨样组织间硅含量为0 。0 l 0 0 6 ，越接近骨小梁其含量越高， 浙江理工大学硕士学位论文 在骨小梁边缘处已高达o 1 2 。 1 2 丝素的结构与性质 桑蚕是人类最早驯化饲养的昆虫，蚕丝也是人类利用最早的天然纤维之一，其蛋白质 是迄今为止利用最早、研究最广泛的天然纤维蛋白。蚕丝中的丝素是一种天然蛋白质，除 了作为传统的纺织原料外，由于其良好的生物相容性，被广泛研究并用作生物医用材料， 与现有的其它生物医用材料相比，利用丝素蛋白可避免复杂、繁琐的合成工艺，其提纯工 艺也比较简便；且丝素蛋白能以多种形式被再生，根据其制备条件和应用领域可加工成溶 液、粉末、薄膜和纤维等不同的形状【1 6 , 3 0 - 3 7 1 。 1 2 1 丝素的组成及其二级结构 蚕丝蛋白是由丝素蛋白( s i l k f i b r o i n ，简称s f ) 和丝胶蛋白( s e r i c i n ) 两部分组成， 亲水性的丝胶包覆在丝素蛋白的外部，约占总重量的2 5 ，而疏水性的丝素蛋白占7 0 ， 此外，蚕丝还含有5 左右的杂质【3 8 1 。丝素蛋白中包含2 0 种氨基酸，其中甘氨酸( g t y ) 、 丙氨酸( a l a ) 约占总组成的7 6 ，其它几种主要氨基酸的含量分别为：丝氨酸( s e r ) 1 2 1 ，酪氨酸( t y r ) 5 3 和缬氨酸( v a l ) 1 8 。丝素蛋白中g l y ，a l a ，s e r 三者的摩尔比 接近3 ：2 ：l ，并且按一定的序列结构排列成较为规整的链段，如( g a g a g s ) n ，这些链 段大多位于丝素蛋白的结晶区域；而带有较大侧基的苯丙氨酸( p h e ) 、酪氨酸( t y r ) 、色 氨酸( x r p ) 等主要存在于非晶区域口9 4 钔。 丝胶可以通过脱胶过程与丝素蛋白分离【4 5 1 ，一般认为它不具有力学强度，对蚕丝的力 学性能有最直接贡献的是由丝素蛋白所形成的高级结构：丝素蛋白以反平行b 一折叠链 ( 1 3 一s h e e t ) 为基础嗍，形成直径大约为1 0 n m 的微纤维，无数微纤维密结成直径大约为l t t m 的细纤维，大约1 0 0 根细纤维沿长轴排列构成直径大约为1 0 1 8 t t m 的单纤维，即丝素蛋 白纤维【卅。 丝素的肽链堆砌排列形成丝素的二级结构，在这些结构中包括两种晶体结构h 8 ，4 9 】。清 水正德【5o 】首先发现桑蚕丝中有两种结晶形态：a 型和b 型。为了区别于分子链构象，这两 种结晶有被称为s i l ki ( 类d 螺旋) 结构和s i l ki i ( 反平行b 折叠) 。 s i l ki i 型结构可用“丙氨酸一甘氨酸”重复单元结构表示，形成了2 i 对称的结构。分 子链呈反方向平行并列，在a 轴方向由氢键相连，形成和a 轴相平行的反向平行折叠片状 结构，这种结构是热力学最稳定的( 如图1 1 所示) 。 浙江理工大学硕士学位论文 f i g u r e1 1a n t i - p a r a l l e l p - s h e e ts t r u c t u r eo f s f l o t z 等多位研究者【“1 提出s i l ki 型结晶结构中分子链模型。在模型中，重复单元是二 肽，整个分子链呈曲轴型，其中丙氨酸呈b 一平行折叠结构，大致与纤维轴平行，甘氨酸呈洳 螺旋结构，大致与纤维轴垂直。当洳螺旋部分伸展开来，氢键被破坏而形成8 折叠构象时， 就实现了s i l ki 型结晶结构向s i l ki i 型的结晶结构转变。s i l ki 型结晶结构是不稳定的，在 剪切热处理或极性溶剂等作用下会变为热力学稳定的s i l ki i 型结晶结构。 具有s i l ki 型结构的蚕丝蛋白可以从蚕丝腺体中取出后，在没有机械力作用下于空气 中干燥得到；也可以用盐溶液把脱胶丝溶解后透析得到。干燥过程中任何机械震动都会导 致s i l ki 结构转为s i l ki i 结构，也可通过改变温度、溶剂极性( 如甲醇，乙醇，甲酸，二 甲基甲酰胺等) 、溶液p n 值、电场和应力( 剪切和拉伸应力) 作用等条件来实现结构的转 变p 2 5 5 】。由于s i l ki 型结构对于机械力的敏感性以及易向s i l ki i 转变的倾向性，使得对其 结构的研究十分困难。 m a r s h 等【5 6 】利用x 一射线衍射首次详细地分析了丝素蛋白的s i l ki i 结构，认为s i l ki i 型的晶体结构中，丝素肽链是按反平行b 折叠构象形成的层状结构，其晶胞属于单斜晶系。 在丝素蛋白纤维中，结晶部分占5 0 6 0 p ”。 丝素蛋白的聚集态结构被认为是由结晶态和无定形态两大部分组成。在具有s i l ki i 结 晶结构的丝素中，肽链链段排列较为整齐，相邻链段之间的氢键和分子间引力使它们结合 得相当紧密，抵抗外力拉伸的能力强，在水中仅膨胀而不溶解，但可在一些特殊的中性盐 中发生无限膨胀( 溶解) 形成粘稠液体，透析除盐可得到丝素蛋白的纯溶液 3 2 , 5 8 删。而无 定形丝素中链段的排列不整齐，链段之间的结合力较弱，易溶于水，柔软度高，抵抗外力 拉伸的能力弱，吸湿性强，对酸、碱、盐、酶和热的抵抗力较弱t 6 5 。丝素蛋自的s i l ki 和 s i l ki i 两种结晶结构均能从溶解状态的丝中获得，获得哪种结构取决于结晶条件。 浙江理工大学硕士学位论文 1 2 2 丝素的生物相容性及其它优良特性 丝素蛋白( s i l kf i b r o i n ，简称s f ) ，由蚕茧缫丝脱胶而得到，来源丰富，是一种无生 理活性的天然结构性蛋白，主要由三种简单的氨基酸：甘氨酸、丙氮酸和丝氨酸组成，它 们占蛋白总量的大概8 5 。丝纤维用于临床上，如用作手术缝合线等已经有几十年的历史。 在多年的应用中，逐渐发现丝纤维和丝素蛋白有更多的潜力，可应用于临床修复和组织工 程支架及作为改性材料，因为它们有着很多优异的条件，例如：丝纤维容易大量得到，而 将丝纤维直接溶在中性盐溶液中( 例如氯化钙溶液) 后，经透析就可以得到纯的丝素蛋白 永溶液；丝素蛋白有良好的生物相容性，无毒，无刺激性；由丝引起的炎症反应不会比一 般用于缝合线的材料所引起的大。与此同时，丝的降解性也引起了人们关注。m i n o u r a 等吲 认为，丝素蛋白是可部分生物降解的，其降解产物本身不仅对组织无毒副作用，还对如皮 肤、牙周组织等有营养与修复的作用。一般认为，在体内丝素蛋白会被缓慢降解并吸收， 吸收速率受位置、力学环境以及其它多种因素的影响。有研究同时也发现 6 7 - 7 3 ，通过制作 不同结构形态的丝蛋白材料可以调节其降解速率。因此，丝素蛋白在生物医用材料领域得 到了日益广泛的研究与应用，而将其用于细胞培养的基质，或对一些生物高分子进行修饰， 改善它们的生物性能，使其适用于组织工程，更是近年来丝素蛋白的应用研究的热点 【6 7 ，伟7 6 】。 t a b l e l 1 c o m p a r i s o no f m e t a le l e m e n t c o n t e n t ( p g g ) i ns i l k d o p ea n dc o c o o ns i l k o f b o m b y x m o r i l i l k w o r m i 竹l 浙江理工大学硕士学位论文 1 2 3 金属离子对丝素结构的影响 家蚕腺体和纤维中含有多种微量金属，如钾、钠、镁、钙、铜等离子，具体含量见表 1 1 【彻。金属离子在蚕吐丝过程中的作用也一直是一个人们关心的话题。v i n e y 等t 7 8 】根据电 感耦合等离子体( i c p m s ) 技术测得了c a 2 + 的增加能加速o 折叠的形成。陈新等册研究发 现，m 矿+ 、c u 2 + 和z n 2 + 能促进丝素构象向p 折叠转变，c a 2 + 能促进其形成稳定的网状结构( 即 形成凝胶) ，k + 和n a + 能破坏这种网状结构的形成。 1 3 天然骨组织中微量矿物元素的作用 一块完整的活骨组织是由骨膜、骨质和骨髓3 大基本结构和分布于其上的血管和神经所 组成。骨质又称骨基质，实际上就是钙化后的细胞间质，由有机质和无机质两种成分构成。 成年人的有机质占3 0 ，主要是骨胶原纤维束，成分为i 型胶原蛋白和极少量的v 型胶原蛋 白，它作为骨的网状支架，赋予骨的弹性和韧性：无机质约占密质骨干重的7 5 ，决定骨骼 的硬度及刚性特征，其成分主要是由钙、磷酸根和羟基结合而成的羟基磷灰石结晶 ( c a l o ( p 0 4 ) 6 ( o 邱2 ，简称h a ) ，除了钙、磷等主要离子外，还含有大量的钠、镁、碳酸根， 柠檬酸根离子和硅离子等 7 9 1 。n a + 、c 0 3 2 和s i 0 3 厶能够分别替换羟基磷灰石结晶晶格中的c a 2 + 或p 0 3 “，也能被吸附于晶格表面以取代c a 2 + 或掺入其水化壳中。 1 3 1 磷酸钙有机复合材料研究现状 纯h a 在临床上的应用非常广泛，由于其良好的生物相容性和生物活性使其在植入体内 后，在植入体周围有大量骨细胞粘附生长，新骨通过化学键合直接与h a 材料相结合，两者 的界面物生成纤维组织层；在多孔结构的磷酸钙生物材料中的孔隙中能形成新的骨组织 s o , s t 。但是最大的局限在于h a 的脆性，即断裂韧性较低，限制了h a 生物材料在受力部位的 应用。 为了增加其韧性，国内外不少专家学者通过加入有机相，模拟天然骨组织的成分，来克 服无机磷酸钙材料缺乏韧性的缺点。 早在2 0 t 岘8 0 年代，b o n f i e l d 8 2 】等人就提出了采用生物陶瓷增强有机材料这一概念。将 各种微粒生物陶瓷颗粒作为一种增强相，添加到具有生物相容性和生物稳定性的有机相中， 制备一种由良好生物活性骨组织替换材料【珏s 4 1 。而h a 增强骨基质制备复合材料具有良好的 生物活性和生物降解性，可用于硬组织的替换和再生【8 5 】。有研究报道【8 6 】，h a 与c h i t o s a n 复 5 浙江理工大学硕士学位论文 合后得到的复合材料在生物应用中能表现出良好的生物医学性能。h a 、c s 和p m m a 混合制 备的复合材料，已经应用于外科整形，如骨的填充和小部位骨的替换1 8 7 , s s l 。而以b t c p g e l a t i n 复合制备的材料，以甲醛为交联剂【9 9 1 ，可以获得较好力学性能的骨替换材料。通 过热压的方式嗍将碳酸钙粉末和聚乙烯粉末( 质量比3 ：1 ) 混合后制备的复合材料，在模拟 体液中浸泡3 h ，就会有大量的h a 生成，当浸泡时间超过3 天后，在其表面沉积5 1 5 p m 厚度 的类磷灰石层。实验结果表明，这种材料有良好的生物吸收性和骨诱导性。 1 。3 2 不同金属离子对天然骨组织的影响 镁是骨组织成分之一，它对骨的形成起着很重要的作用。如果骨组织中羟基磷灰石中 的镁离子被置换后会失去骨中的结晶构造，导致骨质疏松。钾和镁，参与了机体蛋白质和 糖的代谢，钾离子影响神经系统活动，参与维持心、肾及肌肉的正常功能的活动；镁离子 是维持骨胳发育所必需。缺乏钾、镁离子时，动物会出现神经过敏，肌痉挛、惊厥等症状。 过量的钠，却是导致高血压、心脏病甚至引发中风的危险因素。而且高盐食物还会增加胃 癌发生率，损坏肾脏，也会促使骨钙质流失，增加骨质疏松症发生率。但骨钙流入血液后 便尿钙增加，钙在尿路里堆积，容易引起尿路的结石。曲耀华等唧j 经过研究发现，钾离子 通道的活动与大鼠成骨样肉瘤的d n a 合成和细胞增殖活动密切相关。 1 。3 。3 硅离子对骨生长的作用 硅在动物体内的主要存在形式为水溶性水合二氧化硅( 即硅酸) 。它对于动物体的作 用通常表现为惰性无害。就人体而言，7 0 年代前硅曾被认为是人体的“无害”或“非必需” 元素。但后来的研究工作表明，硅在人体内的积极作用不容忽视。特别是从c a r l i s l e 哪等于 1 9 世纪7 0 年代发现硅是鸡和大鼠骨组织生长和发育必需微量元素后，硅对生命过程的作用 及与动物体健康、疾病的关系才日益引起人们重视。7 0 年代中期起，硅与氟、镍、锡、硒 及钒相继在5 年内被确定为人体所“必需”元素。已经发现，硅与动物体内粘多糖的合成 密切相关，硫酸软骨素a 、b 、c 都含有硅。动物实验表明【3 1 ，硅与骨骼的生长及结构有关， 摄入不足，可使骨骼含硅量减少：补硅后骨骼中的硅含量显著增加，骨生成旺盛的地方有 硅渗入。在骨化过程中，硅与钙的含量正相关。缺硅后可使骨骼异常、畸形，牙齿及釉质 发育不良。动物实验表明【3 1 ，软骨正常生长需要硅，尤其是胚胎时期对硅的需求特别明显。 c a r i s l e l 2 l 雕j 研究表明，硅对骨骼的形成和矿化有着重要的作用。电子微探针表明硅置于活 性生长区域，如年幼骨狭窄生长活跃地区，该处与骨成熟有关。年幼大鼠长骨与骨样组织 浙江理工大学硕士学位论文 间硅含量为0 o l o 0 6 ，越接近骨小梁其含量越高，在骨小梁边缘处已高达0 1 2 。在骨 样组织与骨小梁交界处和血管中存在硅这些事实，都使人们认识到了硅参与骨钙化过程。 同时，人们在研究骨修复材料过程中发现，含硅的h a 比纯的h a 活性更强。p a t e l 等陋】 将含硅的h a ( 硅的质量分数0 8 ) 和纯的h a 分别植入白鼠的体内2 3 天后发现，含硅的h a 和纯的h a 植入体表面均有新骨生成，但通过对植入体中骨组织生长区域定量评价显示，含 硅的h a 植入体中骨组织生长区域明显大于h a 植入体骨组织生长区域，这些事实说明硅掺 入h a 的结构中可以显著增强羟基磷灰石的早期体内生物活性。 1 4 本课题的主要研究目的和研究内容 1 4 1 本课题的主要研究目的 生物骨组织中主要成分是胶原蛋白和羟基磷灰石，除此之外还有一些微量矿物元素， 如金属离子，硅离子等，所以体外模拟天然骨组织成分及其结构，研究这些矿物元素对其 形成机理的影响，从而获得具有较好生物活性和相容性的骨组织修复材料，对进一步应用 于硬骨组织修复材料的制备具有重要的理论价值。本课题研究的主要目的是研究不同矿物 元素对丝素磷酸钙复合材料形成的影响及其机理，为进一步体外模拟天然硬骨材料提供重 要的理论指导。 1 4 2 本课题的主要研究内容 1 碱金属离子对丝素，磷酸钙盐复合材料生成的影响。采用常见碱金属离子( 钾，钠) 对丝素蛋白处理后，再加入钙离子、磷酸根离子进行矿化，从而形成矿化复合材料，通过 对金属离子种类、浓度或其它工艺条件的改变，来探讨实验条件对丝素，磷酸钙复合材料生 成的影响及其机理。 2 不同硅离子含量对丝素磷酸钙盐复合材料生成的影响。通过在丝素磷酸钙盐体系 中加入不同量的水溶性硅酸盐，研究硅酸盐对矿化复合材料形成的影响，从而对硅离子在 该体系中的作用及其机理有较为全面的认识。 7 浙江理工大学硕士学位论文 第二章碱金属离子对丝素磷酸钙盐矿化复合材料形成的影响 由于丝素蛋白( s f ) 和h a 都具有良好的生物相容性，因此如果能控制丝素羟基磷灰 石复合材料形成，就可以既保持丝素良好的生物相容性，同时也能够通过加入丝素来提高 复合材料的韧性，克服h a 性脆的缺点。 文献报道的s f h a 复合材料制备的方法大体有两种，一种是湿法合成，即在丝素水溶 液中滴自b c a 2 + 、p q 4 3 。离子，形成s f 和h a 的共沉淀，然后干燥成粉末状，这种方法也被称 为原位合成；第二种方法是在丝素溶液中加入h a 粉末，充分均匀混合后，干燥得到复合材 料。第一种方法采用的是液相反应，在液体状态下，c a 2 + 和p 0 4 结合形成的磷酸钙颗粒尺 寸小，一般能达到纳米级，由于丝素也呈溶液状态，复合材料中两相分布较均匀，不出现 明显的两相分离，但由于滴加的是c a 2 + f g p 0 4 3 - 离予，所以形成的磷酸钙有多种可能，需要 在一定的条件下才能获得h a ，所以本课题着重研究了碱金属离予( 如k + 、n a + 等) 对s f h a 复合材料形成的影响，因为一方面这些金属离子能够促进丝素蛋白结构的变化；另一方面， 天然的骨组织中本身就含有这些金属元素，并且作为要进一步应用于医用替代材料，研究 其在体内微环境中的作用也显得很有必要。 2 1 实验部分 2 1 1 实验原料及主要仪器设备 实验原料：桑蚕茧由湖州市农业科学研究院提供；蚕丝脱胶用n a 2 c 0 3 选用奥妙牌肥皂； 透析袋截留分子量为1 2 0 0 0 1 4 0 0 0 ( 国药集团化学试剂有限公司生产) ；b r a d f o r d 蛋白浓度 测定试剂盒购自碧云天公司；所用其它主要化学试剂为：化学纯溴化锂( l i b r h 2 0 ) ( 国 药集团化学试剂有限公司生产) 、分析纯n a o h ( 上海三鹰化学试剂有限公司生产) ，分 析纯k c i ( c h e m s o n i c 生产) ，分析纯无水c a c l 2 ( c h e m s o n i c 生产) ，分析纯n a c l ( 上 海试剂总厂生产) ，分析纯m g c l 2 6 h 2 0 ( 广东汕头市西陇化工厂生产) 。 主要仪器设备有：7 8 h w 3 恒温磁力搅拌器( 杭州仪表电机有限公司) ，s a r t o r i u s 普及 型p h 计，高速冷冻离心机( b e c k m a na v a n t ij - 2 5 ) ，台式冷冻离心机( s i g m a3 k 1 8 ) ， d u 紫外分光光度计( b e c k m a nd u 5 3 0 ) ，m i l i p o r e 纯水仪( m i l l i p o r em i l l i qb i o c e l ) 。 浙江理工大学硕士学位论文 2 1 2 实验方法及样品制备 f 电2 1f l o wc h a r to f s a m p l e sp r e p a r a t i o n 整个样品制备过程如图2 1 所示。 纯丝素溶液的制备：用0 5 肥皂水溶液精练桑蚕茧丝，浴比为l ：5 0 ，每次煮沸3 0 m i n ， 换成蒸馏水同样煮沸3 0 m i n ，重复上述步骤3 次后用蒸馏水充分洗净，自然晾干，得到纯丝 素纤维。用9m o l ll i b r 水溶液溶解丝素纤维，溶解温度为4 0 c ，时间为1 2 h 。待丝素完全 溶解后，将丝素溶液注入透析袋( 截留分子量为1 2 0 0 0 1 4 0 0 0 ) ，在蒸馏水中透析3 d ，每天 调换蒸馏水。将透析后的溶液风干浓缩，得到纯丝素蛋白浓缩水溶液。纯丝素蛋白溶液的 浓度用b r a d f o r d 法测定( 重量体积比表示，e d m l ，表示为w v ) 。 本课题中丝素磷酸钙复合材料的制备采用液相沉积法，将浓度为1 0 的纯丝素溶液 在透析袋中浸泡在含有不同k + 、n a + 浓度的水溶液中2 4 h ，k + 、n a * 离子与纯丝素质量比分 别为1 ：5 0 0 、1 ：5 0 、l ：5 、1 ：0 5 ( 样品简称为s f 5 0 0 k n a l ，s f 5 0 k n a l ，s f 5 k n a l ，s f 0 5 k n a l ， 未经金属离子处理的样品简称s f k n a o ) ，然后在丝素溶液中分别添加相同量的0 2m o l l c a c l 2 ，0 2m o l ln a 2 h p 0 4 进行生物矿化，保持c a p 摩尔比为2 ：1 ，添加的过程中不断搅拌 9 浙江理工大学硕士学位论文 并且保持相同的添加速度，全部添加完毕后，调节p h 值到8 9 ，静置一段时间后离心得到 沉淀，用蒸馏永清洗除去多余的盐，干燥后即得到粉末状样品( 各样品简称为 s f 5 0 0 h a - k n a l ，s f 5 0 h a k n a l ，s f 5 h a k n a l ，s f 0 5 h a k n a l ，未经金属离子处理的 丝素与磷酸钙复合物简称s f h a k n a 0 ) 。实验设计所有复合材料样品中的丝素与磷酸钙 盐的质量比为3 5 ：6 5 。 2 1 3 样品表征 2 1 3 1 红外光谱( f t i r ) 将不同样品干燥后研磨成粉末，压片制样后，采用美国热高公司生产的n i c o l e t 5 7 0 0 型 傅立叶红外光谱仪，样品与稀释剂k b r 的质量比控制为1 ：2 0 ，扫描次数2 4 次，分辨率2 c m ， 范围为4 0 0 0 4 0 0c m - 1 。 2 1 3 2x 射线衍射( x r d ) 将不同样品干燥后研磨成粉末，采用日本理学电机株式会社的r i g a k ud m a x2 5 5 0 p c 型阳极x 射线衍射仪对样品进行x 射线分析。管电压为4 0 k v ，管电流为2 0 0 m v ，靶材为c u ( z - - 1 5 4 0 6a 1 ，衍射角范围为3 0 - 7 0 0 。 2 1 3 3 场发射扫描电镜( s 删) 将不同样品干燥后研磨成粉末，取极少量镀金，采用日本日立公司生产的h i t a c h i c o l d f i e l de m i s s i o ns e ms - 4 7 0 0 i i 型，电压为1 0 k v ，放大倍数为1 0 0 k ，分辨率为1 s n m 。 2 2 结果分析与讨论 2 2 1 红外光谱( f t i r ) 分析 与天然骨组织相似，天然丝( 包括桑蚕丝和蜘蛛丝) 蛋白中含有一定量的金属离子， 如k + 、n a + 、m 矿+ 、c u z + , n z n z + 等。有研究发现彻，这些金属离子对丝素蛋白的成纤过程 发挥了积极作用。其中，k + 、n a + 等碱金属离子可以诱导丝素蛋白结构从无规线团