（环境工程专业论文）镉、铅环境生物标志物的研究.pdf

应i ； l 超微弱化学发光劳辑时绿索有效反应了挺物受污染聪生产能力的变化。因此，叶绿 索移s o d 可俸为有效的生物标志耪反应重金属对撞物体毒害豹程度。 最焉，对环境生物标志物静研究迸幸亍了总结羊【l 震望，提出下一步瓣磷究器标。 关键词环穗生物标志物c d 2 + p b 2 + 金鱼时绿素s o d 超微弱化学发党 a b s t r a c t m e c h a n i s mo fh e a v ym e t a l sh a sb e e ni n t e n s i v e l ys t u d i e ds i n c el a t et w e n t yc e n t u r y t h i s p a p e rm a i n l y f o c u s e so nt h em e c h a n i s mo fb i o m a r k e r sf o r m a t i o no n g o l d f i s ha n dp l a n ti n d u c e d b yc d 2 + a n dp b “w e d i s c o v e r e dt h a tb o t h g o l d f i s ha n dp l a n th a v e t h e i rs p e c i a lb i o m a r k e r sa n d s e l e c t e ds o da st h ep r i m a r yb i o m a r k e r a sf o rp l a n t ，t h e yc a r lc a u s es o m e c o m p o n e n t ss u c ha s c h l o r o p h y l ls h o w i n gs p e c i a lp h e n o m e n a ，a n d l e a do b v i o u sd e c r e a s eo fp r o d u c t i v i t yf o r c h l o r o p h y l l ，i n d u c i n gd i s e a s eo fr e s p i r a t o r yo rc h a n g i n ga c t i v i t yo fs o d i nl a r g e s c o p e a sf o r g o l d f i s h ，t h e yc a l l c a u s es p e c i a l p h y s i c a lr e a c t i o n s ，d e c r e a s ea c t i v i t y o fs o d ，a n dc h a n g e n o r m a lc o n s t r u c t i o no f c e l l t h r o u g hl a br e s e a r c h ，w ec o n t r a s tt h e mw i t hn a t u r a lk i n d s ，a n d t h e nf i n do u ta ne f f e c t i v ew a yt om e a s u r ee n v i r o n m e n t a lb i o m a r k e r s ，t h r o u g hw h i c hw ed r a w o u tar e a s o n a b l ew a yf o re n v i r o n m e n t a l a n a l y z e i nt h ef i r s tp l a c e ，w e a n a l y z e db i o m a r k e r so fg o l d f i s hi n d u c e db yc d 2 + a n dp b 2 + t h i sp a p e rm a i n l yf o c u s e do ns p e c i a lm e c h a n i s mo fh e a v ym e n t a lc o n t a m i n a t i o n t h r o u g h s t u d y i n go n r a i s e dg o l d f i s hi nl a b o r a t o r y , w ef o u n dt h a tc d 2 + h a ss e r i o u sd a m a g eo n f i s h ，w h i c h w i l li n d u c et h e i r s p e c i a lm o t i v a t i o n ，p a t h o l o g i c a lp r o c e s sa n ds o m eu l t r am i c r o s t r u c t u r e c h a n g e s t h e r ei so b v i o u sc o r r e l a t i o nb e t w e e nd e a t hr a t ea n de x p e r i m e n t a ld e n s i t y w es t r i v e d t od i s c u s so nm e c h a n i s mo fd e l i v e r ya n dc o n v e r s i o nf o r h e a v ym e n t a lp o l l u t i o ni nv i v o t h r o u g he x p e r i m e n t ，i ti se a s yt oe x p l a i ni n h e r e n tl a wo fc h a n g ei nt h e i rn o r m a lf u n c t i o n ，a n d t h e nw ef i n ds o m er e a s o n sf o rc o n t a m i n a t i o n b yc d 2 + a n dp b 2 + s o m ed i f f e r e n tp a r a m e t e r st h a t c o u l db eq u a n t i f i e d i ts h o w e dt h a tc d 2 + i se a s yt oi n d u c em o b i l i t y , s w i m m i n go r i e n t a t i o n ， s w i m m i n gh e i g h t ，d i s t a n c eb e t w e e ne a c hs i n g l ef i s h ，a n dc h a n g eo f t h e i rp h y s i o l o g i c a lc y c l e t h e r ei so b v i o u sc o r r e l a t i o nb e t w e e nd o s ea n de f f e c t t h e r e f o r e ，i ti sf o u n dt h a t s t u d y i n g t h r o u g hm o n i t o r i n g o nb e h a v i o r a l c h a n g e o ff i s hw a sa ne f f e c t i v e w a yf o r b e h a v i o r a l b i o m a r k e r s i nt h es e c o n d p l a c e , w es t u d i e do n t h eb i o m a r k e r sf o ri m m u n o l o g i c i n j u r yo fc h o r o p h y l l a n dh i s t i o c y t ei np l a n tc o n t a m i n a t e db yc d 2 + a n dp b 2 + w i t ht h ed e v e l o p m e n to fi n d u s t r y s o c i e t y , h e a v ym e t a lp o l l u t i o nb e c o m e sw o r s ea n dw o r s e i nv i e wo fs t r o n ga b i l i t yo fg a t h e r i n g c o n t a m i n a t e dm e t a l sf o rp l a n t , w e h o p e t op a s st h e mt om o n i t o re n v i r o n m e n t a l p o l l u t i o nd e g r e e ， i n n e rr e a c t i o nm e c h a n i s m ，a n dp h e n o m e n ao u t s i d c i no r d e rt ou n d e r s t a n dt h em e c h a n i s mf o r h e a v ym e t a l sa c t i n go np l a n t ，w h i c hi n c l u d i n gt h e i rf i m c t i o na n dp o i s o n o u sm e c h a n i s m s ，w e f o u n ds o m ev a l i de n v i r o n m e m a lb i o m a r k e r s a n d a n a l y s i n g m e a i l s ，s n c h a ss o da n d c h l o r o p h y l l m o r e o v e q w ed r a wo u ts o m e p r a c t i c a la n du s e f u t m e t h o d st oc o n t r o lh e a v ym e n t a l p o l l u t i o n w em a i n l y c o n t r a s td o m e s t i cr a i s e dp l a n t ( c o e r c e db yc d ”、磺) 十) w i t hn a m m l p l a n t ， t h e nf o u n dt h a tt h e r e a r es o m eo b v i o u sc h a n g e sf o r c h l o r o p h y l fc h e m i l u m i n e s c e n c ea n d a c t i v i t yo f s o di np l a n tw h e nc o e r c e db yc d 2 + a n dp b 2 十i ti se a s yt oc h a r a c t e r i z ep r o d u c t i v i t y o f p l a n tb y c h e m i l u m i n e s c e n c e t h r o u g hs u p e r - w e a k - e h e m i l t m a i n e s e e n c e t h e r e f o r e ， c h l o r o p h y l la n ds o d c a l la c ta se f f e c t i v eb i o m a r k e ri np l a n tc o n t a m i n a t e db yh e a v ym e n t a l w eh a v es t u d i e di m p a c to fl u m i n o ，h z 0 2a n ds o d w i t hd i f f e r e n td e n s i t ya n dq u a n t i t y , t h e n m e a s l l r ea c t i v i t yo fs o di n d i r e c t l y a sar e s u l t i ts h o w st h a t1 o x1 0 m o l lh 2 0 2 ，o 1 1 0 3 m o l l 1 0 0 x1 0 一m o l ll u m i n o 4 1 3 0 n g m ls o d a r eb e t t e r d u r i n go u rs t u d y i n g f i n a l l y , w er e v i e w e da n dd r a m a t i z e dt h ed e v e l o p m e n to fe n v i r o m n e n t a lb i o m a r k e r s 。 b a s e do nt h ea b o v ed i s c u s s i o n s ，t h ef u t u r ep l a nf o re n v i r o n m e n t a lb i o m a r k e r sw a sa l s op o i n t e d o u t k e yw o r d s ：e n v i r o n m e n t a l b i o m a r k e r sc a 2 + p b 2 + g o l d f i s hc h l o r o p h y l l s o ds u p e r - w e a k c h e m i l u m i n e s c e n c e 东华大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导 师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已明确注明和引用的内容外，本 论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲 自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：罗寄峰 日期：z 。j 年1 1 月 6 i e i 东华大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权东华 大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口，在年解密后适用本版权书。 本学位论文属于 不保密区 学位论文作者签名 罗害幸 日期：p 哆年，月巧日 指导教师签名：它垂丝 日期：加缛月孑日 东华大学硕士学位论文c d 、p b 坪境生物标志镑的研究 第一章前言 自人类社会进入j 业化社会以来，重金属的污染就在不断加剧。世界上除了一 些天然的重金属本底很高的地区如火山活动区、矿区外，其他地区的重金属污染源 主要来自人类的生产和生活活动。工业三废、汽车尾气、污水灌溉等带来的 重金属已经严重地污染了土壤、水体和大气。 目前重金属污染已经危及全球生态环境以及人类健康。重金属的危害首先表 现为对植物正常代谢活动的干扰。通常，重金属包括如：c u 、c d 、z n 、p b 、n i 、 c r 、c o 、m o 、h g 。这些元素中有的是植物生长发育所必需的矿物元素，如c u 、z n 等是多种转录因子以及酶的辅助因子，被称为必需金属元素( e s s e n t i a lm e t a l ) ，而大 多重金属元素则具有很强的毒性，被称为非必需金属元素( n o n e s s e n t i a lm e t a l ) 。这 些毒性重金属元素和超过正常浓度范围的必需金属元素，在植物体内都会造成广泛 的伤害，主要的表现是细胞膜损伤、参与光合以及呼吸代谢的大分子结构被破坏、 氧化胁追、核酸分子降解等。受重金属污染的重要经济作物表现生长缓慢、产量下 降。其次，重金属对人体以及动物也有很强的毒性。通过食物链或者重金属污染的 水源等途径进入人体内的重金属将危及人类的健康。最典型的案例是6 0 年代日本 发生的骨痛病，便是因食用“镉米”所致。我国的情况也日趋严重，如广东韶关大 宝山矿区排出的污水中，c d 、m n 、p b 等重金属严重超标，污水导致土壤的含铅量 超过国家标准四十四倍。受重金属污染影响，皮肤病、肝病和癌症是该区的高发病 症。 面对重金属污染所引起的严重的环境和健康问题，人们提出了许多治理的措 施1 7 j ，如利用沉淀法，淋洗法、拮抗法、电化法、磁化法等处理被污染的土壤。但 这些方法投资成本非常高，发展中国家几乎不可能采用，只适于发达国家污染非常 严重的地点。近年来发展出一种新的治理重金属污染的技术植物修复( e h y t o r e m e d i a t i o n ) 。植物修复是利用植物吸收、积累环境中的污染物，并降低其毒害的环 ， ， 保生物技术。最近北美和欧洲的研究表明：植物修复技术是治理重金属污染的最佳 途径之一。它具有传统环境修复技术所不具备的优点，如能耗低、节省费用、生态 安全、原位治理并便于大规模应用等。目前，植物修复技术正以其特有的优势占领 世界范围内重金属治理的市场，预计到2 0 0 0 2 0 0 5 年之间将达到1 8 0 0 亿美元。但是 此项工程技术的充分发展，需要有植物重金属抗性机制的理论为基础。随着植物修 车华大学硕士学位论文c d 、p b 环境生斯标志麴的研究 复技术的发展，人们对于了解植物重金属抗性机制的研究兴趣也越来越浓厚。 人类的活动使得污染物不断的进入到生态系统中，人们已意识到环境污染所带 来的负面影响。因此，通过立法工作减轻和消除了急性毒性水平污染的发生。然而， 在实际环境中，目前存在的是多种类和低浓度的污染物，特别是重金属离子这类能 长期残存在环境中污染物，它们能够被生物吸收并积累，通过食物链进入到人体， 从而对生物生存和人类的健康构成威胁，因而有必要研究环境中重金属对生物的作 用机理，以求有效地预防与治理重金属污染。 植物重金属抗性机制是一个非常复杂的系统，涉及到植物代谢活动的各个方 面，而且与其他逆境胁迫反应相互交叉，同时不同植物因适应不同的生境而有不同 的抗性机制在起作用。近年来基于对重金属抗性机制的现有了解而进行的基因工程 虽然可以改变某些植物的抗性【2 】，但是很少能达到植物修复工程的要求。我们认为， 仅仅知道植物抗性机制的一个途径，就用于改造现有的植物，很难会有显著的效果。 f 这主要是因为人们对与复杂的抗性机制缺乏全面的了解，对于相互关联的各条途径 的关系缺乏认识。当然，就现阶段的研究而言，要给出某种植物的一个完整的抗性 机制的模式是不现实的，然而对于某两条抗性途径之间的关系的探索却是可行和有 意义的。这一方面的研究将为开展有针对性的和有效的植物修复f 9 】的基因工程提供 理论依据和基因元件。同时，探索植物中未知的抗性机制对于全面了解这一过程和 阐明环境适应性机理有重要的意义。因此，本论文的选题的目的分为两部分：其一 为研究在同一种植物材料中，植物叶绿素所参与的抗性过程的表达，其二为分离与 重金属抗性相关的s o d 酶，探索植物中存在的新的抗性机理。 万年青的根、叶片均可超量累积重金属，可作为一个研究重金属抗性机制的新 材料。是否在重金属抗性中起重要作用，是个前人没涉及的新领域。目前已经知 道叶绿素及超氧化物歧化酶( s o d ) 在重金属抗性机制中起重要作用，但是在同一 。 种植物材料中这两种分子在不同重金属的抗性机制中的功能还处于摸索阶段，本文 拟在万年青中鉴定并分离得到叶绿素以及超氧化物歧化酶( s o d ) ，为进一步分析 万年青中的重属抗性机制奠定基础。 重金属镉在环境中通常是工业冶炼提取铅、铜、锌等的副产品，镉及其化合物 主要用于电镀、制造工业染料、光电池、半导体元件及制成合金改善机械性能。由 于人类活动不可避免的接触到镉，针对镉污染的研究也逐渐增多，金属镉已被列为 是最主要环境荷尔蒙物质之一。已有实验研究表明，镉可经过呼吸道与消化道进入 2 泵华大学硬士学位论文c d 、p b 环境生物标恚耪的研究 人体，直接导致生殖毒性受损甚至遗传毒性。由于重金属易引起生物组织细胞过氧 化，超氧化物歧化酶( s o d ) 作为生物抗击细胞过氧化、进行自身保护与修复的活 性酶，直接表现出一定的改变。而叶绿素作为植物生产能力的表征，在受到外来因 素抑制时，也会发生相应的变化。因而可将叶绿素与s o d 作为植物受环境中重金 属胁迫的生物标志物来研究。 c d 对动、植物的影响，国内外已有不少报道，但主要侧重于吸收、富集等方 面，论文以金鱼、万年青为研究对象，拟从分子生物学角度分析以c d 为主，p b 为 辅的污染体系对生物生命活动的影响。 1 1 生物标志物的分类介绍 生物标志物 1 1 ( b i o l o g i c a l m a r k e r o rb i o m a r k e r ) 是指反映生物系统与环境中的化 学、物理或生物因素之间相互作用的任何测定。它是阐明接触与健康损害之间的工 具。从广义上讲，它是指用于环境学、医学、流 亍病学中危险性评价的任何生物标志， 它包括生物系统内直接或间接与暴露相关的生理、细胞、免疫、生化以及体内的外 来化合物和代谢物水平的测定等。当前，随着v o c s 生物标志物研究的不断深入，它 不仅可评估接触量和健康受损的危险程度，同时也可判断人类个体之间差异和接触 者的易感性等，因而生物标志物已成为国内外研究热点，目前国内主要侧重于对人体 的免疫研究，生物标志物有：蛋白质加合物、基化脱氧嘌呤、8 羟基脱氧鸟苷、d n a 加合物等。具体的标志物研究范围有： ( 1 ) 行为标志物：主要反应较低生物水平的影响，包括环境激素物质、有毒有害 的有机与无机物、环境因素变化等引起的生物生理习性、健康状态异常变化，从而 确定其中的相关关系。 ( 2 ) 生理标志物：主要是描述生物的遗传、繁殖、免疫功能的变化的生理学指标， 可反应多项综合性指数。 ( 3 ) 生长余能检测：生物对能量的利用当受到外界环境变化的影响时，会表现在 生长的不足、细胞修复差、生理适应差等方面，对热量利用不足。 4 ( 4 ) 免疫毒理学标志物：通过对生物免疫机能的结构性参数、免疫功能参数变化 来鉴定中毒情况。 ( 5 ) 组织病理标志物 ( 6 ) 生化标志物：是生物体内最早可测得的变化指标，可用于早期检测与预防。 生物标志物可用于检测生物暴露于环境污染物的剂量和效应，生物体遗传性或 3 采华大学硬士学位论文c d p b 耳境生耪标忘耪的研究 诱变性的敏感性差异，以及由环境污染物引发的各种疾病的早期诊断。用于这种风险 性评价的理想的生物标志物，应能定量检测暴露生物标志物暴露是指外来物质作用 于人体的接触量，体内剂量是指体内所吸收的量。另外可分为效应生物标志物、暴露 生物标志物和易感生物标志物。 暴露生物标志物是外来物质的存在量、人体接触量和体内剂量与相应生物效应 的相关性的标志；它是通过常规实验技术所进行微量鉴定和检测，即测定体内某些外 来物质，或检测该物质与体内内源性物质相互作用的产物，或与暴露有关的其它指标 等。暴露生物标志物按其存在形式可分为内剂量和生物效应剂量。外部暴露是指异 生物质作用于人的接触量，而内部剂量是指体内所吸收的量。暴露标记物指示异生 化合物的存在和它与机体内部的相互作用。可利用数学模式和化学或物理的方法分 析食品、空气、水、土壤等的环境监测方式来评价暴露【2 ，也可采用检测血、尿、 唾液、脑脊髓液和其他生物样品来评价暴露。而暴露生物标记监测法比数学模式或 环境样品分析法对暴露的评价更为准确。它所具备的化学特异性能够指示环境致癌 物的接触剂量与相应的生物效应的相关性：可通过常规试验技术进行微量鉴定和检 测，即测定体内某些外来化合物或检测该化学物质与体内内源性物质相互作用的产 物，或与暴露有关的其它指标。 效应生物标志物是指当一定量的外来物质存在时所引发疾病的特异指示，并与 该疾病的发展有量的关系，即测定生物机体中某一内源性的成分，就能指示靶组织功 能的改变、机体功能容量的改变、机体功能的障碍或疾病的出现等。效应生物标志 物包括早期生物学效应、结构功能变化和临床疾病的各种检测指标。理想的生物标 志物可以定性或定量的被检测，能预示健康危害及其发展趋势。效应生物标志物是指 在生物体内，依据一定量变规律，与已经形成的或可能发生的健康损害和疾病相联系 的，可以测量的生化、生理、行为或其它的改变。它包括生物体整体水平、器官水平、 组织水平、细胞水平和亚细胞水平晰际志物。例如，精子计数是生殖细胞方面的标志 物，肝毒性是器官方面的标志物，基因改变或表达是亚细胞水平的标志物等。再如，环 氧乙烷可导致体细胞突变及生殖细胞的可遗传性损伤。 能够指示疾病的出现，病灶的早期预示或某些造成疾病的周边事件，它的监测 结果可以预示有害健康的发展趋势。生物效应标志物代表着健康危害的挣续性，可 以定性或定量地进行检测。对有害物暴露的早期响应可以通过靶组织功能的改变显 末华大学硬士学位论文 c d 、p b 耳境生勃标志物鹤磺究 皂 示出来。例如染色体损伤，靶基因突变或刺激素状态的改变。生物效应标记物应对 其引发的疾病有特异针对性，并与该疾病的发展有量的相关性，即测定生物机体中 某一内源性成分，指示产生疾病或产生障碍，或机体功能容量所发生的改变。 易感性生物标志物能够指示个体之间或人群之间口】机体对环境因素影响相关的 响应差异。它是生物体内接触某种外来化合物激发的特别敏感的标志物，它与个体 免疫功能差异和靶器官有关，即与体内抵抗环境有害物质造成健康危害的要素测定 有关。易感性标志包括遗传特性和代谢作用的差异，免疫球蛋白水平的变化，机体 对环境损伤的恢复能力等。易感性标志物的基本原理是个体内部差异的指示，这种 差异能提供个体抵抗环境诱导疾病的能力或敏感度。 1 2 环境生物标志物分类与研究方法 环境生物标志物研究，就是通过对环境变化的生物监测，测定生物体液、细 胞和组织的各种反应，用生物化学、免疫学、遗传学的方法来指示污染物的存在与 否以及生物个体的反应，它能够直接以生物体内耙细胞或耙分子为反应终点，十分 敏感。检测结果能够说明生物个体内的细胞和组织是否已暴露于超量的污染物中， 环境污染物是否已对生物耙发生了毒性诱导效应，以及毒性效应是否己对种群、群 落、生态系统引起了连锁反应，作为评价一种化合物环境效应的方法，并力图从环 境中各种对生物有影响的因素出发，寻找、发现污染物的吸附、转移、转化、毒害 机理，并能够从生物生长症状而量化、质化环境因素的变化，从而提供有效的方法 来减轻、控制污染。生物标志物( b i o m a r k e r ) 是近年来国内外预防医学界共同关注的 一个研究领域。筛选和利用敏感、特异、简便和低损伤性的生物标志物，以便早期预 测环境和职业有害因素对机体的可能损害、评价其危险度，从而提出切实可行的干预 措施。是生物标志物研究的主要目标。目前，世界上对于蛋白质加合物的研究方法主 要有：( 1 ) 电泳法：主要根据加合物能改变蛋自质与电泳淌度的原理测定，该方法 具有普遍适用性，但灵敏度低、选择性差，不适合监钡l 侬i 含量的物质。( 2 ) 放射性 分析方法：用放射性同位素标记( 前标) 分析蛋白质加和物，该方法具有灵敏度高 的特点，但只适合动物实验，而不适合分析人的样品。( 3 ) 荧光光谱法：该方法具 有灵敏度高的特点( 5 p g m g 1 h b ) ，所用仪器昂贵，只适用于有荧光特性的蛋白质加 合物。( 4 ) 水解的g - c m s 法：此法是先将蛋白质水解，用h p l c 分离出含加合物 的氨基酸，经脂化和衍生，在g o m s 上进行鉴定、分析，方法适用于分析不会被 全水解破坏的加合物，但是方法步骤多、耗时长、灵敏度低( 2 0 0 i l g g - 1 h b ) 。( 5 ) 末毕大学硬士学短论文 c d 、p b 环境生物标志物韵研究 免疫法：其原理是将分析对象与对分析物有特征的抗体进行反应，而蛋白质加合物 含量用放射性核素、酶或荧光染料等标记物来测定，方法灵敏度高 ( 01 p m o l g 一g l o b i n ) 、简便、快速、应用前景广泛，但是培养和筛选对分析对象有 特征性的抗体是很难的( 对大量的加合物而言) ，又局限了方法的应用。( 6 ) 改进 的埃特曼降解法：方法原理是将反应试剂苯基异巯氰酸( p i t c ) 与蛋白质中烷基化的 n 一末端缬氨酸作用，在碱性条件下产生p i t c 衍生物蛋白质，异构化成为环状烷基 化的p t h 衍生物，然后用g c m s 分析，方法避免了蛋白质水解的费力费时步骤， 提高了灵敏度( 1 0 p m 0 1 g h b ) ，但是局限于n 一末端缬氨酸的加合物测定。( 7 ) r a - n i 催化还原的g c m s 法：方法的原理是在巯基上被烷基化了的半胱氨酸在r a - n i 催 化还原剂作用下解放出烷基化合物，后者经衍生化反应后进行g c m s 分析，方法 的步骤简单，灵敏度高( 1 p m 0 1 g h b ) ，但是方法适用于半胱氨酸的加合物分析。 环境中重金属离子分子生物标志物主要包括以下内容： d n a 加和物 d n a 加合物的研究早就引起了人们的注意，尤其是与一些己知的致癌物的共 价连接，如p a l - i s 类物质、黄曲霉素等，最常采用的方法主要有免疫法、高效液相 色谱法、p 后标记法等。由于在污染水体中鱼的病变大量发生，而已知的致癌物广 泛存在于水环境中，这提示污染物与肿瘤形成有一定联系，因此水生生态毒理学家认 为将鱼作为材料研究作用模式和用于检测是十分有意义的，近年来人们用不同的鱼 进行了这类研究，并与哺乳动物的结果进行比较，证明了人们的预测。早期用标记 化合物来进行此类研究，现在已发展了较多的新方法，近年在用水生生物进行研究 中经常用到的有以下几种方法。 酸水解法定量测定加合物：s h u g a r t 等人发展了酸水解法检测蓝鳃太阳鱼口】中的苯并 芘( b a p ) 加合物，将b a p 加合物从d n a 分子上除去，使其以具强萤光吸收的呋喃 形式游离出来，然后用高效液相色谱( h p l c ) 荧光检测方法定性定量测定，该方法 不仅可以测狲f ：m o l 量的加合物，而且测定的是d n a 与b a p 最终的致癌形式b a p d e 之间形成的加合物。但这种方法需要加合物的标准晶而使应用受到限制， p 后标记检测d n a 加和物嘲：前述几种方法被成功的应用于检测某些化合物或 物理因子对d n a 的作用，其局限性是要选定特定的d n a 加合物，对于确定大量未 知结构和浓度的有致癌可能性的化学物与d n a 的作用则受到一定限制，p 后标记 彖华大学硬士学位论文c d p b 环境生糖标志麴囊q 研究 技术则弥补了这个不足。将分离出的d n a 用一定的酶水解，去磷酸后记，再用双 向层析、放射性自显影，液闪计数等方法定量。此法最大的优点是检测能力强，应 用范同广，可检测任何化学物与d n a 的连接，尤其可用于环境中生物样品的加合 物测定以及判断化合物的毒性，包括纯品或混合物是否有潜在的致癌作用，同时具 有很高的灵敏度，可检测到1 0 个碱基中的一个d n a 加合物。 乙酰胆碱酯酶( a c h e ) 川 乙酰胆碱酯酶是一个经典的毒理指标，在五十年代末，w e i s s 就提出对自然水 环境中极低浓度的有机磷杀虫剂，可用鱼脑或无脊椎动物的乙酰胆碱酯酶( a c h e ) 活 力受抑制程度来检测，这个方法随即为许多学者接受，在国内曾有这方面报道。现 在一般已确认，p a 以上的a c h e 被抑制，证明暴露作用的存在，5 0 以上的a c h e 抑制表明对生物的生存有危害，这对检测非急性毒性极为有用。多年来，这项指标 一直作为神经传导抑制剂的特异性生物标志物。最近报道表明这项生化指标也可指 示单一重金属高予污染的存在。 腺苷三磷酸酶( a t p a s e ) 腺昔三磷酸酶( a t p a s e ) 是生物体内重要的酶，存在于所有的细胞中，包括多种 由不同离子活化及存在于不同细胞结构中的a t p a s e ，在细胞的供能活动如离子平衡 等之中起着重要作用。研究氯代烃农药的作用机制时，人们发现d d t 对n a 、 k a t p a s e ，m g a t p a s e 的抑制作用，并对此多种污染物与生物体a t p a s e 的关系作 更广泛的研究。已发现多种水生生物包括鱼、虾、乌贼、水生昆虫以及鱼的多种组 织，如鳃、肾、脑的多种a t p a s e 对不同的污染物均有反应，如有机氯农药、增塑 剂、多氯联苯、金属离子、炼油废水等。尽管对不同生物、不同组织作用程度有异， 这可能是由于各种生物、各种器官的敏感性不同所致，但这种作用的存在是毫无疑 问的。无论是离体实验或活体暴露，都表明有一定的剂量效应关系存在，有的还 具有典型的毒性效应曲线。酶实验与生物体功能损伤的同时研究己进行了近三十 年，由于多种类型的水污染物对a t p a s e 有抑制作用，至今仍是一项评价污染压力 的参数。 鱼血清的酶 在临床医学上，测定血液中组织专一性的酶，是常用来诊断特定组织或器官 损伤的方法，在水生态毒理学研究中，这些方法也被子用于判断污染物的作用靶 末华大学硕士学位论文c d 、p b 环境生麴标志耪的研究 位，如用转氨酶、脱氢酶来反映水污染物对鱼肝的损伤，山犁醇脱氢酶仅存在于肝 脏，因而血中的山犁醇脱氢酶也被用于指示某些化学物对肝脏的亚致死作用，碱性 磷酸酶由于对金属盐敏感也被用作中毒指标。虽然这些酶不是污染物的直接作用靶 位，但由于能反映一般毒物所引起的专一性的器官损伤，因而得到较为广泛的应用。 f o i m a r 提出，利用一系列鱼血清中非专一性的生化指标包括酶、电解质和激素等可 很好地指示化学污染物慢性暴露的影响。 蛋白磷酸酶 蛋白磷酸酶广泛存在于细胞中，对任何一种蛋白进行催化脱磷酸化作用。蛋白 磷酸化与脱磷酸化是细胞内无所不在的反应，正是这两种反应的特定平衡协调着细 胞内许多生化反应过程若这两种反应中的任意一种改变了其活性，则由之而来的 将是细胞内一系列生化反应的紊乱，包括肿瘤形成过程的促进。 混合多功能氧化酶( m f o ) 有机体的非生物物质的转化包括两个阶段；第一阶段，亲脂性底物被细胞 色素p 4 5 0 依赖性的混合功能氧化酶( m i x e d f u n c t i o n o x i d s s e ，简称m f o ) 代谢，将氧引 入底物分子，第二阶段，内源性分子如葡萄糖醛酸，硫酸盐，谷胱甘酞等与被氧化 的非生物物质结合，形成低毒而且易于排出的产物。这是非生物物质代谢的一般方 式生物体内解毒系统一个重要的特征是参与许多关键性的解毒反应的酶是可通过 暴露而诱导的，而许多环境污染物都是诱导物。因此，检测这种诱导作用，并用作 指标来反映污染物暴露对生物的影响就成了分子生态毒理学研究的一个重要方面。 m f o 作用存在于所有的脊椎动物中，其作用是代谢非极性的亲脂性有机化 合物，包括生物物质和非生物物质。从生理作用来看，它参与体内的胆固醇、胆汁 酸、类固醇、激素、维生素d 的生物合成与代谢；从解毒作用来看，许多外源性的 化学物，如多环芳香烃和药物，都经该酶系统代谢，形成极性较大的产物而易于从 体内排出，许多外源性物质进入体内，经m f o 的作用后发生各种变化，大多转化 成低毒易溶的代谢物排出体外，而有的则变为更毒甚至变成致癌物，所以m f o 又 称为致毒解毒系统。哺乳动物中存在的大多数生物转化反应在鱼的离体和活体实 验中都得到了证实，在六十年代，已有研究表明鱼肝中有类似m f o 的活力存在， 鱼以与哺乳动物相似的方式代谢外来物质。所有的真骨鱼，甲壳类，软体动物等动 物都有p 4 5 0 及有关的醇。 彖华大学硕士学证论文 c d p b 环境生鞠标志翱的研究 m f o 的组成包括细胞色素p 4 5 0 、n a d p h 一细胞色素、p 4 5 0 还原酶( 或n a d h 一 细胞色素b 5 还原酶) 及磷脂。m f o 引起的生物的转化的反应特征相同，但底物、产 物的化学特性差别很大，即具多种催化功能。m f o 是一般表达，根据其催化活性 可以表示为；7 7 氧基异吩恶唑0 脱乙基酶( e r o d ) ，7 - 乙氧基香豆素o 一脱乙基酶 f e c o d ) ，芳烃羟化酶( a h h ) 等。p 4 5 0 是电子传递系统的末端氧化酶是底物连接成 分，因而决定反应的专一性。单、多克隆抗体e d n a 探针己表明p 4 5 0 基因有多种 形式，根据基因序列及染色体定位，确定了族和亚族，p 4 5 0 基因都属于p 4 5 0 总科， 目前已确定2 7 个p 4 5 0 基因族共1 5 4 个基因。对于m f o ，非生物物质既是底物又 是诱导剂，现在，已有可以根据活化p 4 5 0 基因族或亚族对诱导剂及污染物进行分 类，哺乳动物中最详细的是p 4 5 0 1 a 亚族的诱导反应，基因的启动是通过胞内受体 乙酰胆碱的作用。 p 4 5 0 诱导的检测，诱导反应是化学物质刺激基因转录使m r n a 增加，随之 p 4 5 0 蛋白合成增加，然后表现在酶的活性增加，因此，目前可从上述不同水平上来 证实污染物对m f o 诱导的存在。 酶的催化活力是证明m f o 诱导作用存在最早和最常采用的方法。在正常鱼中， 由于e r o d 和a h h 活力很低，有时无法测出，因而，检测e r o d 和a h h 催化活 力是确定鱼中诱导反应的最灵敏的方法。对胚胎进行诱导剂微量注射可看到孵化后 鱼苗中肝e r o d 的诱导。用酶活力测定证明诱导作用存在，其方法较为成熟，但是 酶活性的表达需要酶蛋白的一定结构的维持及辅因子的存在，由于野外条件的限 制，诱导剂和内源性物质的存在，这些都会影响酶活性的准确表达，而且当样品量 较小时( 如鱼卵、鱼苗) ，酶活性测定较为困难。 酶蛋白的测定：成功的从鱼中分离出p 4 5 0 1 a 1 蛋白，为展开免疫法检测p 4 5 0 蛋白提供了较好的条件。1 9 9 1 年发展了用e l i s a 法测定鱼m f o 蛋白的增加证明诱 导的存在。当样品量少时，活力铡定困难、酶活性丧失或有抑制剂存在时，用蛋白 测定法尤为合适。例如，鱼鳃及鳕鱼苗的e r o d 活力很难检测出，但用蛋白测定法 成功地证明了诱导作用的存在。由于抗原性蛋白受变性的影响小，此方法很适用于 测定野外样品。g o k s o y r 等人用野外采集鱼样和在实验室内用多氯联苯 c b ) 暴露后 的鱼样测定e r o d 未能反应诱导，这可能是因为p c b 对e r o d 活力测定有抑制， 然而用e l i s a 法很好证明了p 4 5 0 1 a 1 蛋白的增加，而且该方法的另一优越性是可 9 东华大学硬士学拉论文 c d ，p b 耳境生耪标志勃转研究 同时测大量样品。 m r n a 的测定：1 9 8 8 年，鱼的c y p l a l 基因第一次克隆，e d n a 探针可检测到 c y p i a i 的翻译，并可测到诱导过程中m r n a 的上升。p e s o n e n 的研究不仅发现在 萘黄酮、t c d d 诱导下硬头缚的p 4 5 0 m r n a 迅速上升，而且也检测出随后引起的 p 4 5 0 i a 蛋白和e r o d 活力增加。由此可见，在不同水平上进行测定所反应的诱导 作用是一致的。h a a s c h 也在酶活性、蛋白、m r n a 几个水平上进行了被p a h 和p c b 污染的河水对鱼c y p i a t 的诱导，证明了这几种水平上的测定都可用于p 4 5 0 诱导作 用的测检。从几个水平上测定这种诱导作用，其优越性在于可互相补充证明诱导作 用的存在。 谷胱甘肽硫转化酶( g s t ) 、葡萄糖醛酸转移酶( u d p g t ) 近年来关于解毒系统第二阶段的酶也有不少研究，如谷胱甘肽硫转化酶( g s t ) ， 葡萄糖醛酸转移酶( u d p g t ) 等，有报告指出，当大型潘暴露于几种氯酚中时均可诱 导g s t 。1 0 0 m g lc d 的暴露使虾的中肠g s t 活性降低，但也有的研究发现污染 物暴露对g s t 并没有显著诱导。对u d p g t 也有一些研究，总的看来，远不及对 m f o 的研究那样系统、全面，而且结论也不太一致，可能是测定方法、取样时间 及所采用的底物不同所致。 脂质过氧化作用 细胞和亚细胞膜系统的磷脂富含多烯脂肪酸侧链，这些多烯脂肪酸侧链可使脂 蛋白膜对亲水物质具有一定的通透性。但多烯脂肪酸很容易发生过氧化降解f 酸败) 。 重金属离子在细胞内代谢形成自由基，攻击多烯脂肪酸，引起脂质过氧化作用。在 多烯脂肪酸上，不形成双键的亚甲基碳，对自由基的攻击敏感，形成自由基( r ) 。 有机自由基直接或经过共振转移后，与分子氧反应，生成有机过氧自由基( o o r ) 。 分子氧是顺磁性的，提供二个未配对电子。由于没有能量障碍，有机自由基与分子 氧反应，迅速生成有机过氧自由基。 在脂蛋白膜的碳氢中心，脂肪酸侧链是交错对插的，故在一个磷脂月旨肪酸侧链 上的有机过氧自由基，经过夺氢反应攻击相邻的不饱和脂肪酸的亚甲基氢，生成一 个有机过氧氢( g o o h ) 和一个新的有机自由基。 过氧化物一旦形成，经过这些裂解反应，启动新过氧化物形成的连锁反应。这 种自动催化过程，导致多烯脂肪酸的迅速降解，生成丙二醛( m d a ) 、其它醛类和酮 1 0 豪华大学硕士学位论文c d 、p b 耳境生镑标志耪的研究 类。 脂质过氧化作用引发细胞损伤的机理： 当微粒体体外脂质过氧化时，g - 6 p 酶和p 4 5 0 明显被抑制。在最初阶段，共价 结合和脂质过氧化集中在针尖样局部或接近p 4 5 0 的局部，然后启动次级毒性作用， 这些毒性产物在细胞内某个部位产生，而在另一个部位( 如细胞质膜) 导