（运动人体科学专业论文）长期过度运动训练加速心肌细胞衰老的相关性研究.pdf

i 摘摘 要要 目的目的：本文通过对大鼠进行长时间的不同强度的运动训练，比较各组大鼠之间的日 常行为和血糖变化，以及分析超氧化物歧化酶，谷胱甘肽过氧化物酶，细胞色素 c 氧化 酶值的变化特征，说明不同强度运动对机体产生不同变化，探讨长期不同负荷运动对大 鼠心肌细胞产生的影响，为进一步预防和治疗运动心脏损害提供基础依据，同时探讨过 度运动和衰老之间的联系，找寻增强机体代谢能力及有效延缓机体衰老的方法和途径。 方法方法：35 只 3 月龄成年大鼠分为对照组（10 只） 、有氧运动组（10 只）和过度运动 组（15 只） ，20 只 24 月龄大鼠为老年组。记录各组大鼠体重、进食量，并在造模后次 日对所有大鼠进行断尾取血测血糖，取左心室肌进行组织匀浆，蛋白定量后，利用酶标 仪检测超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、细胞色素 c 氧化酶的值。 结果结果：1.过度运动组大鼠体重明显下降，与对照组相比有显著性差异（p0.01） ， 与有氧运动组相比有显著性差异（p0.05） ；2.有氧运动组和过度运动组中，血糖与对 照组相比分别下降了 7%和 14%，过度运动组血糖显著低于对照组、有氧运动组（p 0.05） ，老年组血糖值显著低于对照组（p0.05） ；3.过度运动后心肌中超氧化物歧化酶 (sod)的含量明显低于对照组和有氧运动组，且相比于对照组大鼠心肌内超氧化物歧化 酶(sod)的含量显著下降 26%，且具有显著性差异（p0.05） 。老年组 sod 的含量显著 低于与对照组和有氧运动组 （p0.05） ； 4.过度运动组的谷胱甘肽过氧化物酶 （gsh-px） 与对照组相比较都具有显著性差异（p0.05） 。老年组谷胱甘肽过氧化物酶（gsh-px） 的含量显著低于与对照组、有氧运动组（p0.05） ；5. 过度运动组心肌中细胞色素 c 氧化酶显著低于对照组、有氧运动组、老年组（p0.01） ，老年组细胞色素 c 氧化酶与 对照组和有氧运动组相比也具有显著性差异（p0.05） 。 结论结论：1.通过检测大鼠血糖，以及左心室肌内超氧化物歧化酶(sod)、谷胱甘肽过 氧化物酶（gsh-px） 、细胞色素 c 氧化酶这四个指标，发现正常大鼠经长期过度运动训 练后出现了类似衰老的现象。2.长期有氧运动使机体发生适应性改变，提高机体清除自 由基的能力，增强心肌内线粒体的抗氧化能力。 关键词：过度运动 衰老 自由基 sod 细胞色素 c ii abstract objective: based on the rats for a prolonged period of exercise training of different intensity compared between the rats and blood glucose changes in everyday behavior, and the analysis of superoxide dismutase, glutathione peroxidase, cytochrome c oxidase value variation, indicating different intensities of exercise on the body produced, and to explore different long-term exercise on the impact of myocardial cells in order to further the prevention and treatment of movement provides the basis for heart damage, overload exercise and aging at the same time of between, search and enhance the body metabolism and delay the effective ways and means of body aging. methods: 35 rats of 3 month were divided into control group (10), aerobic exercise group (10),overload exercise (15), 20 to 24 months old rats as aging. registration of the rats body weight, intake, day after modeling all the rats tails blood glucose, take the left ventricle to tissue, protein quantification, the use of superoxide dismutase detection microplate reader , glutathione peroxidase, cytochrome c oxidase values. results: 1. aerobic exercise group and overload exercise group, blood glucose, compared with the control group decreased by 7% and 14%, overload exercise blood glucose was significantly lower than the control group, aerobic exercise group (p 0.05), older blood glucose was significantly lower than the control group (p 0.05); 2. overload exercise myocardial superoxide dismutase (sod) were significantly lower than the control group and the aerobic exercise group, and compared with the control group myocardial superoxide dismutase (sod) of were significantly decreased 26%, and a significant difference (p 0.05). sod content in elderly group were significantly lower than the control group, aerobic exercise group (p 0.05); 3. overload exercise group of glutathione peroxidase (gsh-px), compared with the control group with significant difference (p 0.05). aging glutathione peroxidase (gsh-px) levels were significantly lower than the control group, aerobic exercise group (p 0.05); 4. overload exercise myocardial cytochrome c oxidase were significantly lower than control group , aerobic exercise group and elderly group (p 0.01), older group of cytochrome c oxidase and the control group and compared aerobic exercise also has significant difference (p 80%vo2max)即力竭强度，进行活动跑台训练 12 周以后，也出现线粒体变大、嵴断裂、心室细胞核固缩等病理变化12。总之，无论是游 泳还是跑台训练，过度运动后心肌细胞都出现明显的病理性损害。 运动能够产生大量的自由基。在 1978 年 dillard 等首次报道人以 50%最大摄氧量负 荷踏车 1 小时后，呼出气中脂质过氧化物或戊烷含量明显增加。1982 年 davies 等应用 ers（电子自旋共振）技术直接证实了力竭运动后，肝脏、肌肉中的自由基明显增加， 从而找到了运动诱发自由基生成增多的直接证据15。 国内外众多学者的研究表明， 短时间激烈运动对体内自由基的产生具有促进作用， 运动可以引起自由基增加。一是因为剧烈运动时耗氧量剧增，氧代谢的结果必然产生自 武汉体育学院硕士学位论文 2 由基；另一方面，局部组织缺氧及代谢产物的堆积影响了线粒体氧化的功能，同时氧气 大量消耗产生了大量的单线态氧，从而激发一系列的自由基反应16。邓红17研究发现间 歇性低氧刺激能激发组织氧化，产生的自由基可以刺激机体，从而使机体获得抗氧化酶 系活性升高的能力。但长时间过度运动至力竭后机体产生大量自由基，导致机体抗氧化 能力下降，并使自由基大量累积。如王文成18等研究的力竭运动对小鼠心肌线粒体自 由基代谢和线粒体功能的影响中发现力竭运动后，丙二醛（mda）含量很显著地升 高，超氧化物歧化酶（sod）活性、谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)含量、总钙浓度和 atp 合成能力均很显著地降低，力竭运动后 24h 基本恢复。陶占泉19等的研究发现， 力竭游泳运动后即刻及 20h 运动后骨骼肌内自由基显著升高， 抗氧化能力显著下降， 而 大脑自由基代谢无明显变化。这些事实说明长时间过度或至力竭的运动可导致机体的抗 氧化能力下降，使机体积累大量自由基，从而导致身体将出现各种由自由基所引起的损 伤。 有趣的是，线粒体肿大、细胞核固缩等表现是细胞衰老的形态学特征。而且过度运 动后引起的体内血液重新分布，局部出现缺血缺氧，并产生大量自由基等活性物质20， 也是造成细胞衰老的重要因素21。 目前研究表明心肌细胞衰老的特征主要表现在：(1)形态学变化。衰老细胞中常会出 现：线粒体体积增大，可观察到线粒体内容物呈网状化并形成多囊体以及外膜破坏；细 胞核出现体积增大和核膜内折，最后可能导致核膜崩解；染色质固缩化；脂褐质将阻碍 细胞内信息传递22。 （2） 自由基。 组织器官缺血和组织缺血再灌注损伤产生大量自由基， 损伤细胞膜，使其通透性升高，造成线粒体肿胀、融酶体破裂、酶外逸21；促使细胞核 固缩；使蛋白质变性；使 dna 共价键断裂、交联；染色体断裂、变异；从而导致组织 细胞衰老。 (3)端粒酶活性较低。 体细胞每传代一次， 细胞中染色体末端的 dna 序列 （即 端粒） 将缩短 50200bp， 端粒缩短到 24kp 时正常人二倍体细胞将不能传代而进入衰 老和凋亡23。在正常细胞中，端粒酶（rna 和核糖核蛋白的复合体）将减少 dna 复制 过程中末端序列的少量丢失，阻止端粒缩短和细胞凋亡。现已证明长寿细胞端粒酶活性 最高，衰老细胞的端粒酶活性较低24 ， 25。 （4）线粒体 dna 的突异。线粒体 dna 中小 片段缺失和插入以及大片段的氧化及其烷基衍生物的累积与年龄增长相关，这种 dna 变异的增加，严重阻碍了线粒体的正常功能，引起线粒体氧化磷酸化能力下降，能量供 应不足引起衰老26 ， 27。 因此提出一个假设：长期长期过度过度运动加速心肌运动加速心肌细胞细胞的的衰老衰老。 第一章 前言 3 目前在国内外期刊上，尚未发现相关报道。本文将重点观察大鼠日常生活状态，测 量大鼠血糖，利用酶标仪分析大鼠心室肌内超氧化物歧化酶（sod）活性、谷胱甘肽过 氧化物酶(gsh-px)含量以及细胞色素 c 氧化酶含量，并将过度运动后心肌细胞的病理 变化与有氧运动后以及衰老的心脏进行比较，找出相关性，以期证实过度运动加速心肌 细胞衰老过程的假设。本研究成果将对因不适当的运动引起的病理性心脏疾病和运动心 脏的临床修复的研究提供重要基础实验数据， 并为指导运动员的专项训练及民众健身锻 炼，以及竞技体育和全民健身提供基础理论依据。 第二章 文献综述 5 第二章第二章 文献综述文献综述 2.1 自由基 2.1.1 自由基简介 自由基又称游离基，是指原子的外层轨道上具有未配对电子的原子、原子团或特殊 状态的分子。自由基中常见的有：氧自由基(oxygen free radicals， ofr) 又称活性氧， 包括超氧阴离子自由基(o2-)、过氧化氢( h2o2 )；羟自由基(oh-)；有机过氧基( roo-) 及 过氧化物(rooh)；氮氧自由基。 人体内的自由基来源于两方面，一是外源性自由基，包括有大气污染物质(no2 、 o3 )、电离辐射(-射线、-射线、紫外线)、某些药物(抗肿瘤药物、抗生素、解热镇痛药 等)、各种微量元素(铅、铝、锂、砷等)、酒精、高压氧中毒引起等；二是内源性自由基， 如在机体内的心肌线粒体膜中产生各种各样的活性氧。h2o2 是 o2-或 ho2-的歧化反应 产物，在过渡金属如 fe2 + 或 cu2 + 的介导下可生成-oh， -oh 可侵害细胞脂质中的不饱 和脂肪酸，引起脂质过氧化反应，生成 lo-、loo-及 looh。looh 释放 i-，产生代谢 产物丙二醛(malondialdehyde ，mda)、乙烷及出现共轭二烯的双键。no 与 o2反应成 为 onoo-，onoo- 的质子化产物为 onooh，它们的部分化学性质类似-oh ，所以也 可视为氧自由基。 过去研究的较早、较多的是自由基对机体的不利影响，认为自由基是有害无益的， 近 10 年来的众多研究证明，自由基对健康的作用具有双重性16。生物体内的氧自由基 有其特殊的生理意义，低浓度自由基为维持健康所必须，如自由基参与细胞免疫，对于 抗局部感染等具有一定的作用28。过量自由基则对于不饱和脂肪酸、蛋白质分子、核酸 分子、细胞外可溶性成分以及膜脂质等具有破坏性作用。因此，自由基并不是闻言生畏 的，要彻底清除，而是将自由基维持在一个适当的水平29，维持氧化和抗氧化防御之间 的动态平衡。 2.1.2 人体内清除自由基的酶类 人体内的抗氧化酶类主要有超氧化物歧化酶（sod） 、谷胱甘肽过氧化物酶 武汉体育学院硕士学位论文 6 (gsh-px)、 过氧化氢酶(cat)、 过氧化物酶(pox)等； 抗氧化剂种类很多， 包括维生素 e、 维生素 c、一氧化氮(no)、-胡萝卜素等。各抗氧化物质之间即有协同作用，又有相互 依赖和保护作用30。 2.1.2.1 超氧化物歧化酶（sod）的生物学作用 根据超氧化物歧化酶（sod）所含金属元素的不同分为 cu、zn-sod、mn-sod、 fe-sod 等形式21，同时还存在多种同工酶。cu、zn-sod 主要存在于细胞浆中，cu 位 于酶的活性中心部分，直接与酶的催化活性相关。sod 可催化超氧阴离子歧化为 o2-和 h2o， 使机体下产生的某些自由基转变为非自由基或是使自由基的不成对电子通过 gsh 转移至 o2，成为可被 sod 清除的 o-而排除30。防止自由基对机体的直接或间接损伤， 调节机体内 o2-和 no 的水平。 2.1.2.2 谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)生物学作用 谷胱甘肽过氧化物酶 (gsh-px)主要存在于线粒体中，gsh-px 有 3 种同工酶，即 磷脂氢过氧化物 gsh-px、胃肠道 gsh-px、血浆 gsh-px30。gsh-px 是含硒(se)的酶 蛋白，其活性由二种酶组成，se 起主要作用，负责催化 h2o2及有机过氧化物的还原； 另一部分仅还原有机过氧化物，se 缺乏时 gsh-px 活性低下，导致组织损害。其主要生 物学作用是清除脂质氢过氧化物(rooh)和 h2o2，减轻有机氢过氧化物对机体的损伤， 参与或调节前列腺素的生物合成。 2.1.3 自由基损伤机体的作用机制 2.1.3.1 细胞的生物膜 细胞的生物膜中含有类脂质，若自由基在体内积累过多，过剩的自由基就会使类脂 质中的不饱和脂肪酸发生过氧化，与不饱和共价键相结合成稳定结构，从而破坏生物膜 的结构和功能31。脂质过氧化物的降解产物丙二醛可与氨基酸、核酸、蛋白质和磷脂等 的游离氨基反应形成脂褐素，使生物分子内部或之间发生交联，dna 的双螺旋被交联出 现复制错误或无法分裂，蛋白质交联形成无定型沉淀物，蓄积于细胞浆中，使得细胞膜 通透性升高21，受体的配位结合减少，细胞功能减退。线粒体膜流动性下降，膜结合蛋 白与膜分离及膜性改变，引起线粒体肿胀；溶酶体破裂、酶外逸30；核膜的脂质过氧化 将直接损伤 dna。这无疑加速了细胞的衰老与死亡。 第二章 文献综述 7 2.1.3.2 线粒体 线粒体是细胞生命活动中心， 内有三羧酸循环、 氧化磷酸化及呼吸链等一系列酶系， 更是细胞的能量中心，因而也是产生大量氧自由基的场所16。线粒体内膜脂质被自由基 过氧化作用后，可造成膜流动性减少，酶活性改变及 atp 和 adp 偶合载体流的减少；线 粒体内膜存在呼吸电子传递链的各个组分，在生理条件下，从脱氢酶反应中，电子由氢 裂解出来， 通过呼吸链组分， 最后在细胞色素 c 氧化酶上以电子将氧还原成两分子 h2o。 然而，当电子在呼吸链传递过程中部分电子在途中泄漏，并使氧以单价还原的形式生成 o2-，这种现象称为“ 电子漏”31。线粒体呼吸链是细胞内自由基的主要发生器之一， 又易被自由基损伤，引起呼吸链电子传递出现短路，其结果使 atp 生成减少，从而影响 细胞的功能。 实验研究还观察到 no 及氮类对线粒体也有较大影响。 生理剂量的 no 可干扰细胞色素 c 氧化酶这种细胞信号形式，影响线粒体呼吸，调 节细胞凋亡进程30。paradies32以心肌为例研究自由基对线粒体的影响。当心肌暴露于 大量自由基时，细胞色素 c 氧化酶的活性及心肌磷脂含量明显降低，增加心肌磷脂含量 可完全恢复由自由基引起的失活的细胞色素 c 氧化酶酶活性。心肌磷脂是细胞色素 c 氧 化酶复合体维持功能所必需的物质，自由基通过对心肌磷脂的过氧化作用降低细胞色素 c 氧化酶活性，从而损害线粒体呼吸链，引起线粒体损伤，导致机体衰老。 2.1.3.3dna 和蛋白质 核酸和蛋白质产生直接的氧化破坏作用，对核酸的氧化、交联，使dna发生断裂、 突变以及热稳定性改变等，从而严重影响遗传信息的正常转录和翻译，使蛋白质表达量 降低甚至消失，或者产生突变蛋白质，而蛋白质合成减少是老年性记忆力减退、智力障 碍以及肌肉萎缩等的重要原因之一33 ， 34。对蛋白质的氧化破坏可使蛋白质肽链断裂、 蛋白发生分子内或分子间交联及蛋白质二级、三级和四级结构破坏，折叠减少，无规律 卷曲增加等，从而导致:（1）酶蛋白失活成为另一种催化错误反应的酶；（2）出现某 些具有异质性的蛋白质，引起自身免疫反应；（3）使结缔组织的结构蛋白发生广泛交 联，其理化性质发生改变，导致血液和组织间的物质交换减少，使器官组织加速衰老退 化35 ， 36。总之，自由基对蛋白质和核酸的影响涉及面很广，后果严重而复杂，是自由 基与衰老联系的重要纽带，是衰老形成的重要原因之一。 武汉体育学院硕士学位论文 8 2.1.3.4 细胞凋亡 自由基诱导细胞凋亡，已被众多研究所证实。lennon 等对 4 种不同造血细胞 hl60、 u937、molt-4 和 daudi 进行体外培养，发现自由基直接引起细胞凋亡，其机理可能与自 由基引起 ca 2 + 内流有关。 albina 等对大鼠的研究发现细胞内源性和外源性 no 的增加可 导致巨噬细胞、 单核细胞的凋亡， 这可能源于自由基对 dna 的直接损伤。 hockenbery 等 发现过度表达谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)的小鼠 il-3 依赖的 fl5、fl12 细胞能在缺 乏 il-3 的情况下存活，说明清除自由基的抗氧化活性物质可阻止细胞凋亡。papiha 等 认为自由基可能通过释放一种特殊的“细胞自杀蛋白”或“凋亡诱导因子”来诱导细胞 凋亡。 2.2 运动产生自由基 1978 年 dillard 等首次报道人以 50%最大摄氧量负荷踏车 1 小时后， 呼出气中脂 质过氧化物或戊烷含量显著增加40。1982 年 davies 等应用 ers 技术直接证实了力竭运 动后肝脏、肌肉中的自由基明显增加，从而找到了运动诱发自由基生成增多的直接证据 40。剧烈运动时耗氧量剧增，氧代谢必然会产生自由基。另外，由于剧烈运动使得体内 局部组织缺氧及代谢产物的堆积影响了线粒体氧化的功能，同时氧气大量消耗产生了大 量的单线态氧，从而激发一系列的自由基反应。 毛文慧的研究发现40，在适量的强度下，机体抗氧化酶的活性随训练强度增加而增 加，超过了这个强度，酶的活性反而降低。王安利等研究游泳对不同月龄小鼠自由基代 谢的影响，经 7 周有氧(游泳) 训练，较系统地观察有氧运动训练对不同年龄小鼠体内 自由基代谢的影响，认为:（1）小鼠在生长过程中，体重、器官重量及 sod 活性的变化 趋势表现为先升高后降低， 表现为青年组非常显著低于成年组， 成年组显著高于老年组； （2）有氧训练可以促进体内氧化与抗氧化的平衡向有利于机体的方向发展； （3）有氧 训练可以抑制老年鼠肝、肺内因增龄引起的抗氧化能力的降低，能延缓肝、肺的衰老过 程。quin-tanichia 报道了大鼠耐力训练后骨骼肌和心肌 sod、cat、gsh-px 活性升高。 higincihil 报道了 3 个月耐力训练后大鼠骨骼肌 sod 活性增加 14 %37%，同时线粒体 有氧氧化酶类的活性增加 100 %左右。曹国华等研究了一次急性有氧或无氧运动对人体 内自由基生成与清除的影响， 14 名大学生运动员在功率自行车上分别进行一次急性或无 氧运动前后，测定血浆和和红细胞 mda， 红细胞 mda 和红细胞 gpx 增强41。宾晓农等 第二章 文献综述 9 在一次力竭负重游泳运动后测定小鼠心、肝、肾组织中 mda 增加， 发现力竭性运动可 使小鼠心肝肾组织中 mda 含量增加。 ullrey 等报告了运动造成自由基水平提高， 致使线 粒体膜完整性丧失， 线粒体代谢机能下降，从而损害了线粒体呼吸链 atp 产生过程， 使细胞能量生成障碍41。以上资料表明，有氧代谢运动可增加抗氧化酶的活性并提高酶 的合成量，从而清除新陈代谢和剧烈运动时产生的大量自由基，降低细胞 lpo 水平，预 防衰老，提高运动能力，抵御运动性损伤42。剧烈运动可增加机体氧耗并引起丙二醛含 量的明显升高，从而产生大量自由基。当人或运动在剧烈运动时，机体清除自由基的能 力不足以平衡运动过程中自由基的生成，引起脂质过氧化增加，积累过多而造成对机体 的损伤。 2.3 衰老的自由基理论 衰老的自由基理论是 1965 年由 harmand 提出的43。这个理论认为体内具有一整套 产生和清除自由基的平衡体系，机体随着年龄增大的退行性变是由于受到内、外环境的 影响以及机体抗氧化酶的活性不断下降使体内自由基物质过剩的结果。 研究发现在衰老人群的脑组织中神经元细胞浆、 星型胶质细胞中 mda 的含量明显增 高。用免疫电镜可观察到神经元的 mda 呈帽状结构围绕脂褐素沉积，mda 围绕神经胶质 中呈线性分布，在连续切片中还观察到老年斑的中心也有 mda 的沉积。神经元的 mda 沉 积和 n(epsilon)-镁甲基赖氨酸有关。而青年人群中却几乎检测不到 mda 的沉积。mda 是脂质过氧化作用的代谢产物，在衰老人群大脑中检测到其浓度明显增高，可以说明其 mad 是检测是否衰老的标志30 ， 44。 测量不同月龄的雄性小鼠心肌 cu ，zn-sod、gsh-px 活性发现，运动后各月龄小鼠 心肌 cu ，zn-sod 及 gsh-px 活性均增加，而静息时测量的结果却是随增龄上述酶活性 有下降趋势。 此外心肌的 cat、 gsh、 与心肌供能有关的柠檬酸盐脱氢酶、 苹果酸脱氢酶、 乳酸脱氢酶及心肌蛋白含量也呈年龄相关的降低。心肌匀浆液及线粒体中 mda 的含量在 老年组小鼠中明显增加。由此可见心肌的抗氧化能力在衰老过程中逐渐降低30 ， 45。 大量研究结果证明， 自由基是衰老的决定因素33 ， 46-48， 许多物种 o 2 - 的产生速率与 其衰老密切相关。如 poeggeler 等的研究结果表明，那些 oh -和 o 2 - 产生速率低而 oh-和 o2 -清除机制完备的有机体存活时间明显较长34， 46-48。sohal 等50对 7 种哺乳动物肾和 心线粒体产生 o2 -和 h 2o2 的速率和最大寿命间的关系研究表明，自由基与最大寿命间呈 高度负相关(r=-0.83-0.92)，从肝线粒体产生 h2o2实验中也发现了两者负相关的现象， 武汉体育学院硕士学位论文 10 从三个主要器官线粒体得到的相同结果进一步证明自由基促进衰老28。 随年龄的增长， 人体内自由基水平呈增长趋势， 同时自由基清除机制却呈退化趋势， 结果造成体内自由基大量积聚。所以自由基对机体健康的危害作用渐趋严重，引发了机 体多种生理功能的障碍，促进了多种老年疾病(如动脉粥样硬化、心脑血管疾病、脑神 经细胞变性、糖尿病以及肿瘤等)的发生、发展，导致机体的衰老，直至死亡。 在整个衰老过程中，自由基引起大量的细胞衰老、死亡，近年来已有大量资料表明 这些细胞的衰老、 死亡许多属于自由基引发的细胞凋亡。 今后， 机体衰老过程中自由基、 突变以及其它有害刺激因素启动细胞衰老凋亡的分子机制，这些过程被调控的分子机理 以及利用衰老基因与长寿基因的研究成果进行的基因治疗方面研究等将成为抗衰老研 究方面的极为重要的组成部分。 第三章 材料与方法 11 第三章第三章 材料与方法材料与方法 3.1 实验对象及分组 自华中科技大学同济医学院购买雄性健康sd大鼠55只， 其中 3月龄大鼠35只， 24 月龄 20 只，体重 250-300g，湖北省实验动物合格证书号码：00001953。24 月龄大鼠分 为老年组 20 只，其他大鼠按照随机方式分为：对照组 10 只、有氧运动组 10 只、过度 运动组 15 只；按国家标准齿类动物饲料分笼喂养，自然光照，房内温度控制为 222， 相对湿度为 4060。对照组不进行任何训练，处于常规笼中生活状态。 3.2 实验设备和仪器 表表 1 主要实验材料主要实验材料与试剂与试剂 材料与试剂 生产厂家 细胞色素 c 氧化酶试剂盒 上海杰美基因有限公司 谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px) 上海杰美基因有限公司 超氧化物歧化酶(sod) 上海杰美基因有限公司 蛋白定量测量试剂盒 上海杰美基因有限公司 表表 2 主要实主要实验仪器验仪器 仪 器 名 称 型号/规格 产 地 台式离心机 tgl-16c 上海安亭科学仪器厂 可调高速匀浆机 fhs-2 江苏金坛市晶玻实验仪器厂 微型旋涡混合器 wh-1 上海沪西分析仪器厂 自动双重蒸馏水器 s2-93 上海亚荣生化仪器厂 电热恒温干燥箱 skg-02 湖北黄石恒丰医疗器械有限公司 电子天平 bs 北京赛多利斯仪器有限公司 微量移液器 eppendorf 德国 eppendorf 公司 不锈钢电热蒸馏水器 sz-93 上海亚荣生化仪器厂 液氮生物容器 yds35 成都金凤液氮容器有限公司 血糖测试仪 随手测 美国强生 酶标仪 rs-232c 美国 thermo multiskan mk3 武汉体育学院硕士学位论文 12 3.3 实验方法 3.3.1 训练造模 3.3.1.1 所需物品 玻璃钢游泳池（60cm80cm100cm） 、温度计、计时器、摄像机、漏勺、记号笔、 橡皮筋、130 克不等的若干铅块和铁丝、标准大鼠饲养笼。 3.3.1.2 训练条件 （1）对照组、老年组常规饲养，不运动。 （2）有氧运动组：进行中等强度训练。第 1、2 周进行适应性训练，第 3 周到第 10 周保持运动量 60min/d。 每周训练 6 天， 休息 1 天。 运动条件为玻璃钢游泳池， 水深 45cm， 水温控制在 301； （3）过度运动组：运动条件与有氧训练组相同。从第 3 周开始，过度训练组开始 尾部负重（负重物为铅块加铁丝） ，先增加体重的 1%，并以七天为一个单位逐步增加， 直到增至体重的 6%，然后保持到第 10 周。 3.3.1.3 训练模型 参考胡亚哲8，geisa c.s.v. tezini 等报道的训练方法，并根据情况有所修改。先适 应性喂养 2 天，然后开始游泳训练，每周训练 6 天，休息 1 天。时间及方法见下表： 表表 3 实验实验运动运动组大鼠组大鼠训练量计划表训练量计划表 有氧运动组 过度运动组 日 期 时 间 负 重 时 间 负重（体重%比） 1 10min 10min 2 15min 15min 3 20min 20min 4 25min 25min 5 30min 30min 第 1 周 6 35min 35min 1 40min 40min 2 45min 45min 3 50min 50min 第 2 周 4 55min 有 氧 运 动 组 不 负 重 55min 适 应 训 练 不 负 重 第三章 材料与方法 13 5 60min 60min 6 60min 60min 第 3 周 1% 第 4 周 2% 第 5 周 3% 第 6 周 4% 第 7 周 120min/d 5% 第810周 1-6 60min/d 150min/d 6% 注：训练时如果大鼠出现力竭表现（沉入水下 10s 不能上浮）立即捞出水面，休息 5 分钟后继续训 练到要求的时间。游泳训练中途死亡的大鼠，处理后收集到超低温冰箱以待检查原因。 3.3.2 实验动物的标本采集 末次运动后次日按以下步骤取材。 图图 1 样品采集图示样品采集图示 3.3.3 检测指标及方法 3.3.3.1 一般情况观察 造模过程中仔细观察各组实验大鼠并详细记录其神态、皮毛、眼神、运动状态，并 断尾断尾取血取血 有氧运动组有氧运动组 过度运动组过度运动组 老年组老年组 麻醉大鼠麻醉大鼠，开胸取血开胸取血 摘取心脏摘取心脏，洗净组织洗净组织， 滤去水分滤去水分 取左心室肌取左心室肌 200mg，放入标签放入标签， 置于液氮中冻存置于液氮中冻存待测待测 对照组对照组 测血糖测血糖 血常规分析血常规分析 武汉体育学院硕士学位论文 14 准确记录对照组、有氧运动组、过度运动组大鼠每日进食量（g/day）及每周体重变化， 过度运动组大鼠每次负重训练前准确称量体重。 3.3.3.2 血糖 造模结束次日，对照组、老年组、有氧运动组、过度运动组四组大鼠在进行麻醉处 死前均用手术刀断尾取血，用血糖仪采血进行检测血糖，并做好记录。 3.3.3.3 超氧化物歧化酶（sod） 超氧化物歧化酶（sod）是体内的重要金属酶抗氧化剂，催化超氧化物阴离子发生 歧化作用，生成过氧化氢（h2o2）和分子氧（o2） ，破坏自由基，防止氧毒性。本实验 检测试剂主要通过比色测定高度可溶性的四唑盐在超氧化物阴离子作用下产生的水溶 性甲臢燃料，来定量分析黄嘌呤氧化酶的还原效率，由此检测超氧化物歧化酶活性。 图图 2 超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶（sod）检测图示检测图示 3.3.3.4 谷胱甘肽过氧化物酶（gsh-px） 取待测心肌组织 离心后取上清液 蛋白定量 严格按照试剂盒 要求添加试剂 即刻放入酶标仪检测 37避光孵育 20 分钟 酶标仪波长 450nm 对照组 有氧运动组 过度运动组 老年组 室温避光孵育 5 分钟 酶标仪波长 595nm 第三章 材料与方法 15 谷胱甘肽过氧化物酶（gsh-px）属于硒蛋白，在细胞浆和线粒体组分中表达，其 功能在于催化各种过氧化物的还原，包括氢过氧化物、过氧化氢等，保护细胞免受氧化 损害。本实验采用谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽还原酶的偶联反应系统中还原型烟酰 胺腺嘌呤二核甘酸磷酸（nadph）氧化后峰值的降低，用比色法来测定在组织中酶活 性的含量。 图图 3 谷胱甘肽过氧化物酶谷胱甘肽过氧化物酶（gsh-px）检测图示检测图示 3.3.3.5 细胞色素 c 氧化酶 细胞色素 c 氧化酶存在于真核细胞线粒体上，主要通过氧化磷酸化为细胞提供能 量。基于底物还原型细胞色素 c，受到细胞色素 c 氧化酶的催化，转化为氧化型细胞色 素 c 后，激光峰值降低，从而检测样品中酶的活性。 取待测心肌组织 即刻研磨组织至粉末 即刻放进预冷的匀浆器匀浆后添加试剂 4离心机离心 10 分钟后取上清液 取 10 微升进行蛋白定量 严格按照试剂盒要 求添加试剂 即刻放入酶标仪检测 25孵育 2 分钟 酶标仪波长 340nm 对照组 有氧运动组 过度运动组 老年组 武汉体育学院硕士学位论文 16 图图 4 细胞色素细胞色素 c 氧化酶检测图示氧化酶检测图示 3.4 统计方法 实验数据利用 spss13.0 统计软件进行分析。采用方差分析、独立 t 检验进行组间比 较。 取待测心肌组织 对照组 有氧运动组 过度运动组 老年组 即刻研磨组织至粉末 即刻放进预冷的匀浆器匀浆后添加试剂 强力涡旋震荡 30 秒后至于冰槽孵育 30 分钟， 期间每 10 分钟涡旋震荡 30 秒 取 10 微升进行蛋白定量 严格按照试剂盒 要求添加试剂 即刻放入 酶标仪检测 室温孵育 2 分钟 酶标仪波长 550nm 4离心机离心 5 分钟后取上清液 第四章 实验结果 17 第四章第四章 实验实验结果结果 4.1 一般情况观察 4.1.1 动物实验数量观察 参加实验的 55 只 sd 实验大鼠，进入实验结果分析 47 只（死亡大鼠除外） 。其中， 对照组 10 只，有氧运动组 10 只，过度运动组 10 只，老年组 17 只。 4.1.2 实验动物的形态观察 4.1.2.1 对照组 神态安静，眼睛有神，皮毛光洁整齐，活泼好动；随生长时间延长，进食量增加， 自然生长，不运动，体重明显增加。 4.1.2.2 有氧运动组 神态炯炯，眼睛有神，皮毛光洁顺滑，异常兴奋。能顺利完成训练任务，大鼠出水 后异常兴奋， 一分钟后方能安静， 并能通过大幅度抖动和甩动动作， 迅速甩干身上的毛， 再自行梳理。进食量增加，自然生长，体重明显增加。 4.1.2.3 过度运动组 普遍神态倦怠，双眼暗淡无光，毛发稀疏、易脱落，体型消瘦，无力，且易受惊吓。 训练结束时，基本都趴在笼底大口的喘息，心脏跳动起伏很大。很久才能自行梳理、甩 干皮毛，对运动的反应较差甚至极差；随着运动量和时间的增加，进食量减少，生长缓 慢，体重明显小于对照组和有氧运动组；造模后期，每次捞出水时，都表现为精疲力尽， 并且所需休息的时间逐渐延长。 4.1.2.4 老年组 神态平平，眼睛无神，皮毛不光滑，有涩感，且易脱落，易受惊吓，自然生长，不 运动。 武汉体育学院硕士学位论文 18 图图 5 各组大鼠实验照片各组大鼠实验照片对比对比 图图 6 对照组对照组、运动组和过度运动组进食量运动组和过度运动组进食量、模前体重和模后体重的比较图模前体重和模后体重的比较图 表表 4 各组大鼠造模前后各组大鼠造模前后进食量进食量、体重体重的变化的变化 对照组 有氧运动组 过度运动组 老年组 进食量 g/day 35.800.39 38.330.29* 48.770.36* 自由进食 造模前体重 g 258.002.58 251.002.94 260.371.88 无体重记录 造模后体重 g 461.0017.58 486.0010.29 420.839.67* 无体重记录 0 100 200 300 400 500 600 进食量 模前体重 模后体重 * 对照组 有氧运动组 过度运动组 第四章 实验结果 19 注： *表示与对照组相比（p0.01） ；表示与有氧训练组相比(p0.05） 从表 4 中可以看出，过度运动组大鼠日平均进食量明显高于对照组、有氧运动组。 其进食量（48.77 克)与对照组（35.80 克）相比具有显著性差异（p0.01） 。 在体重方面，造模前各组大鼠体重无明显差异。造模后对照组和有氧运动组的体 重明显增加，分别达 461 克和 486 克；过度运动组大鼠体重虽然也增加，但增加缓慢， 仅为 420.83 克，其体重与对照组和有氧运动组相比，具有显著性差异(p0.05） 。 4.2 血糖 造模训练结束后，经检测过度运动组血糖值明显低于对照组、有氧运动组，甚至老 年组。并且过度运动组血糖显著低于对照组、有氧运动组（p0.05） ，老年组血糖值显 著低于对照组（p0.05） 。 4.5 5 5.5 6 6.5 7 对照组有氧运动组过度运动组老年组 各 组 血 糖 变 化 值 图图 7 各组大鼠心室肌血糖值及显著性比较结果各组大鼠心室肌血糖值及显著性比较结果 表表 5 实验大鼠各组血糖变化表实验大鼠各组血糖变化表（单位单位：mol/l） 安静对照组 有氧运动训练组 过度运动训练组 老年对照组 血糖 6.270.20 5.830.10 5.380.07* 5.680.13* 注： *表示与对照组对比有显著性差异 （p0.05） ； 表示与有氧运动组对比有显著性差异 （p0.05） ； * * 武汉体育学院硕士学位论文 20 4.3 超氧化物歧化酶（sod） 从表6中可以看出，造模训练结束后，过度运动组大鼠心肌中sod的含量明显低于 对照组和有氧运动组，尤其是过度运动组的sod值与对照组相比较具有显著性差异（p 0.05） 。这一结果与文献报道40基本一致。老年组sod的含量显著低于与对照组、有 氧运动组（p0.05） 。过度运动组与老年组的sod值没有显著差异性，但过度运动组的 sod值明显接近于并高于老年组。 0.7 0.8 0.9 1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 对照组有氧运动组过度运动组老年组 sod 变 化 值 图图 8 各组大鼠心肌细胞内各组大鼠心肌细胞内 sod 值值及显著性比较结果及显著性比较结果 表表 6 各组大鼠心肌细胞内超氧化物歧化酶值各组大鼠心肌细胞内超氧化物歧化酶值（单位单位：微克微克/ /毫毫克蛋白克蛋白） 注： *表示与对照组对比有显著性差异 （p0.05） ； 表示与有氧运动组对比有显著性差异 （p0.05） ； 4.4 谷胱甘肽过氧化物酶（gsh-px） 造模训练结束后，有氧运动组、过度运动组和老年组与对照组相比均具有显著性差 异（p0.05） 。过度运动组大鼠心肌中gsh-px的含量明显低于对照组和有氧运动组以 及老年组，并均具有显著性差异（p0.01） 。过度运动组与老年组的gsh-px值明显接近 于甚至还低于老年组。有氧运动组大鼠心肌中gsh-px的含量与对照组相比也具有显著 性（p0.05） 。老年组gsh-px的含量显著低于对照组、有氧运动组（p0.05） 。这一结 对照组 有氧运动组 过度运动组 老年组 sod 1.4950.33 1.4620.46 1.1100.26* 1.0540.46* * * 第四章 实验结果 21 果与麻春雁55文章的检测结果一致。 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 对照组有氧运动组过度运动组老年组 gsh-px变化值 图图 9 各组大鼠心肌细胞内各组大鼠心肌细胞内 gsh-px 值值及显著性比较结果及显著性比较结果 表表 7 大鼠心肌内谷胱甘肽过氧化物酶值大鼠心肌内谷胱甘肽过氧化物酶值（单位单位：微摩尔微摩尔 nadph/分钟分钟） 注： *表示与对照组对比有显著性差异 （p0.05） ； 表示与有氧运动组对比有显著性差异 （p0.05） ； 表示与老年组对比有显著性差异（p0.05） 。 4.5 细胞色素 c 氧化酶 过度运动组心肌中细胞色素 c 氧化酶明显低于对照组、有氧运动组、老年组。过度 运动组与对照组、有氧运动组、老年组相比具有显著性差异（p0.01） ，过度运动组的 细胞色素 c 氧化酶值显著低于老年组（p0.01） 。老年组细胞色素 c 氧化酶与对照组和 有氧运动组相比也具有显著性差异（p0.05） 。 对照组 有氧运动组 过度运动组 老年组 gsh-px 0.5180.066 0.4560.061* 0.2320.035* 0.3680.124* * * * 武汉体育学院硕士学位论文 22 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 对照组 有氧运动组 过度运动组 老年组 细胞色素c氧化酶值变化 图图 10 各组大鼠心肌细胞内各组大鼠心肌细胞内细胞色素细胞色素 c 氧化酶氧化酶值值及显著性比较结果及显著性比较结果 表表 8 各组大鼠心肌细胞内细胞色素各组大鼠心肌细胞内细胞色素 c 氧化酶值氧化酶值（单位单位：微摩尔微摩尔/分钟分钟） 注： *表示与对照组对比有显著性差异 （p0.05） ； 表示与有氧运动组对比有显著性差异 （p0.05） ； 表示与老年组对比有显著性差异（p0.05） 。 对照组 有氧运动组 过度运动组 老年组 细胞色素 c 氧化酶 0.0500.003 0.0540.007 0.0250.003 * 0.0420.012* * * 第五章 讨论与分析 23 第五章第五章 讨论讨论与分析与分析 5.1 各组大鼠日常生活变化特征及意义 郭林等57的研究认为，运动过程本身是一种对机体的损害过程，而运动对机体