（细胞生物学专业论文）猪或小鼠卵母细胞减数分裂成熟过程中pkc和mapk信号通路的对话及γ微管蛋白定位研究.pdf

刖茜 2 0 0 0 年人类基因组草图绘制成功，生命科学进入后基因组时代。生命科学 家不仅开始从细胞整体水平上探索基因和蛋白质的功能，对发育生物学的研究也 成为当今生命科学的热点。个体是怎样从一个受精卵发育而来的? 这是一个既古 老又全新的课题，随着科学技术的不断进步，随着个体发育分子机制的不断揭示， 相信在不久的将来，人们会找到这一问题的答案。 受精生物学的研究正是这一课题的起点，精子的穿入神奇地激活了卵子的活 性，就像童话中王子的一吻唤醒了沉睡的公主，从此开始了一个人类得以生息不 断的伟大工程。对受精生物学的研究近年来取得了较大的进展，已经从单纯的形 态观察深入到了分子机制的研究阶段，特别是应用爪蟾卵母细胞提取液建立的无 细胞培养系统为受精生物学的研究提供了许多宝贵的资料。精卵的结合和识别从 其本质上讲就是一个细胞外信号向胞内传导的过程，人们发现，在体细胞增殖分 化中起重要作用的信号通路在卵母细胞中也发挥着重要作用，但是相同的信号通 路在卵母细胞中又有其独特的特点。 在我攻读硕士学位期间，对卵母细胞体外成熟和受精过程中卵丘细胞中的蛋白 激酶c 和丝裂原活化蛋白级联激酶信号通路的关系以及g a m m a - 微管蛋白做了一 点最基础的研究工作，相对于科学的大课题，这一点研究工作实在算不了什么， 但是正是从这最初级的研究中我开始学习科学研究的方法和思路，开始思索大课 题和小课题之间的关系，我想这应该是我最大的收获。因为是初次从事科学研究， 并且时间有限，数据的整理，论文的写作都比较仓促，一定存在不少错误之处， 还请大家提出宝贵意见。谢谢! 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果，据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已发表或撰写过的研究成果，也不包含其 他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确地说明并表示谢意。 学位论文作者签名壶小隋 导师签字 签字日期：2 0 0 4 年乒月z 日 签字日期：20 0 4 年乒月2 舶 中文摘要 在体内，哺乳动物卵母细胞的发育停滞在第一次减数分裂前期的双线期。在 周期性激素的诱导下，一部分卵母细胞发生生发泡破裂，恢复减数分裂。在这一 过程中，卵丘细胞中的蛋白激酶( p k c ) 和丝裂原活化蛋白激酶( m a p k ) 在卵丘包 裹的卵母细胞减数分裂过程中具有重要作用，但是它们之间的相互调节及相互作 用关系并不清楚。本实验主要研究了1 ) 卵丘细胞中m a p k 是否参与了p k c 激活 的减数分裂恢复；2 ) 在激素诱导的减数分裂恢复过程中p k c 对m a p k 活性的调节 作用；3 ) 卵丘细胞中p k c 和m a p 诱导减数分裂恢复的可能作用模式。体内卵母 细胞减数分裂的恢复由于受到卵泡内抑制性微环境的影响而发生阻滞，激素的作 用打破这一阻滞而重新启动减数分裂。本实验应用一种体外诱导模型模拟这一过 程。将从卵巢中取出的猪卵母细胞培养在含有减数分裂恢复抑制剂的培养液中， 然后用p k c 的激活剂和激素诱导猪卵母细胞的减数分裂恢复，用蛋白质免疫印迹 检测m a p k 的活性。我们的结果表明p k c 的激活剂，豆蔻酰佛波醇乙脂( p m a ) 可以 诱导猪卵母细胞减数分裂恢复，同时激活卵丘和卵母细胞中的m a p k 活性，而这 一过程可被p k c 的抑制剂c h e l e r y t h r i n e 和c a l p h o s t i nc 所抑制。同时，m a p k 上游激酶m e k 的抑制剂u 0 1 2 6 也可以抑制p m a 诱导的卵母细胞减数分裂恢复和卵 丘细胞中的m a p k 活性，这说明p k c 诱导的卵母细胞减数分裂恢复可能是通过激 活卵丘细胞中m a p k 的活性实现的。在激素诱导的减数分裂恢复过程中，p k c 活 性抑制剂和m e k 抑制剂都可以抑制卵丘细胞中m a p k 的活性，以及减数分裂的恢 复。这说明p k c 和姒p k 都参与了激素诱导的减数分裂恢复。另外，蛋白质合成 抑制剂放线菌酮( c h x ) 抑制了激素和p m a 诱导的卵母细胞减数分裂恢复，却没 有抑制卵丘细胞中m a p k 的活性，而在相同条件下，裸卵的g v b d 却不被抑制。这 说明，当卵丘细胞中p k 激活后，可能激活了某种的蛋白质的合成。综上所述， 体内周期性的激素作用于卵母细胞，激活了卵丘细胞中的p k c ，p k c 又激活了 m a p k ，活化的m a p k 可能通过激活某种蛋白质台成途径，这种与减数分裂恢复密 切相关的蛋白质可能通过缝隙连接或旁分泌形式传递给卵母细胞导致减数分裂 的重新启动。 y 一微管蛋白是微管蛋白家族的成员之一，在微管的晶核起始过程中具有重 要作用。本研究应用激光共聚焦显微术研究了小鼠卵母细胞减数分裂成熟、受精 及早期胚胎发育过程中y 一微管蛋白的动态变化，以及在第一次减数分裂纺锤体 形成过程中n 一微管蛋白和y 一微管蛋白的共定位情况。结果表明，y 一微管蛋白 均匀地分布在生发泡期( g v 期) 小鼠卵母细胞中；生发泡破裂( g v b d ) ，y 一微 管蛋白呈星点状分布于卵胞质及凝集的染色体周围，至前中期，则迁移至纺锤体 的两极；后期至末期，y 一微管蛋白逐渐解凝集，定位于分开的染色体之间。y 一 微管蛋白在第二次减数分裂及受精后的定位与第一次减数分裂过程相似。与g v 期卵母细胞不同的是，在早期胚胎的间期卵裂球中，y 一微管蛋白呈星点状分布。 另外，第一次减数分裂纺锤体组装过程中，在卵胞质中检测到定位几乎完全重叠 的点状分布的n 一微管蛋白和v 一微管蛋白，而在凝集的染色体的位置可见。一 微管蛋白以y 一微管蛋白为中心向四周辐射，随着y 一微管蛋白向纺锤体两极迁 移，a 一微管逐渐组织形成中期纺锤体。以上结果表明，在小鼠卵母细胞减数分 裂成熟、受精、及早期胚胎发育过程中，y 一微管蛋白在微管晶核起始及纺锤体 形成过程中起重要作用。 关键词：蛋白激酶c ，丝裂原活化蛋白激酶，信号通路，y 一微管蛋白，减数分裂 分类号：q 4 9 1 a b s t r a c t f u l l yg r o w nm a m m a lj a no o c y t e sa r ea r r e s t e da tt h ep r o p h a s eo ft h e f i r s tm e i o t i cd i v i s i o nw i t h i nt h eo v a r i a nf o l l i c l e s i nv i v o ，m e i o s i s r e s u m p t i o no fp a r to fo o c y t e so c c u r si nr e s p o n s et ot h ep r e o v u l a t o r ys u r g e o fg o n a d o t r o p i n s p r o t e i nk i n a s ec ( p k c ) a n dm i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i n k i n a s e ( m a p k ) i nc u m u l u sc e l l sa r ei n v o l v e di nf s h i n d u c e dm e i o t i c r e s u m p t i o no fc u m u l u s e n c l o s e do o c y t e s ( c e o s ) ，b u tt h e i rr e g u l a r i o na n d c r o s s t a l kareu n k n o w n t h ep r e s e n te x p e r i m e n t sw e r ed e s i g n e dt o i n v e s t i g a t e1 ) t h ep o s s i b l ei n v o l v e m e n to fm a p kc a s c a d ei np k c i n d u c e d m e i o t i cr e s u m p t i o n ：2 ) t h er e g u l a t i o no fp k co nm a p kf u n c t i o ni n f s h i n d u c e do o c y t em a t u r a t i o n ：a n d3 ) t h ep a t t e r no fp k c a n dm a p kf u n c t i o n i ni n d u c e d m e i o t i cr e s u m p t i o no fp i gc u m u l u so o c y t ec o m p l e x s ( c o c ) i nt h i s e x p e r i m e n ta n i n d u c e dm e i o s i s m o d e lwasu s e dt om i m i ct h e g o n a d o t r o p i n t r i g g e r e dr e s u m p t i o no fo o c y t e si nv i v o ，w h i c hi si n h i b i t e d b yt h ei n h i h i t o r yo v a r i a nf o l l i c u l a re n v i r o n m e n t p k ca c t i v a t o r s ，p h o r b o l 1 2 一m y r e s t a t e1 3 一a c e t a t e ( p m a ) i n d u c e dt h em e i o t i cr e s u m p t i o no fc e o sa n d a c t i v a t i o no fm a p ki nc u m u l u sc e l l s ，w h i l et h i se f f e c tc o u l db ea b e l i s h e d b yp k ci n h i b i t o r s ，c a l p h o s t i nca n dc h e l e r y t h r i n e ，o rm e ki n h i b i t o ru 0 1 2 6 t h e s er e s u t ss u g g e s tt h a tp k cm i g h ti n d u c et h em e i o t i cr e i n i t i a t i o no f c e o sb ya c t i v a t i n gm a p ki nc u m u l u sc e l l s b o t hp k ci n h i b i t o r sa n du 0 1 2 6 in h i b i t e dt h ef s h i n d u c e dg v b do fo o c y t e sa n dm a p ka c t i v a t i o ni nc u m u u s c e l s s u g g e s t i n gt h a tp k ca n dm a p ka r ei n v o l v e di nf s h i n d u c e dg v b do f p i gc e o s p r o t e i ns y n t h e s i si n h i h i t o rc y c o h e x i m i d ei n h i b i t e df s h o r p m a i n d u c e do o c y t em e i o t i cr e s u m p t i o n b u tn o tt h em a p ka c t i v a t i o ni n c u m u l u sc e l l s t h u s ，w h e na c t i v a t e db yf s ha n dp k c ，m a p km a ys t i m u l a t et h e s y n t h e s i so fs p e c i f i c p r o t e i n sa n dt h e nt h es e c r e t i o no fc e r t a i n m e i o s is - a c t jv a t i n gs u b s t a n c e b yc u m u l u sc e l l s t a k e nt o g e t h e r w e r e v e a l e dah y p o t h e s i z e ds i g n a l i n gp a t h w a yt h a tm e d i a t e st h ef s h in d u c e d m e i o t i cr e s u m p t i o no fp i go o c y t e s ：a f t e ra c t i n go nc u m u l u sc e l l s ，f s h 3 l e a d st ot h ea c t i v a t i o no f 姒p kw i t ht h em e d i a t i o no fp k c a c t i v a t i o no f l a p ki n d u c e st h es y n t h e s i so fc e r t a i np r o t e i n si nc u m u l u se e l l s t h e u n d e f i n e df a c t o ri n d u c e st h eo o c y t e st or e s u m em e i o s i s y t u b u l i n ， am e m b e ro ft h em i c r o t u b u l e s u p e r f a m i l y ， i sa p e r i c e n t r i o l a rc o m p o n e n tw h i c hw a sc o n s i d e r e dt ob ee s s e n t i a lf o r m i c r o t u b u l en u c l e a t i o n a tt h ep r e s e n tr e s e a r c h ，t h ed y n a m i c so fy t u b u l i nd u r i n gm o u s eo o c y t em e i o t i cm a t u r a t i o n ，f e r t i l i z a t i o n ，a n de a r l y c l e a v a g ea sw e l la st h ec o l o c a l i z a t i o no fy t u b u l i na n da t u b u l i n d u r i n gt h ef o r m a t i o no fm e i o t i cis p i n d l ew e r es t u d i e db yc o n f o c a l m i c r o s c o p y w ef o u n dt h a ty t u b u l i nw a se v e nd i s t r i b u t e di nt h eg vs t a g e o o c y t e ，b u ti ta g g r e g a t e di n t os o m ed o t sd u r i n gt h ei n t e r p h a s eo fe a r l y e m b r y o s a f t e rg v b dy t u b u l i nd o t sb o t hl o c a l i z e di nt h ec y t o p l a s ma n d i nt h ev i c i n i t yo ft h ec o n d e n s e dc h r o m o s o m e s ，a n da li g n e da tb o t hp o l e s o ft h em e i o t i cs p i n d l ea tp r o m e t a p h a s e a ta n a p h a s ea n dt e l o p h a s e ，y t u b u li nw a sd e t e c t e db e t w e e nt h es e p a r a t e dc h r o m o s o m e s t h el o c a li z a t i o n o fa t u b u l i nc o r r e l a t e dc l o s e l yt oy t u b u l i n i th a d t h es a m e l o c a l i z a t i o ni nt h ec y t o p l a s ma n dr a d i a t e df r o my t u b u l i nc e n t e rc l o s e t ot h ec h r o m o s o m e sd u r i n gt h em e i o t i cs p i n d l ef o r m a t i o n o u rr e s u l t s s u g g e s t e dt h a ty t u b u l i nw a se s s e n t i a lf o rm i c r o t u b u l en u c l e a t i o na n d s p i n d l ef o r m a t i o nd u r i n gm o u s eo o c y t em e i o s i s ，f e r t i l i z a t i o n ，a n de a r l y e m b r y o s ，a n dt h a ti t sf u n c t i o n sm i g h tb er e g u l a t e db ys o m ec h r o m o s o m e a s s o c i a t e dp r o t e i n s k e yw o r d s ：p k c ，m a p k ，s i g n a lp a t h w a y ，y t u b u l i n ，m e i o s i s c l a s s i f i c a t i o nn u m b e r ：q 4 9 1 4 综述 第一部分：蛋白激酶c 与丝裂原活化蛋白激酶在卵母细胞 减数分裂成熟中的作用研究进展 成年脊椎动物卵巢中的卵母细胞停滞在第一次减数分裂前期的双线期，在每 一个生殖周期，由于垂体促性腺激素的刺激作用，部分卵母细胞恢复第一次减数 分裂，并发育到第二次减数分裂中期( m i i 期) ，再次发生细胞周期阻滞。脊椎 动物的卵母细胞通常在m i i 期发生排卵，直到受精或孤雌激活后卵母细胞才突破 m i i 期阻滞，恢复减数分裂并排出第二极体。通常把从卵母细胞恢复减数分裂到 m i i 期的发育过程称作卵母细胞成熟，把排卵后的卵母细胞突破m i i 期阻滞的发 育过程称作卵母细胞的活化。近年来的研究表明蛋白激酶c ( p k c ) 及丝裂原活 化蛋白激酶( m a p k ) 在卵母细胞减数分裂成熟过程中都具有重要作用。 1p k c 在减数分裂恢复中的作用 p k c 是2 0 世纪8 0 年代初发现的一类广泛地分布于各种真核细胞中的丝苏 氨酸蛋白激酶家族，共有1 2 种亚型，分为三大类：经典型p k c ( cp k c ) ，包括 q ，bi ，1 3i i 和y4 种亚型，活性依赖于c a ”和二酰基甘油( d a g ) ，其中cp k c bi 和bi i 是由同一个基因编码经不同剪切形成的亚型；新型p k c ( r ip k c ) ， 包括6 ，8 ，r l 和u5 种亚型，其激活是d a g 依赖性的，但不需要c a 2 州2 j ； 非典型p k c ( op k c ) 包括 1 和两个亚型。np k ct 是人细胞中与小鼠o p k c 相当的蛋白质。np k c 不受c a 2 + 和d a g 调解。它被一些脂类和第二信使 如磷脂酸所活化，近年来发现一些蛋白质分子特异性的与np k c 的调节区相结 合，调节着ap k c 的活性状态 3 】。所有的p k c 亚型都只具有一条肽链，分子质 量7 0 9 0 k u 。p k c 的分子可分为n 端调节区( 约2 0 - - 4 0k u ) 和c 端催化区( 约 4 5 k u ) 两个区域，按照氨基酸残基序列的保守性，p k c 分子分为4 个保守区 ( c 1 c 4 ) 和5 个可变区( v i v 5 ) 。其中，c 1 区是d a g 和佛波脂结合区，并 含有自我抑制的伪底物序列；c 2 区含有某些亚型特有的c a ”结合位点；c 3 和 c 4 区含有某些亚型特有的a t p 和底物的结合位点，构成催化活性中心。在静息 状态p k c 的伪底物区与自身的催化区结合，使p k c 处于无活性状态，p k c 激活 剂与调节区结合，使伪底物区从催化区释放出来，从而激活p k c 。末活化的p k c 通常分布在细胞质中，活化后转位到细胞膜上，磷酸化其靶蛋白【“。 关于p k c 对卵母细胞成熟的调节已经在许多动物中进行了研究，但结果很 不统一。有的研究表明p k c 抑制卵母细胞减数分裂1 5 “，但另一些结果却显示 p k c 促进减数分裂恢复1 7 ”。目前认为，p k c 在卵丘巧日母细胞复合体( c o c ) 中发挥作用的部位决定它是促进还是抑制减数分裂恢复，即：卵丘细胞中p k c 的激活促进卵母细胞恢复减数分裂，而卵母细胞中p k c 的激活抑制其自身的成 熟。对于无卵丘细胞包裹的卵母细胞，即裸卵，p k c 激活剂豆蔻酰佛波醇乙脂 ( p m a ) 能够强烈抑制g v b d 的发生；而p k c 抑制剂钙感光蛋白c ( c a l p h o s t i nc 1 可以解除p m a 对g v b d 的抑制。有报道表明，只要1 6 2 n m o l l p m a 处理5 分 钟，既可抑制9 0 以上的裸卵恢复减数分裂，其他激活剂也有类似的效果口，“。 但是d o w n s 等报道【”，对于有卵丘细胞包裹的卵母细胞，p k c 激活剂都能促进 g v b d 的发生，而且p k c 激活剂还能显著刺激卵丘细胞的扩展。卵丘细胞和卵 母细胞中p k c 的激活，之所以会对卵母细胞的发育有不同影响，可能是由于两 种细胞中表达不同的p k c 亚型，从而激活各自的下游分子，产生不同的效应。 目前已经知道，p k ca ，b ，6 和亚型是卵丘细胞和卵母细胞都具有的，但 p k ce 是卵丘细胞所特有的i ”。有待进一步深入探讨和研究在卵丘卵母细胞复合 体中各个p k c 亚型的下游通路之间的异同。在卵丘细胞中，p k c 激活以后可能 刺激生成一种促进卵母细胞减数分裂的分子，并通过卵丘细胞与卵母细胞之间的 缝隙连接把该分子运送到卵母细胞内；另外，p k c 也可能诱导卵丘细胞产生一 种分泌性的刺激因子，以旁分泌的形式作用于卵母细胞，促进g v b d 。虽然以上 研究都表明p k c 在卵母细胞成熟过程中发挥作用，但有人认为它可能并不参与 生理条件下有促性腺激素诱导的减数分裂恢复，而仅仅作为一种替代途径，参与 由非性腺激素类配体，如表皮生长因子，诱导的减数分裂成熟。 2m a p k 在减数分裂恢复中的作用 p k c 抑制卵母细胞成熟的机制还不清楚。丝裂原活化蛋白激酶 ( m i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s em a p k ) 是近年来发现的另一种参与减数分裂 调节的重要蛋白激酶。m a p k 又名细胞外调节激酶( e x t r a c e l l u l a r r e g u l a t e d k i n a s e ，e r k ) ，是一类广泛存在于真核细胞中的s e r t h r 蛋白激酶，其激活依赖t h r 和t y r 两个位点的磷酸化。在m a p k 家族中分布最广的是4 4 k u ( e r k l ) 和4 2 k u ( e r k 2 ) 两种亚型，m a p k 信号系统的核心是几种蛋白激酶的顺序磷酸化激活。 m a p k 激酶( m a p m ：，又名m e k ) 是m a p k 的直接激活分子，催化m a p k 的 t y r 和t h r 残基双特异性磷酸化。m e k 也是通过磷酸化而被激活，其上游激酶 称作m a p k k k ，目前已经发现多种，其中m o s 是一个3 9 k u 的s e r t h r 蛋白激酶， 由c m o s 原癌基因编码，是脊椎动物生殖细胞中独有的m a p k 上游激酶。c m o s m r n a 是卵母细胞生长时储存的母源性信息，在成熟过程中被翻译，引发m a p k 的级联活化【9 】。目前在哺乳动物细胞中已经发现l o 个m a p k 家族成员，其中 m a p k 1 和一2 与减数分裂关系密切，其他m a p k 家族成员主要参与细胞在应激 条件下的信号转导，故又名刺激活化的蛋白激酶( s t i m u l a t i o n a c t i v a t e dp r o t e i n k i n a s e s a p k ) 。 m a p k 在减数分裂的g 2 m 转化期被激活，而在有丝分裂中却没有这一现象。 哺乳动物卵母细胞中，因为m a p k 的活化发生在g v b d 之后或与g v b d 同时发 生，故m a p k 活性不是成熟促进因子( m a t u r a t i o np r o m o t i n gf a c t o r ，m p f ) 激活和 g v b d 所必需的，目前已研究过的物种包括小鼠、大鼠、猪、牛、山羊和马，结 果无一例外。但是在其他物种，如爪蟾中，m a p k 的激活发生在g v b d 以前， 并且是g v b d 所必需的，m a p k 上游激酶m o s 是决定爪蟾卵母细胞启动成熟分 裂的关键因子。m a p k 在g 2 m 转化中的功能之一是阻止细胞分裂周期( c e l l d i v i s i o nc y c l e ，c d c ) 基因产物c d c 2 的抑制性磷酸化。在爪蟾卵母细胞中，由m y t l 激酶负责c d c 2 的抑制性磷酸化。向未成熟卵母细胞中注射活性m p f 由于m v t l 的抑制作用，并不能引发g v b d ，但是如果事先使m a p k 途径活化，注入的 m p f 就可以引发自身的正反馈激活。这是因为m ”1 的c 末端结构域可与m a p k 的下游激酶p 9 0 r s k 特异性结合，后者被m a p k 磷酸化并激活后再磷酸化抑制 m y t l ，下调g 2 期卵母细胞对m p f 的抑制机制【l 。 在所有研究过的动物( 蛤、海星、小鼠和爪蟾) 中，m a p k 活性与细胞周期 蛋白b ( c y c l i nb ) 的合成在时间上高度一致。m a p k 激活后，c y c l i nbm r n a 的翻 译立即增加。爪蟾中，如果发生g v b d 时抑制c m o s 原癌基因产物m o s 的合成 或活性，m p f 的活性在减数第一次分裂后保持低水平，卵母细胞不能进入第二 次减数分裂。从g 2 期阻滞中释放出来的卵母细胞c y c l i nb 的翻译速率之所以增 加，可能是由于其m r n a 的翻译屏蔽被解除，该过程依赖于其3 端不转录区的 胞质p o l y a 成分( c y t o p l a s m i cp o l y a d n y l a t i o ne l e m e n t ，c p e ) 。在未成熟卵母细胞中， c p e 是c y c l i n b m r n a 的翻译屏蔽因子，m a p k 的作用在于可解除c p e 对c y c l i n b 翻译的屏蔽作用【“j 。 动物界中，m a p k 对c y c l i nb 的翻译起正反馈抑制刺激作用，帮助卵母细胞 突破g 2 期阻滞，这是m a p k 参与m p f 激活的一个明确机制。虽然这一机制不 是所有卵母细胞g v b d 都必需的，但却对后续减数分裂事件至关重要。在那些 不具备成熟能力的卵母细胞中，体外培养后胞质m a p k 的活性很低，说明获得 激活m a p k 的能力是卵胞质成熟的指标之一m 】。 3 m a p k 与p k c 信号通路的关系 细胞内钙离子浓度的升高是所有动物卵子活化所必需的，但它的下游分子还 不清楚。近年来p k c 作为c a 2 + 可能的靶分子得到越来越多的关注盼1 4 ” 。在小 鼠和大鼠的g v 期卵母细胞中都发现用佛波脂激活p k c 后，g v b d 被强烈抑制； 对于m i i 期卵母细胞，佛波脂可以诱导孤雌激活并形成类原核，即p k c 的激活 总是使卵母细胞阻滞在减数分裂的间期。由于p k c 和m a p k 信号通路都参与减 数分裂调节，并且因为m a p k 是多条信号途径的交汇点，因此我们认为p k c 和 m a p k 可能在卵母细胞成熟和活化的信号转导过程中存在对话。该设想得到了 实验结果的支持：对于g v 期卵母细胞，p k c 激活剂在抑制g v b d 的同时也有 效阻止m a p k 的激活，而对于m i i 期卵母细胞，p k c 诱导的孤雌活化也伴随着 m a p k 的失活，说明在减数分裂活化进程中，p k c 的激活起着下调m a p k 水平 的作用。 但是，m a p k 不是p k c 在卵母细胞中调节减数分裂的唯一靶分子，因为在 g v b d 和m a p k 激活以后再用p m a 处理卵母细胞，可以不影响m a p k 活性的 情况下阻止第一极体排放，而且佛波脂对g v b d 的抑制作用可能也不是通过 m a p k 实现的，因为m a p k 非小鼠卵母细胞g v b d 所必需。在探讨了m a p k 与p k c 的关系之后，可能会给人以这样的印象：只要一种试剂能抑制或促进 g v b d ，那它也抑制或促进m a p k 激活。在用显微操作去除卵母细胞的生发泡 以后，m a p k 仍能按照正常的发育时程激活，而p k c 在无核情况下也同样抑制 m a p k 活化，这种抑制作用也同样可以被蛋白磷酸酶的抑制剂0 a 所克服。这表 明p k c 与m a p k 的相互作用是在卵胞质中实现存在的，而不是抑制g v b d 的 结果。总之，p k c 和m a p k 之间的信号通路关系还不清楚，许多问题需要进一 步阐明。 第二部分：y 一微管蛋白研究进展 1 9 8 9 年，o a l d e y 等【l6 l 在构巢曲霉口s p e r g i l l u sn i d u l a n s ) 发现了y 微管蛋白 的编码基因m i p a ，从此微管蛋白家族又多了一名新成员。y 一微管蛋白几乎存 在于所有真核生物细胞中，是一个在进化上非常保守的蛋白，人、果蝇 ( d r o s o p h i l a ) 、衣藻( c h l a m y d o m o n a s ) 及锥虫( t r y p a n o s o m a ) 中y 微管蛋白序列 相似性在7 2 9 4 之间【1 7 】，与a ，b 一微管蛋白也有2 9 一3 5 的序列相似性【1 6 。 y 微管蛋白在真核生物体细胞内具有重要的细胞功能，它起始胞内微管的晶核 形成，控制有丝分裂纺锤体的组装等，并进而影响微管以及其他细胞结构的生物 功能l ”l 。 ly 微管蛋自在胞内的形式及胞内定位 在真核生物体内，y 一微管蛋自主要以y 微管蛋白环式复合体( y t u b u l i nr i n g c o m p l e x ，y t u r c ) 和y 一微管蛋白小复合体( y t u b u l i ns m a l lc o m p l e x ，y t u s c ) 两种形式存在2 0 】y t u r c 最先是从非洲爪蟾( x e n o p u s ) 卵中提取获得的，含 有大约1 0 。1 4 个y 微管蛋白分子以及至少6 种其他相关蛋白。电子显微观察表 明，具有弹性的开放环式结构1 2 ”，该环式结构直径2 5 n m ，沉降系数在2 5 s 和3 2 s 之间【埘，y t u s c 含有2 个v 一微管蛋白分子，每个分子上结合2 种相关的保守 蛋白，形成6 s 的小复合体。与y 微管蛋白结合的两种保守性蛋白因生物体而异， 在酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) e p 为s p c 9 7p 和s p c 9 8 p ，果蝇中为d g f i p 9 1 和d g r i p 8 4 ，人体中为h g c p 2 和h g c p 3 ，非洲爪蟾中为x g f i p l 0 9 和x g f i p l l 0 1 2 1 。 人们还在不断地致力于发现新的y 微管蛋白复合体的构成成分。从果蝇胚胎中 提取的y t u s c 和y t u r c 都含有y 一微管蛋白以及d g r i p 9 1 和d g r i p 8 4 ，表明y t u s c 和y t u r c 具有相关性。用5 0 0 m m o l ln a c i 高盐溶液处理后只获得y t u s c y t u r c 完全消失，表明y t u s c 可能是组成y t u r c 的亚单位，而y t u s c 的高盐抗性暗示它可能为最小的结构单位2 0 1 。 大多数真核生物含有离散的微管组织中心，例如真菌的纺锤体极以及动物的 中心体f 2 3 】。胞内的y t u s c 与一些y 微管蛋白结合蛋白( g a m m a t u b u l i n b i n d i n 2 p r o t e i n s ，g t b p s ) 结合，锚定在中心体或者其他微管组织中心。对酿酒酵母的研 究表明，g t b p ss p c 7 2 p 在m t o c s 的定位受细胞周期和外激素应答途径的调控 2 4 1 ， 在细胞的营养生长期，s p c 7 2 p 结合到纺锤体极的亚结构半桥( h a l fb r i d g e ) 和外斑( o u t e rp l a q u e ) ，这两种纺锤体极的亚结构组织了胞质微管的形成。在 g l 期，2 3 的s p c 7 2 p 通过与半桥组分k a r l p 结合定位于半桥，而在其他生长周 期大多数s p c 7 2 p 位于外斑。不同时期s p c 7 2 p 在纺锤体极的结合位点直接决定y t u r c 的定位以及微管的晶核形成。另外，y 微管蛋白在许多动物细胞有丝分裂 纺锤体上也存在富集现象【2 5 1 。除此以外，在某些分裂细胞的中间体上也发现了 y 微管蛋白。在植物细胞中，所有胞内微管均发现y 一微管蛋白的点状分布。另 外，y 一微管蛋白在一些胞质复合体中也有大量分布，如鸡血红细胞【2 6 1 。甚至在 一些细胞的胞液之中，y 一微管蛋白也可与其他蛋白质形成可溶性复合体而稳定 存在【2 7 。 许多动物的卵母细胞以及早期胚胎中没有中心体结构，但是在卵胞质中可检 测到中心体周围物质( p e r i c e n t r i o l a r m a t e r i a l ，p c m ) 2 9 1 ，并以此作为微管组织 中心组织减数分裂纺锤体的组装。而y 微管蛋白作为中心体周围物质的固有成 分在多种卵母细胞中的定位与纺锤体密切相关。在非洲爪蟾卵母细胞中，y 一微 管蛋白位于正在形成中的纺锤体上，直到前中期，y 一微管蛋白凝集在纺锤体的 两极 3 0 。在小鼠的m i i 期卵母细胞中，y 微管蛋白除了定位于纺锤体的两极， 在胞质中也有星点状凝集存在阢3 2 】。猪卵母细胞中，y 微管蛋白位于第一次减 数分裂的中期纺锤体上，直到早后期，y ，微管蛋白才凝集在纺锤体极的周围1 3 3 。 在大部分卵母细胞中，y 微管蛋白的定位随着减数分裂纺锤体的形成呈现动态 变化，并且与纺锤体的两极相关。但是也有例外，果蝇卵母细胞第一次减数分裂 过程中，y 微管蛋白在纺锤体两极没有检测到定位信号 3 4 1 。最近又有报道，在 牛卵母细胞中，y 一微管蛋白位于m i i 期纺锤体及卵皮质区【3 5 】。 2y 一微管蛋白与微管晶核起始 微管在细胞分裂、细胞内运输及胞质组织等许多方面具有重要的生物学功 能。微管是由o 、0 异二聚体在g t p 存在下自发聚集形成的，在体外纯化的微管 溶液中，微管的聚集包括寡聚物形成和微管延伸两部分，其中，由微管蛋白异二 聚体形成寡聚物的过程就是微管晶核形成的过程。在体内微管的聚集受到多方面 的调节，如细胞周期的调节，微管组织中心的调节，微管结合蛋白的调节等。目 前，对于微管的延伸和解聚过程人们已有了较全面地了解，但是对微管的晶核形 成却知之甚少。微管的聚集过程象化学结晶过程一样需要一个晶核或说种子，晶 核形成过程中首先形成一个6 1 2 个o 、b 异二聚体聚集形成的短链，这称为晶 核的起始阢”】，然后，在其上聚集形成一个纵的寡聚物，一旦寡聚物形成，微 管便会迅速延伸。大量的证据表明y 一微管蛋白在微管的晶核起始过程中起重要 作用。最初在构巢曲霉中定位及y 微管蛋白功能干扰实验中【3 8 ，39 1 ，y 微管蛋 白功能被破坏后，生发的胚芽细胞核中区缺少纺锤体，染色体呈凝集状分布。这 表明y 微管蛋白对于纺锤体微管的组装具有重要作用。质粒缺失和抗体注射实 验证明了y 微管蛋白在微管起始中有重要作用m4 ”。体外实验表明，中心体经 盐处理清除y 一微管蛋白后会失去形成微管晶核的能力，分子筛收集的y 微管蛋 白组分的加入可以使该能力得到恢复【4 ”。另外，y 一微管蛋白基因的过分表达则 会导致微管的非正常聚集。微管的生长停滞以及错误组装可能导致与微管相关的 许多生物功能的丧失，包括细胞内的物质运输、细胞运动、细胞的分化发育以及 细胞分裂增殖等与细胞生存密切相关的生命活动缺失。 y 一微管蛋白介导微管晶核起始的具体机制目前还不十分明确，这一过程对 于微管生物功能的发挥起着决定作用，而且对于细胞周期和其他微管蛋白的合成 也起着重要的调节作用【4 3 】。根据实验结果，研究人员提出两种可能的分子模型， 即原丝模型( p r o t o f i l a m e n tm o d l e ) 和模板模型( t e m p l a t em o d e l ) 。原丝模型的提出 基于早期y t u r c 的环式结构，是在纯化o t 3 一微管过程中发现的1 2 ”。该模型中， y t u r c 作为一根部分或者完整的微管原丝，轴向整合到初生微管的管壁中，从 而诱导微管的晶核起始。而模板模型1 2 2 ，删认为y t u r c 作为螺旋模板与微管原丝 的负极端连接，为微管的形成提供生长平台，y t u r c 的分子直径直接决定了微 管外径为2 5 n m ，y t u r c 的其他组成蛋白构成微管的帽子结构，由g t b p s 介导 定位于微管组织中心。但是，由于y t u r c 是由偶数个y 微管蛋白( 1 2 或者1 4 ) 组成，与1 3 个微管原丝的数目不符，研究人员又对该模型进行了修正。如果y t u r c 含有1 4 个y 微管蛋白，其中两个在微管的形成中可能发生叠加；如果y t u r c 含有1 2 个y 一微管蛋白，所形成的螺旋环式结构的一部分由缺口代替。也 有可能微管的晶核形成在开始的时候为1 2 或者1 4 根微管原丝，在后面的延长过 程中逐渐转变成1 3 根。通过荧光和电子显微镜观察非洲爪蟾y t u r c 的形态， 大多数研究结果与摸板模型保持一致 4 甜。2 0 0 0 年，l e g u y 等 4 6 依据他们的研究 结果提出了新的晶核起始机制。在其研究中，从网状细胞胞溶物中分离获得的部 分纯化的y 微管蛋白单体，以高亲和性与a ，t 3 一微管蛋白二聚体的负极端结合 形成一个帽式结构，每个单体y 一微管蛋白足以阻遏微管负极端的增长，证明y 一 微管蛋白定位于微管的负极端。同时，在o 8 n m o l f l y 微管蛋白存在的情况下， 微管蛋白聚合浓度降到1 2 1 7 “m o l l ，表明y 微管蛋白可有效降低微管组装的 临界浓度。重叠杂交实验( b l o t o v e r l a y ) 则表明，y 微管蛋白与b 微管蛋白具 有更强的亲和性。根据上述结果，l e g u y 等认为：在微管形成之初，三个a ， b 一微管蛋白二聚体首先聚合形成一个低聚物，y 微管蛋白与该低聚物上的一个 b 微管蛋白亚基侧面连接，阻止初生微管负极端的纵向生长，同时，由于y 一微 管蛋白与且微管蛋白亚基的侧面相连，占用了相邻微管原丝的b 微管蛋白位 点，干扰n ，b 一微管蛋白二聚体与相邻微管原丝之间的横向连接，从而在负极 端彻底形成一个死末端复合体( d e a d e n dc o m p l e s ) 。 3y 微管蛋白的其他生物功能 最近的研究表明，y 一微管蛋白除了在微管晶核起始过程中起重要作用外，