（环境工程专业论文）反硝化细菌的筛选、鉴定及其强化处理硝酸盐废水的研究.pdf

山东人学硕士学位论文 摘要 氮素是导致水体污染的一类重要污染物。目前，由氮素污染引起的水体富营 养化已成为世界性的环境问题。国内外对氮素污染的治理日益重视，生物脱氮技 术因其迅速安全倍受青睐。生物脱氮的主体是反硝化细菌，从环境中分离筛选高 效反硝化细菌菌株，并掌握其脱氮特性，是提高反硝化细菌应用的关键环节。 采用稀释土壤悬液涂布平板法从南四湖植物芦竹根际土壤中筛选出一株产 气快、脱氮率高的反硝化细菌l z 1 4 ；采用富集培养分离法，分别从芦苇和香蒲 根际土壤中分离筛选出3 株和4 株反硝化细菌。筛选出的反硝化细菌均为兼性厌 氧的革兰氏阴性杆菌。通过硝酸盐还原产气试验，证明筛选出的反硝化细菌均具 有良好的产气能力，可以作为生物脱氮的菌种来源。 菌株l z 1 4 与其他菌株相比具有最优的脱氮能力，本研究重点对菌株l z 1 4 的脱氮特性进行了系统考察。菌株l z 一1 4 最适碳源为乙酸钠，可利用碳源和氮源 范围广泛；适宜在温度2 0 3 5 的缺氧条件下进行脱氮；生长繁殖迅速；以乙酸 钠为碳源、硝酸钾为氮源分别考察了c n 和p h 值对菌株l z 1 4 生长及脱氮过程 的影响，结果表明最佳c n 为5 ，在c n 为5 ，初始硝态氮浓度为1 5 0m g l 的 情况下，3 6 h 内可将硝态氮完全去除，t n 去除率可达8 4 5 ；最适p h 值范围在 7 0 8 0 之间，此区间以外，菌株l z 一1 4 难以生长及保持脱氮能力。菌株l z 1 4 的脱氮过程主要发生在菌体生长的第1 2 3 6 h ，并伴随有一定量亚硝酸盐的累积， 之后2 4 h 内亚硝酸盐可被完全降解。 通过p c r 扩增、1 6 sr d n a 测序结合同源性分析，确定了菌株l z 1 4 的分类 学地位( g e n b a n k 登录号为f j 5 8 8 9 1 0 ) 。菌株l z 1 4 与p s e u d o m o n a ss t u t z e r i 进化 距离最为接近，确定其属于p s e u d o m o n a s 属，该属是典型的具有反硝化功能的菌 属。 在实验室条件下，通过盆栽试验构建模拟人工湿地，考察了投加菌株l z 1 4 菌剂对人工湿地处理硝酸盐废水的生物强化效果。结果表明，经过8 d 的处理， 投加菌液强化组使受污染新薛河河水中c o d c ，从3 3 9m g l 降到了1 5 9m g l ， 去除率为5 3 1 ；t n 从4 0 7m g l 降低到了0 9 8m g l ，去除率为7 5 9 。与未 投菌的对照组相比c o d c ，和t n 去除率分别提高了2 4 9 和3 9 5 ，生物强化效 山东人学硕l 学位论文 果显著，可作为一种治理硝酸盐废水的有效方法。 关键词：反硝化细菌；筛选；系统发育；脱氮特性；生物强化 2 山东大学硕j j 学位论文 a b s t r a c t a tp r e s e n t ，e u t r o p h i c a t i o nh a sb e c o m eag l o b a le n v i r o n m e n t a lp r o b l e m at e n t i o n f o rt r e a t m e n to fn i t r o g e np o l u t i o ni sg r o w i n ga th o m ea n da b r o a d ，a n db i o l o g i c a l d e n i t r i f i c a t i o nt e c h n o l o g yi sp o p u l a rb e c a u s eo fi t sr a p i da n ds a f ec h a r a c t e r i s t i c b i o l o g i c a ln i t r o g e nr e m o v l ap r o c e s sw a sm a i n l yc a r r i e do u tb yd e n i t r i f y i n gb a c t e r i a t oi s o l a t ea n ds c r e e nt h ed e n i t r i f y i n gb a c t e r i af r o mn a t u r a lo ra r t i f i c i a le c o s y s t e m sh a s b e c o m et h ek e ys t e pf o ri t sa p p l i c a t i o n i no u rr e s e a r c h d e n i t r i f y i n gb a c t e r i u ms t r a i nl z - 14w i t hf a s t e rg a sp r o d u c i n ga n d h i g h e rn i t r o g e nr e m o v a le f f i c i e n c yw a ss c r e e n e db yd i l u t es o i ls u s p e n s i o n - s p r e a d p l a t et e c h n i q u e sf r o ms o i lt h a ts a m p l e df r o mt h er h i z o s p h e r eo fa r u n d od o n a xl a n o t h e r7d e n i t r i f y i n gb a c t e r i as t r a i n sw e r es c r e e n e df r o mr h i z o s p h e r eo fp h r a g m i t e s c o m m u n i sa n dt y p h al a t i f o l i aa f t e re n r i c h m e n t t h ec e l l so fs c r e e n e ds t r a i n sw e r e m o s t l yg r a m - n e g a t i v e ，f a c u l t a t i v ea n a e r o b i ca n ds h o r tr o d - s h a p e d n i t r a t er e d u c i n g a n dg a sp r o d u c t i n ge x p e r i m e n t sr e v e a l e dt h a ta l lt h o s es c r e e n e dd e n i t r i f y i n gb a c t e r i a h a v eh i g hn i t r o g e nr e m o v a lc a p a c i t ya n dc a nb eu s e da sas o u r c ef o rn i t r o g e nr e m o v a l t r e a t m e n t o u rr e s e a r c hf o c u s e do ns t r a i nl z - 14w i t hh i g h e rn i t r o g e nr e m o v a lc a p a c i t ya f t e r c o m p a r i s o nb e t w e e n8s c r e e n e ds t r a i n s s t r a i nl z 一14c a nu s ee x t e n s i v ec a r b o n s o u r c e sw i t ha c e t a t ea st h em o s te f f e c t i v eo n e u n d e ra n o x i cc o n d i t i o nw i t h t e m p e r a t u r ea t2 0 。ct o3 5 c ，t h es t r a i ng r e wf a s ta n de x h i b i te x c e l l e n tn i t o r g e n r e m o v a la b i l i t y t h ee f f e c t so fc nr a t i oa n dp ho nt h eg r o w t ha n dd e n i t r i f i c a t i o n p r o c e s so fs t r a i nl z 一14w e r ea l s oi n v e s t i g a t e dw i t ha c e t a t ea n dn i t r a t ea ss o l ec a r b o n a n dn i t r o g e ns o u r c er e s p e c t i v e l y t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m a lc nr a t i ow a s5 a n dt nr e m o v a lr a t eo f8 4 5 w a sa c h i e v e di n3 6h o u r sw i t l lc o m p l e t er e m o v a lo f 15 0m g ln i t r a t e n t h ef a v o r i t ei n i t i a lp hr a n g ef o rs t r a i nl z - 14w a s7 0t o 8 0 ， b e s i d e sw h i c hn e a r l yn oc e l lg r o w t ha n dd e n i t r i f i c a t i o nc o u l db ed e t e c t e d i tw a sa l s o f o u n dt h a tn i t r o g e nr e m o v a lp r o c e s sw a sm a i n l yh a p p e n e di nt h eg r o w t t ip h a s eo ft h e 12 - 3 6h o u r sw i t hac o n s i d e r a b l ea m o u n to fn i t r i t ea c c u m u l a t i o nw h i c hc a nb er e d u c e d c o m p l e t e l yi nt h el a t e r2 4h o u r s 3 山东人学硕上学位论文 b yp c ra m p l i f i c a t i o na n dh o m o l o g ya n a l y s i so f16 sr d n as e q u e n c e ，i tw a s f o u n dt h a ts t r a i nl z 1 4 ( g e n b a n ka c c e s sn u m b e r ：f j 5 8 8 9 1 0 ) w a sc l o s e t o p s e u d o m o n a ss t u t z e r io nt h ee v o l u t i o n a r yt r e e t h et a x o n o m i cs t a t u so fs t r a i nl z - l4 w a sd e t e r m i n e da sp s e u d o m o n a sw h i c hw a sat y p i c a ld e n i t r i f y i n gg e n e r a u n d e rl a b o r a t o r ys c a l e ，c o n s t r u c t e dw e t l a n d sw e r ec o n d u c t e dt oi n v e s t i g a t et h e i m p a c to fb i o a u g r n e n t a t i o nb ys t r a i nl z 一1 4t ot r e a tn a t u r a la n da r t i f i c a ln i t r a t e w a s t e w a t e r t h er e s u l t sr e v e a l e dt h a ti n8d a y s e x p e r i m e n t ，c o d c ra n dt nr e m o v a l e f f i c i e n c yo f5 3 1 a n d7 5 9 c o u l db ea c h i e v e dw h e nt r e a t i n gw i t hp o l l u t e dx i n x u e r i v e rw a t e r c o m p a r e dw i t hc o n t r o l l e dg r o u p ，t h ec o d c ra n dt nr e m o v a le f f i c i e n c i e s w e r ei n c r e s e db y2 4 9 a n d3 9 5 r e s p e c t i v e l y b i o a u g m e n t a t i o nw a sp r o v e dt ob e a ne f f e c t i v em e t h o dt ot r e a tn i t r a t ew a s t e w a t e r k e y w o r d s ：d e n i t r i f y i n gb a c t e r i a ；i s o l a t i o n ；p h y l o g e n e t i ca n a l y s i s ；n i t r o g e nr e m o v a l c h a r a c t e r i s t i c ；b i o a u g m e n t a t i o n 4 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进 行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何 其他个人或集体己经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人 承担。 论文作者签名：盟麴日期： 训9 j 关于学位论文使用授权的声明 本人同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的印刷件和电子 版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手 段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：盟导师签名：张日 期：丝! 业 山东大学硕上学位论文 1 1 研究背景 第一章绪论 随着工农业生产的发展和人们生活水平的提高，我国含氮污染物的排放量迅 速增加，大小水体成为这些污染物的“收容所”，水体质量急剧恶化。目前，全 国各地已经建立起了一大批废水生物处理工程，有效地遏制了水质污染持续恶化 的势头。但是，污水二级处理后的排放水含氮量依然较高，俨然成为一个严重的 环境污染源。 氮和磷是废水中常见的无机营养物，它们是引起湖泊富营养化的主要因素。 长期以来，污水的处理均以去除有机物和悬浮固体为目标，并不考虑对氮等有机 营养物质的去除。随着污水排放总量的不断增加以及化肥、合成洗涤剂和农药等 的广泛应用，废水中氮、磷等营养物质对环境所造成的影响也逐渐引起了人们的 注意【1 1 。氮对水体环境的影响最为突出的是水体( 特别是封闭水体) 的富营养化。 根据( ( 2 0 0 7 年中国环境状况公报报道：全国2 8 个国控重点湖( 库) 中，满足i i 类水质的2 个，占7 1 ；i i i 类的6 个，占2 1 4 ；i v 类的4 个，占1 4 3 ；v 类 的5 个，占1 7 9 ；劣v 类的1 1 个，占3 9 3 。主要污染指标为总氮和总磷。在 监测的2 6 个湖( 库) 中，重度富营养的2 个，占7 7 ；中度富营养的3 个，占 1 1 5 ；轻度富营养的9 个，占3 4 6 。其中南四湖、洪泽湖、镜泊湖、西湖、 玄武湖、大明湖等处于轻度富营养化；太湖、巢湖、达赉湖处于中度富营养化； 昆明滇池、白洋淀处于重度富营养化。2 0 0 7 年全海域共发生赤潮8 2 次，累计面 积1 1 6 1 0 平方公里。其中，有毒赤潮为2 5 次，有毒赤潮面积1 9 0 6 平方公里。全 年赤潮灾害造成直接经济损失6 0 0 万元。全海域共发生1 0 0 平方公里以上的赤潮 3 0 次，累计面积1 0 2 5 3 平方公里，分别占赤潮发生总次数和累计总面积的3 7 和8 8 。其中，面积超过1 0 0 0 平方公里的赤潮1 次。由此可见，我国湖泊、水 库及沿海海域普遍遭受污染，水体富营养化已严重危害农业、渔业、旅游业等诸 多行业，并对饮用水卫生和食品安全构成巨大威胁。 南水北调工程是解决我国北方水资源短缺问题的特大型基础设施项目，工程 包括东线、中线和西线三条调水线路。其中，东线工程主要负责给黄淮海平原东 部和山东半岛供水，解决江苏北部、山东东部和河北东南部以及津浦铁路沿线的 5 山东人学硕l j 学位论文 城市缺水问题，并可作为天津市的补充水源。南四湖作为南水北调东线工程的蓄 水核心，其水质优劣直接决定了南水北调东线调水的水质状况。按照国务院批准 的南水北调东线工程治污规划实施意见和国务院南水北调工程建设委员会要 求，南水北调东线山东段的水质目标是：2 0 0 7 年黄河以南段水质稳定达到地 表水环境质量标准( g b 3 8 3 8 2 0 0 2 ) i i i 类水质要求；到2 0 1 0 年输水干线全线稳 定达至u i i i 类水质要求。尽管调水沿线水质逐年改善，但根据调查，2 0 0 8 年南四 湖湖体水质仅能达到地表水v 类水质标准( 主要污染物是总氮和有机物) ，绝大 部分入湖河流污染严重，不能达到相应功能区划要求。整体看来，调水沿线水质 远未达到预期目标，给后续调水水质安全埋下了隐患。 调查表明，南四湖有入湖河流5 3 条，农业面源污染、工业及生活污水的排 放，导致入湖河水污染严重，尤其是氮磷的排入，造成了南四湖处于富营养化状 态的现状。为了治理南水北调沿线的水污染状况，山东省从严制订了新的排污标 准，强化了污染的治理力度，但从近期实施情况来看，入湖水质与调水水质目标 之间仍有较大的差距。由于河水在长期的流动过程中对污染物的降解已经达到一 个动态平衡，仅仅依靠河道目前的自净作用，难以保证入湖河水达到调水水质要 求。因此，加快南四湖流域水污染治理已成为当前确保东线一期工程目标顺利完 成的关键环节，研究开发经济、高效的污水脱氮处理技术，将有助于调水工程目 标的实现。 1 2 水体中氮素的来源及危害 1 2 1 水体中氮素的来源 氮是自然界中主要的一种主要组成元素，在自然界里不断地进行迁移、转化 和循环。氮素的循环转化主要由生物反应所致，主要的作用方式见表1 1 。 6 山东人学硕上学位论文 n 2 _ n h 3 n f l 3 _ 有机物 有机物_ n h 3 n h 3 _ n 0 2 , n 0 3 。 n 0 2 , n 0 3 , n o ，n 2 0 n 2 n o r , n 0 3 一+ n h 3 生物固氮 氨的同化 氨化作用 硝化作用 反硝化作用 异化性硝酸盐还原作用 固氮细菌 植物、细菌、低等真核生物 各种( 微) 生物 硝化细菌 反硝化细菌 发酵性细菌 氮素可以经过多种作用进入水体，主要方式见表1 2 。 表1 2 氮素进入水体的方式1 3 j 氮素的米源进入水体的方式 氮素的米源 进入水体的方式 污水厂出水 直接排放或灌溉船舶等交通- t 具直接排放 工业生产污水排放化石燃料 降水、风和重力沉降 未经处理污水直接排放天然同氮作用就地 火山活动降水、风和重力沉降士壤和地壳变动风和重力沉降 农业施肥 地表径流和地下水运动垃圾渗滤液地下水运动 动植物残体腐败地表径流和地下水运动化粪池渗滤液地下水运动 污水处理厂污泥直接废气或农用挥发、降水、地表径流 动物废弃物 非市区径流直接排放和地下水运动 水体中氮素来源、组成因其所处的地域及周围环境的不同而有所差异，主要 来源可分为点源和面源两部分。点源污染以生活污水和工业废水为主，生活污水 含氮量一般比重较大，含氮量较为稳定。此外，垃圾填埋渗滤液已经成为一个新 的不容忽视的氮污染源。面源污染以农田土壤流失和大气干湿氮沉降为主。有研 究表明，水田的氮肥利用率一般仅为2 0 3 0 ，旱地为4 0 - 6 0 。同时也显示，耕 作对土壤氮素损耗也有影响，越是耕作，随水土流失而损耗的土壤氮物质越多【3 j 。 氮在自然界最主要的存在形式是氮气，水体中的氮主要以有机氮和无机氮的 形式存在【4 】。有机氮主要包括蛋白质、多肽、氨基酸、核酸、脂肪酸和尿素等。 它主要来源于生活污水、农业生产施用的大量氮肥、有机肥及n h v , 、制革、印染、 食品加工业等产生的工业废水、渔牧养殖业产生的残饵、排泄物等。这些有机氮 7 山东人学硕f ：学位论文 经过微生物的分解后转化为无机氮。无机氮包括氨态氮、硝态氮和亚硝态氮及硫 化物和氰化物。无机氮主要来自于有机氮的分解转化，使用无机氮肥的农田排水 和地表径流，还有一些冶金工业的炼焦、化肥厂排放的废水等。江河、湖泊底泥 和沉积物的溶出物也是无机氮的来源之一。在未经处理的废水中，有机氮和氨氮 是氮的主要存在形式；在二级生化处理后出水中氨氮和硝态氮是氮的主要存在形 式。自然界中的氮循环作用本来可以避免环境中某种形式氮的积累，但各种人为 因素破坏了这种自然的平衡作用，则可能造成环境中氮素的污染。 1 2 2 氮素污染的危害 过多的氮化合物进入水体会恶化水体质量，影响渔业发展和危害人体健康。 氮素污染的危害主要表现以下几个方面： ( 1 ) 加速水体的富营养化 富营养化是水质衰老的一种现象，是指在人类活动的影响下，为生物所需的 氮、磷等营养物质大量进入湖泊、河口、海湾等缓流水体的水生态系统中，引起 藻类及其他浮游生物迅速繁殖，水体透明度下降及溶解氧量减少，使水体的功能 及生态系统受到阻碍和破坏、老化速度加快的一种现象。在自然条件下，湖泊也 会从贫营养状态过渡到富营养状态，沉积物不断增多，不过这种自然过程非常缓 慢，常需几千年甚至上万年。而人为排放含营养物质的工业废水和生活污水所引 起的水体富营养化现象，可以在短时期出现。富营养化主要发生在湖泊、近海海 湾及其他缓流水体中，我国大部分湖泊目前正遭受不同程度的富营养化污染。 ( 2 ) 增加给水处理的困难 被氮素严重污染的水体，会给水的净化处理带来许多困难，进而严重影响饮 用水水质。由于我国许多城市的供水水源地为水库、湖泊等水体，水体的富营养 化，导致大量藻类和水生生物的孳生繁殖，可以堵塞滤池，破坏其j 下常运行；藻 类分泌物影响加氯消毒过程，而且经消毒后可能生成“三致”污染物；水体中少 量氨的存在使加氯量成倍增加，脱色、除臭、除味化学药剂投加量亦会增加。 ( 3 ) 消耗水体中的溶解氧 藻类大量过度繁殖死亡后有机体被异养微生物分解，会大量消耗水中的溶解 氧。同时，由于水面被藻类覆盖，使光合作用受限而影响大气复氧。还原态的氮 素排入水体后，可在硝化细菌的作用下继续被氧化为硝酸盐，1 m o l 的氨氮氧化 8 山东大学硕十学位论文 成1 m o l 硝酸盐需要消耗2 m o l 的0 2 ，另外氨氮的存在还会刺激水中藻类的大量 生长。这些因素将会大量消耗水体中的溶解氧，引起鱼类和其它水生生物的窒息 死亡，或因水体处于厌氧状态而产生h 2 s 等臭气，最终引发一系列的环境问题。 ( 4 ) 对生物有毒害作用 氨氮会影响鱼腮的氧传递，当水中氨氮超过lm g c 时，即会使水生生物的 血液结合氧能力降低，超过3m g c 时，可在2 4 - - 9 6 h 内使金鱼、鳊鱼死亡。对多 数鱼类而言水中游离氨的致死量为lm g l t 3 1 。 硝酸盐被摄入人体后部分会被还原成亚硝酸敲，亚硝酸盐可氧化血液中的亚 铁血红蛋白为高铁血红蛋白，而后者不具备结合氧的能力，随着血液中高铁血红 蛋白含量增加，血液输送氧的能力下降，严重者导致人体组织紫绀，临床上称高 铁血红蛋白症。4 , - - 6 个月的婴儿对硝酸盐的耐受力比较低，极易造成婴儿高铁血 红蛋白症( b l u eb a b i e s ) ，引发窒息死亡。再者，亚硝酸盐会在胃中与胺或酰胺结 合形成亚硝基胺或其化合物而具有致癌作用【5 】。流行病学研究表明，硝酸盐摄入 量大的人群，胃癌发生率也高。世界卫生组织( w h o ) 现行饮用水硝酸盐氮含 量的指导性标准为1 0m p j l ，推荐标准为5m c l ，我国现行的标准也为1 0m g l 。 美国饮用水水质标准中规定亚硝态氮限量标准为lm g l ，而我国仅是作为 参考，尚未制定有关标准，鉴于其毒害性较高，需要引起足够的重视。 1 3 反硝化脱氮的机理及影响因素 1 3 1 反硝化脱氮的类型及机理 对于氮素污染的治理，国内外常见的工程技术有空气吹脱法、选择性离子交 换法、折点加氯法、磷酸氨镁沉淀法及生物脱氮法等。其中，生物脱氮是最经济 有效的治理技术。生物脱氮技术通常由硝化工艺和反硝化工艺组成。硝化工艺以 去除氨氮为主，虽然能够把氨氮转化为硝酸盐，但是不能彻底将氮素从水体中除 去；反硝化工艺则能从根本上消除氮素对环境的污染。 广义的反硝化作用，包括一切硝酸盐的还原作用，可以形成各种产物，如亚 硝酸盐、氨、含氮有机物等；狭义的反硝化作用，专指硝酸盐的还原最终产物是 分子态氮【6 l 。能够进行反硝化作用的细菌，统称为反硝化细菌( d e n i t r i f y i n g b a c t e r i a ) 。从微生物学的角度看，反硝化作用是反硝化细菌的厌氧呼吸过程，硝 9 山东人学硕1 ：学位论文 酸盐是电子受体，氮气是主要的代谢产物，要完成这个厌氧呼吸过程，需要不断 的从外界获得电子供体。已知的反硝化细菌都是微好氧的，尚未见到严格厌氧的 反硝化细菌7 1 。反硝化细菌是反硝化作用发生的主体，探明反硝化细菌的种属及 特性，搞清它们的营养条件和环境条件，将有助于废水生物脱氮工艺的研究、开 发和应用。 根据营养类型、需氧情况的不同，大致可将反硝化过程分为以下几类： ( 1 ) 异养兼性反硝化( h e t e r o t r o p h i cf a c u l t a t i v ed e n i t r i f i c a t i o n ) 即传统的反硝化。通常情况，反硝化发生在厌氧或缺氧条件下。当同时存在 分子态氧和硝酸盐时，反硝化细菌优先进行有氧呼吸。微生物从有氧呼吸转变为 无氧呼吸的关键是合成无氧呼吸的酶，而分子态氧的存在会抑制这类酶的合成及 活性。因此，必须保持严格的缺氧状态( d o 4 6 t 2 6 1 。因此，多数情 况下，d o c 成为水环境中反硝化作用的限制因子。 ( 2 ) p h 值 p h 值也是影响反硝化速率和反硝化终产物的一个重要的环境因子。对反硝 化细菌的生长来说，最佳p h 值为6 5 7 5 。在此p h 范围内，反硝化速率最大， 当p h 值不在最佳范围时，反硝化速率降低。环境p h 值可影响到反硝化反应的 最终产物，当p h 值嘶5 时，最终产物以n 2 0 占优势；当p h 值 8 0 时，会 出现n 0 2 的积累，且p h 值越高，n 0 2 的积累越多，这是因为高p h 值抑制了亚 硝酸盐还原酶的活性，而对硝酸盐还原酶的活性影响不大所致。 ( 3 ) 温度 废水生物处理中的反应温度，对微生物的生长、繁殖关系密切，温度支配着 酶反应动力学、微生物生长速度以及化合物的溶解度等，因而对污染物的降解转 化起着关键作用，一般当温度控制在2 0 3 5 ，可获得较好的处理效果，超过 最高生长温度时，会使微生物的蛋白质迅速变性，酶系统遭到破坏而失去活性； 低温虽然不会使微生物死亡，但会使其代谢活力降低，进而处于生长繁殖停滞状 态。温度对反硝化作用的影响比其他的废水生物处理过程要大些。对反硝化作用 来说，最适宜的运行温度是2 0 4 0 。低于1 5 时，反硝化速率明显下降，而 在5 以下时，反硝化过程虽能进行，但多数情况下速率极低。 ( 4 ) 溶解氧 溶解氧( d o ) 的存在对反硝化过程有很大影响。如果反应器的溶解氧过多， 将会对反硝化菌的异化作用发生抑制作用。其机制为阻抑硝酸盐还原酶的形成或 者仅仅充当电子受体从而竞争性的阻碍了硝酸盐的还原。一般来说，在反硝化系 统中，反应器内的溶解氧应控制在o 5 m g l 以下，否则会影响反硝化的正常进行。 1 4 人工湿地与生物强化技术研究进展 人工湿地技术( c o n s t r u c t e dw e t l a n d s ) 兴起于2 0 世纪中期，由于其具有易 1 4 山东人学硕上学位论文 于建立、易于管理、造价低、能耗低、有利于生态恢复等优点【2 ，在北美和欧洲 等地已经得到了广泛的应用，可用来处理多种类型的废水，如矿山废水、暴雨径 流、生活污水、受污染地下水、工业废水、农业面源污染、水产养殖废水及垃圾 渗滤液等【2 8 。3 3 1 。此外，采用人工湿地技术还可用来处理富营养化的景观水体，如 湖泊、河流等【3 4 , 3 5 l 。我国关于人工湿地的研究起步相对较晚，但发展迅速，目前 在净化处理水库、面源污染、低浓度养殖废水、中小城镇污水、城市内河以及包 括啤酒、造纸等在内的工业废水治理上均取得了一定的进展【3 6 4 0 1 。 人工湿地主要利用基质、植物、微生物的联合作用，实现污染物的高效处理。 研究表明，湿地对污染物的去除能力受湿地类型、污染负荷、湿地龄、水力条件、 植物类型、基质类型、季节等诸多条件影响【4 1 4 3 1 ，不同研究人员得出的结论存在 一定差异。从大多数研究结果来看，人工湿地对有机物、悬浮物及污染细菌的去 除率可高达9 0 以上，但对氮磷的去除率相对较低且不稳定，一般保持在 4 0 6 0 左右1 4 4 4 6 】，在有预处理设施和处理面积足够大的条件下，氮磷的去除率 有时可高达9 0 【4 7 , 4 8 1 ，但同时又带来了运行成本增加、工艺管理不便的弊端。 湿地中氮的迁移转化过程较为复杂，但能够完成脱氮的途径主要包括以下几 种：植物吸收、微生物反硝化、基质吸附和氨挥发。研究表明，植物的吸收作用 十分有限，其贡献率一般不超过t n 去除率的1 0 0 4 9 j ，仅当污染负荷较低时植物 吸收作用贡献较大，可占t n 去除总量的4 7 ，高负荷条件下仅占0 7 【5 0 1 ；基 质吸附由于存在饱和性，对t n 的去除贡献也相当有限；而氨挥发仅当p h 大于 8 0 时才能起到较大作用1 4 9 1 ，由此看来，湿地脱氮以微生物的反硝化作用为主。 湿地微生物的反硝化作用受淹水时间、水位波动、有机碳源供应、污染负荷和基 质层深度等条件影响【5 卜5 引，自然条件下，生物作用难以得到充分发挥。如何提高 微生物的作用，增加氮的处理效果是当今人工湿地研究的一个核心问题【55 1 。 近年来，基于优势菌技术基础上建立的生物强化技术在土壤修复、废水处理 等领域得以广泛应用。通过投加对目标污染物具有高效降解特性的优势菌种，可 有效提高污染物处理能力。目前，生物强化技术已经开始应用于有机废水、石化 废水、造纸废水、炼油废水、受污染湿地修复等领域【5 6 。6 0 1 ，并取得了一定的进展。 国内已经有学者开始着手进行生物强化处理景观水体的研究，但尚处于起步阶 段。刘书宇等人【6 l 】采用优势菌群强化复合生态床技术来修复景观水体，其研究结 果表明，优势菌群中大量氨氧化细菌和亚硝酸氧化菌的存在，使基质中硝化作用 山东大学硕士学位论文 进行迅速而且彻底，减少了中间产物的积累，促进了不同形态氮的生物去除，在 停留时间为4 d 时，优势菌群生物强化系统对t n 的去除率为7 1 5 ，比未投菌 的对照组提高了4 1 3 。姚晓丽等人i 蚓则采用一株反硝化细菌制剂对武汉东湖抹 布塘富营养化景观污水进行了生物强化处理试验，结果表明，投加反硝化细菌4 个月后，水体c o d m n 下降了6 3 7 6 6 9 ；t n 降低了3 4 8 3 8 5 ，同时有效提高 了水体的溶解氧和透明度，改善了湖水水质。吴伟掣6 3 】通过向池塘水体中投加复 合微生态制剂，明显提高了池塘水体中氨化细菌、反硝化细菌和亚硝化细菌的数 量，使各种氮循环细菌在春夏秋不同的季节均保持较为恒定的数量，提高了氮循 环的速率和效能，通过直接影响水体中氮循环细菌的数量而促进了水体的氮循 环。 1 5 研究意义及内容 1 5 1 研究意义 脱氮微生物的存在，是生物脱氮作用进行的先决条件，因此，如何从自然环 境或人工环境中分离筛选反硝化细菌，增加反硝化细菌的种属资源，一直以来都 是研究的重点。反硝化细菌几乎存在于各种生境中，目前，已经从土壤中分离出 了多种反硝化细菌【6 4 1 ，因此，从多种受污染生境中分离反硝化细菌是可以实现的。 国内外长期工程实践表明，人工湿地对有机物的去除率较高，但对氮的去除 率偏低且不稳定。要确保南四湖水质达到地表水i i i 类标准，满足南水北调东线工 程的水质要求，必须在现有人工湿地技术基础上作进一步改进，强化其脱氮能力。 生物强化技术通过定向增加对目标污染物具有特殊降解能力的功能菌群的数量、 种群构成和活性，来强化系统对特定污染物的去除效率，从而达到一定的处理目 标。研究表明，微生物是湿地生物化学循环的核心，植物根际是微生物活性最高 的区域，植物与微生物之间具有良好的共生关系。通过生物强化，增加脱氮菌群 的数量，强化植物和微生物对目标污染物的协同去除作用，可以实现污染物去除 和植物增长的双重目标，是一条经济、高效的污染治理新技术。对于经济基础薄 弱、生态破坏严重的南四湖湿地来说，采用生物技术强化其污染治理能力，是实 现生态修复、保障调水水质安全的最佳途径。目前，有关生物强化湿地脱氮的工 艺尚鲜有报道，本研究将在此方向上开展基础研究，为今后生物强化技术的应用 提供帮助。 1 6 山东大学硕士学位论文 1 5 2 研究内容 获取高效的反硝化细菌是进行生物强化脱氮的前提和关键。研究表明，从天 然土壤中分离筛选纯种土著反硝化细菌，具有较高的生态安全性6 5 1 ，有利于降低 风险。因此，本研究拟从南四湖湿地土壤中分离筛选反硝化细菌，并了解其脱氮 特性，为将来生物强化脱氮的工程应用提供菌种资源和基础资料。 本研究针对南四湖入湖河流氮素污染较为严重的现状，从南四湖人工湿地主 要植物根际土壤出发，研究从中分离筛选具有高效脱氮能力的反硝化细菌的方 法；考察筛选出的反硝化细菌的脱氮特性，获得其最佳的脱氮条件参数；对筛选 出的反硝化细菌进行种属鉴定，扩充脱氮微生物的种属资源；利用筛选出的菌株 进行生物强化人工湿地脱氮模拟实验，分析反硝化细菌生物强化湿地脱氮的机理 及可行性。主要研究内容如下： ( 1 ) 采用一定的生物手段，尝试不同的方法，从南四湖人工湿地主要植物 芦竹、芦苇和香蒲根际土壤分别分离筛选反硝化细菌。 ( 2 ) 比较不同菌株之间脱氮能力的差异，复筛出最优脱氮菌株。通过反硝 化碳源、c n 、p h 值、溶解氧、温度、投菌浓度等脱氮条件的考察，掌握筛选 出的反硝化细菌的脱氮特性及规律，以期为其在实际中的应用提供有益指导，并 为相关微生态制剂的研发提供理论依据。 ( 3 ) 利用1 6 sr d n a 技术，对反硝化细菌进行种属鉴定，确定其系统发育 地位。 ( 4 ) 在实验室条件下，模拟反硝化细菌生物强化人工湿地处理含硝酸盐废 水试验，分别考察反硝化细菌对实际受污染新薛河河水和人工配水的处理效果， 分析生物强化的可行性及作用机理。 1 7 山东人学硕十学位论文 第二章南四湖植物根际土壤中反硝化细菌的筛选 微生物的分离工作，有时针对某一特定种，有时针对某一类群，有时则是以 摸清某一特定环境的微生物本底为目的的广泛分离。所以，分离的时候应根据不 同的目的、分离对象所处的自然环境及分离对象所具有的特性来选择相应的培养 基和方法。 植物根际土壤微环境复杂，非常适合微生物的生长，微生物与根区协同作用 显著，生物多样性丰富。研究表明，植物根际作为土壤中微生物代谢活性最高的 区域，存在着大量脱氮功能菌群，从土壤中分离出的细菌，6 5 以上具有反硝化 能力1 6 6 1 。南四湖人工湿地由于长期接纳、处理周边地区农业径流、工业废水和生 活污水等含氮废水，已具有一定的生物脱氮能力，湿地土壤基质中存在着大量的 反硝化脱氮功能菌群。本研究选取南四湖人工湿地三种主要植物：芦竹、香蒲和 芦苇，采用一定的生物学手段，尝试从其根际土壤中分离、筛选具有高效脱氮功 能的菌株，并建立起快速有效分离筛选反硝化细菌的方法。 2 1 材料与方法 2 1 1 材料与设备 ( 1 ) 土壤样品采集 试验所用土壤样品均采自南四湖新薛河入湖口人工湿地。选取生长旺盛的植 株，抖落表层大块土壤后，剩余部分作为植物根际土壤。现场采集的土壤样品及 时置于实验室4 。c 冰箱保存备用。 ( 2 ) 培养基成分 a 、菌株分离、纯化、保藏培养基( l ) 【6 7 】： c h 3 c o o n a ，2 9 ；蛋白胨，1 5 9 ：酵母膏，3 9 ；葡萄糖，l g ；n a c i ，6 9 ；琼 脂，1 2 9 ：k n 0 3 ，1 5 9 ：p h 控制在7 0 7 2 。 b 、菌株筛选、脱氮培养基( d m ：d e n i t r i f y i n gm e d i u m ) ( l ) ： c h 3 c o o n a ，2 9 ；k h 2 p 0 4 ，0 4 9 ；m g s 0 4 7 h 2 0 ，0 6 9 ；c a c l 2 2 h 2 0 ，0 0 7 9 ； k n 0 3 ，l g ；t r i s 缓冲液1 2 m l ；微量元素2 m l ；p h 控制在7 0 7 2 。 1 8 山东人学硕1 ：学位论文 c 、需氧性测定培养基( l ) 6 s 】： 蛋白胨，1 0 9 ：酵母膏，5 9 i 葡萄糖，l g ；琼脂，1 5 9 。 ( 3 ) 试剂 格里斯试n t 6 】： a 液：o 5 9 的对氨基苯磺酸加入到1 5 0 m l 的2 0 稀醋酸溶液中。 b 液：1 9 的a 一萘胺加入到2 0 m l 蒸馏水和1 5 0 m l 的2 0 稀醋酸溶液中。 二苯胺试剂： o 5 9 无色的二苯胺加入到2 0 m l 蒸馏水及1 0 0 m l 浓硫酸中。 革兰氏染色液： 草酸铵结晶紫、路哥氏碘液( l u g o ls o l u t i o n ) 、9 5 7 , 醇、蕃红； 其余试剂如无特殊要求外，均为国产分析纯。 ( 4 ) 主要仪器设备 微孔滤膜过滤器( 直径2 5 m m ，滤膜孔径0 2 2 9 m ) 、注射器； u v - 2 4 5 0 紫外分光光度计( s h i m a d z u ) 1 l r h 一2 5 0 a 生化培养箱( 广东省医疗器械厂) ； h z q r 恒温振荡培养箱( 哈尔滨东联电子技术开发有限公司) ； c x 3 1 光学摄像显微镜( 日本o l y m p u s 公司) ； h h 。s 恒温水浴锅( 江苏金坛市汇通电子有限公司) ； 万用电子炉；电子天平；t t - 9 8 1 电热蒸馏水器； y x q g 0 2 电热式蒸汽消毒器( 山东新华医疗器械股份有限公司) ； 康宝系列净化工作台( 济南康宝净化设备有限公司) ； e p p e n d o r f 移液器，培养皿若干。 2 1 2 实验方法 ( 1 ) 菌株分离：平板涂布法、平板划线法 a 、直接分离法：未经富集直接从原始土壤样品中分离菌株 土壤悬液制备【6 8 】：称取1 0 9 芦竹根际土壤样品置于2 5 0 m l 三角瓶中，加 1 0 0 m l 无菌水及几粒玻璃珠，摇床振荡15 m i n 使土样分散均匀。待土样分散后， 1 9 山东大学硕i j 学位论文 静置5 m i n 后，吸取l m l 土壤悬液至9 m l 稀释液( 无菌水) ，得到1 0 2 稀释度悬 液，依次按l o 倍稀释法稀释至l o ，由此制得各稀释度土壤悬液。 分别吸取各稀释度悬液0 i m l 至反硝化细菌分离用固体培养基平板( 已放 置过夜，无杂菌生长) ，用玻璃刮刀将土壤悬液涂布均匀。之后将平板倒置，放 入3 0 恒温培养箱，培养至长出明显菌落。 b 、富集分离法：定向富集后分离菌株 反硝化细菌定向富集：取一定量的植物根际土壤置于5 0 0m l 锥形瓶中，加 入4 0 0 m l 已灭菌的反硝化培养基( 成分同d m 培养基) ，形成深层培养的缺氧环 境，置于摇床3 0 。c 恒温慢速振荡培养。待观察到瓶中培养基液面有大量气泡后， 吸取2 0 m l 的菌液再行富集，连续富集多次，至可观察到菌液能够迅速大量产气。 将富集后的菌液采用倍比稀释法，涂布至固体培养基，之后静置于3 0 。c 恒 温培养箱，培养至长出明显菌落。 待上述平板长出菌落后，用接种环逐个挑取形态各异的菌落至新的固体培养 基平板，划线分离。同时记录挑取的各菌落形态特征，包括菌落形态( 圆形、不 规则、根状扩展、丝状、) 、质地( 表面光滑、湿润、干燥、褶皱) 、边缘( 整齐、 缺刻、波状、裂叶状) 、光学特性( 透明、半透明、不透明) 、大小、凸凹性、光 泽、有无同心环及颜色等。 ( 2 ) 菌株纯化：平板划线法 挑取分离出来的菌株，在平板上多次划线纯化，直至显微镜下观察显示无杂 菌为止，此时可认为菌株己纯化完毕。分离出的菌株在含有硝酸盐的固体培养基 上生长良好，具有潜在的反硝化