（光学专业论文）sers活性体系的优化及其在生物分子研究中的应用.pdf

首都师范大学硕士学位论文s 瞰活性体系的优化及其在生物分子研究中的应用 s e r s 活性体系的优化及其在生物分子研究中的应用 o p t i m i z a t i o no fs e r s a c t i v es u b s t r a t e sa n di t sa p p l i c a t i o n i nb i o m o l e c u l a ra n a i v s i s 摘要 拉曼光谱( r s ) 技术是以拉曼效应为基础建立起来的以光子作探针、具有实时检测特点 的分子结构表征技术，广泛应用于生物、医学和化学化工等领域，近年来应用于生物方面 的报道不断增多。应用激光拉曼光谱除能获得有关组分的信息外，更主要的是它能反应与 正常生理条件( 如水溶液，温度，酸碱度等) 相似的情况下的生物大分子的结构变化信息， 同时还能比较在各相中的结构差异，这是用其它仪器难以得到的成果。本论文充分利用激 光拉曼光谱技术能够应用于生物标记与分子构形构象及其吸附行为的这个特点，研究了包 括d n a ( 苹果单链、小牛胸腺、其它单链) ，碱基( 鸟嘌呤、腺嘌岭) 和维生素等的拉曼 光谱，获得了一定的相关分子的结构以及组分信息。 而且充分利用表面增强拉曼散射( s e r s ) 光谱的高灵敏度、高分辨率、水干扰小， 可淬灭荧光、稳定性好及适合研究界面等特点，结合谱学电化学技术，发展了一种银胶纳 米颗粒修饰的高效s e r s 活性电极体系，并基于这种体系得到了上述三类生物分子的高质 量s e r s 光谱；为它们的表面研究、吸附物界面表面状态研究、界面取向及构型构象的研 究和结构分析提供了一定的实验证据。 尤其重要的是，论文中首次把磁控溅射应用于电极修饰，从而构筑了更高灵敏、高分 辨的高效s e i 峪活性体系。这种全新的复合s e r s 活性体系，不仅为吸附分子构筑了巨大 的比表面积，从而大大增加了其拉曼散射截面；而且由于其兼有粗糙电极以及金属薄膜的 双重金属耦合s e i 峪增强机制，往往表现出超高强度、高灵敏度、高分辨率的增强拉曼信 号。磁控碱射修饰的这种电极s e r s 体系还避免了化学修饰的成分复杂的弊端，这种方法 修饰的电极体系是化学纯净的二元s e r s 活性基底，而且由于磁控溅射的高度可控等优 点，为新时期s e r s 活性体系增强机制的探讨完善提供了新的课题和实验依据。 关键词：生物分子拉曼s e r sd n a 碱基维生素谱学电化学修饰电极 首都师范大学硕士学位论文s 睐s 活性体系的优化及其在生物分子研究中的应用 a b s t r a c t e m p l o y - m gp h o t o 鸺嬲p r o b c s ，r a 脚ns p 咖鲫) p yi sp o t c 耐a l l ym i d e a lt e c l l r i i q u ef o r 咖d y i n gm o l e c u l 盯s 咖c t l 啪w i mi n s i n ld 咖t i o nb a o n 黜m 孤辩a 牡c r m ge f 融b e s i d e st l l e c o m p o n e mi i l f o m 埘吨i o n ，l 嬲e r r a m 舭s p e 咖o p yc 狮a l f l c c tt i l cv a r i e t yo ft l l eo 曙锄i c m 啪m o l e c u l a rs 咖c 嘶t l l es i m i l 盯c o n d i t i o mw i t l lt l l a to fn o m l a lp l l y s i o l o g y ，s u c h 勰 a q u e o 懈s o l u t i o n ，t e i n p i 伽o rp h v a l b a s c d 伽t 1 1 ea d v 柚t a 窖韶o fl 豁e r i b m 锄s p e c 妇lt 。c h n i q u 嚣湖b ea p p l i c do ns t l l d y i t l g o 唱蛐i c 仳瞪l 【，m o l c c u l a rc o n f i g u m t i o na n ds u m c cb e l l a v 0 lh 啪咄r a m 觚s p 妇o fd n a ， b a s i c g m u p 柚d 伽n i nw e c h o s 锄鼬p m b em o l e 叫l e s 舢a s u l t a b 岫血m l a t i v c m o l e c u l 盯g t n j c 眦一i 岫t i o na n d 唧n 蛐ti n f o l 蚴a t i o nw c o b t a i m d f u 曲c 珊o m ，h 碘q 蛆l 时s u m e n h 锄c c dr a m 瓶s p e 咖( s e r s ) o ft t i 锄w e a i s o g a i n e db 弱e d ak i n do fs e r sa c t i v es y s t e m mw h ，c hc o l l o i d a la gn 柚o p a r t i c l e sw e c o 鼬c d o nc o a f s ee l e c 打d d e nw a sf 0 u n dt l i a tt l l ee l e c h d d em o d i f i e dw i t 量lm e t a lc o l l o i dw a s 柚e 如t i 、，c s e r ss y 妣mw h i c hc o m b i 舱dt 量l ei m r i t so f c o l l o i dw 曲a d v a n t a g 髂o f e l e c 咖d c h o w e v e r ，“、张se q 吼l l ys i 印m c a n to f i i n p v m g 吐圮m o d i f i e de l e c 昀d es e r sa c t i v es y s t e m w i t l lu n i f o r i i l 锄dp u a gn a n o p a n i c l ec o 毗i n g sb 嬲e do nm a 鲫e 栅ls p u t t c 血g t h i sk 砌o f s i l v e 卜m o d i f i e ds i l v e fe b ：仃o d eh 船g o o ds t a b i l i t y 锄dt h cs i l v c rn a n o p a n i c l c s s i l v e re l e c t r o d e h a v eh o m o g c n e o u ss i z ed i 矧b u t i o n c o m p 眦dw i 也n l es i l v 睁c o l l o i dm o d m c ds i i v 凹e i e c t r o d e ， t h e r ew e n o 锄ye ) 【呦e o u sc o m p l o n e n ti o 船o nt l l ee k c 删e a c t u a l l yb a s c d t t l i ss y s i l w eo b t a i n e dm u c hh i g 蛔卜q i l a l 酊s e r ss p c c 廿ao fa d i 鹏m o l c c u l c s ，嬲w e i l 舔h i g h q l l a l h y p o t e n t i a l 也p e n d c ms e r ss p e c 舰t h ep r o b a b l ee x p l a 舱t i o n sf o r m ed r a m t i cv a r i e t i e s 蛐d e n h a n c e dm e c h 柚i s mw e r ed i s c u s s e db a s c do nt 1 1 ea d s o r d t i o nb e h a v i o ro f a d e n i l l co ns u b s n a t e k e yw o r d s ：0 f g 锄cm a c m m o l e c u l e ；黜曲锄；s e i 峪；d n a ；b 解i cg u p ；v i t 锄i n ； 2 首都师范大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下( 或 我个人) 进行研究工作所取得的成果除文中已经注明引用的内 容外，本论文不合任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成 果对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意本声明的法律结果由本人承担 学位论文作者签名：瓜 日期：1 7 年厂月l 。日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解首都师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 学校有权保留、送交论文的复印件，允许论文被查阅，学校可以公布 论文的全部或部分内容，可以采用影印或其他复制手段保存论文 ( 保密论文在解密后应遵守) 导师签名：论文作者签名： 日 期：安生!月 ! ： 旦 注：此页放在封面后，目录前 首都师范大学硕士学位论文 s 眈s 活性体系的优化及其在生物分子研究中的应用 第一章前言 拉曼散射a 隅) 光谱曾是研究分子结构的主要手段。自1 9 6 0 年激光问世并将这种新型光 源引入拉曼光谱后，拉曼光谱的弱点( 主要是拉曼效应太弱) 被攻克。拉曼光谱出现了崭 新的局面目前激光拉曼光谱已广泛应用于有机、无机、高分子、生物、环保等各个领域， 成为重要的分析工具它不仅与红外光谱相配合，可以更完整地研究分子的振动和转动能 级，更好地解决有机结构的分析问题。而且由于它的一些特点，如水和玻璃的散射光谱极 弱，因而在水溶液、气体、同位素、单晶等方面的应用具有突出的特长。近几年来又发展 了傅里叶变换拉曼光谱仪、表面增强拉曼散射( s e r s ) 光谱仪、超拉曼、共振拉曼、时间 分辨拉曼等新技术，激光拉曼光谱在高分子结构研究中的作用正在与日俱增。 作为生物化学主要研究对象的生物大分子多是处在水溶液环境中，研究它们在水溶液 中的结构对于了解生物大分子的结构与性能的关系是很重要的目前关于水溶液中生物大 分子的结构( 构性，构象) 资料还比较少生物大分子溶于水时结构上是否会发生变化? p h 、离子强度、温度和溶剂等环境条件对生物大分子的结构会有什么影响? 这些问题都有 待我们去研究。 由于水的红外吸收很强，因此用红外光谱发研究生物体系有很大局限性，而水的拉曼 散射很弱，干扰小，而且拉曼效应对于分子构象的变化比较灵敏。此外，对生物大分子结 构有重要影响的s _ - s 键在红外光谱中吸收很弱，又处于低波数区因而测定很困难，但 它在拉曼光谱中却显示强峰。在激光拉曼光谱的测定中，样品用量很少，可低至数微克， 这对生物化学体系也是非常重要的由于上述原因，再加上激光拉曼光谱仪本身的不断改 进，使激光拉曼光谱已成为一种能够快速，详尽提供有关水溶液中生物大分子结构信息的 新技术。 生物大分子中，蛋白质、核酸、磷脂等是重要的生命基础物质，研究它们的结构、构 象等化学问题以阐明生命的奥秘是当今极为重要的研究课题。应用激光拉曼光谱除能获得 有关组分的信息外，更主要的是它能反应与正常生理条件( 如水溶液，温度，酸碱度等) 相似的情况下的生物大分子的结构变化信息，同时还能比较在各相中的结构差异，这是用 其它仪器难以得到的成果。这些分子往往具有很少受其它振动模式的干扰，且具有强拉曼 效应，是分析鉴定结构的可靠模型 近年以来，生物大分子、d n a 研究的热烈程度不断升级。生物标记、分子构形构像、 l 首都师范大学硕士学位论文s e r s 活性体系的优化及其在生物分子研究中的应用 表面界面吸附行为等等都是众多研究组热衷的课题。事实上，生物大分子的拉曼光谱可以 得到许多结构方面的信息，d n a 有序结构类型，磷酸骨架，核糖或脱氧核糖和碱基的信息 等等而表面增强的拉曼光谱不仅兼顾普通拉曼的这些优势，而且由于其高灵敏度，高分 辨率，在对标记、识别检测和表面吸附行为进行有效的解释和表征上有着更大的优势。 然而，生物大分子由于其本身的特性，并不容易在普通条件下得到增强的拉曼光谱。 如何更清晰更完备表征拉曼光谱能给出的这些信息，并最大限度的挖掘s e r s 光谱在这一 领域的优势，是关键的因素。事实上s e r s 技术，包括表面增强的机理，作为一种探测分 子表面界面行为的新技术正不断探索和完备完善中。 s e r s 技术依赖于高效活性的s e r s 体系，目前使用最多的s e r s 活性体系是金属胶体 纳米颗粒以及电极电化学体系。溶胶是目前使用最多的s e r s 基底，因为它的制备无需特 殊装置，所以被广泛用于生物化学及痕量分析等领域中。尽管溶胶具有不少优势，但它也 有一定的缺点：首先，溶胶是一个亚稳态系统，它的凝聚作用只能稳定几个星期，而且容 易受温度等因素的影响；其次，溶胶的凝聚受多种因素的影响，不同实验中初始胶体颗粒 的大小、形状与表面状态也很难一致，从而无法进行不同谱图间的比较；另外，银胶溶液 中的吸附分子必须是可溶的，这给银溶胶在使用范围上带来一定的限制。 至于电极电化学体系，是指在电化学池中进行氧化还原过程( o r c ) ，使得电极表面 溶解并再沉积，进而得到有一定粗糙度的表面。这种体系是最早应用于s e r s 活性的体系 之一。然而，研究发现电极电位的改变除了改变电极表面粗糙度外，还对吸附分子的氧化 态、取向以及表面覆盖度等产生影响，这些因素将导致s e r s 增强因子及选择定则的变化， 从而降低了谱图的重现性。普通粗糙化电极的另一个缺陷是无法得到均匀粗糙度的表面， 给某些理论研究带来不利。 低维纳米材料的日新月异给s e r s 活性体系的优化带来了新的内容。在我们的这些工 作中，结合这两种体系，我们就优化了一套新的s e r s 散射活性体系。我们通过在粗糙电 极上修饰同样具有s e r s 活性的纳米颗粒，得到了一种比单独粗糙电极或单纯胶体纳米颗 粒都要高效的s e r s 活性体系。应用这种体系，我们得到了一系列在普通条件下并不容易 得到增强效应的生物大分子的高质量的s e r s 光谱，包括m q a ，碱基和维生素。由于这种 体系兼顾了谱学电化学粗糙电极的优势，我们还捕捉了其光谱随着电位变化的戏剧性扰动 信息。 然而，我们并不满足于简单胶体修饰电极的这些结果，为了使体系更加均一可控，我 2 首都师范大学硕士学位论文 s 既s 活性体系的优化及其在生物分子研究中的应用 们甚至尝试把磁控溅射技术应用于电极修饰，通过超高真空溅射银纳米颗粒在电极上，代 替普通滴加胶体银在电极上的方法，从而构筑超灵敏高分辨的高效s e r s 活性体系试验 证明，这些新技术的探讨，有利于得到超高强度、高灵敏度、高分辨率的增强拉曼信号。 本论文分为两个部分，综述部分和实验研究部分：综述部分主要建立在三年中阅读的 大量文献基础上，对研究工作相关现状的一些体会和总结，包括第二章和第三章；而实验 部分主要是在学习中所完成的研究工作，包括第四章、第五章和第六章。 特征量 拉曼散射是一种重要的非弹性散射，为了更深刻的理解拉曼散射，下面我们简单介绍 一下与拉曼有关的几个特征量。 1 拉曼频移( 肌q u e n c ys h i f t ，) 频移即散射光相对于入射光频率的变化，是非弹性散射的最主要的特征量。频移是介 质内部的结构所决定的，与入射光无关。对于不同的物质，其频移量有不同的计算方法【。 一般情况下，是先确定原子间相互作用势，再从该势在平衡位置的平衡条件【，。i 。= 七， 求出力常数七，频移就可以求出来了。 2 散射截面( s c a t t e r i n gc m s ss e c t i o n ，仃) 散射截面的单位是c m 2 ，其意义是用面积为单位表示入射光的散射率。 f 如图，设入射光为平行光线，其通量f 。是常数， 。入射光子数 1 单位面积单位时间 在与入射方向成1 9 角、与散射源距离为r 处的出射通量e 为 。 出射光子数 屯2 雨面丽i 蕲丽而 显然，最与r 2 是成反比的，但e r 2 与r 是无关的在图中， ( 2 ) e 枷= 五置2 d n 是单位 3 首都师范大学硕士学位论文s e r s 活性体系的优化及其在生物分子研究中的应用 时间通过面积微元剃的光子数。因此 删= 端瓣 ( 3 ) 式确定的量与r 无关。用它与原来平行光通量e 之比可以确切的表示散射过程， 将 ! 二j ：里：篁堡重堕些盟堂王墼 e每单位时间单位面积入射光子数 定义为微分散射截面。 微分散射截面的经典表达式 姿；名兰 ( 4 ) 面2 丁 其含义是：通过与入射光子流垂直的面元( d 盯) 的光子由源的散射作用均出现到立体 角m 的锥形管中【下图】。 蠢 散射截面直接关系到散射强度，亦常定义为 馐确= p ) m ( 5 ) 为进一步描述该散射过程，还定义了微分散射截面 塞2 敕云等麓。咖r 赣云s 薏如 c s ， 丽2 敕丽吲2 敢是硒“珊 ( 5 ) 与( 6 ) 式相比，该积分是对某一散射带进行，对应于某一立体角d n 内和某一特 定激发态相联系的总散射贡献。( 6 ) 式中的被积函数就是微分散射截面，其定义为 盎= 志 擒d j m 如s 1 3 散射光强( s c a t t e r i n gi n t e s i 劬i ) 为了简便起见，我们将分子简化成偶极子。光入射到偶极子上，会引发辐射，其 辐射的总强度为【4 】 4 首都师范大学硕士学位论文 s 既s 活性体系的优化及其在生物分子研究中的应用 j ：掣掰 ( 8 ) 知 ” 式中的l ，是感生偶极子的振荡频率，也就是散射光的频率。膨。是感生偶极矩的振幅。 则在笛卡儿坐标系中，沿任一轴方向单位立体角内平均单位时间的散射强度为 j ：学圮( j ：础：) ( 9 ) 这里仅考虑了单个偶极子的情况，而实际测量的则是大量分子体系的平均，极化率张 量口与偶极子在空间的取向有关，而单个偶极子的取向是任意的。因此，求解大量粒子的 总的散射光强必须对个别偶极子的可能取向求平均，然后乘上总的偶极子数n ，可得到散 射光强为 ，= 古孚懈军彳一z 酗叩 ， 首都师范大学硕士学位论文s 既s 活性体系的优化及其在生物分子研究中的应用 2 1 拉曼简介 第二章拉曼光谱 光与物质相互作用的现象早已为人们所了解，如瑞利散射使大气层现蔚蓝色的天空， 廷德尔散射在乳浊悬浮液中的表征，颗粒的米氏散射，这些都是弹性散射，即入射光频率 与散射光频率相等的光散射作用。在探究物质的微观结构中，更有用的是分子转动、振动， 晶格振动及各类激发元参与的非弹性散射。拉曼散射就是其中之一的能反映分子转动、振 动的非弹性散射【m 】。 所谓光的非弹性散射现象是指散射光频率与入射光频率有所偏离，这种频率发生改变 的辐射就称为r a m a n 散射当一束光入射到分子上时，除了与入射光频率咖相同的散射光 以外，还有频率分量为( o 曲魄的散射光，鲰是与分子振动或转动相关的频率，这种光散射 现象就称为拉曼散射。在激发线低频一侧的谱线为斯托克斯线( s t o k e s ) 。也叫红伴线；在 激发线高频一侧的线为反斯托克斯线( a i i t i - s t o k 懿) 旭叫紫伴线；激发线处的散射谱线则 称之为瑞利线，见附图2 1 。 谱 线 强 度 图2 1 拉更和瑞利谱线 2 1 1 拉曼散射的经典理论 由经典电磁理论【1 43 1 可知：入射光电磁场感生偶极矩为 庸( f ) = 巳弓( f ) ， 埘 ( 2 一1 ) 7 首都师范大学硕士学位论文 s e r s 活性体系的优化及其在生物分子研究中韵应用 若电磁场中电场分量吾按如下形式变化： e = e o c o s l l ( 2 2 ) 式中乩比原子振动频率大很多，而与电子的振动频率相当。则感生偶极矩m 可写成 电场e 的级数表示式 露= 庙+ 壶面2 + 刍届3 + + 去窖” ( 2 - 3 ) 训御。m 式中a 是电子极化率，p 是超极化率，t 、是高阶秩张量。我们只讨论正常拉曼散射 的线性相，即a 圆，将a 对简正坐标按泰勒级数展开 窃= + 。+ 壶( 割。泓刍。n 上式中的q 的一次项确定了一级拉曼效应，二次项确定了二级拉曼效应。若分子中的 原子以q 频率振动，则由q = q o g d s 母。f 可得一次拉曼效应中的电子极化率随时阃变化规 律为 删= + 偿 。驰s 吖 ， 所以有 可以看出感生偶极矩露振动不仅有入射光频率吃，而且还有慨千) 两种对称分布 在，两侧的新频率，它们起源于原子振动队电子极化率仉的调制。前者相应于频率不变 的弹性光散射，如瑞利散射；后者相应于频率发生变化的非弹性光散射，即拉曼散射。而 频率减少的b 。一吼) 称为斯托克斯频率；频率增加的b 。+ ) 称为反斯托克斯频率。对 于前者，散射的分子从入射光中“吸收”一个振动量子，而后者，散射分子放出一个振动量 子和入射的光量子“结合”成频率为b 。+ q ) 的散射光- 畋 纨 吨 瞄 o 9 幺 如 o 唾- | ； 、婴g山 口一 a r 叫谯酏 吼匐 s 虱一负 ，鸳围 c，0j私故 _ e 卜 唱 町 面 呈 = ，r 咖 m 诅 删 鸭 首都师范大学硕士学位论文s 职s 活性体系的优化及其在生物分子研究中的应用 诚然，经典光电磁场理论能很好的解释拉曼频移的物理起因，但是，在斯托克斯与反 斯托克斯散射强度之比的计算中得到了，出现了与实验事实相反的结论：由电磁波辐射方 程组可推算出偶极子散射强度为 ，( f ) = 专脚1 2 ( 2 - 7 ) 将( 1 6 ) 式代入上式得拉曼散射强度为 ( f ) = 一露i 岛c o s 2 吼h 砰c o s 2 h 一) f + 霹c o s 2 h + q ) f + 交叉项+ 】 ( 2 8 ) 式中的瑶= 簖：相应于瑞利散射项，群= 丢罄 。鲸h q ) 相应于斯托克斯散 瓤暖= ( 割。繇h 耐相应于反斯航斯散胝因此急= 躇， 但是实验事实却是k 托克新 o 脯托克新。所以用经典电磁理论不能很好的解释散射光强的问 题。 2 1 2 拉曼散射的量子理论 以铣，瓦分别表示激发光入射光子的频率和波矢，以q ，叠分别表示散射光子的频率 和波矢，以，g 分别表示散射过程中伴随产生或湮灭的元激发的频率和波矢。当一束光 入射到分子上时，入射光( 量子) 瓴，或) 被分子吸收后使电子和晶格振动从初态也，) 跃迁到一个虚中间态眈，瑶) ；随即辐射出散射光子h ，叠) ，由中间虚态回到终态以，吃) ， 与此同时，产生( 或湮灭) 了一个频率为而波矢为g 的元激发，见图2 - 2 。 9 首都师范大学硕士学位论文s e r s 活性体系的优化及其在生物分子研究中的应用 壳， 壳国 壳， 南缈- 南m ， 壳m 壳脚，恕缈 峨 以 鼙铀k e 碍绕 蔫利线 t 卜- 簟o k e 覃蛾 图2 - 2 拉曼散射量子跃迁示意图 受徽虐卷 受徽立态 e e 多粒子( 核与电子) 组成的系统遵从的含时薛定格方程为 风旷忆f ) - 访昙北 ( 2 - 9 ) 当一束光照到分子上时，相当于系统上加一含时微扰日，可设整个系统总哈密顿算 符为 h = h h + h 1 光子场与分子体系的同一波函数甲满足薛定谔方程 疏芸：( h 。憎) 甲 ( 2 1 0 ) a f 、”7 、 该方程的微扰解只取到一级近似时可以写成 甲伊，f ) = 哗舻，f ) + 畔伊，f ) = h 9 ，f ) ( 2 - 1 1 ) 光波电磁场于系统的微扰互作用能为日= 一豆露，其中光波电磁场面可以写成 重= j e 。m 。+ j + e 州式中j 是复振幅，则 h = 一j ? 函。町一j + 肠o 。“( 2 - 1 2 ) 将( 2 1 1 ) 和( 2 - 1 2 ) 式代入( 2 - 1 0 ) 式做求解处理，于是得 ) = m ：e x p 【- “m t + 国l ) f 】+ m ：c x p 【f ( 一m 。) r 】 ( 2 - 1 3 ) l o 首都师范大学硕士学位论文s e 路活性体系的优化及其在生物分子研究中的应用 系统分子受光照微扰时产生能级跃迁，引致的电偶极跃迁矩。k 为 。k ( f ) = 从酽，f ) 露儿胪，) 毋 ( 2 一1 4 ) ，。= 刍k 二阻。1 2 + o 。+ 出。) 4 i c 。1 2 + o 。一脚。) i p 。1 2 】( 2 一1 5 ) 式中的第一项对应的是与外来激光频率吼无关的伴随七号m 跃迁的自发辐射。式中 的第二项就是散射光频率为( k + 吼) 的正常拉曼散射，当e p e 。时，为反斯托克斯散射； 当e k b 。时，为斯托克斯散射。式中的第三项表示伴有两个量子感应发射，即七一所的跃 迁。这类发射只有在受激粒子数剧增时才能被观测到【l 】o 2 2 拉曼光谱法的特点 拉曼光谱学的应用范围广泛，遍及化学、物理学、生物学、医学和环境科学等等。这 些应用的性质各异，从纯定性直到高度定量与红外光谱相比，拉曼光谱有着一些独特的 优势【2 ，町： 第一，拉曼光谱的频率位移不受单色光源频率的限制。单色光源的频率可根据样品的 不同特点而有所选择。红外光谱的光源不能任意调换。 第二，激光的方向性强，光束发散角小，可聚集在很小的面积上对极微量的样品进行 测定。 第三，拉曼光谱不破坏样品，毋需样品制备，一般样品可装于毛细管内直接测定，玻 璃即为理想的窗口材料，危险的及热敏样品可在密封容器中测试。而红外测试则需要对样 品做一定的处理 第四，用激光器为光源，激光的单色性好，激光拉曼光谱谱带常常比红外谱带更尖锐， 分辨性好。由于拉曼光谱研究的是谱线位移，故用一台普通的拉曼光谱仪就可方便地测量 从几十到四千波数范围内的光谱，若用红外光谱则需中红外和远红外的配合才能完成。尽 管红外和拉曼光谱均是研究分子的振动能级，但红外光谱是在红外区进行吸收研究。而拉 曼光谱则是在可见区研究分子的振动能级，这样激光拉曼光谱较红外光谱大大降低了对样 品池、单色仪和检测器等光学元件材料的要求，在操作上也大为方便。 第五，激光拉曼光谱可以方便的用于水溶液体系的测量，这是拉曼光谱于红外光谱相 1 l 首都师范大学硕士学位论文 s 醯s 活性体系的优化及其在生物分子研究中的应用 比最显著的优点之一。由于水分子的不对称性，在拉曼光谱上没有伸缩振动频率带并且其 它的变形、剪切等振动频率谱带很弱，因而水的拉曼谱图很简单。而水的红外光谱带数很 多且强度大，对溶质的谱图分析带来很大干扰。对醇类溶液，拉曼光谱也有同样的优点。 第六，拉曼散射的强度通常与散射物质的浓度呈线性的关系，而在红外光谱中吸收与 浓度为对数关系。 第七，拉曼活性的谱带是基团极化率随简正振动改变的关系，而红外活性的谱带是基 团偶极矩随简正振动改变的关系，拉曼光谱中包含的倍频及组频谱带比红外光谱中少。所 以拉曼光谱往往仅出现基频谱带，谱带清楚，分析起来比红外光谱更简单。 第八，拉曼光谱能对s - s ，c c ，c = c 。n = n ，c = s ，p s 等红外吸收较弱的官能团 给出强的拉曼信号，对易产生偏振的一切重要元素( 过渡金属、超铀元素等) 的络合键均 可出现拉曼强谱带。 第九，拉曼光谱可用于单晶的低频晶格频率及高频分子频率的研究，这是由于晶格内 分子的排列一定，偏振参数不像液体那样是空间平均化的。在振动频率的归属上能应用与 排列有关的偏振数据。 另外，使用高功率脉冲激光器对受激拉曼散射和超拉曼效应等非线性现象的研究可大 大增加人们对物质固态和液态结构方面的认识。 2 ，2 1 可见、近红外激光拉曼光谱 拉曼光谱是一项重要的现代光谱技术，它的应用早已超出化学、物理的范畴，渗透到 生物学、矿物学、材料学、考古学和工业产品质量控制等各个领域，成为研究分子结构和 组态、确定晶体结构的对称性、研究固体中的缺陷和杂质、环境污染物、生物分子和工业 材料微观结构的有力工具。 传统的拉曼一般采用可见光作为激发光源。最广泛使用的是氩离子激光器，常用波长 为4 8 8 枷和5 1 4 啪吼但是，由于在可见区极易产生荧光，而荧光的强度往往是拉曼强 度的几万倍乃至近百万倍，因此可见光作激发光源时，往往受到荧光的干扰，有时甚至得 不到光谱而且。一些深颜色的样品对可见光的吸收很强，也很难得到拉曼光谱。将激发 光源从可见区移开不仅能避开荧光的干扰而且也能解决深颜色样品的吸收问题。 首都师范大学硕士学位论文 s e r s 活性体系的优化及其在生物分子研究中的应用 改变激发光源可以有两个方向，一是将光源移至近红外区，二是将光源移至紫外区。 因为近红外区的光源频率低，光子能量也低，一般不会激发电子态m ，正是这一原因使 得近红外拉曼可以避免荧光的干扰，但同时由于灵敏度较低和热辐射干扰等原因使得近红 外拉曼的使用也受到一定的限制。 近年来发展的傅立叶变换拉曼( f r _ m 吼锄) 采用近红外l o “m 激发光源，由迈克耳 逊干涉仪傅立叶变换系统代替了分光扫描系统对散射光进行探测。此外，采用介质膜滤光 片来降低干涉仪内瑞利散射光相对水平，还采用高灵敏度的锗二极管和铟镓砷检测器来降 低探测器的噪剐8 】。傅立叶变换拉曼光谱仪与传统的可见光激发色散型拉曼仪比较，最大 的成就是容易测定有荧光和对光不稳定的化合物的拉曼光谱，拓宽了拉曼技术的使用范 围，使得样品测试率从普通拉曼仪的1 0 2 0 提高到9 0 。并且干涉仪没有任何狭缝和色 散元件，一次扫描就可完成全波段的测定，而一次测量只需要一秒。由于使用的干涉仪对 仪器的漂移不敏感，对样品池放置的重现性要求也不高，因而谱图的重现性好；分辨率和 光通量在全谱范围内不变，所以光谱频率的准确度高；在色散仪扫描一个谱点的时间内， 干涉仪已经扫描完所有的谱点，因此谱图的信噪比高1 9 】而且，近红外光足以穿透生物组 织，可以直接提取生物组织内的有用信息。 但是，受散射原理的制约，散射光强度与激发光频率的四次方成正比，因此使用5 1 4n m 可见光激发的散射光强度为l o “啪近红外光激发的散射光强度的近二十倍，用3 2 5 砌 紫外光激发的散射光强度是l o “n m 近红外光激发的散射光强度的一百多倍。由此，近 红外波段尽管发展了傅立叶变换技术，但在强度上仍然无法跟紫外光激发，甚至可见光激 发下的散射光强度相比拟。 改变激发光源的另一个方向是将激发光源移至紫外区使用紫外光作为激发光源不仅 能避免荧光的干扰，而且能解决灵敏度低的闻题，因此近年来发展迅速。 2 2 2 紫外拉曼 紫外拉曼相对于可见区拉曼存在着巨大的优势。这种优势首先表现在灵敏度高。由拉 曼散射定律可知，散射光的强度与光的频率的4 次方成正比因此当拉曼散射的激发光源 由可见光改为紫外光对，拉曼教射强度往往会有几十倍的提高大量的实验也证明，对于 相同浓度的在可见及近红外区均不能获得任何拉曼信息的样品在紫外区往往能够获得理 想的拉曼光谱，本文实验研究部分的有关实验直接地证明了这一点。 1 3 首都师范大学硕士学位论文s e r s 活性体系的优化及其在生物分子研究中的应用 紫外拉曼的另一个优点就是几乎没有荧光的干扰。大部分物质的荧光都发生在可见 区，用紫外光激发时，即使是斯托克斯线也落在紫外区，因此能够避免荧光的干扰。 紫外拉曼还具有选择性。在常规的拉曼散射中，激发光源的光谱位置离任何吸收带都 比较远，所有的电子受入射扰动的情况都是相同的，粗略地说，所产生的所有的电子都是 相同的，所有拉曼允许的振动与电子的耦合是相似的。因此，在常规的拉曼中，所有的样 品对光谱的贡献是类似的，与它们的浓度成正比f 1 0 1 。但是，如果在电子吸收带内进行激 发，也就是所谓的共振激发，处于跃迁状态的电子在它们固有的振荡频率上被激发，感生 偶极矩非常大，于是产生的拉曼散射的强度很大。因此如果用被分析物选择吸收的频率激 发，以稀释的样品就可以获得有效的振动拉曼光谱。 对于大的分子，甚至可以选择一定的频率对该分子的特定部分进行激发共振拉曼技 术利用和特殊样品某一部分内的特殊电子跃迁相一致的频率选择激发，能够选取高纯化学 物质。因为只有那些振动态与特定极矩的电子相符合的分子才能明显地增强拉曼谱带，这 就使紫外拉曼具有了双重选择性【1 “ 近些年，随着紫外拉曼技术的迅猛发展，该技术在应用中已取得了大量成果。 2 3 拉曼光谱仪器 2 3 1 近红外傅立叶变换拉曼光谱( n i r f t - r a m a n ) 虽然拉曼光谱学在某些实验条件下所具有的独特优点胜过红外光谱学，可以充分加以 利用，但它仍为仪器结构复杂及荧光干扰等问题所困扰，与红外光谱相比，仍难以成为常 规分析方法。 1 9 6 4 年，c i l a n t r y 和g e b b l e 【“】首次证明了用傅立叶变换技术获得拉曼光谱的可能性， 但由于早期的实验并未获得预期的效果，以及当时人们对此所持的怀疑态度，因而未能引 起广泛的注意1 9 8 3 年，j e 衄i n g s 等在美国图森天文台应用傅立叶变换红外光谱设备进 行了f t - r a m a n 的实验，并于1 9 8 6 年成功地发表了该实验地第一篇文章。同年，h i r s c h f c l d ”3 l 著文肯定了f 1 球a m a n 的可行性和应用前景，并预言该技术可能成为色散型可见拙曼 光谱技术的有力竞争对手。与只能覆盖l o 样品的传统拉曼光谱相比，通过使用近红外 激光光源的傅立叶变换拉曼光谱，有效地克服了荧光干扰，可给出有8 0 样品的拉曼光 1 4 首都师范大学硕士学位论文s 既s 活性体系的优化及其在生物分子研究中的应用 谱。此后，n i r - f t - r a m a n 迅速在化学、生物学、物理和医学样品中非破坏性结构分析 等方面显示出强大的生命力，尤其在解析化合物体系与荧光化合物的结构方面已经成为有 力的工具【1 4 1 ，从而导致了拉曼光谱的一场新革命。 固定镜 图2 3f r - i h m a l l 光谱仪的示意图 典型的f r a m a n 光谱仪【2 】的示意图如图2 3 ，主要是由光源、样品台、光学过滤器、 麦克尔逊干涉仪和检测器等组成。激发光源经过衰减器照射到样品上，经样品散射后进入 麦克尔逊干涉仪，再经过介电滤光器和可见滤光器后进入检测器。后经计算机进行数据处 理。目前，大多数的f t r a m 锄光谱仪都采用n d ：y a g 激光器，即掺钕钇铝石榴石红宝石 激光器为激光光源( 近红外，1 0 6 4 啪) ：采用c h e v m n 滤光器或介电滤光器将散射光中的 瑞利散射滤去；而使用的干涉仪都是利用傅立叶变换红外仪器常用干涉仪，只是将分束器 换成石英的，以利于近红外广透过；检测器常用液氮冷却的g e 或i n g a a s 检测器，检测范 围在高波数可分别达到3 4 0 0 c m 1 或3 6 0 0 c m - 1 。整个仪器的操作和数据处理都由计算机完 成。 2 3 2 r e n i s h a w 砌沮2 0 0 0 型紫外可见显微拉曼光谱仪 r e 札i s h a wr m 2 0 0 0 型显微拉曼光谱仪属于近年发展起来的新型拉曼光谱仪，由于采 用了新型的c c d 光探测元件，因而具有很高的量子效率和灵敏度，可以测量很弱的拉曼 信号显微技术特别适合微区拉曼测量，可以在白光下观察并记录样品表面的显微图象， 这一点对研究样品表面的不同性质的区域以及某些物理量在样品表面的分布情况非常有 1 5 首都师范大学硕士学位论文 s 既s 活性体系的优化及其在生物分子研究中的应用 用。同时显微镜下的激光光斑直径只有一个微米大小，光强集中，功率密度大，因而不需 要很大功率的激发光源，所以显微拉曼光谱仪一般采用小型的固体激光器。同时由于采用 成像式的信号接受，有别于光电倍增管的单道扫描，因而大大节约了测量时间。但是由于 它采用n o t c hf i i t c r 过滤杂散光的瑞利线，因而对于很低波数的拉曼信号损失较多。 本实验室的r m 2 0 0 0 型拉曼光谱仪还配置了冷、热样品池来测量极端条件下样品的 拉曼光谱。以及光纤探头用于一些特殊场合不宜接近或移动的样品的光谱测量。 图2 4 为i 洲2 0 0 0 型共焦显微拉曼光谱仪的原理示意图，入射激光经过扩柬镜( b e 锄 啪d 盱) ，再经过两块反射镜到达全息滤波片( 劬f i j t e f ) 上，由于全息滤波片对于 特定频率激光线的阻挡作用，入射激光的绝大多数能量被反射，再经过显微镜内部反射， 由物镜聚焦至待测样品表面，反射光线、散射光连同其它杂散光一起沿着相反的方向返回 到全息滤波片上，在此激光线以及靠近激光频率的瑞利散射光和杂散光被两片全息滤波片 所阻挡不能透过，而拉曼散射光得以通过，再依次经过聚焦透镜、狭缝( s l j t ) 、另一聚焦 透镜、反射棱镜到达衍射光栅( d 姗t i o ng r a t i n g ) 表面，经由光栅分光后聚焦到c c d 搽 测器上，通过信号放大和转换后输入到计算机处理，得到样品的拉曼光谱。 2 4 生物拉曼 田2 - 4r m 2 0 0 0 型共焦置徽拉曼光谱仪 生物大分子中，蛋白质、核酸、磷脂等是重要的生命基础物质，研究它们的结构、拘 象等化学问题以阐明生命的奥秘是当今极为重要的研究课题。应用激光拉曼光谱除能获得 1 6 首都师范大学硕士学位论文s 睐s 活性体系的优化及其在生物分子研究中的应用 有关组分的信息外，更主要的是它能反应与正常生理条件( 如水溶液，温度，酸碱度等) 相似的情况下的生物大分子的结构变化信息，同时还能比较在各相中的结构差异，这是用 其它仪器难以得到的成果。 与用于生物学研究的其它物理手段相比，拉曼散射是一种大信息含量的研究手段例 如生物的几何性质、化学键力的大小以及环境对它们的影响都能在拉曼谱线上得到反映。 概括地说，用拉曼光谱进行生物学研究有以下特点： l ，可以在含水地活性条件下进行研究：研究样品可以不用制备成晶体：一般情况下， 测量不会造成样品的破坏。 2 ，用共振增强拉曼光谱可以对复杂分子和生物体系的某一特定部分进行有选择的研 究。 3 ，利用以脉冲激光微光源的时间分辨拉曼技术，可以研究短到皮秒( 1 0 。1 2 s ) 甚至飞 秒( 1o - 1 6 ) 的生物反应动力学过程。 4 ，利用显微或共焦显微拉曼光谱可以得到样品体积只有l 微米或面积l 微米大小和 不同深度的光谱信息。 5 ，最近发展起来的显微拉曼光谱成像术，利用拉曼散射光可以对同一样品不同组分 或同一组分的不同基元进行有选择的平面或立体成像，为一般光学和电子显微镜所不具 备。 生物学的拉曼光谱研究与其它学科的拉曼光谱一样，基础性的研究很重要，它是技术 应用的基础【瑚。 作为生物化学主要研究对象的生物大分子多是处在水溶液环境中，研究它们在水溶液 中的结构对于了解生物大分子的结构与性能的关系是很重要的。目前关于水溶液中生物大 分子的结构( 构性，构象) 资料还比较少。生物大分子溶于水时结构上是否会发生变化? p h 、离子强度、温度和溶剂等环境条件对生物大分子的结构会有什么影响? 这些问题都 有待我们去研究。由于水的红外吸收很强，因此用红外光谱发研究生物体系有很大局限性， 而水的拉曼散射很弱，干扰小，而且拉曼效应对于分子构象的变化比较灵敏。此外，对生 物大分子结构有重要影响的& - s 一键在红外光谱中吸收很弱，又处于低波数区因而测 定很困难，但它在拉曼光谱中却显示强峰。在激光拉曼光谱的测定中，样品用量很少，可 1 7 首都师范大学硕士学位论文 s e r s 活性体系的优化及其在生物分子研究中的应用 低至数微克，这对生物化学体系也是非常重要的。由于上述原因，再加上激光拉曼光谱仪 本身的不断改进，使激光拉曼光谱已成为一种能够快速，详尽提供有关水溶液中生物大分 子结构信息的新技术。 而基于拉曼之上的s e r s 光谱技术不仅可以在分子水平上提供指纹光谱信息，而且可 以确定吸附分子的种类，研究表面反应；根据表面增强选择理论，可以判断表面分子的取 向和作用方式i “。v o d i i l l l 和c u l i l a 等基于罗丹明b 标记的巯基化寡聚n a d 链体系， 发展了一种乳腺癌基因s e r s 探针m 。m u r g i d a 等评述了在电极表面仿生膜上细胞色素c 电子转移机制的s e r s 研究方法【1 8 1 c 0 n o n 小组报道了葡萄糖氧化酶在银表面催化反应 的s e r s 光谱1 1 9 】。 大量的研究人员利用s e r s 解决了生物化学、生物物理和分子生物学中的许多问题， 包括提供分子的特殊基团( 如氨基酸中的氨基、羧基、芳环等) 与界面的相互作用、生物 分子与金属的键合方式、d n a ( r n a ) 在银胶上的吸附状态，特别是在生物标记、探测 及生物传感等方面不断有很多新的报道。p e 劬e g o i n 等2 0 】报道了s e r s 方法在超灵敏跟踪 探测方面的新界限。通过非共振s e r s 方法，展现了溶液浓度下降到a m 0 1 ( 1o 1 。) 时的标 记方案通过选择恰当的s e r s 增强条件，可以用作对重要生物分子科监视和检测的例行 分析方法【2 1 】。 标记鉴定生物分子如蛋白、抗体、d n a 、细胞的标记方法种类很多，如染料分子标 记、同位素、酶标记等方法发展较为成熟。随着纳米粒子合成技术的提高、生物分子标记 技术的发展，纳米粒子用于生物分子标记已成为近几年的研究热点。p o n e r 等提出用多种 探针分子修饰免役金做拉曼标记，使得纳米粒子标记与s e r s 光谱相结合实现多组免疫应 答之间的识别检测。m i r k i n 等人用染料分子修饰的单链珊q a 、r n a 将其固定在金纳米粒 子