基因组编辑技术专题ppt课件.ppt

基因组编辑技术专题,1,自从证明DNA是遗传物质以后，人类就开始了通过改变DNA来改造生物体生理机理和功能的尝试。,1973年，斯坦利N科恩(StanleyN.Cohen)和赫伯特W博耶(HerbertW.Boyer)成功将蛙的DNA插入到细菌中。20世纪70年代，基因泰克(Genetech)公司对大肠杆菌进行基因改造，使其带有一个人源基因(这个基因是人工合成的)，最后生产出治疗糖尿病的胰岛素。1974年，加利福尼亚州索克生物研究所(SalkInstituteforBiologicalStudies)的RudolfJaenisch通过将SV40病毒的DNA注射到小鼠的囊胚中,培育出了第一只转基因小鼠。,2,基因突变技术：物理诱变、化学诱变转基因技术：T-DNA插入RNA干扰技术：dsRNA、ArtificialmiRNA核外遗传技术：质粒、人工染色体同源重组技术：e.g.传统的基因敲除小鼠,无法控制突变位点不能精确控制外源基因插入位点对靶基因抑制不彻底、不特异难以稳定的遗传费时费力费钱，难以大量应用并引起一系列生物伦理的问题,现状,3,4,基因组编辑技术,基因组编辑技术（genomeediting）是一种可以在基因组水平上对DNA序列进行改造的遗传操作技术。也称为基因打靶（Genetargeting）。技术的原理是构建一个人工内切酶，在预定的基因组位置切断DNA，切断的DNA在被细胞内的DNA修复系统修复过程中会产生突变，从而达到定点改造基因组的目的。,5,历史1993年前ZFN就已开始出现，迄今已发展了20多年才有今天的成就；2009年底出现的TALEN似乎一夜之间呈现出取代ZFN的架势；2012年底CRISPR/Cas已显现出取代TALEN的巨大潜力，在2013年成为现实。荣誉2011年：ZFN，TALEN和Meganuclease2011年度方法（NatureMethods）2012年：TALEN2012年十大突破（Science）2013年：CRISPR/Cas被认为是诺贝尔奖级别的成果，华人科学家张峰已因此获得生物医学大奖。,基因组编辑技术,应用基因组巡航导弹，分子剪刀，DNA外科医生定点突变，定点修饰（包括得到转基因），转录调控基因治疗（如遗传病）,6,基因编辑的三大利器,ZFN(Zinc-fingernucleases,ZFN)TALEN（transcriptionactivator-likeeffectornucleases)CRISPR/Cas(clusteredregulatoryinterspacedshortpalindromicrepeat/Cas-basedRNA-guidedDNAendonucleases）,特异性DNA识别域,非特异性核酸内切酶,+,7,ZFN原理,ZFN=蛋白的DNA识别域+核酸内切酶DNA识别域：由一系列Cys2-His2锌指蛋白（zinc-fingers）串联组成（一般34个），每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。,8,核酸内切酶：非特异性核酸内切酶FokI，形成二聚体时切割双链DNA,两条ZFN之间具有被称为“间隔区”的spacer结构，该结构的长度以56bp为宜，7bp也能正常工作，合理的“间隔区”设计才能保证ZFN二聚体拥有最佳的工作空间。,9,ZFN技术的缺陷,DNA识别域虽然具有较强的特异性识别能力，但是其识别的序列长度比较有限。因为ZFN剪切的过程不完全依赖同源二聚体的形成，所以一旦形成异源二聚体，就很可能造成脱靶效应；如果出现脱靶，可能导致DNA的错配和序列改变，产生较强的细胞毒性。当这些不良影响积累过多，超过细胞修复机制承受的范围时，便会引起细胞的凋亡。另一方面，该手段在细胞内部操作的精确程度不足，则可能会引起相关基因突变，引发癌症等。ZFN作为基因治疗的手段之一，如果在生物体内使用，可能会引发免疫反应。而现有的研究手段尚不能预测引入的ZNF蛋白是否会引起免疫系统的进攻。到目前为止，ZFN技术只能用于体外操作（invitro），在对人体提取的细胞进行处理之后，再导入回输到病人体内。,10,TALEN,TALE（Transcriptionactivator-likeeffectors）:一种源于植物致病菌的靶向基因操作技术。科学家发现，来自植物细菌Xanthomonassp.(黄单胞菌)的TAL蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系,一个模块单元识别一个碱基，简单且特异性极好。通过组合各类模块，可对任意核苷酸序列进行靶向特异性敲除或内源基因的表达调控。目前已在人、大鼠、小鼠、猪、羊、斑马鱼、拟南芥及酵母等多类物种中得到成功应用。,11,TALEN原理,典型的TALEN由一个包含核定位信号（NLS）的N端结构域、一个包含可识别特定DNA序列的典型串联TALE重复序列的中央结构域，以及一个具有FokI核酸内切酶功能的C端结构域组成。DNA识别域：由一系列TAL蛋白串联组成（一般20个左右），每个TAL蛋白识别并结合一个对应的碱基。核酸内切酶：非特异性核酸内切酶FokI，形成二聚体时切割双链DNA,12,全长为34aa的Tal蛋白的第12、13位氨基残基可以特异性识别核苷酸碱基。NG可以识别THD可以识别CNI可以识别ANN可以识别G或A通过这种特异性识别，将多个Tal蛋白组装在一起，就可以构成可以识别目的片段的Tale蛋白。,TALEN原理,13,TALEN的特异性打靶的原理：一对可以特异性识别靶基因的TALE，定位到需要编辑的基因组区域；然后非特异性核酸内切酶FokI切断双链DNA从而造成DNA双链断裂（double-strandbreak，DSB）；再通过DNA的自我修复，引起碱基的缺失或突变，从而引起基因突变。FokI只有在形成二聚体的时候才有内切酶活性。,TALEN原理,14,构建特异性的TALEN表达载体,15,TALEN介导的基因编辑,TALEN质粒对共转入细胞后，表达两个融合蛋白，分别与靶位点特异结合，由于两个TALEN融合蛋白中的FokI临近，形成二聚体，发挥非特异性内切酶活性，在两个靶位点之间剪切DNA。形成DSB时，同源重组可将需要敲入的序列组合入基因组。,16,TALEN元件的优化,17,TALEN的技术特点,任意敲除，无基因序列、细胞、物种限制，永久失活成功率高，在保证转染效率的前提下，有效性可达95%以上打靶效率高，可完全替代RNAi技术脱靶率低，尚未发现明显脱靶效应技术简单，只需按照常规构建质粒方法构建Talen质粒,18,19,Fightinginvasion.Whenviruses(green)attackbacteria,thebacteriarespondwithDNA-targetingdefensesthatbiologistshavelearnedtoexploitforgeneticengineering.,20,Invasion.Streptococcusthermophilus(嗜热链球菌)suchasthisonemayacquirekeydefensivesequencefrominfectiousbacteriophage,attachedattop.,Lactose,Lacticacid,发现,21,CRISPR-Cas主要由两部分组成：,1CRISPR-Cas系统的发现,CRISPR（成簇、规律间隔的短回文重复序列）-Cas是很多细菌和大部分古生菌的天然存在免疫系统，通过对入侵的病毒和核酸进行特异性的识别的一种获得性免疫机制。,22,BreakthroughPrizeinLifeSciences,23,1CRISPR-Cas系统的发现,免疫过程,24,1CRISPR-Cas系统的发现,CRISPR-Cas系统赋予原核细胞针对外源DNA特异性免疫,而这种特异性是由间隔序列（spacer）决定的。在宿主防御噬菌体攻击中，细菌进化了CRISPR介导的适应性免疫。这种免疫功能的发挥是由CRISPR间隔序列的动态性变化，即通过增加或删除间隔序列（spacer）来实现的。,25,CRISPR/Cas系统分类：根据CRISPRCas系统中的Cas蛋白的种类和同源性，可将CRISPRCas系统区分成3种类型：,1CRISPR-Cas系统的发现,26,2TypeIICRISPR系统Cas9,随着越来越多的不同菌中的CRISPR系统被发现，研究者们根据他们降解外源的遗传物质的方法，将他们分为了三类。TypeIandTypeIII.这两套系统由于参与的蛋白众多，需要几个复合物共同作用才能发挥作用，使得它不宜操作和改造。,27,PAM:proto-spaceradjacentmotifs(保守的间隔相邻基序)crRNA:CRISPRRNAtracrRNA:trans-activatingCRISPRRNA,3.人工改造,TypeIICRISPR系统中的Cas9是个核酸酶，这个核酸酶结合两个RNA(crRNA,tracrRNA)就可以切割双链DNA.,28,3.人工改造,他们进一步阐明了RNA和目标DNA配对的原则，同时将crRNA-tracrRNA连接成了chimeraRNA，这样只需要Cas9蛋白和一条定制的RNA就可以编辑特性的DNA。,2012年JenniferA.Doudna和EmmanuelleCharpentier的这篇Science发现了一个比较简单的CRISPR（TypeII）系统的机理。这一系统就简单多了，一个巨大的160KD的蛋白Cas9利用RNA,就可以完成识别和切割靶向的DNA。,29,3.人工改造,他们进一步分析了Cas9作为核酸酶的活性位点：两个核酸酶活性域会分别切割靶DNA的两条链，造成双链断裂。,30,Nucl.AcidsRes.-2013-DiCarlo-nar_gkt135,Cas9,gRNA,20nt,4.工作原理,Cas9蛋白与向导RNA结合、组装的动作是这套位点特异性的基因组修饰过程里的限速步骤。,31,真核系统的应用,1）优化密码子，让Cas9蛋白可以在哺乳动物系统中很好的表达。2）加了核定位序列(NLS)，这样可以把Cas9送到细胞核内进行基因组编辑。3）当然，同时需要表达一个guideRNA，把Cas9定位到靶DNA处。4）CRISPR-Cas系统靶向要求为PAM序列（5-NGG-3），即靶序列后面必须为NGG才能被向导RNA识别，在人类基因组中平均每8个碱基就可以出现一个NGG。,利用这个技术，就可以很方便高效廉价地在细胞上做基因编辑：包括敲除、修改、插入。,4.工作原理,32,4.工作原理-切割后的处理,NHEJ:Non-homologousendjoining非同源性末端接合,HDR:Homology-directrepair同源直接修复,33,进一步用Nickase增加编辑特异性,因为Cas9介导的靶向主要依赖于guideRNA和目标DNA20左右的碱基的配对，大家开始重视脱靶效应（off-target）。,ZhangFengMITDOI:10.1126/science.341.6148.833,基因组编辑（基于DSB）NHEJHDR,基因干扰,基因激活,原理,设想一下：一个人（Cas9）拿着一把钥匙（gRNA）去开一栋大楼中的某个房间。,40,应用水稻,Indel(33%),NatureProtocolsdoi:10.1038/nprot.2014.157,41,测序分析转基因株系3个靶位点突变（体细胞突变形成嵌合体）：,应用拟南芥,42,SchematicDiagramofAssemblingCas9/sgRNAConstructandSelectingTargetSitesinPDS1,Agrobacterium,Weconstructplasmidsthatcarrying4/3/2/1sgRNAstargetingPtPDS1gene,respectively.,应用杨树,43,应用杨树,44,TheBigFragmentChangesattheDesignedCas9TargetingSitesinPtPDSGene,AbigfragmentinversionmutantofPtPDS1,AbigfragmentdeletionmutantofPtPDS1,应用杨树,45,应用果蝇,A.Bassett,J.-L.Liu/Methods69(2014)128136,HRMA:High-resolutionmeltinganalysis(高分辨率熔解曲线分析),46,A.Bassett,J.-L.Liu/Methods69(2014)128136,应用果蝇,whitegene,yellowgene,47,应用HIV,Deletion(190bp),LTR:longterminalrepeats,ProcNatlAcadSciUSA.2014Aug5;111(31),清除感染细胞中的HIV,48,应用HIV,ICC:Immunocytochemistry免疫细胞化学技术WB:WesternblotMOI:multiplicityofinfection感染复数,ProcNatlAcadSciUSA.2014Aug5;111(31),预防再度感染,49,应用医药,ChemBiol.2015Jan22;22(1):107-16,Drug-targetinteraction,XPO-1,C528SmutationintheXPO1genec