（环境工程专业论文）多聚体微泡造影剂的合成与制备.pdf

凹北i ：业人学硕士学位论文摘要 摘要 在回顾多聚体微泡造影剂的发展历史和被动靶向制剂研究现状的基础上，研究 了目前国内外多聚体微泡造影剂产品的组成、制备、临床试验及研发状况，发现 多聚体包膜微泡造影剂不仅是今后声学造影剂发展的主流，而且在成为药物或基 因的靶向载体方面也有着非常好的前景。不同于传统的多聚体造影剂产品，采用 中和法、吸附法、机械匀化法、声振空化法、冷冻干燥法、薄膜水化法等来制 备，实验中仍然采用乳液聚合法。 前期实验所制备的多聚体微泡造影剂存在单体转化率低、有刺激性气味、显影 效果较差等问题；在造影荆的生物降解性、基因携载方面还是一片空白。 在此研究基础上，首先，充分考虑多聚体微泡造影剂组分的无毒性、生物相容 性、溶血性等问题，通过改变双组分单体的种类及配比，引发剂、复合乳化剂的 种类和剂量，以及实验条件如紫外光引发强度、引发时间、搅拌速度等因素，并 研究这些因素对聚合反应和微泡特性的影响，解决了多聚体微泡造影剂存在的不 稳定、有毒性、单体刺激性气味等问题。 其次，通过光学显微镜观察微泡的粒径分布情况，并采用三种不同的方法进行 多聚体微泡造影剂的体外显影实验研究。通过与水囊试验和硅胶管实验相比较， 发现了一种更有效的体外显影方法一一琼脂显影法，使用此方法对多聚体微泡造 影剂的显影性进行评价。采用好氧生物降解法对多聚体微泡造影剂在环境中的生 物降解性进行研究，建立了以p c d 曲线、c o d 曲线和红外光谱图像三个方面测定和 评价多聚体微泡造影剂降解性的方法。 最后，将所制备的多聚体微泡造影剂注入动物体内，通过动物实验来验证微泡 造影剂的显影性、安全性等。将微泡与d n a 片段结合，通过高速离心检测微泡与 d n a 片断的结合状态，来观察多聚体微泡造影剂的携载基因能力。 实验确定了用于消化道显影的微泡造影剂原料组分和最佳的实验反应条件。用 于消化道显影的多聚体微泡造影剂的平均粒径在o 5i jm 4um 之间，微泡浓度达 到1 0 。m l 。能稳定保存1 0 个月以上；体外显影实验和动物实验都表明显影效果良 好，可用于消化道显影；并且可携载基因，在高速离心后仍然保持与d n a 片断结 合的状态。 关键词：多聚体微泡造影剂，乳液聚合，乳化剂。引发剂，紫外引发 a b s t r a c t t h i sp a p e rr e v i e w e dt h eh i s t o r yo fp o l y m e r i cm i c r o b u b b l ec o n t r a s ta g e n t s ，s t u d i e d t h ec o m p o s i t i o na n dp r e p a r a t i o no fm i c r o b u b b l ec o n t r a s ta g e n t s w ep r o p o s e das p e c i a l p o l y m e r i cm i c r o b u b b l ec o n t r a s ta g e n t sp r e p a r a t i o nm e t h o d ：e m u l s i o np o l y m e r i z a t i o n t h a ti sd i f f e r e n tf r o mt r a d i t i o nm e t h o d s ：n e u t r a l i z a t i o n 、a d s o r p t i o n 、m e c h a n i c a ls t i r r i n g m e t h o d 、s o n i c a t i o n 、f r e e z e d r y i n g m e t h o da n dh y d r a t i n gm e t h o d p o l y m e r i c m i c r o b u b b l ec o n t r a s ta g e n t sa r en o to n l yw i d e l yu s e di nt h eu l t r a s o n i cm e d i c a lf i e l d ，b u t a l s ou s e di nd r u go rg e n ed e l i v e r y p o l y m e r i cm i c r o b u b b l ec o n 舡a s ta g e n t sw h i c hp r e p a r e di nf o r m e re x p e r i m e n th a v e m a n yp r o b l e m s ，s u c ha sl o w m o n o m e rr a t e ，t h r i l lo d o r , p o o rd e v e l o p i n gp r o p e r t i e sa n d s oo n ，b i o d e g r a d a t i o na n dd r u go rg e n ed e l i v e r yo f m i c r o b u b b l es t i l li san e wc o n c e p t a tf i r s t ，w es o l v e dt h e s ep r o b l e m s ：l a b i l i z a t i o n 、t o x i c i t ya n dt h r i l lo d o ro f m i c r o b u b b l e s ，b e s i d e sc h a n g et h es p e c i e sa n dd o s a g eo fm o n o m e r , e m u l s i f i e ra n d i n i t i a t o r , w h i c ha r en e c e s s a r yi n t h er e a c t i o n ，r e a c t i o nt i m e ，b i o d e g r a d a b i l i t ya n d p r e s e r v i n gt i m e sw e r ea l s oi n v e s t i g a t e dr e s p e c t i v e l y s e c o n d l y , w eu s et h r e em e t h o d st o r e f l e c td e v e l o p i n gp r o p e r t i e so ft h ep o l y m e r c o n t r a s ta g e n t sw h o s ed i a m e t e rw a so b s e r v e db ym i c r o s c o p e b yc o m p a r i s o nt oo t h e r m e t h o d s ，ag o o dv i t r oe x p e r i m e n t - a g a rm e t h o dw a sf o u n d t h ev a l u eo fp c d a n dc o d ， i n f r a r e d s p e c t r o g r a m f o ra c r y l i cp o l y m e rw e r er e c o m m e n d e dt o e v a l u a t e b i o d e g r a d a b i l i t yo fa c r y l i cp o l y m e r a tl a s t , w ev a l i d a t e dt h ed e v e l o p i n gp r o p e r t i e sa n ds e c u r i t yo fa c r y l i cp o l y m e rb y a n i m a lt r i a la n do b s e r v e da b i l i t yo fg e n ed e l i v e r yt h o u 曲c o m b i n i n gm i c r o b u b b l e sw i t h d n a t h eb e s tr e a c t i o nc o n d i t i o na n ds p e c i e so fm o n o m e rw h i c hu s e di ni t ss t o m a c h w e r ec o n f i r m e d t h ea v e r a g ed i a m e t e ro fm i c r o b u b b l e sw a sb e t w e e no 5 岫a n d4 1 x m , t h ec o n c e n t r a t i o nw a s10 9 m l ，a n dc a nk e e pm o r et h a n1 0m o n t h s a n i m a lt r i a la n d v i t r oe x p e r i m e n t ss h o w e dt h a tr a ti m a g i n gc o n t r a s tw a so b v i o u s l ye n h a n c e da g e n ti ni t s 1 1 两北1 二业人学硕+ 学位论文 a b s t r a c t s t o m a c hb ys a i dc o n t r a s t m o r e o v e r ，t h es e l f - d e s i g n e dp o l y m e r i cm i c r o b u b b t e sc o n t r a s t a g e n tc a nb ec o m b i n e dw i t hd n a f r a c t i o n si n3 0m i n u t e s h i g h * v e l o c i t yc e n t r i f u g a l e f f e c td o e sn o tc h a n g et h ec o m b i n a t i o n ， k e y w o r d s ：p o l y m e r i cm i c r o b u b b l e sc o n t r a s ta g e n t ，e m u l s i o np o l y m e r i z a t i o n ，e m u l s i f i e r , i n i t i a t o r , u v - i n d u c e d ，g e n e i i l 阿此i 业人学硕一f ：学位论文| j u鬲 刖罱 微泡造影剂的研究已有3 0 多年的历史，最早期的微泡造影剂是通过手振或注 射时空化产生游离气体微泡，这种微泡体积大、不稳定，除非直接注射不能使矗 心系统成像。8 0 年代研制了具有声振人血白蛋白或脂质外壳的空气微泡，大小与 红细胞相似，经外周静脉注射后可以使左心腔显影，但微泡的外壳很薄( 3 0 5 0n m ) ， 空气容易弥散出微泡回到血l 液中，经静脉注射后在血液中持续时间短，不能用于 心肌灌注显影“3 。新的造影剂在设计时，采用低溶解性低弥散性的高分子气体如含 氟含硫气体，提高了微泡在j i 【l 液中的寿命，稳定性增加，但不能很好的控制微泡 的声学特性，粒径分布的均性欠佳，声衰减明显等。根据目前的国内外关于微 泡造影剂的文献资料，最新一代微泡造影剂的研究重点为改变微泡的外壳构成， 大多利用可生物降解多聚体材料，合成多聚体微泡造影剂。多聚体微泡的抗压力 性能及体内稳定性明显提高，而且微泡大小分布均一性好，通过改变材料的聚合 条件，可以改变微泡的声学特性，是目前微泡造影剂研制中最具有前途的一个方 向。 国外对于多聚体微泡造影剂的研究最多，德国及美国均已有多聚体微泡造影 剂成品上市，但多聚体微泡造影剂的靶向性尚还在研究中，且有关多聚体微泡造 影剂的制备技术大多处于未公开状态。国外进口的造影剂产品价格昂贵，超出了 国内多数人的支付水平。这将成为一个巨大的经济负担，在经济方面不大可行。 因此发展本国的微泡造影剂产品是未来发展的趋势。 另外，多聚体微泡的制备不仅可以用于发展造影剂行业，而且在作为药物或 基因的靶向载体方面也有着非常好的前景。利用微泡在超声介导下的空化效应， 可以携带药物作超声定点靶向组织治疗，在溶栓治疗、抗肿瘤的治疗等其他药物 携载方面具有潜在的重要应用价值。 本文在目前微泡造影剂研究基础上，提出了以生物可降解的多聚体材料作为 微泡膜包裹氮气，采用乳液聚合法来制各多聚体微泡造影剂。实验是在初步确定 了原料组成及各组分间配比等的基础之上展开的，主要工作目标是置换原来乳液 成分中对人体有毒性的组分，并且增强微泡膜的靶向性，进一步确定原料组成， 找到各组分问的最佳配比。解决乳液的稳定性、单体聚合率、恩影性、靶向性等 问题，制各出分别适合用于胃肠道或心肌显影的多聚体微泡造影剂。 西北i ：业人学硕士学位论文 第一章文献综述 1 1 研究背景 第一章文献综述 1 1 1 多聚体微泡造影剂国外的研究进展 1 9 7 7 年t i c k n e re g 等学者应用超声可以探测到的明胶包裹的氮气微泡无创性 测量动物肺动脉压力。1 9 8 0 年c a r r 0 1 1b a 等将这种微泡作为超声造影剂用于肝 脏肿瘤组织的显像，获得成功，经动脉注射后可以使肿瘤组织轮廓比较清晰的显 现出束，并可以持续显影4 分钟以上，但这种明胶微泡比较大，粒径分布带比较 宽，平均直径( 7 5 9 土2 1 ) 啪，最大直径1 3 0 肛m ，如果经静脉注射，绝大部分将在 肺毛细血管阻塞，因此不能作为经静脉注射的超声造影剂。1 9 9 0 年又有学者尝试 应用海藻盐作为外壳的微泡，虽然能产生很高的回声，但直径仍大于3 0 p ，不能 用于静脉注射”1 。 随着高分子化学的发展，医用高分予材料开发用作药物基因传递和控释的载 体。这些高分子载体材料以合成的可生物降解的聚合物体系和天然的大分子体系 为主，受上述应用的启发，国外有学者用可生物降解高分予材料与空气或其它难 溶性气体，采用先进的声振交联微球技术，制备出新型储存稳定性强、可经静脉 输注、体内稳定、心肌显影效果好的心肌造影剂“1 。 s c h n e i d e rm 等制备了叔丁基甲基碳酰多聚谷氨酸包裹的空气微泡，测试了其 物理和超声特性并与白蛋白空气微泡进行了比较“1 。多聚体微泡数量平均直径( 3 土1 2 ) m ，粒径分布带窄，只有1 的微泡直径超过8 p m ，而白蛋白微泡相应的数 值是平均直径( 4 土2 。1 ) m ，多聚体微泡具有很强的超声反声源性，发射频率在 7 5 m h z 时的背向散射系数与白蛋白微泡相似，然而在2 2 5 m h z 时，白蛋白微泡的背 向散射系数大于多聚体微泡，这些结果与超声衰减测量结果是一致的，多聚体微 泡的最大声衰减在8 9 m h z ，而自蛋白微泡的最大声衰减在3 5 4 5 m h z 。微泡在 接近自己的共振频率时，背向散射强度最大，而共振频率与微泡的半径成反比， 因为上述声学特性的不同可解释为白蛋白微泡中大微泡占的比例大，所以白蛋白 微泡的共振频率低，在较低的发射频率时背向散射强度最大，多聚体微泡的最大 声衰减移向较高的发射频率，也是由于与白蛋白微泡相比，外壳的硬度提高。多 聚体微泡在1 5 0 m m h g ( 1 9 9 5 k p a ) 压力下是稳定的，而白蛋白微泡对压力却非常敏 2 西北f 业人学硕士学位论文 第一章文献综述 感，不能承受收缩期左室腔的压力。由上述对比分析可见，多聚体微泡具有以下 特点：粒径更理想，粒径分布更集中，体内稳定性高，抗压力性能好，外壳较硬， 共振频率较高，需要在较高的发射频率时获得理想的散射强度。 a c u p h e r e 公司认为他们克服了那些已经获得f d a 批准的造影剂的局限性，研制 了一种新型的超声造影齐t j a l 7 0 0 ”1 ，内含氟碳气体，平均直径2 2 m ，浓度2 ，2 1 0 9 m 1 ，有低空隙率的外壳层，其外壳由合成的可生物降解的多聚丙交酯乙交酯( p l g a ) 组成，内含疏水成分。这种材料已经被f d a 批准用于其它药物输送系统。不同于天 然材料的超声造影剂，这些合成材料组成的外壳及其结构特点可以防止微泡在体 内的迅速崩裂，成像过程中保持其声学特性。a i 一7 0 0 b b 够提供高强度的持续时间 比较长的增强显影而声衰减很低。有关在人体使用a i - 7 0 0 的安全性和心肌灌注成 像的结果表明，a i 一7 0 0 的不良反应都是轻微暂时的，监测参数没有显著性变化”1 。 p o i n tb i o m e d i c a l 公司研制的一种新型双层外壳超声造影剂( b p 1 2 7 ) ，外层 为白蛋白，内层为可生物降解的多聚体( 具体材料不详) ，内包裹氮气，平均直径 ( 4 i 2 1 ) m ，浓度0 5 l o 1 1 动物试验证实高度的心腔显影而后方声衰减极小”。 总之，p o i n tb i o m e d i c a l 公司研制的b p 一1 2 7 和类似含空气的m 1 0 0 1 的特点为， 粒径分布一致性好，具有可以包裹高溶解性气体的能力，共振频率高，后方声衰 减轻微。b p 一1 2 7 是专为能量多普勒成像模式设计的声学造影剂。 德国s e h e r i n g 公司研制的s h u 5 6 3 a 。1 是另外一种特殊的多聚体声学造影剂， 外壳由多聚丁基氰基丙烯酸酯( p o l y b u t y l 一2 一c y a n o a c r y l a t e ) 组成，内含空气，平 均直径1 2 m ，所有微泡直径 1 9 0 ，主要用于制 造静脉营养药脂肪乳) 眦1 。 西北t ：业大学硕十学伉论文 第三章多聚体微泡造影剂的制备 并且，研究资料显示，磷脂酰胺乙醇胺有助于超声显影的功能，因此，本实验 在选取s p a n 类和t w e e n 类复配的乳化剂基础上加入了少量的卵磷脂。 3 2 。3 引发剂的选择 引发剂是乳液聚合配方中最重要的组成部分之一，引发剂的种类和用量会直 接影响产品的产量和质量，影响聚合反应的反应速率和聚合物的分子量。乳液聚 合反应中所用引发剂的种类很多，在选择引发剂时，首先要考虑引发剂本身所具 有的分解活化能或半衰期：若引发剂的分解活化能过高或半衰期过长，将会降低 聚合反应速率或延长聚合时间；反之，若引发剂的分解活化能过低或半衰期过短， 则会引起引发剂分解过快，温度难以控制，从而有可能引起爆聚。其次，考虑到 本实验所要合成的是用于人体的微泡造影剂，对试剂的纯度和毒性要求高于一般 试剂，故在选择引发剂时，应避免或尽可能少地引入新的物质和离子，从而最大 限度减少造影剂乳液在体内的副作用。 有关不同种类的引发剂对实验结果的影响在前期实验中进行了详细的探讨。结果 列于表3 4 ： 表3 4 不同种类引发剂对实验结果的影响 引发剂实验结果 过硫酸铵 取氧水 m 0 2 一f e e l 2 偶氮二异丁腈 过氧化笨甲酰 引发效果不错，乳液中含有大量微泡，但静脉注射时凝血 性较强，兔子一经少量注射立即死亡： 引发反应效果不佳，乳液分层现象严重； 不能引发反应，制备出液体显褐色，有存在f e “的可能 能充分引发反应，且制得的乳液稳定不分层，单体昧较大 能充分引发反应，制得乳液有不明显分层，单体昧较大 由实验结果可以看出过硫酸铵能充分引发聚合，制得稳定不分层的乳液，乳 液中单体的气味很小几乎没有。但动物试验( 兔子) 表明到各的乳液具有很强的 凝血性，少量静脉注射后在血液中即发现有血液凝聚的现象。病理分析认为，凝 血现象为过硫酸铵在聚合过程中所分解出s o 。2 自由基所致。虽然过硫酸铵不能用 于静脉注射显影实验，但是消化道给药一般不会产生凝血之类的毒性，因而可用 于制各消化道显影的造影剂。 油溶性引发剂过氧化苯甲酰和偶氮二异丁腈( a i b n ) 均能充分引发反应，可 相对来讲，由a i b n 作引发剂所制备出的乳液较稳定。且考虑到a i b n 是最常用的 偶氮类引发剂，一般在4 5 6 5 下使用，8 0 6 c 9 0 时激烈分解。并且a i b n 分 两北工业火学硕士学位论文 第三章多聚体微泡造影剂的制备 解时产生的氮气与微泡内包裹的气体种类恰好吻合。因此在本研究前期实验中选 定引发剂为a i b n 。 但是，由于医学上对注射用的超声造影剂的毒性、生物降解性等方面的要求 远高于一般的口服用超声造影剂，所以在制备超声造影剂时，如何避免有毒物质 或人体难以接受物质的引入是一个贯穿始终的指导思想。在以上所介绍的试剂中， 引发剂a i b n 虽然能够充分地引发单体聚合，但a i b n 在分解前后分子式中所含有 的氰基- - c n 还存在有一定的危险性。有资料显示，a i b n 加热分解在放出氮气的同 时，还有可能放出对人体危害较大的有机氰化物“。6 。因此，尝试用紫外光代替引 发剂a i b n 来直接引发单体聚合，从而完全避免了引发剂对人体造成危害的可能性。 3 2 4 光引发剂的选择 光引发体系就是在光的照射下，引发剂光解能够产生具有引发活性的自由基 或离子体，进而引发功能单体或带有活性基团的齐聚物，并发生聚合反应。目前已 经成功开发应用的光敏引发体系，根据其产生活性基单体的类型不同，主要可分 为：( 1 ) 自由基型光引发剂，如比较常用的二苯酮、苯乙酮类、安息香醚类、硫杂葸 酮类等；( 2 ) 离子型光引发剂( 主要为阳离子型) ，如二苯基碘盐、三苯基硫盐、三 苯基硒盐等。离子型光引发剂体系的显著优点是受氧气的阻聚影响作用较小，在空 气氛围内也可快速完全聚合，这给实际应用带来了极大方便，可用于一些新型成像 体系汹1 。 实验初期。因所制备的实验装置紫外灯功率最大只能达到2 2 5 w ，因而考虑加 入光引发剂来促进单体的完全聚合。对光引发剂性能的要求：( 1 ) 在辐射光源的光 谱范围内，具有较高的吸光效率：( 2 ) 具有较高的活性体( 自由基或离子) 量子产率； ( 3 ) 在树脂基体中具有良好的溶解度；( 4 ) 具有长时间的保存性能；( 5 ) 无色，放置 过程中不变黄；( 6 ) 无气味，毒性低；( 7 ) 价廉易得、成本低。本实验因为对毒性的 要求较高，因丽选用无毒的安息香乙醚来做光引发荆蛳1 。 3 3 多聚体微泡造影剂的制备研究 采用紫外引发装置后，虽然可制得粒径和浓度均令人满意的微泡。但始终存 在乳液分层，单体聚合率低，显影不明显，仍存在毒性等问题。本实验针对此类 问题进行实验研究。 西z l h j _ = 业大学硕士学位论文 第三章多聚体微泡造影剂的制备 3 3 1 乳液分层问题 ( 1 ) 乳化剂比例的影响 乳化剂中亲水性和亲油性两部分的相对大小决定了该物质的性质和用途。h l b 即亲水亲油平衡值，是对每个表面活性剂人为规定的个数值，此数值越大亲水 性就越强；相反，此数值越小疏水性就越强。实验中所用乳化剂及其h l b 值见表 3 5 ： 表3 - 5 乳化剂及其h l b 值 0 w 型聚合物乳液 最佳t l l b 值范围 聚苯乙烯 聚醋酸乙烯 聚甲基丙烯酸甲酯 聚丙烯酸乙酯 甲基丙烯酸甲酯与丙烯酸乙酯的共聚合物( 质量比1 ：1 ) 1 3 o 1 6 o 1 4 5 1 7 5 1 2 1 1 3 7 1 1 8 1 2 4 1 1 9 5 1 3 0 5 确定了乳化剂的种类和总用量之后，参考由复合乳化剂h l b 值计算公式所得 h l b 值的理论值，改变复合乳化剂的配比，观察在不同的乳化剂配比下所得乳液稳 定性结果如表3 - 8 所示。 西北 ：业大学硕士学位论文 第三章多聚体微泡造影剂的制备 表3 - 8 乳化剂不同配比对实验结果的影响 豢誉辫懑鬻辫篝攀攀拳 譬? ；毒i “。爹溪攀二i _ 。? j f 1 爨奠繁鬻，誉誊誉j 麓i ? i - “u 、i i 。 一一o 。篱。爹爹雾麓ji ? ，、。，。一? i 。 。 图：卜4 ：在1 0 0 0 r m i n 离心后照片图3 5 ：在3 0 0 0 r m i n 离心后照片 诬托工业大学硕士学位论文 第三章多聚体微泡造影荆的制舞 ! ! = ! e = = = ! ! = = = = = = ! ! ! ! ! ! = l = ! = = ! = o ! = = = = = ! ! ! = = 一i e = ! = ! ! g = = ! = = ! = = = j = 自l = ! 一 ( 3 ) 单体配比的影响 两种单体之间的比例差异，会使共聚物乳液的外观，浓度，稳定性等许多性 能发生变化。确定单体的比例时，需考虑单体均聚物与共聚物的玻璃化温度之间 的关系：当共聚物的玻璃化温度t g 接近室温时，在常温下有相当的硬度，t g 越高， 膜就越硬；反之t g 越低，膜越软。 表3 - 9 复合单体心龋比对聚合乳液的影响 由实验结果可以看出，复合单体的配比发生变化时不仅对乳液微泡的浓度有 影响，而且对乳液的外观及稳定性也有一定的影响。当两单体m 和c 之间的比值 为2 ：l 时，不但出现了明显的结块现象，而且乳液的稳定性较差；二者之间的比 例为3 ：1 时，仍存在凝胶现象，而且乳液经离心后仍然出现分层现象：当二者的 比值为5 ：l 时，既无凝胶现象，所得乳液也较稳定，以3 0 0 0 r m i n 速度离心5 分 钟后，也无分层现象。可见当共聚物的玻璃化温度越高时，乳液越稳定。因此本 实验确定两单体之间的最佳配比为5 ：1 。 3 3 2 乳液中单体的聚合率：单体气味去除问题 ( 1 ) 紫外光功率的选择 在以紫外光代替引发剂a i b n 引发单体聚合的实验中，其中一个很重要的影晌 因素就是紫外光的功率。紫外光功率的大小不但对单体的聚合有影响，而且还决 定了乳化作用的强度。因此对乳液体系的形成、稳定以及微泡大小均有较大的影 响，只有功率适中才可充分引发聚合反应。本实验中分别采用不同的功率来引发 反应，结果如表3 一1 0 所示： 西北j ：业大学硕士学位论文第三章多聚体微泡造影剂的制各 表3 1 0 不同功率r 紫外光对聚合反应的影响 功率( w )单体转化率( ) 1 2 0 1 8 0 1 9 5 2 2 5 5 0 0 3 4 5 4 4 7 6 2 5 4 8 8 6 3 5 1 1 0 0 图3 - 5 紫外光功率对单体转换率的影响 由实验结果我们可以看出，在一定的紫外引发时间( 3 h ) 下，随着紫外光功 率的增加，单体的转化率有所提高。而且在5 0 0 w 时，单体完全转化为聚合物。并 且随着紫外光功率越大，所需要的引发时间越短。但当紫外光功率过大时，虽然 单体转化率高，但是乳液的制备过程中易产生凝聚物，同时有白色沉淀物生成。 主要是因为当紫外光功率过高时，产生大量的自由基，聚合反应不均匀，从而形 成了一些白色沉淀物。 ( 2 ) 紫外时间的影响 在采用紫外光引发乳液聚合反应的实验中，除了受紫外光功率的影响，引发 反应时间也是一个很重要的影响因素。 西北工业大学硕士学位论文 第三章多聚体微泡造影剂的制各 表3 - 】1 ：紫外功率为) 8 0 w 条什i - ，单体的转化率随紫外引发时间的变化情况 紫外引发时间( h ) 单体转化率( ) 1 8 6 4 2 8 1 9 2 9 0 5 5 4 8 8 3 2 0 5 345 紫外日f 发财闻t ( h ) 图3 7 紫外引发时间对单体转换率的影响 由上图可以看出，在反应初期和中期，随着紫夕 引发时间的延长单体的转化 率有所提高，但当反应时间达到5 小时后，单体转化率开始明显下降。适当延长 时间以使充分反应，但并不是反应时间越长越好，反应后期，合成的聚合物在紫 外光照下，通过自由基反应，开始重新又降解为小分子摄物质。因而，紫外引发 时间并不是越长，单体转化率越商。在紫外功率为1 8 0 r 条件下，紫外引发5 小时 是单体转化率最高。 ( 3 ) 乳化剂的影响 a 乳化剂种类的影响 紫外功率为1 8 0 w 条件下，单体的转化率随乳化剂种类的变化情况 砧 惦 柏 矩 黔 如 侣 鬟v姑晕辱荤掌斟 西北= 业大学硕士学位论文第三章多聚体微泡造影剂的制备 ： 5 。 一4 5 x v 4 。 甜 l ： 斟2 5 1 5 345 时间t ( h ) 图3 - 8 乳化剂种类对单体转换率的影响 0 5 2 3 # 和0 5 1 9 # 制备的乳液在单体种类、配比、乳化剂配比、搅拌速度、通 气量等其他条件相同，只是乳化剂种类有所差别。0 5 2 3 # 采用司盘和吐温以及卵 磷脂复配制备，而0 5 1 9 # 采用司盘和吐温复配制备。由图可见，采用乳化剂司盘 和吐温复配时，加入少量的卵磷脂后，单体转化率更高。主要是因为卵磷脂中含 有磷脂酰胆碱，具有良好的乳化效果。 b 乳化剂浓度的影响 表3 1 2 ：紫外功率为2 5 5 w 条件f 单体韵转化率随乳化剂浓度的变化情况 西北工业大学硕士学位论文 第三章多聚体微泡造影剂的制备 41516171 419202 12223 乳化钔浓度( ) 图3 - 9 乳化剂浓度对单体转抉率的影响 由上图可以看出，在紫外光功率为2 5 5 w ，其他因素一致的条件下：单体的转 化率随乳化剂浓度的增大而增大。主要是因为乳化剂浓度增大时，乳胶粒数目越多 自由基在乳胶粒中的平均寿命就越长，自由基有着充分的时间进行链增长，故可达 到很大的分子量，单体转换率增大。 ( 4 ) 光敏剂的影响 表3 1 3 光敏剂剂量对单体转化率的影响 图3 1 0 光敏剂剂量对单体转化率的影响 啦 伯 他 阳 阱 能 鬟一斟掣卅廿萃普 嚣北工业大学硕十学位论文 第三章多聚体微泡造影剂的制备 在紫外光功率为2 2 5 w ，乳化剂浓度为1 7 2 ，其他因素一定的条件下，单体 的转化率随光敏剂( 安息香乙醚) 质量的增加而增大。使用光敏剂剂量较大时， 虽然能解决单体转化率的问题，但是由于短时间内产生大量的自出基，分布不均 匀，乳液稳定性下降，产生大量的白色沉淀物；剂量较小时，虽然稳定性较好， 但是单体转换率低，乳液中还存在一定浓度的单体，有刺激性气味，不能用于静 脉注射或胃肠道显影。因此，在紫外光功率有限的情况下，光敏剂的使用不能从 根本上解决问题，还需要进一步的研究。 ( 5 ) 引发剂的影响 a 使用偶氮二异丁腈做为引发剂 表3 - 1 4 引发剂对单体转换率的影响 引发剂单体转化率( ) 紫外引发 紫外引发+ 偶氮二异丁腈 紫外引发+ 光引发荆 6 3 5 1 1 0 0 1 0 0 在紫外引发的基础上，加入少量的偶氮二异丁腈有助于单体的聚合率的提高， 达到完全聚合。并且，在聚合过程中，无任何凝聚物出现，所制备的乳液稳定， 不分层，存放时间久。而加入光引发剂后，乳液制备过程中，由于光引发剂不能 充分均匀分散，制备过程中易产生白色的凝聚物。但偶氮二异丁腈a i b n 在分解前 后分子式中所含有的氰基- - c n 存在一定韵危险性。有资料显示，偶氦二异丁腈a i b n 加热分解在放出氮气的同时，还有可能放出对人体危害较大的有机氰化物o6 ”1 。因 此，虽然偶氮二异丁腈引发效果良好，但是仍然不能做为有效的引发剂。 b 在适合温度条件下，使用过硫酸铵做为引发剂 表3 1 5 引发时间对单体转换率的影响 反应时间( h )单体转化率( ) 0 5 l 1 5 2 2 5 3 6 4 9 l 6 9 5 5 7 2 。0 6 7 3 8 4 8 1 6 2 1 0 0 两北工业大学硕l ：学 ：f 7 ：论文 第三章多聚体微泡造影剂的制备 墓 斟 萋 培 0 51o 1 52 0 z 5 3 0 魔复时问t ( h ) 图3 - i1 引发时间对单体转化率的影响 由实验结果可以看出过硫酸铵能充分引发聚合，单体转化率随着时间的延长 而提高，3 小时达到完全聚合，制得稳定不分层的乳液，乳液中单体的气味很小几 乎没有。但静脉注射兔子后，兔子死亡。实验分析结果表明制备的乳液具有很强 的凝血性，少量注射厢在血液中即发现有血液凝聚的现象。病理分析认为，凝血 现象为过硫酸铵在聚合过程中所分解出s 。自由基所致。但是，用过硫酸铵制备 的乳液用于胃肠道显影时效果良好，并无任何毒性现象发生。主要因为没有与血 液接触，多聚体微泡膜稳定不分解，随人体的排泄物一起排出体外。因为本研究 后期主要针对胃肠道显影进行研究，所以选用过硫酸铵做为引发剂。 3 4 微泡造影剂携载基因研究 本节的目的旨在探讨自行研制的、可生物降解微泡壁是否具有牢固结台基因 的能力，为实施靶向基因治疗打基础。 3 4 1 材料与方法 ( 1 ) 材料与仪器汹1 q ia a m pd n am i n ik i t 试剂盒( q i a g e n 公司生产) ：p r o p i d i u mi o d i d e ( p i ) 染液( 购自s i g m a 公司) ：v c x s 0 0 超声细胞破碎仪( s o n i c s 公司生产) ；t g l 一1 6 1 l 帖 呻 ； ：g 佰 砷 岔 骶北一l ：业入学颈士学位论文 第三章多聚体徽泡造影剂的制备 型微量离心机( 珠海黑马医学仪器有限公司生产) ；d m l b2 型荧光显微镜( 德国 l e i c a ) 。 ( 2 ) 多聚体微泡 外壳材料为以酯类为主的多 聚体，内含氮气，采用乳液共聚法 制备。该多聚体微泡在普通光镜下 呈现均匀分布、内部中空的微囊结 构，粒径i 0 - - 8 0 i tm ，乳液中微 泡的浓度是3 1 0 9 m 1 ，室温下储 存( 图3 1 2 ) 。 图3 1 2 自行研制的多聚体微泡图像 ( 1 0 x 4 0 普通光学显微镜) ( 3 ) d n a 片断的制备 a 获得人类基因组d n a 抽取静脉血i ml ，、韵t 是抗凝，j 聚照q ia 8 n 姒 i 【i n ik i t 试裁盒 曲北j i ：业人学硕士学位论文 第四章微泡造影剂结果分析 图4 - 3 1 注射造影剂后 图4 3 0 注射造影剂前 圈4 3 2 注射造影剂后 动物试验一中，狗右心室显影非常好，而左心室没有任何显影。左心室不显 影，说明微泡没有通过肺循环或者微泡通过后已失去超声反射特性，微泡没有通 过肺就已破裂或瘪了。主要因为微泡内气体为n 。，血液溶解性较好、扩散系数高， 静脉注射后由于肺动脉压力的作用，很容易扩散出气泡溶于血液，造成气泡塌 陷失去超声反射特性：而且由于大气泡内的气压比周围血液中的气压更大些，受 到的肺动脉压力也更大，所以大气泡内的气体更容易从泡中溢出。当造影剂到达 左心室时，大气泡已消失，只剩大部分的小气泡，丽小气泡的超声反射特性差， 因此观察不到任何显影。 ( 2 ) 动物试验二和病理切片试验 选用兔子作为试验动物。其中一只兔子注射少剂量的造影剂样品( 2 # ) ，兔 西北工业人学硕士学位论文 第四章微泡造影剂结果分析 子死亡，左心室显影。另一只兔子不注射任何造影剂，以作病理对照。 由病理切片图分析：动物肺和肾脏有毒副作用显示，肺部表现为肺细胞壁增 厚，肺泡变小，肾脏对照显示觑管有肿胀的迹象，肾小管对照显示有大量红细胞， f i l 管扩张。肝脏、脾脏和心肌没有发现有明显的毒副作用显示。 山上述病理实验可知，2 # 微泡造影剂对肺和肾脏有明显的毒副作用， 动物试验一中，狗右心室显影非常好，而左心室没有任何显影。但在保存了 2 年之后，再次用2 # 做动物实验二，静脉注射入兔子，左心室显影。 这是因为2 年前2 # 微泡由于粒径偏大，没有通过肺循环，并且所用的乳化 剂与引发剂均有不同程度的毒性，因而导致狗死亡，且左心室无显影。而2 年后， 2 # 微泡经过2 年的存放，粒径变小，以1 “m 为主。因而微泡可以通过肺循环， 并在左心室显影，但其本身的毒性并来被消除，因而在注射0 1 m l 后，兔子就已 死亡。 ( 3 ) 动物试验三 选用兔子作为试验动物。 第一只兔子；静脉间断注射总共5 m l 的0 5 1 8 造影剂，兔子表现正常，无任何 中毒迹象，但无超声摄影。继续注射3 衢1 的0 5 0 8 ，0 4 2 5 号掸，兔子均正常，但无 超声显影。最后魏与安乐死。 第二只兔子；先静脉注射l m l 的0 5 1 8 造影荆，魏予正常，但秃明显的超声显 像；爵注射o ：i m l 的2 # 造影剂，发心室最影，但巍子立邵死亡。兔子死亡时， 表现为呼吸先衰竭，仪船仍然有心跳显示。 丽0 5 0 8 、0 4 2 5 、0 5 t 8 等样品经过乳化剂，引发剂辞类及剂量的改进，均采用 无毒试剂，对人体蠢骞，霸丽筑子并来死它。但因微泡越径偏小，以0 2um 为主 体，小气泡对超声显像黉献不大，对超声显像贡献最大的以粒径1 6 ul i l 的气泡 为主，而属于此粒径范围的微泡只有2 左右，并且由于大微泡内的气压比周围 血液中的气压更大些，受到的肺动脉压力也更大，所以大微泡内的气体更容易从 泡中溢出。当造影剂到达右心室时，大微泡已消失，只剩大部分的小微泡，而小 微泡的超声反射特性差，因此观察不到任何显影。 4 3 2 胃肠道显影动物实验 采用大白鼠傲动物实验7 3 ，7 4 1 。试验用清洁级s d 大白鼠，体重2 5 0 3 0 0 9 。先 将2 m i 0 8 2 8 # 乳液稀释到4 m l ，通过灌胃针注入小白鼠。再抽取o 8 m 1 4 水合氯 醛从腹腔注射，6 分钟后大白鼠全麻，固定在鼠台上，用灯光照射，维持大鼠体 温，剪去腹部毛发，用7 l 超声探头观察。实验全过程，大鼠生命体征平稳，实 验完毕后观察2 天，来见异常，最后实施安压死。 西北工业大学硕士学位论文 第四章微泡造影剂结果分析 图4 - 3 3 钡餐在胃部显影 图4 3 4 造影荆在臀部显影 由上图可以看出，造影剂在胃部显影效果良好，大大优于钡餐在胃部履影。 而且所制备的乳液经动物实验显示安全无毒，可用于进行临床实验。0 8 2 8 # 乳液 虽使用过硫酸铵做为引发剂，但是因为没有注入血液，不会产生凝血性，而且对 肠胃无任何的刺激作用，是一种非常有发展前景的微泡造影剂，可以进行临床实 验。 4 4 微泡生物降解性分析 4 4 。1 二氧化碳释放曲线及讨论分析 ( 1 ) 内源反应瓶e e _ - 氧化碳释放曲线 图4 3 6 空白试验中未加入有机物，所测得c o 。羹实际上是接种物在实验过程 中内源呼吸所释放的c o 。量。由于无营养物质，反应瓶中细胞利用贮存物质进行内 源呼吸，即自身溶解。 西北工业大学硕士学位论文 第四章微泡造影剂结果分析 匾蚕叠墨【 u1z3 4b q ， #9i u1 i1 21 3 1 4 时阅，d 圈4 - 3 6 内源反应瓶的生物可降解性 微生物在代谢过程中产生的有毒代谢产物，会抑制微生物的生长繁殖。死亡 率增加，活微生物减少，因而，2 6 天，微生物内源呼吸放出c 0 。量逐渐减少活 微生物具有一定的死亡率，这是生物处理系统中的一个基本物质转化现象，这些 生物体的死亡并不改变物质的总量，但却意味着系绕中的慢速可降解物质增加了， 这样的物质水解后会引起新的生物增长和氡的消耗。而大量死亡的微生物裂解后 释放出的细胞物质，成为其他一部分微生物的营养物质，被其利用合成贮存自身 细胞物质。同时一部分微生物继续进行自溶。因而，6 一1 2 天，微生物放出c 0 2 量 有明显上升。到1 4 天，c o ：量又下降，这说明死亡微生物释放豳的营养物质被消耗 殆尽，微生物数量不断减少，剩余茵体继续自溶。 ( 2 ) 多聚体微泡造影荆的二氧化碳释放曲线 多聚体微泡造影剂乳液是聚合物与单体的混合液。前2 天内，微生物快速经 历了停滞期。停滞期初期，一部分适合降解单体的微生物迅速适应环境，快速进 入停滞期末期。细胞物质增加，菌体体积增大，其长轴的增长速度特别快，细胞 代谢活力强，呼吸速度，核酸及蛋白质的合成速度接近对数期细胞，并开始细胞 分裂，以溶液中单体为营养物质的微生物迅速以几何级数增加。 0l2 3 4 5 6 7 8 91 0 1 1 1 2 1 31 4 时阃，d 图4 3 7 多聚体微泡造影剂的生物可降解性 5 4 3 2 l 0 ，1is嫡葶 5 4 3 2 1 0 ，1h1嘟du 西j 匕工业大学硕士学位论文 第四章微泡造影剂结果分析 同时，由于聚合物较单体难降解，所以现降解此类聚合物酶暂不需要，没有 受到诱导合成，它们以非常低的浓度水平存在或者仅仅作为信息存在于d n a 中。 其它不适应环境的微生物死亡。总体上看来，以降解单体微生物为主体的微生物 总量在前2 天有所增加，并且代谢活力强，呼吸速度，合成速度快，反应在图象 上前2 天c 嘎量最高。2 - 4 天，经过两天的降解，溶液体中单体数量被大大降低， 大量的单体微生物，一部分开始调整自己的酶系统，使之适应它所面临的单体匮 乏，而聚合物浓度高的新环境。微生物对于外界环境变化的感知是通过酶进行的， 外界环境的变化“诱导”或“激活”微生物的某类酶的产生或活化，从而在一定 程度上改变微生物的行为使之适应环境。因为微生物不是在任何情况下都合成它 能够合成的所有的酶。它们实际上仅仅合成那些在一定环境条件下必须的酶，这 也是微生物遵循的“经济”原则。有一些酶在任何情况下总是需要的( 大部分为 合成代谢所需的酶) 。这一类酶微生物总在不断合成，与微生物生存的环境和培养 基无关，这样的酶叫组成酶。丽那些只有在需要时才产生的酶q 诱导酶。对于诱 导酶的合成，需要诱导物，诱导物通常是这种酶作用的底物或者在结构上与此底 无非常相似的化合物。在这种情况下，之前聚合物酶的合成实际上受到作用于d n a 的阻遏物的抑制。而诱导物的出现解除了阻遏物对d n a 的阻遏作用，从而使得t ) n a 上的基因片段启动其“命令”程序，开始聚合