（材料学专业论文）壳聚糖—Hlt2gtOlt2gt非均相降解工艺研究.pdf

摘要 本文研究了在非均相体系中中性条件下，双氧水氧化降解壳聚 糖制备低分子量壳聚糖的过程与机理，考察了温度、双氧水用量、 时间、壳聚糖粒度和搅拌速度等条件对降解反应的影响，以得出制 备最佳产率低分子量壳聚糖和预定分子量壳聚糖的最佳工艺条件。 实验中采用凝胶渗透色谱法测定产物的平均分子量，以红外光谱分 析、核磁共振波谱分析、扫描电子显微镜等手段表征试样。 实验证明在中性条件下非均相体系中双氧水氧化降解是低分 子量壳聚糖制备的一种有效方法，影响低分子量壳聚糖产率的主要 因素是h 2 0 2 用量比和反应温度。通过正交试验法优化降解条件， 得到了制备较高产率低分子量壳聚糖的最佳条件：反应时间为4 h 、 反应温度为6 5 、用量比r ( h 2 0 2 糖单元) 为6 、壳聚糖粒度为 6 0 8 0 目、搅拌速度为1 4 0 r m i n 。 对降解反应后剩余的水不溶性壳聚糖残渣进行的二次降解实验 证明，非均相体系中双氧水氧化降解壳聚糖的反应中，壳聚糖原料 基本能实现完全利用。 核磁共振波谱分析和红外光谱分析证明，低分子量壳聚糖的结构 相对于壳聚糖原料并未发生变化。双氧水氧化降解壳聚糖的过程是 p 1 ，4 糖苷键的断裂过程。 通过正交试验法优化降解条件，得到了制备预定分子量壳聚糖 的最佳条件：反应温度6 5 、反应时间1h 、h 2 0 2 用量比r 为6 、 投料量6 9 。水溶性壳聚糖分子量与壳聚糖原料的分子量基本无关， 主要是由降解反应条件决定的。制备最佳产率和预定分子量壳聚糖 的反应条件不相符。 在非均相体系中，h 2 0 2 氧化降解壳聚糖固体制备低分子量壳 聚糖的反应主要在壳聚糖固体表面进行，h 2 0 ：以剥离的方式在壳 聚糖固体表面将壳聚糖分子链裂解，断裂的壳聚糖分子链进入水溶 液中，成为水溶性低分子量壳聚糖。 关键词：非均相降解体系，低分子量壳聚糖，产率，分子量，降解 工艺，机理 a b s t r a c t t h ep r o c e s sa n dt h em e c h a n i s mo fc h i t o s a nd e g r a d a t i o nw i t hh y d r o g e np e r o x i d e i nt h eh e t e r o g e n e o u ss y s t e mw a ss t u d i e d ，a n dt h ee f f e c to ft e m p e r a t u r e ，a m o u n to f h y d r o g e np e r o x i d e ，t i m e ，p a r t i c l es i z eo fc h i t o s a na n ds t i r r i n gs p e e dt ot h er e a c t i o n w a si n v e s t i g a t e d t h em o t i v eo ft h ew o r ki st og e tt h eb e s tr e a c t i o nc o n d i t i o no f p r e p a r i n gl m w c ( l o wm o l e c u l a rw e i g h tc h i t o s a n ) o ft h eb e s ty i e l da n do fp r o p e r m o l e c u l a rw e i g h t i nt h ee x p e r i m e n tg p ci su s e dt o t e s tt h em o l e c u l a rw e i g h to f l m w c i r n m ra n ds e ma r eu s e dt oc h a r a c t e r i z el m w c t h es t u d ys h o w e dt h a ti nt h eh e t e r o g e n e o u ss y s t e mh y d r o g e np e r o x i d eo x i d a t i n g i sae f f e c t i v em e t h o dt om a k el m w c t h ea m o u n to fh y d r o g e np e r o x i d ea n dt h e r e a c t i o nt e m p e r a t u r ei st h em a i nf a c t o ra f f e c t i n gt h ey i e l do fl m w c t h er e a c t i o n c o n d i t i o ni so p t i m i z e dt h r o u g ho r t h o g o n a lt e s ta n dl m w co f t h eb e s ty i e l di sg o t t e n t h es e c o n dd e g r a d a t i o nr e a c t i o ns h o w e dt h a t i nt h eh e t e r o g e n e o u ss y s t e mt h e c h i t o s a nm a t e r i a lc o u l db em o s t l yu s e d i n f r a r e ds p e c t r o s c o p ya n a l y s i sa n dn m rs p e c t r o s c o p ya n a l y s i ss h o w e dt h a t t h es t r u c t u r eo fl m w cw a sa l m o s tt h es e l l - l ea sc h i t o s a n t h eb a s i cr e a c t i o no f c h i t o s a nd e g r a d a t i o nb yh y d r o g e np e r o x i d ei st h eb r e a k a g eo f1 , 4 0 一d g l u c o s i d e b o n d s t h eb e s tr e a c t i o nc o n d i t i o no fp r e p a r i n gt h ep r o p e rm o l e c u l a rw e i g h tl m w ci s g o t t e nt h r o u g ho r t h o g o n a lt e s t t h em o l e c u l a rw e i g h to fw a t e r - s o l u b l ec h i t o s a nh a s n o t h i n gt od ow i t ht h em o l e c u l a rw e i g h to fc h i t o s a nm a t e r i a l a n dt h eb e s tr e a c t i o n c o n d i t i o no fp r e p a r i n gl m w co ft h eb e s ty i e l di sd i f f e r e n tf r o mt h ec o n d i t i o no f p r e p a r i n gt h ep r o p e rm o l e c u l a rw e i g h tl m w c i nt h eh e t e r o g e n e o u ss y s t e m ，t h ed e g r a d a t i o nr e a c t i o no fc h i t o s a nb yh y d r o g e n p e r o x i d eh a p p e n sm a i n l yo nt h es u r f a c eo ft h ec h i t o s a np o w d e r h y d r o g e np e r o x i d e p e e l so f f t h ec h a i no f c h i t o s a nm o l e c u l eo nt h es u r f a c eo f t h ec h i t o s a np o w d e r , a n dt h e b r e a k i n gc h i t o s a nc h a i nw a sd i s s o l v e di n t ot h ew a t e ra n df o r m e dt h el m w c k e y w o r d s ：h e t e r o g e n e o u ss y s t e m ，l o wm o l e c u l a rw e i g h tc h i t o s a n ，y i e l d ， m o l e c u l a rw e i g h t ，d e g r a d a t i o np r o c e s s ，m e c h a n i s m 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得苤壅盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：杂鼍u 篷 签字日期：1 跏孓年乙月2 影日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解墨壅盘茎有关保留、使用学位论文的规定。 特授权墨鲞盘茔可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用皋授权说明) 学位论文作者签名：永吾l 雹 导师签名浆乎赶 签字日期：一的y 年t 月1 日 签字日期：r 年1 月z 曰 第一章概述 1 1 发展简史 第一章概述 地球上存在的天然有机化合物中，蕴藏量最大的是纤维素，其 次是甲壳素。甲壳素是地球上数量最大的含氮有机化合物，其次才 是蛋白质。估计自然界每年生物合成的甲壳素将近l o o 亿吨。 甲壳素广泛存在于海洋节肢动物，如虾、蟹的甲壳之中，也存 在于菌类、昆虫类、藻类细胞膜和高等植物的细胞壁中，分布极其 广泛。虽然甲壳素在自然界的存在量巨大，然而直到18 1 1 年，才 被法国研究自然科学史的b r a c o n n o t 发现。l8 2 3 年，另一位法国科 学家o d i e r 从昆虫的甲壳中分离出同样的物质，命名为c h i t i n ( 甲 壳素) 。 18 5 9 年，法国人r o u g e t 将甲壳素放于浓k o h 溶液中煮沸， 洗净后可溶于有机酸中。18 9 4 年，h o p p e s e l e r 把这种修饰过的 甲壳素称为“壳聚糖”。 从l8 1 1 年发现c h i t i n 到18 5 9 年发现c h i t o s a n ，直到1 9 1 0 年 的1 0 0 年间，全世界仅有不到2 0 篇有关甲壳素和壳聚糖的论文发 表，开创性的工作大多由法国人完成。2 0 世纪7 0 年代以前，甲壳 素和壳聚糖的研究重心主要集中在欧美国家，1 9 3 4 年在美国首次 出现了关于它们的专利，并在1 9 4 1 年制各出了壳聚糖人造皮肤和 手术缝合线。2 0 世纪7 0 年代后，研究重心移到了日本。2 0 世纪 8 0 年代起，全世界范围内掀起了研究高潮，这期间几乎每3 d 就有 l 项专利申报。在日本，许多食品和保健品中都添加有壳聚糖或其 衍生物制品。 中国是1 9 5 2 年开展甲壳素研究的，1 9 5 4 年第一篇研究报告发 表。1 9 58 年国内首先将可溶性甲壳质作为印染助剂应用于印染工 业。后来研究工作一度停止，直到2 0 世纪8 0 年代中期，国内逐渐 开始加大对甲壳素、壳聚糖研究工作的宣传力度，影响较大的有 1 9 8 3 年谢雅明和1 9 8 4 年严俊 2 1 的文章，较为详细的综述了壳聚 糖的有关性质与应用，对中国的甲壳素研究热潮起到了推动作用。 2 0 世纪9 0 年代是我国研究和开发的全盛时期，全国有过百家大专 第一章概述 院校和科研机构投入到这项研究工作中，每年有数十篇文章发表， 不断有新的壳聚糖研究成果问世。 壳聚糖是天然糖中唯一大量存在的碱性氨基多糖，是自然界中 存在的唯一一种带阳离子的能生物降解的高分子聚合物，具有许多 特殊的物理化学性质和生理功能，在纺织、印染、造纸、食品、化 工、环保、农业及医药等领域都有很高的实用价值。我国对甲壳素 和壳聚糖的研究多年以来取得了蓬勃的发展，我国成为世界上甲壳 素和壳聚糖生产量最大的国家，但是长久以来仅用于出口国外，在 深加工和研制开发新产品上，和国外相比仍有很大的差距。 1 2壳聚糖的物理和化学性质 1 2 1物理性质 1 2 1 1一般物理性质 甲壳素，属于碳水化合物中的多糖，其学名是夕( 1 4 ) 一2 一乙 酰氨基2 脱氧d 葡萄糖，是由一乙酰氨基葡萄糖以芦一1 ，4 糖苷键 缩合而成的，其结构式如图1 1 所示。甲壳素是白色或者灰白色无 定型、半透明状固体，分子量因原料不同而由数十万至数百万，不 溶于水、稀酸、稀碱、浓碱和一般的有机溶剂，可溶于浓的盐酸、 硫酸、磷酸和无水甲酸。 hn h c 二o c h a 0 o hn h c = o c h ， 图1 1 甲壳素的结构式 第一章概述 h n h 2 o 0 h n h 2 c h 3 c=o hn h 。博 o h 2 0 h j n 图1 2 壳聚糖的结构式 通过将甲壳素脱乙酰化可制得壳聚糖，如图1 2 所示。壳聚糖 是白色无定型、半透明、略有珍珠光泽的固体，因原料不同和制备 方法不同，分子量从数十万至数百万不等。不溶于水和碱溶液，可 溶于稀的盐酸、硝酸等无机酸和大多数有机酸，不溶于稀的硫酸、 磷酸。一般认为，- 乙酰氨基脱去5 5 以上的甲壳素或者能在l 乙酸或1 盐酸中溶解的脱乙酰甲壳素就可以称为壳聚糖。壳聚 。糖与甲壳素的差别，仅仅在于一脱乙酰度不同而已。甲壳素结构 中，也有氨基葡萄糖的糖基，壳聚糖结构中，也有 r 一乙酰氨基葡 萄糖的糖基。 将甲壳素和壳聚糖中每个糖基上的乙酰氨基( c h 3 c o n h 一) 和氨基( n h 2 一) 换成羟基( h o 一) ，就成了纤维素，见图1 3 。 ho h 0 o h | | 广 0 ho h 图1 3 纤维素的结构式 h o h h 据此可以推断，甲壳素、壳聚糖与纤维素会有许多类似的性 质和用途。 第一章概 述 1 2 1 2 溶液性质 ( 1 ) 在稀酸中的溶解过程壳聚糖在一些低浓度无机酸和有 机酸中溶解的实质，是壳聚糖分子链上具有众多的游离氨基，这些 氨基的氮原子上具有一对未共用的电子，致使氨基呈现弱碱性，于 是便能从溶液中结合一个氢离子，从而使壳聚糖成为带阳电荷的聚 电解质( 实际上可看作是一种高分子盐) ，破坏了壳聚糖分子间和 分子内的氢键，使之溶于水中，因此，实际上不是壳聚糖溶于稀酸 中，而是带阳电荷的壳聚糖聚电解质溶于水中( 图1 4 ) 。 h n h 2 o + h 图1 - 4 稀酸水溶液中的壳聚糖 壳聚糖的溶解，至少要受3 个因素的影响： 脱乙酰度脱乙酰度越高，分子链上的游离氨基越多，离子 化强度越高，也就越易溶于水；反之，脱乙酰度越低，溶解度越小。 分子量壳聚糖分子链上分布着许多羟基、氨基，还有一些 ，乙酰氨基，它们会形成许多强弱不同的分子内和分子间的氢键， 这些氢键使得壳聚糖分子链彼此缠绕在一起且比较僵硬，而且分子 量越大，缠绕越厉害，溶解度越小。 酸的种类并不是所有的稀酸都能溶解壳聚糖，稀硫酸、稀 磷酸就不能溶解壳聚糖，如果把壳聚糖与稀酸的作用看成是形成了 一种高分子盐，那么，有的盐能溶于水，有的盐则不能溶于水。 ( 2 ) 溶液的稳定性壳聚糖溶液的稳定性在使用中特别重要。 氨基葡萄糖的c l o h 是半缩醛羟基而不是醇羟基，它显示出较大 的活性，它与另一个氨基葡萄糖的c 4 一o h ( 是醇羟基) 发生缩合 反应，脱去1 分子水，形成了口1 ，4 糖苷键，许多氨基葡萄糖这样 缩合，便形成了壳聚糖。壳聚糖的半缩醛结构的糖苷键是不稳定的， 壳聚糖的酸性溶液在放置过程中，会发生酸催化的水解反应，壳聚 糖分子的主链不断降解，分子量逐渐降低，最后被水解成寡糖和单 第一章概述 糖。即使小心配制壳聚糖溶液，采取一些方法使之几乎没有游离酸 存在，放置较长时问也会发生这种水解。所以，壳聚糖溶液要求现 用现配。 壳聚糖水解到晟后得到的是氨基葡萄糖，如图1 5 。 甲壳素水解到最后得到的是乙酰氨基葡萄糖，如图1 6 。 h hn h 图1 5 氨基葡萄糖 1 2 2化学性质 hn h c=o c h 3 图1 6n 乙酰氨基葡萄糖 壳聚糖化学性质的研究，内容十分广泛，是认识壳聚糖本质， 开发产品的重要基础。研究壳聚糖的化学反应，有两个重要的目的， 一是解决它在水中或有机溶剂中的溶解性，= 是获得性能很好甚至 独特性能的产品。 1 221 0 一酰化和n 一酰化 甲壳素和壳聚糖可与多种有机酸的衍生物如酸酐、酰卤( 主要 是酰氯) 等反应，导入不同分子量的脂肪族或芳香族酰基。壳聚糖 分子链的糖残基上既有羟基，又有氨基，因此，随反应溶剂、酰化 试剂的结构、催化剂、反应温度等因素的不同，酰化反应可发生在 不同的官能团上。这是壳聚糖化学反应中研究最多的一种反应。 1 2 2 2含氢无机酸酯化 甲壳素和壳聚糖的羟基，尤其是c 6 一o h ，可与些含氧无机 酸( 或其酸酐) 发生酯化反应，如生成硫酸酯、黄原酸酯、磷酸酯、 酸( 或其酸酐) 发生酯化反应，如生成硫酸酪、黄原酸酯、磷酸酯、 第一章概述 硝酸酯的反应都属于此类酯化反应。另外在壳聚糖的氨基上也可能 发生酯化反应。 1 2 2 3 醚化 甲壳素和壳聚糖的羟基可与烃基化试剂反应生成醚，如甲基 醚、乙基醚、苄基醚、羟乙基醚、羟丙基醚、氰乙基醚、羧甲基醚 等。近几年来对这类反应比较重视，可以开发出一些新型材料。 1 2 2 4n - 烷基化 壳聚糖的氨基是一级氨基，有一孤对电子，具有很强的亲核性， 能发生许多反应，n 一烷基化是除n 一酰化以外的另一类重要的反应。 壳聚糖与卤代烷反应，首先发生的是n 一烷基化3 1 。 1 2 2 5 氧化 甲壳素和壳聚糖可以被氧化剂氧化，氧化反应的机理很复杂。 氧化剂不同，反应的p h 值不同，氧化机理和氧化产物也不同。既 可使c 6 一o h 氧化成醛基或羧基，也可使c3 一o h 氧化成羰基( 成 酮反应) ，还可能发生部分脱氨基或脱乙酰氨基，甚至破坏毗喃环 及糖苷键。 1 ，2 2 6螯合 甲壳素和壳聚糖的糖残基在c 2 上有一个乙酰氨基或氨基，在 c3 上有一个羟基，从构象上来看，它们都是平伏键，这种特殊结构， 使得它们对具有一定离子半径的一些金属离子在一定的p h 值条件 下具有螯合作用，尤其是壳聚糖，与金属离子的螯合更广泛一些， 更具特色，说明壳聚糖是一类新的天然高分子螯合弃g ，而且无毒、 无副作用。 1 2 ，2 7对酸的吸附 壳聚糖是一种碱性多糖，其氨基能结合溶液中的h + ，许多无机 酸、有机酸和酸性化合物，甚至两性化合物，都能被壳聚糖吸附结 合。壳聚糖的这一特点，可应用于食品、药物、生物制品的脱酸， 避免用碱中和而增加盐分；或从溶液、发酵液中提取酸性化合物， 如氨基酸、核苷酸、青霉素等。 第一章概述 1 2 2 8接枝共聚 甲壳素和壳聚糖分子链上的活性基团很多，可以进行接枝共聚 反应，从而改进它们的性能，满足特殊的需要。接枝共聚反应一般 有化学法、辐射法和机械法三种，从反应机理来说，又可分为自由 基引发接枝和离子引发接枝。 1 2 2 9 交联 甲壳素和壳聚糖可通过双官能团的醛或酸酐等进行交联。交联 主要是在分子间发生，也不排除在分子内发生。交联的主要目的是 使产物不溶解，甚至溶胀也很小，性质很稳定，这对于它们被用作 层析的载体或作固定化酶载体是十分重要的，尤其是壳聚糖常常需 要交联。 1 3低分子量壳聚糖的应用 经降解得到的低分子量壳聚糖，分子量在1 l0 4 以下的低聚 壳聚糖，不仅溶于水，还具有独特的生理活性和物化性质，因而应 用范围大大拓宽。特别是聚合度为6 - 9 的壳寡糖，更具有许多独特 的生理活性和功能性质：在人体肠道内活化增殖双歧杆菌，抑制大 肠杆菌的生长【4 ；促进脾脏抗体生成，抑制肿瘤细胞的生长：强化 肝脏功能，防止中风和胃溃疡；降低血压、血糖、血脂，吸附胆固 醇；在微酸环境中具有较强的抗菌作用和显著的保湿吸湿能力1 5 j ； 活化植物细胞，促进植物快速生长。因此，水溶性的壳寡糖具有极 为广泛的应用范围和发展前途，受到研究者的关注。 1 3 1低分子量壳聚糖在农业方面的应用 低分子量壳聚糖在农业上可以用于植物生长调节、饲料添加 剂、种子处理、农产品保鲜、抗病虫害等诸多方面，并且因其无毒、 无害、无污染可安全降解等特点而具有广阔的应用前景。相比未处 理过的种子，低分子量壳聚糖处理过的种子具有较高的发芽率和发 芽指数，王延峰等的研究表明【6 ，适宜浓度的低分子量壳聚糖处理 能提高种子淀粉酶的活性，淀粉酶将种子中的淀粉转化为简单的有 机化台物供种子萌发时对营养的需要。 第一章概述 目前，低分子量壳聚糖对植物病害的诱抗机理尚不清楚。研究 表明，低分子量壳聚糖可诱导植物的活性氧迸发，使过氧化氢酶、 超氧化物歧化酶、几丁质酶、过氧化物酶等防御酶的活性发生变化 “。同时，低分子量壳聚糖的诱抗活性与其溶液浓度、分子量和 脱乙酰度有着密切的联系，分子量在5 0 0 2 0 0 0 之间，高脱乙酰度 的低分子量壳聚糖具有好的抑菌效果，对应不同的病原菌所需的有 效壳聚糖浓度不同【1 “”j 。 1 3 2低分子量壳聚糖在医学方面的应用 低分子量壳聚糖对人体细胞有良好的生物相容性与亲和性，其 单体与人体中透明质酸的单体一致，与人体细胞不会产生排斥反 应，无抗原性。这一独特的性质使得它在医药品中有许多重要的应 用。低分子量壳聚糖在生物医学方面的重要功能之一就是其对肿瘤 的抑制作用，其抑瘤机理尚不清楚，报道的结果相互矛盾的很多， 一种认为是活化了巨噬细胞、n k 细胞、t 和b 细胞，从而激活了 机体免疫系统，从而消灭肿瘤细胞【14 6 1 。另一种说法是低分子量 壳聚糖具有直接抑制肿瘤细胞繁殖的作用【1 7 8 1 。 壳聚糖分子中的氨基和羟基能与金属离子发生螯合作用，利用 这一性质可将低分子量壳聚糖制成去除人体内过量的重金属的药 物。苏庆等人的研究表明【l9 1 ，低分子量壳聚糖螯合p b 2 + 的过程是一 种离子取代，反应平衡时间较快，其半交换时间是2 2 s 。所以它能 够快速、有效地降低血铅浓度，并且不会造成e d t a 等药物治疗引 起的人体必需微量元素平衡的破坏，避免产生副作用。 低分子量壳聚糖的分子结构中具有质子化铵，质子化铵能与细 菌带负电荷的细胞膜作用，干扰细菌细胞膜功能造成细菌体内细胞 质流失。同时，低分子量的壳聚糖由于分子量小，能进一步进入菌 体内部，扰乱细胞的正常生理代谢1 2 0 j 。 覃彩芹等【2 1 用微热量法测量低分子量壳聚糖对金黄色葡萄球 菌的抑菌作用，同时用平板法测水溶性壳聚搪抑制多种细菌的活 性，结果表明2 浓度低分子量壳聚糖可以完全抑制这些细菌的生 长。郑连英等1 22 j 的研究表明：壳聚糖对不同细菌的抑制效果随着 分子量的变化而变化，壳聚糖对金黄色葡萄球菌的抗菌作用随分子 量减小而逐渐减弱，对大肠杆菌分子量越小，抗菌作用越明显。目 前，以壳聚糖为基础原料的壳聚糖无纺布、壳聚糖流延膜、壳聚糖 8 第一章概述 涂层纱布等多种医用敷料已经用于临床。含有低分子量壳聚糖的医 用纱布具有止血、促进伤口愈合的功效。 1 3 3 低分子量壳聚糖在化妆品方面的应用 低分子量壳聚糖在化妆品方面的应用主要是利用其优良的保湿 增湿性能。低分子量壳聚糖本身具有成膜功能，又具有良好的透气 性能，是一种强的吸湿剂与保湿剂，与传统的保湿增湿剂相比，低 分子量壳聚糖的保湿增湿效果更佳，在洗面奶及各类膏、霜中使用 更显其优越性，低分子量壳聚糖可在皮肤表面形成一层膜，可阻断 或减弱紫外线对皮肤的伤害，而且，低分子量壳聚糖良好的透气性 又不影响皮肤排泄废物和毒素，本身所具有的抑菌作用还会抑制或 杀死皮肤表面的有害微生物，不会形成粉刺【2 ”。因为低聚壳聚糖 分子量较小，较之大分子壳聚糖更易于被皮肤所吸收、促进血液循 环，以此制成的膏、霜类化妆品可通过毛孔等直接渗入皮肤内部甚 至于细胞内部，起到调理、保护、滋润皮肤的功能1 2 “。 1 3 4低分子量壳聚糖在食品方面的应用 低分子量壳聚糖作为一种生物活性的天然高分子化合物，具有 低甜度、低热值、降血脂、降_ 衄糖等功效，而且无毒、无副作用。 以低分子量壳聚糖为主要原料生产的生物保健品，不仅有利于人体 肠内双歧杆菌的增殖，同时可抑制肠内有毒菌和腐败物质的生成， 增加人体内纤维索的质和量、提高机体的免疫力1 2 ”。低分子量壳 聚糖具有非常爽口的甜味，且不易被体内消化液降解，故几乎不产 生热量，是糖尿病人、肥胖病人理想的功能性甜味荆 2 6 】。另外， 低分子量壳聚糖在水溶液中容易形成牢固膜，此膜对气体有选择渗 透性，非常适合做食品保鲜剂【2 “。 1 4 低分子量壳聚糖的制备方法 目前，通过降解反应制备低分子量壳聚糖的方法主要有酶降解 法、酸水解法、氧化降解法、物理法等。 9 第一章概述 1 4 1酶降解法 酶法降解壳聚糖，就是用特定的酶对壳聚糖进行降解，它可以 选择性地切断壳聚糖分子中的b 一1 ，4 糖苷键，从而制得特定的低分 子量壳聚糖，克服了化学降解产品分子量分布宽、均一性差的缺点， 产品均一性好。与其他降解方法相比，酶降解法不发生副反应，反 应条件温和，工艺较易控制，是一种较为理想的降解方法。 酶降解法可分为专一性酶降解法和非专一性酶降解法。 1 4 1 1专一性酶降解法 专一性酶主要是指甲壳素酶和壳聚糖酶。甲壳素酶广泛分布于 细菌、真菌、放线菌等多种微生物以及植物组织和动物的消化系统 中【28 1 。该酶系一般被诱导为多酶复合体：即甲壳素外切酶、内切 酶和b n 一乙酰氨基葡萄糖苷酶。甲壳素酶降解甲壳素的途径为： 先由降解酶系统水解甲壳素的糖苷键，如外切酶从甲壳素分子链的 非还原端开始，以甲壳二糖为单位，依次酶解；内切酶则随机水解 糖苷键：由外切酶水解成的甲壳二糖，被b n 一乙酰氨基葡萄糖苷 酶水解成单糖，有些b n 一乙酰氨基葡萄糖苷酶也有较弱的外切酶 活性，也是从甲壳素的非还原端开始直接水解成单糖。 壳聚糖酶主要存在于真菌细胞中，根据作用模型可分为外切型 和内切型两种，内切型壳聚糖酶以释放二聚体、三聚体或低聚糖为 主，外切型则从壳聚糖的非还原末端产生单糖残基一氨基葡萄糖 1 2 9 1 。曾嘉、郑连英1 3 0 1 的研究表明，以几丁质为载体固定化壳聚糖 酶可显著增长其活性时间，将固定化酶与壳聚糖溶液在6 0 下连 续反应10 次，每次反应时间为6 h ，固定化酶的活力基本保持稳定， 活力损失小于l o 。 1 4 1 2非专一性酶降解法 非专一性酶主要有溶菌酶、脂肪酶、蛋白酶和纤维素酶等。溶 菌酶主要存在于鸡蛋蛋白、人的血清及唾液中。溶菌酶的天然底物 为某些真菌细胞壁中的粘肽、甲壳素以及部分n 乙酰化壳聚糖。脂 肪酶是作用于水。有机界面上不溶性底物的酶。蛋白酶主要有木瓜 蛋白酶、胃蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶和胰液素等。 周孙英等【3 1 对四种不同类型酶降解壳聚糖的效果作了比较， 分别在四种酶的最适宜条件下反应，胃蛋白酶对壳聚糖水解速度最 第一章概述 快，纤维素酶的水解速度仅次于胃蛋白酶，其次是脂肪酶，溶菌酶 的水解速度最慢。z h a n g l 3 2 1 等用由纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶组成 的复合酶降解壳聚糖，结果得到了聚合度为3 10 的低分子量壳聚 糖。l i n 等 3 】的研究发现木瓜蛋白酶主要作用于数均分子量为5 2 0 万的脱乙酰度较低的壳聚糖。木瓜蛋白酶的特点是价格低廉，容易 得到，用它降解壳聚糖，反应中酶活性不变，降低了生产成本，是 一种有工业化潜力的酶降解方法。 1 4 2酸水解法 酸水解法是降解甲壳质和壳聚糖的传统方法。壳聚糖在酸性溶 液中是不稳定的，会发生糖苷键的断裂，即长链的部分水解，形成 许多聚合度不等的片段。酸水解法的优点是价格低廉，操作简单， 缺点是反应难以控制，得到的低分子量壳聚糖的分子量分布难以控 制，并且对环境污染严重。目前，酸水解法主要有，盐酸水解法、 磷酸水解法、乙酸水解法、过醋酸水解法、氢氟酸水解法、酸亚 硝酸盐水解法、浓硫酸水解法等。刘晓等【3 4 l 以不同浓度( 2 、3 、4 、 6 m ) 盐酸对壳聚糖降解实验，在6 m 的盐酸水解处理中，壳聚糖降 解在1 2 h 时达到最高值( 7 6 4 ) 。曾坤伟等【”j 采用h c l 和h3 p 0 4 的 水醇溶液为反应介质降解壳聚糖，并用无水乙醇沉淀和洗涤，制 备出收率超过9 5 的水溶性的微晶壳聚糖。 1 4 3 氧化降解法 氧化降解法是近年来国内外研究比较多的壳聚糖降解方法。尤 其是关于h 2 0 2 氧化降解壳聚糖的研究，由于该方法具有反应速度 快、产率高、反应物无毒等优点，是一种理想的化学降解方法，正 受到越来越多的关注。 1 4 3 1 h 。0 ：氧化降解法 h 2 0 2 氧化降解法是国内研究比较多的壳聚糖降解方法，可分 为均相降解法和非均相降解法两种l3 6 】。均相降解法是将一定量的 壳聚糖溶解在稀盐酸或稀醋酸溶液中，然后加入一定浓度的h 2 0 2 溶液进行降解反应，反应完成后加入n a o h 溶液中和，然后加入无 水乙醇沉淀分离得到低分子量壳聚糖。非均相降解法是指在水或稀 第一章概 述 碱性溶液中加入壳聚糖粉末或者小颗粒，壳聚糖不溶解，悬浮于水 或碱性溶液中，然后加入h 2 0 2 溶液进行反应，得到低分子量壳聚 糖。严淑兰等i ”j 以乙酸为介质，以h 2 0 2 为氧化剂，进行了壳聚糖 降解的正交实验，获得了最佳实验条件：h 2 0 2 浓度4 ，反应温度 5 0 ，反应时间2 h ，乙酸浓度4 5 。覃彩芹等【3 8 分别以h 2 0 、 h c l 、h a c 、n a o h 为介质，h 2 0 2 为氧化剂降解壳聚糖，讨论了反 应介质和反应条件对壳聚糖分子量的影响。 1 4 3 2其他氧化降解法 除了单纯用h 2 0 2 降解壳聚糖之外，还可以在h 2 0 2 中混入其他 的化学物质以提高降解效率。n a c i o 本身具有很强的氧化性，在水 溶液中电离可以产生c 1o ，能选择性进攻0 1 ，4 糖苷键，对壳聚 糖进行氧化降解。罗平等1 39 用n a c i o h 2 0 2 混合体系氧化降解壳聚 糖，采用h 2 0 2 1 4 ，n a c l 0 1 3 ，反应温度4 0 9 0 ，反应时间 1 4 小时比较适宜，这时产品收率和外观质量都比较好。 还有报道以过硼酸钠( n a b 0 3 ) 为氧化剂氧化降解壳聚糖。林正 欢等【4 0 1 将壳聚糖与n a b 0 3 在酸溶液中进行均相降解反应，结果表 明降解产物氨基含量基本无变化，壳聚糖环结构保持完整，氧化断 键发生在1 ，4 糖苷键上。 1 4 4物理法 对壳聚糖的降解，除了上述的酶降解法、酸水解法和氧化降解 法，其他还有一些用物理的方法，如微波法、辐射法和超声波法等。 一种是在上述方法的基础上辅助加以微波法、辐射法和超声波法， c h o i 等【4 l j 以2 2 0 0 k g y 的辐射量辐射溶解在2 乙酸溶液中的壳聚 糖，随辐射量的增加，壳聚糖溶液的粘度下降，在辐射量增至】0 k g y 前，溶液粘度下降迅速，之后溶液粘度变化幅度减缓，而且随着辐 射量的增加，产物的颜色逐渐加深。周孙英等”2 】研究了在超声波 的辐射下，壳聚糖在稀醋酸溶液中的降解，壳聚糖浓度为1 左右， 醋酸浓度为5 1 0 ，降解速度最快辐射7 h 后粘度下降了7 3 。 随着超声波作用时间的延长，低聚糖的含量逐渐增大，分子量也随 之降低。另一种是直接用微波或超声波辐射壳聚糖固体，在固态下 将壳聚糖降解为低分子量的壳聚糖。h a i 等1 4 3 将脱乙酰度为9 0 - n 9 9 的壳聚糖粉末装入聚乙烯袋中，以放射源为c o “的y 射线辐 第章概述 射，结果发现开始辐射后，壳聚糖的分子量下降很快，辐射量超过 2 0 0 k g y 后分子量下降不明显，并且脱乙酰度高的壳聚糖分子量要 下降得快一些。李治等e 4 4 】以y 射线照射玻璃瓶中的固体片状壳聚 糖，相同的辐射量时，真空下的壳聚糖要比常压下的壳聚糖的分子 量要低，辐射降解不但没有破坏壳聚糖分子链上的n h2 ，反而使其 数量略有增加。壳聚糖的辐射降解一般服从无规降解动力学，分子 链上任何一处的同类化学键都有均等的断裂机会，对壳聚糖的降解 过程是通过辐射使糖苷键随机性切断的过程，降解产物分子量随着 辐照强度及辐照时间的增加而减小，并且降解产物分子量的均一程 度随着辐照剂量的提高而提高。 1 4 5 各种制备方法的比较 在低分子量壳聚糖的各种制备方法中，酶降解法是一种较好的 方法，降解酶可特异地、选择性地切断壳聚糖的声一1 ，4 糖苷键，降 解过程和降解产物的分子量分布更容易被控制，从而可以便利地对 降解过程进行监控，得到所需一定分子量范围的低聚壳聚糖。而且， 酶法降解是在较温和的条件下进行的，相对于其他方法，酶法降解 不需要加入大量的反应试剂，不发生其他副反应，对环境污染较少。 但是其在工业化生产的实现上尚存在不少困难，如酶的获取、酶的 纯化、酶的固定化等，而且成本也非常高，要以经济成本进行大规 模工业化生产，还需要进行更深入的研究。 酸降解法是壳聚糖降解制备低分子量壳聚糖的一种简单易行 的方法，降解反应所用试剂廉价易得，易于实现产业化。但是降解 过程较难控制，所得降解产物的分子量范围很宽。虽然这种方法早 己用于工业化生产，各种分子量范围的壳聚糖产品都能得到，但要 得到特定分子量范围且具有较高收率的壳聚糖产品还是比较困难 的；反应的后处理比较困难，会造成一定的环境污染。 物理降解法服从无规降解动力学，即分子链上任何一处的同类 化学键都有均等的断裂机会，该法是无须添加物的反应，反应易控， 无污染，产品品质高，但该法的缺点是容易引起一些交联和支化反 应，且收率太低，导致生产成本过高，要实现工业化还有待于进一 步的研究。 氧化降解法是近年来研究比较多的一种方法，普遍采用多种试 剂对壳聚糖进行降解反应或降解产物的后处理。氧化法降解速度 第一章概述 快，成本低，易于实现产业化，但氧化剂的使用增加了降解产物分 离纯化的难度。 采用h 2 0 2 做氧化剂降解壳聚糖是目前研究和生产应用最多的 一种方法。其优点是反应速度快、产率高，成本低，易处理，且对 反应产物的后续处理影响小，易于实现工业化生产。h 2 0 2 氧化降解 的缺点是反应的稳定性和重复性较差，产品的产率较低，低分子量 壳聚糖的分子量分布较宽等。 目前，低分子量壳聚糖的制备方法还不成熟，各种制备方法各 有利弊，有待于迸一步完善。成本低，工艺简单，产品均一，无污 染是壳聚糖降解方法的发展方向。目前，大多数的降解方法还只是 处于实验室研究阶段，面对市场对壳聚糖高纯度和窄分子量分布的 需求趋势，寻求合适的降解方法依然是众多科学工作者的目标。同 时，对降解工艺上的要求也趋向于绿色化，希望在生产过程中尽量 减少使用和排出对环境产生不可修复影响的物质。要最终实现产业 化大生产、产生显著的社会经济效益，还必须在其降解机理、降解 效率、降解产物的分子量分布、降解产物的分离、纯化等方面进行 更深入的研究，并探索新的经济可行的降解方法，开发新的生产工 艺。 1 5 课题研究意义 本实验拟在非均相体系中以h 2 0 2 氧化降解法制备低分子量壳 聚糖，研究并优化其工艺条件。国内外的研究已经取得了不少的成 就，以n n k a b a l n o v a 、k el i a n gb c h a n g 和y m d u 等人4 5 。4 7 】 为代表的研究表明： 在中性介质中由非均相体系降解壳聚糖时，壳聚糖与h 2 0 2 的作用中糖苷键的断裂是基本反应； 在酸性均相介质中壳聚糖的降解速率并不明显高于非均相 中性介质中壳聚糖的降解速率； h 2 0 2 浓度对非均相体系中壳聚糖的降解反应影响较大。 壳寡糖的生成与h 2 0 2 浓度、温度、壳聚糖的物理化学性 质等因素有关； 在中性条件下的壳聚糖一h 2 0 2 非均相降解体系中，当h 2 0 2 浓度超过1 2 以后，降解的最后阶段将成为均相体系； 第章概述 但到目前为止仍然存在一些缺点和不足，如反应的稳定性、重 现性差，产品的产率较低，以及低分子量壳聚糖的分子量分布较宽 等。 本课题拟通过选择及优化壳聚糖一h 2 0 2 非均相降解体系的降 解条件，最终希望将水溶性壳聚糖收率提高到8 0 左右，并希望 该反应在优化条件下能有较好的稳定性和重现性，为中试及工业化 生产探索出合适的工艺条件。 该课题在理论上可以进步完善壳聚糖一h 2 0 2 非均相降解体 系的动力学研究、探索加快反应速度及稳定性的新方法，在应用上 为制各水溶性壳聚糖寻找一种环境友好的、符合可持续发展战略的 新途径。 壳聚糖是一种碱性氨基多糖，在对其进行降解时，不但要考虑 反应物自身带来的影响，而且还要考虑因体系环境的改变对壳聚糖 降解过程的影响。在反应体系中影响降解反应的因素主要有反应温 度、时间、搅拌速度、壳聚糖微粒的大小、脱乙酰度和分子量、反 应物的投料比等。根据以上分析，在反应过程中我们拟从以下几个 方面来进行壳聚糖降解体系的优化研究。 ( 1 ) 设计l l6 ( 4 5 ) 正交实验，改变反应温度、反应时间、搅 拌速度、投料比及原料粒度等因素，对实验结果通过极差分析，获 取最佳反应条件。 ( 2 ) 进一步探索各因素对反应的影响，以达到可以通过改变 反应条件来控制水溶性壳聚糖的分子量的目的。 ( 3 ) 在优化条件下研究降解反应动力学，达到对反应过程的 初步认识。 ( 4 ) 考察反应温度、反应时间、搅拌速度、投料比及原料粒 度等因素对降解速度及水溶性壳聚糖收率的影响，考察其作用机 理，通过改变某些工艺条件来提高水溶性壳聚糖的收率。 第二章最佳产率水溶性壳聚糖的制各 第二章最佳产率水溶性亮聚糖的制备 2 1 材料与仪器 2 1 1实验仪器与设备 表2 1实验仪器设备 除上述仪器外，其它实验室常用仪器不再一一列出。 1 6 第二章最佳产率水溶性壳聚糖的制各 2 1 2 主要原料 表2 2原料 2 2实验流程 2 2 1降解实验方法 本实验采用正交试验法安排整个实验过程。正交试验法又叫正 交试验设计法，它是用“正交表”来安排和分析多因素问题试验的 一种数理统计方法。这种方法的优点是试验次数少，方法简单，使 用方便，效率高，并且在将实验次数降至最低的情况下，不影响实 验结果的准确性。 按照表2 4 所示，分别在不同的反应条件下进行壳聚糖的降解 实验。反应在恒温水浴中进行，并根据每次实验所用双氧水量调节 去离子水的用量，使反应体系总体积为6 0 m l 。具体降解反应实验 步骤如下： 按照实验要求安装好实验仪器后，称量3 9 壳聚糖加入到四1 3 瓶中，然后加入所需量的去离子水( 去离子水所需量由反应所用的 第二章最佳产率水溶性壳聚糖的制备 双氧水的量来确定，使反应体系中去离子水和双氧水的总体积为 6 0 m 1 ) ，开动搅拌器，以特定的速度搅拌，在恒温水浴中加热至预 定温度后，一次性加入所需量的双氧水，恒温反应至预定时刻后结 束反应，将反应液在冰水中冷却，抽滤，即得到水溶性低分子量壳 聚糖溶液和水不溶性壳聚糖残渣，然后将残渣在真空干燥箱中干 燥，称重，壳聚糖水溶液放入冰箱中，冷藏待用。 2 2 2正交实验因素水平的确定 在本实验中，我们综合考察反应温度、反应时间、h 2 02 与壳 聚糖的用量比以及壳聚糖粒度和搅拌速度等条件对h 2 0 ：氧化降解 壳聚糖的影响，以尽可能的获取最大产率的水溶性低分子量壳聚 糖。在正交实验中，各因素水平的确定是非常重要的。只有确立了 各因素水平的准确考察范围，才能正确反映各因素对反应的影响。 2 2 2 1降解反应温度的选择 。 李邦良、毛自平1 4 8 - 4 9 1 等研究表明，当温度低于5 0 时，h 2 0 2 氧化降解壳聚糖的反应非常缓慢，水溶性壳聚糖的产率非常低，因 此本实验反应温度下限选择为5 0 。较高的反应温度有利于制备水 溶性低聚糖，随着反应温度的升高，水溶性产物的收率大大增加， 但是随着反应温度的升高，水溶性壳聚糖的颜色逐渐变深，当温度 升至7 0 时，水溶性低分子量壳聚糖固体的颜色已经是棕黄色。 鉴于对低分子量壳聚糖的质量要求，反应温度不能太高，以免影响 色泽。所以降解反应的最高温度在正交设计时以选择6 5 为宜。 2 2 2 2降解反应时间的选择 低分子量壳聚糖的制各要实现工业化生产，生产效率是一个不 容忽视的因素，在不影响低分子量壳聚糖的产率的情况下，应该尽 量缩短反应时间，所以选择降解反应时间的各水平为2 h 、4 h 、6 h 、 8 h 。 2 2 2 3双氧水用量的选择 按照生产过程中成本最低化的原则，反应过程中应该使双氧水 的用量最少。根据实验测定h 2 0 2 与壳聚糖单元的用量比为0 5 时， 壳聚糖反应率较低，不能满足本实验的要求，因此选择h 2 0 2 与壳 1 8 第二章最佳产率水溶性壳聚糖的制备 聚糖单元的用量比为1 、2 、4 、6 。 2 2 2 4壳聚糖