（食品科学专业论文）酪蛋白糖巨肽制备技术的研究.pdf

酪蛋白糖巨肽制备技术的研究 食品科学 研究生张秀媛指导老师袁永俊 酪蛋白糖巨肽( c a s e i ng l y c o m a c r o p e p t i d e ，缩写为c g m p ) 是蛋白酶酶解k 酪蛋白得到的c 末端亲水性糖肽。9 0 的c g m p 中含有唾液酸。c g m p 的分 子质量约为9 k d a ，但随p h 而变化，在酸性范围内如p h 3 5 ，大约为1 0 - - 3 0 k d a ， 中性条件如p h 7 0 ，大约为2 0 一- - 5 0 k d a 左右。这主要是由于在不同的p h 下c g m p 的聚合程度不同造成的。c g m p 独特的氨基酸组成和含有丰富的唾液酸使其具 有多种生理功能，如能抑制胃分泌物；能调节免疫系统反应；能抑制病原体包 括病毒和细菌等黏附至细胞；能结合霍乱和埃希氏大肠杆菌的肠毒素；能促进 双歧杆菌的生长。除此之外，酪蛋白糖巨肽不含任何芳香族氨基酸，故可用作 苯丙酮尿患者膳食中的首选成分；它富含支链氨基酸( 缬氨酸和异亮氨酸) ，而 且蛋氨酸含量低，使其在控制肝病方面也有成效。由于c g m p 具有这么多功能， 它可以广泛地应用于保健食品及药品中。c g m p 的开发不仅为医药和保健食品 提供了一种功能因子，而且也增加乳的附加值，这样可以获得更大的社会效益 和经济效益。 目前制备c g m p 的方法主要是从乳清中直接提取和酶解酪蛋白后提取。这 些制备c g m p 的方法由于乳清和酶解产物的复杂，使得分离纯化比较困难， 要得到高纯度的c g m p 成本高且不适合于工业化生产。本实验研究一种不仅能 根据需要而制备不同纯度c g m p ，而且还适合于工业化生产的制备方法。 本实验用凝乳酶水解酪蛋白制备c g m p ，并研究了酶解的条件，再用 s u p e r d e x7 51 0 3 0 0g l 凝胶柱层析和p e s 2 0 0 超滤膜超滤分离纯化c g m p ，并 研究了凝胶柱层析和超滤的条件，最后用凝胶柱层析测定了c g m p 纯度和分子 量。凝胶柱层析得到蛋白回收率分别为0 6 5 、0 5 2 和0 2 9 和糖基化程度分 别为7 1 6 1 x g m g 、9 9 1 l x g m g 和4 4 4 i t g m g 的三类c g m p ，它们的总蛋白回收率 为1 4 6 、平均糖基化程度为7 6 t g m g 。超滤制备的c g m p 的蛋白回收率为 1 7 7 、糖基化程度为7 0 1r t g m g 。超滤和凝胶柱层析联用得到了比较纯的 c g m p ，它们的总蛋白回收率为1 0 8 、平均糖基化程度为7 8 9 1 a g m g ，并且还 可以得到蛋白回收率分别为0 4 5 、0 3 6 和0 2 7 和糖基化程度分别为 8 9 7 p , g m g 、9 9 5 i _ t g m g 和3 3 7 p , g m g 的三类c g m p ，它们的分子量分别为 4 3 0 0 0 d a 、3 0 0 0 0 d a 和2 5 0 0 0 d a 。 关键词：酪蛋白糖巨肽，凝乳酶，超滤，凝胶层析 r e s e a r c ho np r e p a r a t i o nt e c h n i q u eo fc a s e i n g l y c o m a c r o p e p t i d e - - f o o ds c i e n c e p o s t g r a d u a t ez h a n gx i u y u a n t u t o ry u a ny o n g j u n c a s e i ng l y c o m a c r o p e p t i d e ( c g m p ) i sct e r m i n a lh y d r o p h i l i cg l y c o s y l a t e d p e p t i d e ，i ti sh y d r o l y s a t eo f k - c a s e i nb yp r o t e i n a s e 9 0 c g m ph a ss i a l i ca c i d t h e t h e o r e t i c a lm o l e c u l a rw e i g h to fc g m pi sa p p r o x i m a t e l y9 k d a , b u tt h ea p p a r e n t m o l e c u l a rw e i g h tc h a n g e sw i t hp h ，i nt h ea c i d i cs c o p el i k ep h 3 5 ，p r o b a b l yi s1o 3 0 k d a ，n e u t r a lc o n d i t i o nl i k ep h 7 0 ，p r o b a b l yi s2 0 5 0 k d a t h i si sm a d eb e c a u s e o fd e g r e eo fp o l y m e r i z a t i o no fc g m pu n d e rd i f f e r e n tp h c g m ph a su n i q u ea m i n o a c i da n dr i c hs i a l i ca c i dw h i c hm a k ei th a v em a n yp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n s ，s u c ha s s u p p r e s st h es t o m a c hs e c r e t i o n ，a d j u s ti m m u n es y s t e m ，i n h i b i tp a t h o g e na d h e r i n gt o t h ec e l l i n c l u d i n g v i r u sa n db a c t e r i u m ，u n i f yi n t e s t i n o t o x i no f c h o l e r aa n d e s c h e r i c h i ac o l ia n dp r o m o t eb a c i l l u sb i f i d u sg r o w t h i na d d i t i o n ，c g m pi st h ef i r s t c h o i c ef o o df o rp h e n y l p y r u v i c a c i d u r i ap a t i e n t ，b e c a u s ei td o e sn o ti n c l u d ea n y a r o m a t i ca m i n oa c i d c g m pi su s e f u li nh e p a t o p a t h y , b e c a u s ei ti sr i c hi nb r a n c h e d c h a i na m i n oa c i d ( v a la n di l e ) a n dl o wi nm e t h i o n i n e c g m pi sw i d e l yu s e di n h e a l t h yf o o da n dm e d i c i n ew i t hs om a n yf u n c t i o n s i t se x p l o i t a t i o nn o to n l yo f f e r sa f u n c t i o n a lc o m p o n e n tf o rh e a l t h yf o o da n dm e d i c i n e ，b u ta l s oa d d sv a l u eo fm i l k s o m o r es o c i a la n de c o n o m i c a lb e n e f i t sa r eg a i n e d a tp r e s e n t ，p r e p a r a t i o nt e c h n i q u ef o rc g m p m a i n l ya r ed i r e c t l ye x t r a c t i o n f r o mw h e ya n de x t r a c t i o nf r o mh y d r o l y s a t eo fc a s e i n t h o s ep r e p a r a t i o nt e c h n i q u e a led i f f i c u l t f o rs e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o nb e c a u s eo fc o m p l e x i t yo fw h e ya n d h y d r o l y s a t e ，h i g hc o s tf o rg a i n i n gh i g hp u r ec g m pa n df i t f o ri n d u s t r i a l i z e d p r o d u c t i o n t h ee x p e r i m e n ts t u d i e sak i n do ft e c h n i q u ew h i c hn o to n l yp r e p a r e s d i f f e r e n tp u r ec g m pa c c o r d i n gt on e e d ，b u ta l s of i tf o ri n d u s t r i a l i z e dp r o d u c t i o n i nt h ee x p e r i m e n t ，f i r s t ，r e n n i ni su s e dt op r e p a r ec g m pa n dh y d r o l y z e d c o n d i t i o ni ss t u d i e d s e c o n d ，c g m pi sp u r i f i e di nv i r t u eo fs u p e r d e x7 510 3 0 0g l a n dp e s 一2 0 0u l t r a f i l t r a t i o nm e m b r a n e ，t h e i rc o n d i t i o ni sa l s os t u d i e d a tl a s t ，p u r i t y a n dm o l e c u l a rw e i g h to fc g m pa l ed e t e r m i n e di nv i r t u eo fg e lc h r o m a t o g r a p h y t h e r e s u l to fg e lc h r o m a t o g r a p h ys h o wt h er a t eo f r e c o v e r yo fp r o t e i na l e0 6 5 ，o 5 2 a n d0 2 9 ，t h ed e g r e eo fg l y c o s y l a t i o no fc g m pa r e71 6 r t g m g ，9 9 1l x g m ga n d 4 4 4 1 x g m g ，t h e i rt o t a lr a t eo fr e c o v e r yo fp r o t e i ni s1 4 6 ，t h e i ra v e r a g ed e g r e eo f g l y c o s y l a t i o ni s7 6 p g m g t h er e s u l to fu l t r a f i l t r a t i o ns h o wt h er a t eo fr e c o v e r yo f p r o t e i ni s1 7 7 ，t h ed e g r e eo fc g m pi s 7 0 1i t g m g i fu l t r a f i l t r a t i o na n dg e l c h r o m a t o g r a p h ya r ea s s o c i a t e d ，t h er e s u l ts h o wc g m pa l em o r ep u r e r , t h e i rt o t a l r a t eo fr e c o v e r yo fp r o t e i ni s1 0 8 ，t h e i ra v e r a g ed e g r e eo fg l y c o s y l a t i o ni s 7 8 9 i t g m g ，t h r e ek i n d so f c g m pi sa l s og a i n e d ，t h e i rr a t eo f r e c o v e r yo f p r o t e i na l e 0 4 5 ，0 3 6 a n d0 2 7 ，t h e i rd e g r e eo fg l y c o s y l a t i o na l e8 9 7 i - t g m g ，9 9 5 i _ t g m g a n d3 3 7 1 x g m g ，t h e i rm o l e c u l a rw e i g h ta r e4 3 0 0 0 d a ，3 0 0 0 0 d aa n d2 5 0 0 0 d a k e y w o r d s ：c a s e i ng l y c o m a c r o p e p t i d e ，r e n n i n ，u l t r a f i l t r a t i o n ，g e lc h r o m a t o g r a p h y 西华大学硕士毕业论文 声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作所取得的 研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文不包含其他人已经发 表或撰写过得研究成果，也不包含为获得西华大学或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 本学位论文成果是本人在西华大学读书期间在导师的指导下取得的，论文 成果归西华大学所有，特此声明。 作者签名窃徽勿弼年参月力归 翩签名芬谁册年够月稍 第5 9 页 西华大学硕士毕业论文 l 文献综述 乳是哺乳动物乳腺的分泌产物。乳中各成分的比例恰当，具有很高的营养 价值，同时乳在人类和动物免疫保护与生长调节中还具有着独特的功能，是新 生哺乳动物最好的食品。酪蛋白是乳的主要成分，富含磷、吸附钙和丰富的必 需氨基酸，并且它的局部有亲水域和疏水域，且极易消化，是优质氨基酸供给 源，因此以酪蛋白为主要成分的奶酪是西方人喜食的食品之一。近些年从酪蛋 白的酶解产物中发现了多种具有生物活性的肽类，这些生物活性肽主要有：类 吗啡活性肽、抗菌肽、免疫活性肽、c g m p 、抗血栓活性肽、矿质元素结合肽、 抗高血压肽、促进d n a 合成和细胞生长的活性肽、抗癌细胞肽等，它们对婴幼 儿正常的生长发育和正常生理功能的发挥起着非常重要的作用，而且对调节成 年人的生理功能、预防疾病和感染也具有重要意义。 1 1 酪蛋白糖巨肽的结构和功能 1 1 1 酪蛋白的结构 酪蛋白是乳蛋白的主要组成成分，占乳蛋白的7 6 - - 8 6 ，在牛乳中以酪 蛋白胶束状态存在，主要包括a 。1 酪蛋白、a 。2 酪蛋白、b 酪蛋白、k 酪蛋白， 其它的酪蛋白成分主要源于酪蛋白的磷酸化和糖苷化及有限的水解，最常见的 是qs 2 - 酪蛋白磷酸化、k 一酪蛋白的糖苷化和b 酪蛋白水解产生的y 酪蛋白和 肽等。在牛乳酪蛋白中a 。1 酪蛋白约占3 8 、a 。2 一酪蛋白约占1 0 、1 3 一酪蛋白 约占3 5 、k 一酪蛋白约占1 3 【l j 。 k 酪蛋白是酪蛋白中唯一含糖成分和对钙不敏感的酪蛋白。氨基酸组成分 析表明，k 。酪蛋白含有1 6 9 个氨基酸残基，包括两个胱氨酸残基( 两个s h 基) ， 通常含有一个磷酸基，富含脯氨酸、丙氨酸、谷胺酰胺、谷氨酸等，分子量约 为1 9 1 0 4 d a 1 】【3 】。k 酪蛋白中的糖成分有半乳糖( g a l ) 、n 乙酰氨基半乳糖 ( g a l n a c ) 、n 乙酰神经氨酸( n e u n a c ) ( 唾液酸) 等三种，这些糖基本上都在k 酪蛋白中的c g m p 肽段上，至少含有一个唾液酸的三糖和四糖，占k 一酪蛋白中 c g m p 结构糖链的9 0 以上。由于没有磷酸丝氨酸簇和苏氨酸糖苷化残基，因 此k 酪蛋白对钙离子不敏感。k 酪蛋白在酪蛋白胶束中主要分布在外部，可 第1 页 西华大学硕士毕业论文 稳定乳中的酪蛋白胶束，凝乳酶可以专一性地裂解第1 0 5 、1 0 6 位的p h e m e t 键， 释放出副k 酪蛋白和c g m p 肽段，使酪蛋白胶束失去稳定能力，而产生胶体凝 集，干酪制作和酶解制备c g m p 就是应用了此特征1 2 j 。 牛乳中k 酪蛋白有两种遗传变异型即a 型和b 型【3 】，不同之处在于第1 3 6 位 和第1 4 8 位的残基不同，a 型在这两处的氨基酸分别是苏氨酸和天冬氨酸，b 型 在这两处的氨基酸分别是异亮氨酸和丙氨酸，它们的一级结构如图1 1 所示【4 j 。 1 p y r o g l u g l u g l n a s p - g l n 。g l u g l n p r o i l e a r g - - c y s g l u l y s a s p - g l u 。a r g p h e p h e l s e r - a s p - 2 1 l y s l l e a ls - l y s 一下y r 1 1 e p r o i l e g l n t y r v a l 一l e u s e r a r g t y r p r o s e t t y r g l y l e u 一 4 1 a s n t y r 。t y r 。g l n g l n 。l y s p r o 。v a l 。a l a l e u il e - a s n a s n g l n 。p h e + l e u + p r o t y r p r o t y r - 6 l t y r a l a - l y s p r o a 1 a a 1 a v a l a r g s e r p r o - a l a - g l n i l e l e u g l n t r p - g l n v a l l e u s e t 一 8 1 a s n t h r v a l p r o a l a l y s s e r c y s - g l n - a l a - g l n p r o t h r t h r m e t a 1 a a r g h is - p r o h is 1 0 11 0 5l1 0 6 p r o h i s l e u 。s e r 。p h e m e t a l a i l e p r o p r o 。l y s 。l y s 4 h s n 。g l n - a s p l y s t h r - g l u i l e p r o 。 1 2 1 i l e ( v a r i a n tb ) t h r l l e a s n t h r l l e a l a - s e r g i y g l u p r o t h r s e r t h r p r o t h r 一 一g l u a l a - v a l g l u t h r ( v a r i a n ta ) 1 4 1 a l a ( v a r i a n tb ) s e r t h r v a l 一a 1 a t h r l e u g l u 一一s e r p r o g 1 u v a l - 1 1 e g l u - s e r - p r o p r o - g l u - l l e a s n a s p ( v a r i a n ta ) 1 6 l1 6 9 t h r v a l g 1 n v a l - t h r - s e r t h r a l a - v a l 0 h f i g 1 1f i r s tc l a s ss t r u c t u r eo f1 ( ：- c a s e i n 图1 - 1k 酪蛋白的一级结构 注：l e u - 亮氨酸；c y s 半胱氨酸；p h e 一苯丙氨酸：t y r - 酪氨酸；t r p 一色氨酸；h i s 组氨酸： a r g 一精氨酸：m e t 一甲硫氨酸( 蛋氨酸) ；a l a - 丙氨酸；l i e - 异亮氨酸；p r o 一脯氨酸；l y s 一赖 氨酸；a s n 一天冬酰胺；g i n 一谷酰胺；a s p - 天冬氨酸：t h r - 苏氨酸；g l u 一谷氨酸；s e r - 丝氨酸： g l y - 甘氨酸；v a l 一缬氨酸 1 1 2 酪蛋白糖巨肽的结构与生理功能 1 1 2 1 牛酪蛋白糖巨肽的结构特性 酪蛋自糖巨肽( c a s e i ng l y c o m a c r o p e p t i d e ，英文缩写c g m p ) 是k 酪蛋自中 第2 页 西华大学硕士毕业论文 的一个多肽片段，它在1 9 5 3 年就引起了研究人员的注意，j o l l 奄s 等发现经凝乳酶 处理的牛乳以及酪蛋白盐溶液中，1 2 的三氯乙酸溶液中可溶性氮含量明显增 加。此后，人们主要关注凝乳酶对酪蛋白的作用机制。1 9 5 6 年w a u g h 等发现了 k 酪蛋白；1 9 6 5 年d e l f o u r 等人发现k 一酪蛋白的特定位置经凝乳酶切断，生成 不溶的副k 酪蛋白和一种1 2 三氯乙酸可溶的c 端亲水性多肽两部分，由于此 可溶性多肽分子量较大且含有较多的糖链，于是就称为糖巨肽，而由酪蛋白来 源的此类多肽则统称为酪蛋白糖巨肽。牛k 酪蛋白被凝乳酶水解后生成副k 酪蛋白和c g m p 两部分的示意图如图1 2 所示【4 j 【5 j 。 oh 1 1 0 5l li 1 0 6 p y m g l u 、，v 、一v p h e c n m e t + h 2 0 1 6 9 v a i c o o 击蒜一o 弋口士一嘏 牛k 酪蛋白来源的c g m p 氨基酸序列已清楚，它由牛k 。酪蛋白的n ，末端 1 0 6 位氨基酸( m e t ) 开始至1 6 9 位c 末端( v a l ) 结束的6 4 个残基构成的。图1 - 3 为牛 c g m p 的氨基酸序列图谱【3 1 1 4 。 1 0 61 2 1 m e t a l a i l e d o d o l y s l y s a s n - g l n a s p l y s t h r g l u i l e p r o t h r i l e a s n t h r i l e i l e ( v a r i a n tb ) 1 4 1 a l a s e r g l v g 1 u p r o t h r s e r t h r p r o - t m 一 一g l u a l a v a l g l u s e r t h r v a l a l a - t h r t h r ( v a r i a n ta ) a l a ( v a r i a n tb ) 1 6 1 l e u - g l u - s e r p r o g l u v a l i l e g l u s e r p r o p r o g l u i i e a s n t h r v a l g l n v a l 一t h r a s p ( v a r i a n ta ) 1 6 9 s e r - t h r a l a v a 0 h f i g u r e1 - 3c h a r to fa m i n oa c i ds e q u e n c em c o wc g m p 图1 - 3 牛c g m p 氨基酸序列图谱 第3 页 西华大学硕士毕业论文 注：m e t 甲硫氨酸( 蛋氨酸) ；a l a 丙氨酸；n e 异亮氨酸；p r o 脯氨酸；l y s 赖氨酸；a s n 天冬酰胺；g i n - 谷酰胺；a s p 天冬氨酸；t h r - 苏氨酸；g l u 谷氨酸：s e r - 丝氨酸：g l y 甘氨 酸；v a l 一缬氨酸 由于牛酪蛋白来源的k 酪蛋白有a 和b 两种遗传变异型，而这两种遗传变 型的不同之处在于第1 3 6 位和1 4 8 位的氨基酸不同，此外，牛乳来源的k 酪蛋白 的1 3 1 、1 3 3 、1 3 5 、1 3 6 位的苏氨酸残基和1 4 1 位的丝氨酸残基为配糖体化的部位， 1 4 9 位的丝氨酸为磷酸化的部位。因此，对应于k 一酪蛋白第1 0 6 1 6 9 氨基酸残基 片段的c g m p 有两种遗传变型且都有五个配糖体化的部位。有报道显示虽然乳 牛来源的c g m p 含有五个配糖体化的部位，但是每个c g m p 分子中只含有一个 配糖键，牛乳来源的c g m p 的糖基化是随机发生的。c g m p 呈多样性，主要表 现在其配糖体化的部位与肽链上连接的糖和磷酸盐不同。齐滕等明确了牛k 酪蛋白的主要糖链和微量糖链的化学结构以及它们的存在比率，而且推测出糖 链的合成路线，其存在的糖链主要有以o 糖苷型结合的2 种中性糖链和3 种酸性 糖链，9 0 以上的结合糖链都含唾液酸。来自初乳和常乳的c g m p 中碳水化合 物存在差异，前者比正常乳含更多的复杂的碳水化合物。常乳的c g m p 含有以 下4 种不同的低聚糖 5 】【6 】 7 】： i 、g a l n a c o r i i 、g a l1 3 ( 1 3 ) g a l n a c o r i i i 、n e u a ca ( 2 3 ) g a lb ( 1 - - - 3 ) g a l a c o r 、g a l1 3 ( 1 - 3 ) 【n e u a c a ( 2 - - - , 6 ) ) g a l n a c o r v 、n e u a ca ( 2 - - , - 3 ) g a l1 3 ( 1 - 3 ) n e u a ca ( 2 - - - 6 ) ) g a l n a c o r 其中：g a l 为半乳糖：n e u a c 为n 乙酰神经氨酸( 唾液酸) ；g a l n a c 为n 一乙 酰半乳糖胺；r 为苏氨酸或丝氨酸 牛酪蛋白来源的c g m p 其多肽链的分子质量约为9 k d a ，随p h 而变化。在酸 性范围内女h p h 3 5 ，大约为1 0 - - , 3 0 k d a ，中性条件下如p h 7 0 ，大约为2 0 - - - 5 0 k d a 左右【5 】【8 1 。许多c g m p 的制备就是基于它的此特性而进行分离纯化。 1 1 2 2 羊酪蛋白糖巨肽的结构特性 不同来源的c g m p 结构有所不同。对山羊和绵羊c g m p 的化学分析、定量 第4 页 西华大学硕士毕业论文 分析的信息虽然相对较少，但j o l l b s 及a l a i s ( 1 9 7 3 ) 做了大量的相关工作，他们 从山羊k 一酪蛋白中分离出了c g m p 并报道了其化学成分，认为山羊c g m p 与牛 c g m p 氨基酸组成及序列不同，山羊c g m p 是由6 6 个氨基酸残基( 1 0 矗1 7 l 残基) 组成的多肽，理论分子量为6 8 2 4 d a ，包含碳水化合物及磷的山羊c g m p 的表观 分子量约为7 5 0 0 d a 。与牛c g m p 序列相比，山羊序列中含有1 9 个替代子及两个 插入子( v a l 1 3 2 、h i s 1 3 3 ) ，其中甘氨酸和亮氨酸在羊乳中不存在而在牛乳中存 在，组氨酸在羊乳中存在而在牛乳中不存在，这反映了物种之间的差异。山羊 乳中唾液酸含量的9 9 9 与蛋白质结合，释放入甜乳清的占7 5 ( v v ) p j 。另据 报道，具有6 6 个氨基酸残基的山羊c g m p 的等电点为4 8 ，它较具有6 4 个氨基酸 残基的牛c g m p 变体a 及b 的等电点( 分别为4 0 4 和4 1 4 ) 稍高。与牛酪蛋白来源 的c g m p 样，羊酪蛋白来源的c g m p 的分子量也取决于p h 值，p h 7 时具有较 高的分子量，约为3 3 0 0 0 d a ，这是由于此时呈三聚体或四聚体，酸性时呈单体， 分子量约为7 5 0 0 d a 。牛、绵羊、山羊这三个物种c g m p 的氨基酸组成相近( 尤其 是绵羊和山羊) ，但并不完全相刚1 u j 。 无论是来源于牛酪蛋白的c g m p 还是来源于绵羊、山羊酪蛋白的c g m p ， 都几乎不含芳香族氨基酸( p h e 、t y r 、t y p ) ，故其在的2 8 0 n m 处吸收弱，经常用 2 1 0 n m 2 8 0 n m 处的u v 吸收差来评价c g m p 的纯度。还可以利用此性质在用柱层 析法制备c g m p 的过程中用双波长同时检测推算c g m p 的大约洗脱的时间。 1 1 2 3 酪蛋白糖巨肽的生物功能 唾液酸存在于许多生物体内，随着生物进化程度的增加，唾液酸在生物体 内的含量及衍生物类型亦增加，进化程度较低的生物，如原生动物、昆虫、环 节动物、多孔动物、扁形动物等均极少有或者没有唾液酸存在。脊椎动物中普 遍存在唾液酸，如鱼类、两栖类、爬行类、鸟类等动物。哺乳动物体内普遍存 在唾液酸，且在各种体液中均存在，相对而言在脑脊液和粘液中最多。通常唾 液酸均结合于生物大分子中，游离态唾液酸很少，例如脑脊液中游离态唾液酸 含量约占脑脊液中唾液酸含量的3 。研究表明唾液酸具有许多生理功能，最主 要的生理功能是在生物体内防御机制中起较重要的作用。人的母乳中含有较高 浓度的唾液酸，经大量研究发现其与婴儿的发育以及感染防御机制具有较大关 第5 页 西华大学硕士毕业论文 系。最近研究显示唾液酸具有抑制引起下痢原因病毒的感染作用和提高学习能 力的效果，唾液酸在脑内还与脑的发育有较大的关系。 c g m p 具有独特的氨基酸组成和含量较高的唾液酸，使其具有了多种生理 活性功能。经过大量的体外和体内实验表明，c g m p 的生理功能主要有： ( 1 ) 结合霍乱和埃希氏大肠杆菌的肠毒素 霍乱弧菌能产生的霍乱毒素亚单位a 和亚单位b ，b 亚单位是与细胞壁上寡 糖结合的位点，一旦结合，亚单位a 激活细胞上的腺苷酸环化酶，这种酶会使 细胞失水，从而导致腹泻，可能还会死亡。研究已表明霍乱毒素亚单位a 和b 的受器是一种神经节苷脂【1 1 】，这种神经节苷脂与c g m p 的寡糖结构类似，因此 c g m p 有结合霍乱毒素和埃希氏大肠杆菌毒素的特性。 k a w a s a k i 等用唾液酸酶处理c g m p ，其抑制作用完全丧失；用蛋白酶处理 后其抑制作用也部分丧失，说明c g m p 有结合霍乱毒素的功能，并且也说明了 唾液酸和肽链共同参加了抑制作用【1 2 1 。 ( 2 ) 抑制病毒和细菌等黏附至细胞 许多细菌和病毒是通过黏合剂与宿主结合的，s t e i j i n 对黏合剂及接受器的 特性进行了大量的研究，认为c g m p 能和病毒、细菌结合主要是因为它的肽链 上的单糖( 唾液酸) 与接受器有足够的相似性，它们能堵塞接受器，因此可抑制 细菌和病毒黏附至细胞 1 3 】。n e s s e r 等人一直在研究牛乳组成成分对抑制龋齿发 生的机制，研究表明，c g m p 能减弱龋齿发生的机制是c g m p 能使产生牙齿噬 菌斑的微生物组成发生改变，使其微生物群由葡萄球菌变为由很弱致癌性的放 线菌组成，研究同时发现c g m p 不仅抑制龋齿而且可使牙齿重新无机化【1 引。 ( 3 ) 抑制胃肠道分泌物 胃蛋白酶水解c g m p 得到两个肽段，它们可以抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白 酶等蛋白酶对蛋白的水解，从而保护乳中免疫球蛋白、乳铁蛋白及溶菌酶等活 性蛋白不受破坏，经胃到达肠道【1 5 】【1 6 】。g u i l l o t e a u 等给老鼠静脉注射c g m p ，没 有抑制胃液分泌和减慢胃肠蠕动，但如果喂同等剂量的c g m p ，喂食后l h - - - 2 h 具有明显的抑制胃液分泌的作用，这是由于c g m p 可以刺激肠道分泌胆囊收缩 素，从而调节肠道功能【1 7 】。非糖基化的c g m p 对分泌胆囊收缩素没有作用，糖 基化的b 变种只能微弱的刺激分泌胆囊收缩素，而糖链末端含唾液酸的a 变种具 第6 页 西华大学硕士毕业论文 有较大的刺激作用，这表明肽链和结合的碳水化合物的结构对刺激胃液分泌是 很重要的【l 引。 ( 4 ) 促进双歧杆菌的生长 双歧杆菌可以抑制细菌生长，因此可以预防胃肠道疾病。曹晋宜等对小鼠 进行c g m p 灌胃实验时，发现不同剂量的c g m p 都可以促进肠道内双歧杆菌的 增殖，其中以中剂量组( 8 0 1 上g d 和1 0 0 i _ t g d ) 双歧杆菌增殖最为明显【1 9 】。 ( 5 ) 调节免疫系统的反应 脾淋巴细胞的增殖是感染反应的一个环节，抑制脾淋巴细胞增殖就表现为 抑制免疫应答，就象一种过敏反应。o t a n i 等通过实验表明酪蛋白可以抑制被鼠 伤寒杆菌有丝分裂原的脂多糖所诱导的老鼠脾细胞的增殖，抑制活性主要来源 于k 酪蛋白的凝乳酶水解产物中的c g m p 片段，副k 酪蛋白没有抑制活性。如 果将c g m p 中的唾液酸消化掉，则它就不具有这样的活性，这说明唾液酸是主 要起作用的成分。他们又将c g m p 用凝乳酶水解，它的抑制活性就降低了，而 用胰蛋白酶或者链霉蛋白酶水解，活性反而增加，说明c g m p 的肽链也参与了 抑制脾细胞增殖的作用。因为凝乳酶消化后的c g m p 抑制活性减弱了，人们了 解到c g 中的1 4 9 位丝氨酸磷酸酯在c g m p 结合到有丝分裂原受体上时扮演 了重要角色。细胞在加入c g m p 和没有加入的情况下培养，再将细胞用抗k 酪 蛋白的抗体染色，结果是只有用c g m p 培养的细胞保留了抗k 一酪蛋白的抗体， 这表明是c g m p 结合到了细胞表面并起了作用【2 0 j 。 还有研究表明由c g m p 所得的一些小肽还有类似鸦片的拮抗作用，有抑制 血小板凝集及降低血压效果等。 此外，c g m p 由于其独特的氨基酸组成，使其具有独特的营养特性。c g m p 几乎不含有芳香族氨基酸，可作为苯丙酮尿症患者( p k u ，一种不能代谢芳香族 氨基酸的遗传病) 膳食中首选的成分。c g m p 含有较多的支链氨基酸( 如缬氨酸 和异亮氨酸) ，可用于多种肝病的治疗，相关的研究人员认为，支链氨基酸与芳 香族氨基酸的比率系数越大，其对肝病的治疗效果越好，经证实，此系数约为 2 0 左右时，c g m p 可作为肝病患者的膳食，效果很好 2 1 】 2 3 1 。 由于c g m p 具有这么多功能，它可以广泛地应用于保健食品及药品中。据 报道含有c g m p 的部分商品已经应用到人们的生活中，如在美国加入c g m p 的 第7 页 西华大学硕士毕业论文 牙膏已经研制成功，它可以抑制龋齿和口腔溃疡的发生。有文章认为，把c g m p 加入到饼干、果冻等食品中能增进人体健康，使机体增强免疫力；在医药制品 中加入c g m p 用于血栓症的治疗：c g m p 能结合肠毒素的特性使它广泛的应用 于婴幼儿食品当中【2 2 1 。c g m p 的发现和研究不仅开发了一种新型的功能性因子， 也提高了酪蛋白的附加值，这样可以获得更大的社会效益和经济效益。 1 2 酪蛋白糖巨肽的制备方法 目前制备活性肽的方法有酶解法、直接提取法、化学合成法、重组菌生产 等，但目前报道制备c g m p 的方法主要是直接提取法，还有酶解法。 1 。2 1 直接提取法 目前直接提取法是制备c g m p 的最主要方法。直接提取法制备c g m p 使用 的原料为乳清。乳清是生产干酪的副产物，按生产干酪时工艺的不同分为甜性 乳清、酸性乳清和含盐乳清。甜性乳清是指生产契达干酪或用凝乳酶凝固的其 它类型的干酪时产生的乳清，其p h 约为6 o ；酸性乳清是指生产农家干酪、稀奶 油干酪、费塔干酪或用乳酸凝固的其它干酪时产生的乳清，其p h 为4 6 左右；含 盐乳清是指生产干酪时另加了食盐而得的乳清。用凝乳酶制备干酪的原理是凝 乳酶切断k 一酪蛋白的第1 0 5 、1 0 6 位的p h e m e t 键，生产疏水的副k 酪蛋白( 1 1 0 5 残基) 和亲水的肽段( 1 0 6 , - - , 1 6 9 残基，即c g m p ) ，使酪蛋白胶束失去稳而 沉淀，疏水性的副k 酪蛋白随同酪蛋白其它组分一起沉淀而成为干酪的组成成 分，而亲水性的c g m p 留在了乳清中。其它类型的干酪都是根据酪蛋白的等电 点而生产的，因此甜乳清是制备c g m p 的最佳原料。有研究指出，甜乳清中 c g m p 的含量为1 2 - 1 5 9 l ，估计相当于总乳清蛋白含量的1 5 2 5 ( 乳清蛋 白占乳总蛋白的0 6 - - 0 8 ) 2 3 】。美国2 0 0 2 年的一项专利技术是分别采用2 0 k d 和5 k d 的膜对新鲜干酪甜乳清进行截留，p h 分别调整为3 1 和6 7 ，在1 2 、压差 为o 2 m p a 的条件下对乳清进行超滤生产c g m p 2 4 1 。那海涛从乳清中采用超滤和 凝胶层析制备了比较纯的c g m p 2 5 】。乳清中含有大量的乳糖和灰分使分离纯化 比较困难，并且也可使超滤膜和凝胶很快的污染。 第8 页 西华大学硕士毕业论文 1 2 2 酶解法 酶解法是制备活性肽常用的方法，其关键就是选择合适的酶和确定合适的 水解条件。c g m p 是切断k 酪蛋白的第1 0 5 、1 0 6 位的p h e m e t 键而得到的亲水 片断，并且c g m p 中不含芳香族氨基酸。根据这些特点用于制备c g m p 的酶要 具有专一性切割芳香族氨基形成的肽键，并且很少作用于其它氨基酸形成的肽 键。我们常用的蛋白酶中只有凝乳酶( 皱胃酶) 、胃蛋白酶和胰凝乳蛋白酶符合 此要求。 凝乳酶是一种羧基蛋白酶，属于天冬氨酸家族的蛋白酶。传统的凝乳酶即 皱胃酶是从小牛犊的胃里提取得，随着小牛的不断成长，它的分泌降低而胃蛋 白分泌增加。凝乳酶和胃蛋白酶一样有广泛的酶作用位点，但它能专一性地切 割k 一酪蛋白的第1 0 5 、1 0 6 位的p h e m e t 键，且最适p h 为5 o 5 5 ，在天然f f l p h 6 7 时凝乳酶仍保持足够活力【4 】。干酪的制作就是应用了凝乳酶能专一性的切割k 酪蛋白的第1 0 5 、1 0 6 位的p h e m e t 键。可以使牛乳凝结的蛋白酶很多，但是大多 数不适合制作干酪，因为它们的牛乳凝结活力太强，导致蛋白过度水解，致使 干酪得率下降，蛋白质过度水解或者非特异水解会改变干酪的风味( 产生苦味) 和质构缺陷。p i o t rm i n k i e w i c zc h a r l e sj s l a n g e n 等就是利用凝乳酶水解k 酪蛋 白制备c g m p ，再利用反向高效液相、核磁共振和质谱分离纯化并分析了各种 c g m p 的特性【2 6 1 。在使用酪蛋白作为底物制备c g m p 时，由于酪蛋白在酸性条 件下溶解性不好，只有先把其溶于碱溶液再调为合适的p h ( 凝乳酶最j 画_ p h 为 5 0 - - - 5 5 ，在p h 6 7 时凝乳酶仍保持足够活力) ，使用凝乳酶在调节底物溶液的 p h 时不经过酪蛋白的等电点4 6 ，这使得底物溶液配制比较容易，还有凝乳酶能 专一性地切割k 酪蛋白的第1 0 5 、1 0 6 位的p h e m e t 键，这使得以后的分离纯化 比较容易。这些特点使得凝乳酶成为制备c g m p 的最佳选择。 胃蛋白酶是一种酸性蛋白酶，属于天冬氨酸家族蛋白酶。它的底物特异性 较低可催化多种肽键的水解，但优先作用于由芳香族氨基酸、组氨酸、缬氨酸 和丙氨酸残基等形成的肽键。水解后的产物除少数氨基酸外，主要是肽类【27 1 。 它有两个最适p h 值，一是在p h = 2 0 ，另一个是p h = 3 5 。刘剑虹等用胃蛋白酶在 p h 2 5 、4 0 下酶解酪蛋白制备c g m p ，并用分光光度法测其酶解液中c g m p 的 纯度，结果得到用胃蛋白酶酶解酪蛋白得到的c g m p