（食品科学专业论文）“米邦塔”仙人掌多糖的提取与纯化研究.pdf

“米邦塔”仙人掌多糖的提取与纯化研究 摘要 仙人掌是指仙人掌科的所有植物，常见的有仙人掌、仙人球和 仙人柱。仙人掌不仅是一种食物资源，也是一种宝贵的药材，己广 泛用于治疗糖尿病、肥胖病、烫伤等病症。1 9 9 7 年，我国农业部优 质农产品开发服务中心从墨西哥米邦塔地区引进“米邦塔”仙人掌 ( o p u n t i am i l p aa l t a ) ，经过适应性栽培和品种筛选，选育出优秀的 菜用仙人掌品种。食用仙人掌“米邦塔”的引进与推广为我国仙人 掌产业的发展带来了绝好的机遇。 本论文以食用仙人掌“米邦塔”为原料，主要研究了仙人掌多 糖的提取工艺，分离纯化工艺，理化性质及抗糖尿病等方面的内容。 实验采用热水提取乙醇沉淀法从仙人掌中提取多糖，对原料粉 碎颗粒大小，提取次数，提取时间、提取温度、料液比、p h 值，乙 醇浓度，乙醇体积，醇沉时间等进行单因素实验，结合正交实验设 计，优化筛选确立了最佳提取工艺条件，即原料粉碎颗粒大小4 0 6 0 目，提取2 次，提取温度7 0 、提取时间5 0 m i n 、料液比l ：3 0 、p h 值9 ，乙醇沉淀条件，乙醇浓度9 5 ，乙醇体积4 倍，4 h 。最终仙人 掌多糖的平均得率为8 5 3 。 粗多糖经过活性炭脱色，s e v a g 法除蛋白，再经透析后，得到纯 化后的粗多糖，测得了粗多糖的部分理化性质，发现多糖和少量蛋 白质组成，不含有淀粉、生物碱、甾体类物质。经不同浓度乙醇分 级，薄层色谱，大孔树脂分级等实验，得出粗多糖由三种多糖( 0 p a ： 0 p b ：0 p c ) 成分，其比例为：1 1 4 5 ：4 5 6 7 ：l 。经凝胶色谱分析， 得到粗多糖图谱，发现有5 个峰值，分子量范围从几千到上百万。 说明粗多糖是由一系列分子量不等的多糖混合组成分散性体系。 同时对仙人掌多糖生物活性进行了初步研究。本实验从仙人掌 提取出粗多糖，灌胃四氧嘧啶致糖尿病小鼠动物模型。按不同剂量， 每天灌胃一次，自由进食，经一周，二周分别观察和测空腹血糖值 后，发现仙人掌粗多糖能显著缓解糖尿病小鼠的多饮、多食、消瘦 症状，有明显的降血糖作用。降血糖活性仙人掌多糖的研究为糖尿病 的防治提供了一种新颖、安全、可靠的途径。目前关于仙人掌防治 糖尿病活性成分的探讨及防治机理的研究还处于起步阶段，有关活 性成分的确切分子结构及防治机理尚在研究之中。 关键词：仙人掌多糖，提取，纯化，糖尿病，降血糖 r e s e a r c ho ne x t r a c t i o na n d p u r i f i c a t i o no fp o l y s a c c h a r i d e s f r o 。mo p u n t i am i l p a a l t a a b s t r a c t o p u n t i am i l l i st h ec a t e g o r yn a m eo fa l lk i n d so fc a c t u s ，i n c l u d i n g p a l m ，b a l la n dp i l l a r i ti sn o to n l yak i n do ff o o dr e s o u r c e ，b u ta l s oa k i n do fv a l u a b l em e d i c i n a lm a t e r i a l s i th a se x t e n s i v e l yu s e dt oc u r e d i a b e t e sm e l l i t u s ，o b e s i t y ，s c a l da n db u r n s i n1 9 9 7 ，t h ed e v e l o p i n ga n d s e r v i c eo fh i g hg r a n da g r i c u l t u r a lp r o d u c t sc e n t r eo f t h em i n i s t r yo f a g r i c u l t u r ei n t r o d u c e do p u n t i am i 勿口a l t af r o mm e x i c ot oc h i n a a f t e r a d a p t a b l ec u l t i v a t i n ga n ds c r e e n i n gb yv a r i e t i e s ，ak i n do fe x c e l l e n t v e g e t a b l eo p u n t i aw a sp r o d u c e d ，w h i c hb r o u g h ta b o u tag o o dc h a n c et o d e v e l o pc h i n e s eo p u n t i ai n d u s t r i a l t h i s p a p e r i s m a i n l y d i s c u s s e da b o u t t e c h n i q u e o f e x t r a c t i n g o p u n t i ap o l y s a c c h a r i d e s f r o m o p u n t i am i l p aa l t a ，t h ep u r i f y i n g t e c h n i q u e ，t h ep h y s i c a la n dc h e m i c a lp r o p e r t i e so fp o l y s a c c h a r i d e s ，a n d i t sf u n c t i o n si na n t i d i a b e t e sm e l l i t u s i n t h e e x p e r i m e n t ，o p u n t i ap o l y s a c c h a r i d e s i se x t r a c t e d b y h o t w a t e rd i g e s t i o n ，a n dd e p o s i t e db ye t h a n 0 1 a f t e rt h es i n g l ef a c t o r e x p e r i m e n t sa n do r t h o g o n a le x p e r i m e n t sa g a i n s tm a t e r i a lp a r t i a ls i z e ， e x t r a c tt i m e s ，t i m e ，t e m p e r a t u r e ，p h ，f e e dl i q u i dp r o p o r t i o n ，e t h a n o l c o n c e n t r a t i o n ，v o l u m ea n dd e p o s i tt i m e ，t h e b e s t t e c h n i q u e w a s e s t a b l i s h e d ，w h i c hw a s4 0 - 6 0s c r e e nm e s ho fm a t e r i a lp a r t i a ls i z e ， e x t r a c tt w o t i m e s ，7 0 ，5 0 m i n ，p h 9 ，e t h a n o l c o n c e n t r a t i o n9 5 ， v o l u m e4t i m e sa n dd e p o s i t4h o u r s a tl a s t ，t h ee x t r a c tr a t eo fo p u n t i a p o l y s a c c h a r i d e si s8 5 3 t h e n ，t h ec r u d ep o l y s a c c h a r i d e s i sd i s c o l o r e db ya c t i v ec a r b o n ， 1 1 1 r e m o v e d p r o t e i nb y s e v a gw a y ，a n dd i a l y z e d b y s e m i p e r m e a b l e m e m b r a n e a p o r t i o no fp h y s i c a la n dc h e m i c a lp r o p e r t i e so ft h ep u r i f i e d p o l y s a c c h a r i d e sw a sa n a l y z e d a n dt h e r ei sas m a l la m o u n to fp r o t e i n ， b e s i d e sp o l y s a c c h a r i d e s h o w e v e r ，t h e r ea r en o ts t a r c h ，a l k a l o i d ，a n d s t e r o i d t h ep u r i f i e dp o l y s a c c h a r i d e si sc l a s s i f i e db yas e r i e so fe t h a n o l w i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n ，t h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y ，m a c r o p o r o u s r e s i n a n dt h r e ek i n d so fp o l y s a c c h a r i d e sa r ed i s c o v e r e d ，w h i c ha r e n a m e do p a ，o p b ，o p c t h e i rr a t i oi s1 1 4 5 ：4 5 6 7 ：1 a f t e ra n a l y z e db y g e lc h r o m a t o g r a p h y ，ac o l l e c t i o no fi l l u s t r a t i v ep l a t e si so b t a i n e d t h e r e a r ef i v ep e a kv a l u e s ，w h i c hm e a n st h ep o l y s a c c h a r i d e si sas y s t e m c o m p o s e db y as e r i e so f p o l y s a c c h a r i d e s i t s m o l e c u l a r w e i g h t d i s t r i b u t e sf r o ms e v e r a lt h o u s a n d st om o r et h a nam i l l i o n a tl a s t ，t h eb i o a c t i v i t yo fp o l y s a c c h a r i d e si ss t u d i e dp r e l i m i n a r y t h ep o l y s a c c h a r i d e si s i n j e c t e di n t os t o m a c ho fm i c e ，w h i c hh a v e d i a b e t e sm e l l i t u sc a u s e db ya l l o x a n a f t e ro b s e r v a t i o na n dd e t e c t i o n a b o u tb l o o d s u g a r ，i t i sd i s c o v e r e dt h a tt h e p o l y s a c c h a r i d e s h a s h y p o g l y c e m i cf u n c t i o n i tc o u l dr e l i e v em a r k e d l yt h a tt h em i c ew i t h d i a b e t e sm e l l i t u sd r i n km o r e ，e a tm o r e ，b u tb e c o m et h i n d i a b e t e s m e l l i t u si sak i n do fm e t a b o l i cd i s e a s e so fi n t e r n a ls e c r e t i o n t h es t u d y o f h y p o g l y c e m i c b i o a c t i v e p o l y s a c c h a r i d e sp r o v i d e s an e w ，s a f e ， d e p e n d a b l ew a yt op r e v e n ta n dc u r ed i a b e t e sm e l l i t u s h o w e v e rt h e m e c h a n i z a t i o ni ss t i l lu n d e rp r i m a r yr e s e a r e h k e yw o r d s ：o p u n t i a p o l y s a c c h a r i d e s ，e x t r a c t i o n ，p u r i f i c a t i o n ， d i a b e t e sm e ! l i t u s ，h y p o g l y c e m i c i v “米邦塔”仙人掌多糖的提取与纯化研究 第一章绪论 1 1 植物多糖的研究现状 多糖又称多聚糖( p o l y s a c c h a r i d e s ) ，由1 0 个以上单糖通过糖苷键连接而成，是一 种结构极其复杂的大分子，其相对分子质量一般为数万甚至达数百万。多糖可以分为同 质多糖和杂多糖两种，只有一种单糖组成的多糖，称为同质多糖：由两种以上单糖组成的 多糖称为杂多糖。按照糖单元的排列，又可以分为直链和支链形成的多糖。目前己发现 的多糖有几百种，按其来源不同，可分为动物多糖、植物多糖、微生物多糖( 细菌和真菌) 和海藻多糖。多糖是生命机体的重要组成分与维持生命所必须的结构材料1 。 近几十年来，由于相关研究包括膜的化学功能、免疫物质的研究以及对新药物资源 的寻找等，人们发现糖类在生物体中不仅是作为能量资源或结构材料，更重要的是它参 与了生命科学中细胞的各种活动，具有多种多样的生物学功能，如抗肿瘤、抗炎、抗凝 血、抗病毒、抗放射、降血糖、降血脂等活性。随着分子生物学与细胞生物学的发展以 及多糖的分离、纯化及结构分析等生化手段的长足进步，多糖的生理活性、化学结构及 构效关系成为多糖研究的前沿阵地，有人夸大性预言，今后数十年将是多糖的时代1 4 1 。 世界各国十分重视糖类的研究。其中以日本、美国、德国、俄罗斯等国处于领先地 位。日本学者在常规化学方法的基础上，大量引进现代分子生物学技术与手段，加强了 对中药多糖活性决定簇的化学结构与功能关系的研究，在柴胡、当归等中药的研究方面 有了一定的突破，1 9 8 9 年日本创刊了糖科学与糖工程动态杂志，1 9 9 1 年实施“糖工 程前沿计划”。我国对多糖的研究起步比较晚，但在研究糖类的作用机理时，紧密与中医 药理论相结合，进展甚快。近2 0 年来，分别从灵芝、黑木耳、茯苓、金针菇、魔芋、山 药、芦荟、香菇、银杏、人参、黄芪、枸杞、柴胡、当归、冬虫夏草、地黄等中分离出 活性多糖。然而与国外相比，我国仍有一定的差距，积累的临床资料仍很缺乏，大部分 多糖尚处于实验阶段，因此有必要开展多糖的分离纯化、生物活性、化学组成和结构分 析等方面的研究工作，并对其进行化学修饰，研究多糖构效关系，寻找活性高，特别对 肿瘤、艾滋病有效的多糖i 删。本论文是从仙人掌( o p u n t i a ) 中提取分离出仙人掌多糖，对 其理化性质、及生物活性进行一系列的研究。因此在综述部分将主要介绍植物多糖及仙 人掌的研究现状。 1 2 植物多糖提取分离纯化 1 2 1 多糖的提取 植物多糖是极性大分子化合物，提取方法主要有水提和碱提两种。一般认为中等相 陕西科技大学硕士学位论文 对分子质量多糖活性较强，增加多糖的溶解度有利于提高其生理活性。多糖的提取多采 用热水和稀碱溶液，避免强酸、强碱的作用，以免造成糖苷键的断裂及其构象的变化。 植物多糖的提取因植物的不同部位而有所区别，一般将植物组织或器官粉碎，用7 0 一i 0 0 热水浸提卜2 小时，重复2 3 次，过滤分离，滤液经浓缩，乙醇沉淀，分离沉淀，干 燥后，得粗多糖m ，j 。 1 2 2 脱蛋白 脱蛋白较好的方法是s e v a g 法，用氯仿、戊醇( 或丁醇) 按4 ：l ( 或5 ：1 ) 比例混合后， 加至样品中振摇，样品中的蛋白质与混合液形成凝胶，可用离心法除去，用蛋白质水解 酶( 如胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶等) 使样品中蛋白部分降解后，再 用s e v a g 法则效果更好一些。某些多糖因含有酸、碱性基团，易与蛋白相互作用，也较 难脱除。此外，还有三氯乙酸，盐酸等脱蛋白法1 1 2 l 。 j 1 2 3 脱色 对于植物来源的多糖，因含有酚型化合物致使其颜色较深，色素大多呈负性离子， 不能用活性炭吸收剂脱色，可用弱碱性树脂d e a e 纤维素或d u o l i t ea _ 7 来吸附色素；若 糖与色素是结合的，易被d e a e 纤维素吸附，不能被水洗脱，这类色素可以浓氨水进行氧 化脱色1 1 3 l 。 1 2 4 多糖的纯化 作为多糖，还需将混合多糖分离为单一多糖，纯化方法有部分沉淀法、金属络合法、 季胺盐沉淀法、甲醇或乙醇分级沉淀法和制备性区域电泳等。但大多数采用d e a e 一纤维 素、d e a e 一凝胶及其它凝胶柱层析法进行纯化，国外采用l k b 柱层析系统q 。 分部沉淀法：根据不同多糖在不同浓度的低级醇、酮中具有不同溶解度的性质，由 小而大按比例加入甲醇或乙醇或丙酮进行分部沉淀。 盐析法：不同多糖在不同盐浓度中溶解度不同。常用的盐析剂有氯化钠、氧化钾、 硫酸铵等，以硫酸铵最佳： 金属络合物法：多糖能与铜、钡、钙、铅离子形成络合物而沉淀。常用的络合剂有 斐林试剂、氯化铜、氢氧化钡和醋酸铅等。得到的络合物沉淀用5 ( v v ) 无机酸乙醇液 或硫化氢分解。 季胺盐沉淀法：季胺氢氧化物是一类乳化剂，与酸性多糖形成不溶性化合物，常用 于分离酸性多糖。常用的季胺盐是十六烷基三甲基铵的溴化物( c a t b ) 及其碱( c t a o h ) 或 十六烷基吡啶( c p c ) 。一般地说，酸性强或相对分子质量大的多糖首先沉淀出来，所以控 “米邦塔”仙人掌多耱的提取与纯化研究 制季胺盐的浓度能分离各种不同的酸性多糖。 离子交换柱层析法：常用的阴离子交换剂为d e a e - 纤维素、e c t e o l a 一纤维素、阳离 子交换剂有c m 纤维素、s e 纤维素等。此法适合于分离各种酸性、中性多糖及粘多糖。 凝胶柱层析法：根据多糖分子大小和形状不同而达到分离目的。常用的凝胶有葡聚 糖凝胶( s e p h a d e x ) 、琼脂糖凝胶( s e p h a r o s e ) 及d e a e s e p h a d e x 。此法不适合于粘多糖的 分离。展开剂为各种浓度的盐溶液及缓冲液，离子浓度最好不低于0 0 2 m o l l 。 制各性区域电泳：不同的多糖在电场的作用下按其分子大小、形状及所带电荷的不 同而达到分离。 超过滤：不同的超过滤膜排阻相对分子质量和形状不同的多糖通过，因而达到分离。 亲和层析：如涂有聚芳香化合物载体对分离某些多糖如凝集素很有价值。 制备性高压液相色谱( h p l c ) ：h p l c 是在经典柱层析原理的基础上，采用分布窄、粒 径细的颗粒作载体，将流动相以高压注入柱内，样品组分迅速而不断地在流动相和固定 相之间进行反复多次平衡分配，彼此分离，并向下迁移，迁移速率依赖于各组分与固定 相之间的相对亲和力。 1 3 多糖纯度的鉴定及相对分子质量测定 1 3 1 多糖纯度的鉴定 多糖的纯度标准不能用通常小分子化合物的纯度标准来衡量，即使是一种多糖纯品， 其微观也是不均一的。纯度鉴定通常有四种方法：比旋度法，超离心法，高压电泳法及 凝胶过滤法。前三种方法误差较大，所以必须要有二种以上方法的结果才能肯定其均一 性。目前最常用的且较正确的方法是h p l c 方法l l i 。 比旋度法：不同的多糖具有不同的比旋度，同时在不同浓度的乙醇中具有不同溶解 度。所以如多糖水溶液经不同浓度的乙醇沉淀所得沉淀物，具有相同比旋度，则证明该 多糖为均一组分。 超离心法：微粒在离心力场中沉降的速度与微粒的密度、大小与形状有关。如果某 一多糖在离心力场作用下形状单一区带，说明微粒具有相同沉降速度，则表明其分子的 密度大小和形状相似。 高压电泳法：多糖在电场作用下，按其分子大小、形状及其所带电荷不同而移动不 同的距离。位阻因素决定了不同多糖与硼砂形成不同的复合物，在电场作用下，多糖的 相对迁移率常因复合物的不同而不同。 凝胶过滤法：由于凝胶具有一定孔径大小，故不同形状和大小的多糖分子在凝胶层 析柱中移动速度亦不同，较大分子移动得较快，较小分子移动得较慢，流出液经示差检 陕西科技大学硕士学位论文 测仪检测，如只有一个对称的峰，则表明为均一组分。凝胶层析法可分为常压柱层析及 高压柱层析( 即h p l c ) 二种。 1 3 2 相对分子质量测定 多糖的相对分子质量只代表一定分子质量范围的平均分布。即使是同一多糖，用不 同的方法会测得不同的相对分子质量。常用测定相对分子质量的方法有渗透法、超离心 法、高压电泳法、粘度法、超过滤法、还原末端法及聚合度法、光散射法等，这些方法 比较麻烦且误差很大。渗透压、蒸气压渗透计法和端基法测得分子量具有数均分子量( m n ) 性质，用光散法测得分子量具有重均分子量( 脚) 性质。高效液相色谱具有快速、高分 辨率和重现性好等优点，广泛应用于多糖的纯度和相对分子质量测定。最简便方法的是 凝胶过滤法。根据在凝胶柱上不同分子量的多糖与洗脱体积成一定关系的特性，先用己 知相对分子质量的d e x t r a n 系列标准葡聚糖制作标准曲线，然后将样品用流动相配成一 定浓度上样，由样品的洗脱体积从曲线中求得相对分子质量。但每次缓冲液均需相同， 否则会产生较大的误差1 1 】。 1 4 植物多糖的结构研究 1 4 1 植物多糖的结构分类 植物多糖的结构分类沿用了对蛋白质和核酸的分类方法，可分为一级、二级、三级 和四级结构1 1 i 。 二 一级结构包括糖基的组成、糖基排列顺序、相邻糖基的连接方式、异头物构型以及 糖链有无分支、分支的位置与长短等。与蛋白质和核酸相比，糖的一级结构非常复杂。 另外，通过硫酸化、乙酰化、磷酸化、甲基化等衍生形式还可形成糖衍生物，这就更加 剧了糖一级结构的复杂性。 二级结构指多糖骨架链间以氢键结合所形成的各种聚合体，只关系到多糖分子中主 链的构象，不涉及侧链的空间排布。在多糖链中，糖环的几何形状几乎是硬性的，各个 单糖残基绕糖苷键旋转而相对定位，可决定多糖的整体构象。通常糖苷键有两个可旋转 的主链二面角：巾、1 l f ，两个单糖若为卜6 连接，则还有第三个可旋转的二面角( ) ，解 决寡糖构象的关键在于确定巾、1 i r 、o 取值。但是，它们的取值受相邻糖环之间的空间 阻碍和相邻糖残基间的非共价键相互作用的严格限制。因此，多糖的二级结构形式主要 依赖一级结构的排布。 多糖链一级结构的重复顺序，由于糖单位的羟基、羧基、氨基以及硫酸基之间的非 共价相互作用，导致有序的二级结构空间有规则而粗大的构象，即是多糖链的三级结构。 d “米邦塔”仙人掌多耱的提取与纯化研究 多糖四级结构指多聚链间非共价链结合形成的聚集体。多糖链的聚集作用可在相同 的分子间进行，如纤维素链问的氢键相互作用，也可在不同的多糖链间进行，如黄杆菌 聚糖多糖链与半乳甘露聚糖骨架中未取代区域之间的相互作用。 综上所述，多糖的结构形态是各个单糖残基在空间相对定位的综合。解析这些定位， 对于理解多糖的生物学功能有极深刻的意义。 1 4 2 多糖的结构分析 多糖的结构测定，如果是同质多糖，需确定单糖间连接位置、糖苷键构型以及有无 分支和分支点的位置、分支链的长短及糖的构型等。杂多糖则需要测定单糖组成、各单 糖比例以及不同单糖间的连接l ”i 多糖结构分析有化学方法和仪器方法。常用化学方法的有水解法、完全酸水解 部 分酸水解、乙酰解、甲醇解、高碘酸氧化法、s m i t h 降解、甲基化反应和特殊基团的鉴 定及酶学方法。 常用的仪器分析法有紫外分光光度法( u v ) 、红外光谱法( i r ) 和拉曼光谱法、气相色 谱( c c ) 和液相色谱( l c ) 、质谱( m s ) 、核磁共振( n m r ) 等。 1 5 植物多糖的生理活性及其构效关系 1 5 1 植物多糖的生理活性 多糖作为药物进行研究始于2 0 世纪4 0 年代，日本从6 0 年代起开始研究担子菌多糖 的药物活性，并开发出一些有名的药物。中国对多搪的研究始于7 0 年代，由于我国有非 常丰富的中草药资源和雄厚的传统中医理论，近年来对植物多糖的研究发展很快，研究 水平日益提高。至今己报道了一百多种具有免疫功能、抗肿瘤、抗病毒、降血糖、延缓 衰老、抗感染等多种生理活性的中药多糖，有的己在临床上被用于肿瘤、肝炎、心血管 疾病的辅助治疗和康复1 1 6 】。 1 5 2 多糖的构效关系 多糖的组成和糖苷键类型：由植物中提取的抗肿瘤活性多糖一般由半乳糖或半乳糖 醛酸等组成，如t l i e nj e 等从紫松果菊( e c h i n c a n ap u r p u r e a ) 分离的由阿拉伯糖及半乳、 糖组成的多糖，可促进巨噬细胞产生肿瘤细胞坏死因子。水溶性d 一葡聚糖有抗肿瘤作用， 尤其是直链、无过长支链、不易被体内d 一葡聚糖酶水解的多糖具有明确的抗肿瘤活性 l i 。 目前认为以( 1 3 ) 一b d - 葡聚糖和以( 1 4 ) 一b d - 葡聚糖占优势的多糖具有明显的抗肿 瘤活性，以n d - 葡聚糖为主的多糖也有抗肿瘤作用。 陕西科技大学硕士学位论文 硫酸化多糖：实验证明，硫酸盐阴离子对硫酸化多糖抑制h i v 是必须的离子结构。 如相对分子质量小的牛膝多糖有增强免疫作用，但无抗病毒的活性，引入一定量的硫酸 基团后，就有了较强的抗乙型肝炎病毒h b s a g 和h b e a g 的活性。 高级结构：多糖的高级结构与功能的关系至今还不十分清楚，但科学家已肯定高级 结构对功能的影响比一级结构还重要。抗肿瘤活性研究中发现，相对分子质量5 万以上 具有三级结构的多糖才有抗肿瘤活性。主链结构同是b - 1 ，3 ，又有6 - 1 ，6 侧链的葡 聚糖，有些具有强的活性，而有些却无活性。如茯苓多糖( p a c h y m a n ) ，化学结构虽与香菇 多糖相似，但无抗肿瘤活性，若将其中的一些b - 1 ，6 侧链用类似高碘酸氧化或s m i t h 降解法将其切去，结果获得了具有强烈抗肿瘤活性的多糖，x 一射线分析表明此时已形成 三级结构1 1 8 1 。 溶解度：多糖的活性与溶解度有重要关系，水溶性d 一葡聚糖有抗肿瘤活性，非水溶 性多糖，如糖原、淀粉则无，这与其过长、易被酶解的支链有关。不溶于水的b ( 1 3 ) 一d - 葡聚糖经过部分按甲基化后，水溶性提高，其抗肿瘤的能力也相应提高。 其他因素：相对分子质量过大或过小，多糖活性都不高，一般中等相对分子质量的 多糖活性最高；多糖的黏度也会影响实际使用，如多糖黏度太大，可通过部分降解减少 其黏度，但基本结构不变1 1 9 l 。 糖分子中的游离羟基对活性也很重要，y a m a d a 发现将车前子多糖过氧化后，其活性 下降甚至消失，但当氧化物还原成多羟基后又显示出活性。 多糖部分乙酰化后而具有抗肿瘤活性，比如，地衣多糖乙酰基的引入，导致多糖分 子方位改变，羟基暴露，于是溶解性增加，表现出抗肿瘤活性1 1 9 】。 多糖羟基化后对活性也有影响，如纤维素无活性，但。一甲基纤维素和o - 羧基纤维素 有抗肿瘤活性：茯苓多糖的羧甲基化、羧乙基化衍生物对i c r - j c le r h l i c h 肿瘤有强的 抑制作用1 1 9 l 。 1 6 仙人掌概述 仙人掌类植物是仙人掌科所有种类的统称，常见的有仙人掌、仙人球和仙人柱。全 世界约有7 0 - 1 1 0 个属2 0 0 0 余种。仙人掌是仙人掌科( c a c t a c e a e ) 的一个主要的属，仙人 掌属( o p u n t i a ) 植物系仙人掌科双子叶植物。多年生，茎肉质，常有刺或刺毛，叶常退化， 花多大型、两性，果实通常肉质浆果状，种子无胚乳。仙人掌在1 8 c 以上开始生长，最 适温度为2 0 一3 0 ，为热带、亚热带植物。多生长于美洲及墨西哥干旱、沙漠或半沙漠 地区，以墨西哥分布最多，享有“仙人掌王国”之美称。我国云南、贵州、四川、广东、 海南等省都分布有野生仙人掌，其中，作为药用的种主要有仙人掌( o d i l l e n i i ) 、绿仙 人掌( 0 m o n a c a n t h a ) 、印度仙人掌( 0 f i c u s i n d i c a ) ，主要分布在我国南部沿海的沙滩 “米邦塔”仙人掌多糖的提取与纯化研究 上，其繁殖力及环境适应能力都很强i z o 。 在国外，仙人掌不仅是一种宝贵的药材，而且也是一种食物资源。作为药材，己广 泛用于治疗糖尿病、肥胖病、烫伤等病症，在墨西哥己开发生产出治疗糖尿病的片剂和 胶囊。而作为食物资源，在墨西哥，仙人掌属、s t e n o c e r e u s 和量天尺属的一些品种， 长期以来被们作为蔬菜、水果栽培，或用于酿酒、制成罐头，提取食用色素、果胶等。 口前，在南美洲、欧洲的一些国家，种植食用仙人掌己形成较大规模产业，食用仙人掌 已经是平常百姓的家常菜，甚至有人认为仙人掌可望成为新世纪人类重要的食物来源之 一。其中，仙人掌产业最发达的国家是墨西哥。墨西哥的仙人掌种植，经历了家园种植、 人工驯化、商品性生产阶段，现己进入系统化、规模化开发。自1 9 4 5 年开始，该国农业 专家在成功培育出食用仙人掌后，又将其分化成菜用( 有墨西哥米邦塔、墨西哥金字塔等 品种) 、果用( 有墨西哥皇后等品种) 、药用、饲料用几大类。口前，墨西哥食用仙人掌栽 培面积、产量均为世界第l 位，每年对欧洲诸国的出口量达1 5 万吨。栽植、开发仙人掌 己成为墨西哥和其他拉美国家干旱地区发展农业生产的重要途径。墨西哥政府越来越重 视对仙人掌类植物资源的保护、研究和开发，不仅大力扶持仙人掌的种植与加上业j 而 且建立收购中心，协助开拓市场。发展仙人掌产业，己为墨西哥带来了巨大的经济效益， 也必将继续为他们创造出更多的财富啪l 。 我国民间对仙人掌的利用虽也很早，但由于资源的限制和研究开发的滞后，开发水 平与国外相比还有很大差距，目前只有少数几家企业生产仙人掌药品和化妆品。1 9 9 7 年， 我国农业部优质农产品开发服务中心从墨西哥米邦塔地区引进“米邦塔”仙人掌 ( o p u n t i am i l p aa l t a ) ，经过适应性栽培和品种筛选，选育出优秀的莱用仙人掌品种。 1 9 9 9 年7 月1 0 日农业部优质农产品开发服务中心公布了对“米邦塔”食用仙人掌的定 名，以及引进与试种的报告。为了米邦塔食用仙人掌的推广和应用，2 0 0 1 年4 月，中国 农业国际交流协会在北京成立了米邦塔食用仙人掌协作委员会。食用仙人掌“米邦塔” 的引进与推广为我国仙人掌产业的发展带来了绝好的机遇。首先是通过食用仙人掌的大 规模宣传，使人们对仙人掌有了全新的认识和了解，并形成了一定的需求基础；其次是 种植面积不断扩大，为仙人掌加工提供了原料保障：再次是种植企业、科研系统及部分 相关生产企业都开始探索和研究仙人掌的产品开发，并已取得了一定的成果。为仙人掌 产业的整体发展奠定了基础。“米邦塔”食用仙人掌的原名为：o p u n t i am i l p aa l t a ，而 真正的学名却是o p u n t i af i c u s - i n d i c a ( 可意译为印第安无花果) 。因为该品种产自于 墨西哥首都附近的米邦塔地区，因此，人们习惯上将它称“米邦塔食用仙人掌”。这是 墨西哥固有的称法，在引进我国后，农业部也沿用了这个称法。 陕西科技大学硕士学位论文 1 7 仙人掌属植物的化学成分 “米邦塔”仙人掌为仙人掌科仙人掌属植物，常绿灌木，高可达2 3 米。茎基部木 质化，上部有分枝。叶掌状，扁平，叶最长进可长至1 0 - 4 0 c m ，宽1 0 1 5 c m ，肉质，绿色， 有短刺或基本上无刺。据测：每1 0 0 克含蛋白质0 3 克，粗纤维1 克，磷l o 毫克，核黄 素0 0 3 克，尼克酸0 3 克，抗坏血酸1 8 毫克，并含有大量黄酮类物质，多糖，维生素 和矿物质。此外，还含有多种植物化学物质( 又称植物营养素，学名为p h y t o c h e m i c a l s ) 。 营养成份远比其它蔬菜高。嫩叶、老茎、果实、汁液均可利用。具有行气活血，清热解 毒，清炎、抗癌、抗衰老、降血糖、降血脂和美容作用。 1 7 1 多糖成分 粘液质细胞和粘液质是仙人掌植物的特征之一。有关仙人掌属植物粘液质的化学研 究也多见报道，研究最早最多的是0 f u l g i d ae n g e l m 的粘液质，最初的研究表明它是 一种酸性多糖，主要含有旷半乳糖、l - 阿拉伯糖、d _ 半乳糖醛酸。进一步的结构研究则 揭示了它是以b ( 1 3 ) 一连接的半乳糖为主链，在c 6 上有吡喃型的d - 半乳糖醛酸、d 一 半乳糖、d - 木糖、l 一鼠李糖以及呋喃型的l 一阿拉伯糖。对0 d i l l e n i i 研究表明，其粘 液质是一种阿拉伯半乳聚糖，主链为b ( 1 4 ) 一连接的半乳糖，侧链为( 1 4 ，5 ) 连接的 阿拉伯糖。而0 v u l g a r i s 粘液质则是由葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖等组成的多糖。 对0 m e g a c a n t h a 研究表明，其主链为( 1 3 ) 、( 1 4 ) 及( 1 6 ) 连接的吡喃型半乳糖，支 链则含阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖和葡萄糖醛酸。0 m o n a c a n t h a 和 0 n o p a l e a c o c b e n i i i i f e r a 中的粘液质与0 f u l g i d a 较相似，均为含阿拉伯糖、半乳糖、 鼠李糖、木糖、半乳糖醛酸的酸性多糖。类似成分也存在于0 a u r a n t i a c a 和 0 b r a s i l i e n s i s 的粘液质中。关于0 f i c u s i n d i c am i l l 研究的结果不尽相同，由a m i n 等进行的实验表明其粘液质为中性多糖，包括阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖、木糖等糖单 元，并不含糖醛酸。相反，0 f i c u s i n d i c a 的一种无刺栽培变种的多糖中既含有山葡聚 糖和糖蛋白组成的中性部分，又有由阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖、木糖、半乳糖醛酸构 成的酸性部分。后来t r a c h t e n b e r g 等的研究支持了含酸性多糖的结果，该粘液质含糖醛 酸1 0 ，分子量为4 3 1 0 6 ，在相对湿度为1 0 0 的条件下，其游离形态与钙盐结合形态 均能够吸收水分达到其干重的1 7 5 ，并且吸水能力受细胞内的p h 、阳离子浓度以及糖的 存在等因素的影响 z l - z s 。 1 7 2 生物碱 生物碱( a l k a l o i d ) 是生物体内一类含氮有机化合物的总称，它有类似于碱的性质， 能和酸结合成盐。多数生物碱有比较复杂的环状结构，氮原子结合在环内( 也有少数例 “米邦塔”仙人掌多糖的提取与纯化研究 外) ，具有光学活性。这类化合物有特殊和显著的生理作用，是中草药中重要的化学成分。 生物碱多数为无色结晶，味苦，有旋光性，多可溶于有机溶剂，如乙醇、氯仿等。生物 碱与酸生成的盐，能溶于水。 美国的普渡大学对仙人掌生物碱的研究上作较多，至今己发表论文5 0 余篇。其中以 mc l a u g h l i n ，j e r r yl 教授的上作最为突出。s u n i b h o n dp u m m a n g u r a 报导了十二种仙 人掌植物的生物碱含量。其中b a h a m a s ，a m y r i s e l e m i t e r a 是几种有医用价值的种属，对 其进行了重点研究，从中分离出香豆素、d e h y d r o g e i j e r i n 、大麦芽碱、n 一甲基酪胺、酪 胺( t y r a m i n e ) 以及n 一甲基一3 ，4 一二甲氧基一b 一苯乙胺，并进行了结构鉴定1 2 6 l 。 就m m i c r o c a r p a 和m t e t r a n c i s t r a 仙人掌而言，在植株的不同部位( 如结节、皮层、 脉管组织和根部) 的各种生物碱含量也不相同，m j k n o x 等人报导了这方面的结果鲫。 1 7 3 黄酮类化合物 最早关于这方面的研究是在1 9 5 1 年，p a r i s 等从0 v u l g a r i sm i l l 花中分离出一种 黄色针晶，定名为仙人掌黄酮苷( o p u n t i a lf l a v o n o s i d e ) ，是一种易溶于热水的葡萄糖 苷。一其药理实验表明：它能抑制大鼠离体肠管蠕动，也具有一定的降压作用。后来对该 属植物黄酮成分的研究也主要集中在花上。人们从0 d i l l e n i ih a w 中分离得到了异鼠 李黄素一3 一葡萄糖苷，槲皮素( q u e r c e t i n ) 及异槲皮苷( i s o q u e r c i t r i n ) 。从 0 f i c u s i n d i c am i l l 的花中获得异鼠李黄素一3 一葡萄糖苷。而在对0 1 i n d h e i m e r i e n g e l m 花进行研究中又分离出了金丝桃苷( h y p e r i n ) ，即：槲皮素一3 一半乳糖苷、异鼠李 黄素一3 一鼠李葡萄糖苷( n a r c i s s i n ) 及异鼠李黄素一3 一半乳糖苷。随后，c l a r k 等从多种仙 人掌属植物的花中得到山奈黄素一3 一半乳糖苷、山奈黄素一3 一葡萄糖苷、芦丁、槲皮素和 异鼠李黄素的3 一葡萄糖苷、3 一鼠李葡萄糖苷。法国学者指出，该属植物中黄酮类成分的 苷元多为3 一甲基槲皮素、3 一甲基山奈黄素、槲皮素、山奈黄素、异鼠李黄素等。从而可 看出，该属植物黄酮类成分在结构上非常相似，这在化学上证明了它们之间有较近的亲 缘关系【* 蚓。 1 7 4 果实中的色素成分 该属植物果实中色素主要有两种，即紫红色的b 一花青素( b e t a c y a n i n s ) 和黄色的甜 菜黄素( b e t a x a n t h i n ) 。这两种成分在果实生长的不同阶段相对含量不同，使果实呈现不 同的颜色。m i n a l e 及i m p e l l i z z e r 等从其果实水提物中得到甜菜苷和异甜菜苷，用离子 交换树脂法得到2 种甜菜黄素，梨果仙人掌黄质( i n d i c a x a n t h i n ) 和o p u n t i a x a n t h i n 。 a l a r d 从0 f i c u s - i n d i c a 中发现了一种b 一花青素( n e o b e t a n i n ) ；s t i n t z i n g 和b u t e r a 等采用高效液相色谱技术，从其中分离出5 种新的甜菜黄素，并指出，它们是含有丝氨 陕西科技大学硕士学位论文 酸、酪氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸的甜菜醛氨酸( b e t a l a m i ca c i d ) 合成的前体 1 。 1 7 5 甾体化合物的研究 在植物体内具有甾体结构成分的物质称为植物甾醇，它多以游离或与糖结合为甙的 形式存在于植物体内。天然甾醇大多是2 7 ，2 8 或2 9 碳原子的化合物。甾醇是生物膜的 重要组成部分。有些甾醇具有明显抗肿瘤、降血脂和抗菌作用。 仙人掌中含有甾醇。s a l t ，t h o m a sa 研究了8 种仙人掌甾醇含量。这8 种仙人掌是 e c h i n o p s i s t u b i fl o r a ，p e m s k i aa c u l e a t a ，h y l o c e m u s u n d a t u s ，n o t o c a c t a c e a e s c o p a ， e p i p h i l u m s p l ，s c h l u m b e r g e r ab r i d g e s i i ，o p u n t i ac o m o n du e n s i s ，和o h u m i f u s a ，其中以谷 甾醇含量最高，为总甾醇化合物的6 6 - 8 7 ，甲基胆甾醇占8 一3 3 ，豆甾醇占2 - 8 ， 胆甾醇( c h o l e s t e r 0 1 ) 在6 种仙人掌中含量 料液比 时间 温度。以所得最佳