（遗传学专业论文）蝴蝶兰原球茎诱导及辐射对原球茎增殖和分化的影响.pdf

摘要 本文以蝴蝶兰c r c - 2 0 9 品种为材料，采用离体培养和统计学分析的方法，研究了不 同灭菌时间、基本培养基种类、外源激素( 6 b a 、n a a ) 和营养添加物( 椰乳、香蕉 汁) 的种类与剂量对蝴蝶兰的花梗腋芽、试管苗的叶片、茎尖和根尖等外植体的原球茎 诱导率和增殖率的影响。建立了适宜蝴蝶兰花梗腋芽诱导的培养体系，筛选出了适宜不 同外植体诱导原球茎产生和增殖的培养基。这对于蝴蝶兰离体快繁生产工艺体系的建立 具有一定的参考价值。 其中。蝴蝶兰花梗腋芽诱导为营养芽的最适宜培养基为：花宝一号3 # l + 6 - b a 5 0 m g l + c m1 5 0 m l l + 蔗糖1 5 9 l + 活性炭0 i g l ，p h 5 4 ；蝴蝶兰叶片原球茎诱导的最适 培养基为花宝一号3 9 l + 6 - b a 5 o m g l + n a a 0 1 m g l + c m1 5 h n l l + 蔗糖1 5 9 ，l + 活性炭 o 1 9 l ，p h 5 4 ；蝴蝶兰叶片原球茎增殖的最适培养基为：花宝一号3 9 l + 6 b a 5 o m g ，l + n a ao 3 m g l + c m1 5 0 m l l + 活性炭o i # l ，p h 5 4 ；诱导原球茎最适合的外植体是无 菌苗的幼嫩叶片。 另外，本文还结合辐射诱变育种技术，对蝴蝶兰原球茎进行了1 5 1 2 0 c , y 剂量的 6 0 c a ) 吖射线处理，观察并分析了y 射线对蝴蝶兰原球茎存活率、增殖率和分化率的影响， 初步确定了6 0 c o 吖射线对蝴蝶兰原球茎的半致死剂量( l d = 5 0 - 6 8 g y ) ，为蝴蝶兰辐射 育种提供了重要的参考依据。 关键词：蝴蝶兰；花梗腋芽；叶片；原球茎；辐射 a b s t r a c t i nt h i ss t u d y , t h ee f f e c t so fd i f f e r e n tl e n g t ho ft i m eo fs t e r i l i z a t i o n , t h er e c i p eo fb a s i c m e d i u m , t h ec o n c o n w - , d i o no fc x o g 曲m 培h o r m o n e ( i e 6 b 气n a a ) a n dd i f f e r e n tk i n d sa n d d o s e so fn u t r i t i o n a la d d i t i v e s ( c o c o n u tm i l k , b a n a n aj u i c e ) o nt h ep r o t o c o r m - l i k eb o d i e s ( p l b s ) i n d u c t i o nr a t ea n dp r o l i f e r a t i o nr a t eo ff l o w e rs t a l kb u d s ，p l a n t l e t sl e a v e sa n dr o o t s h o o tt i p so fp h a l a e n o p s i sa p h r o d i t ee u l f l v a rg c - 2 0 9 b yu s i n gi nv i t r oc u l t i v a t i o na n d s t a t i s t i c a la n a l y s i sm e t h o d ac u l t u r es y s t e mw a se s t a b l i s h e dt 0i n d u c ef l o w e rs t a l kb u d so fp a p h r o d i t e as e r i a lo fc u l t u r em e d i aw a ss c r e e n e do u t , w h i c hw e r es u i t a b l ef o ri n d u c t i o na n d p r o l i f e r a t i o no fp a p h r o d i t ep l b sf r o md i f f e r e me x p l a n t s t i l i st e c h n i q u ec o u l db ev a l u a b l e t os o m ee x t e n tf o re s t a b l i s h m e n to f i nv i t r om i c r o - p r o p a g a t i o ns y s t e mo f p a p h r o d i t e n er e s u l t ss h o w e dt h a t ：a no p t i m a lc u l t u r a lm e d i u mt h a ti n d u c ef l o w e rs t a l kb u d so f p a p h r o d i t ev e g e t a t i v eb u d sw a s h y p o n e xn o 13 9 i j + 6 - b a5 0 m g l + c m1 5 0 m i l + s u c r o s e 1 5 9 l + a c t i v ec a r b o n0 1 9 l ，p h 5 4 ；a no p t a ：i l a lc u l t u r a lm e d i u mt h a ti n d u c el e a v e sp l b s w a s ：h y p o n e xn o 13 9 l + 6 - b a5 0 m g l + n a ao 1 m g l + c m1 5 0 m i l + s u e r o s e1 5 9 ，】l + a c t i v ec a r b o no 1 9 ，l ，p h 5 4 ；缸o p t i m a lc u l t u r a li i l e d i t l mt h a ti n d u c el e a v e sp l b s p r o p a g a t i o nw a s ：h y p o n e xn o 13 9 l + 6 - b a5 0 m g n 。t h e + n a a0 3 m g l + c m1 5 0 m i l + s u c r o s e1 5 9 l 十a c t i v ec a r b o no 1 9 l ，p h 5 4 o p t i l a ie x p l a n tf i tf o rp l b si n d u c t i o nw a g y o u n g l e a v e si nv i t r o i na d d i t i o n , t h ee f f e c t so fm u t a t i o ni n d u c e db y1 5 1 2 0 g y 州r a y sr a d i a t i o no n 只 a p h r o d i t ep l b sw a sa l s os t u d i e d me f f e c t so f 丫r a y so ns u r v i v a lr a t e s , p r o p a g a t i o nr a t e s , a n dd i f f e r e n t i a t i o nr a t e so np a p h r o d i t ep l b sw e r ea l s oa n a l y z e d ap r i m a r i l yc o n c l u s i o n w a sm a d et h a tt h eh a l fl e t h a ld o s e ( l d s o ) o f 弋0 1r a y so np a p h r o d i t ep l b sw a sa b o u t 5 0 - 6 s c i y , w h i c hc o u l do f f e ra ni m p o r t a n tr e f e r e n c ef o rr a d i a t i o nb r e e d i n go f p a p h r o d i t e k e y w o r d s ：p a p h r o d i t e ；f l o w e rs t a l kb u d s ；l e a f ；p r o m c o r m - l i k eb o d i e s ( p l b s ) ；r a d i a t i o n h 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研 究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注 和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研 究成果，也不包含为获得东北师范大学或其他教育机构的学位 或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的 任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名；粉聋日期： 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 日 期： 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 指导教师签名：丝 7 日期：塑丑掣 电话； 邮编：一 引言 随着观赏园艺业的迅速发展，人们对观赏植物的种类和商品特性要求越来越高。常 规育种需创造分离群体，再经表型性状筛选。才能实现育种目标。这样的育种途径需要 时间较长，育种成本高，在观赏园艺植物育种中应用有限。辐射诱变育种是利用啦。吖 射线等物理因素诱发植物基因和染色体畸变，获得有价值的新突变体，进而选育出优良 新品种。近年来随着生物技术的发展，组织培养与辐射诱变方法相己结合成为很有效的 育种手段l l j 。 1 观赏植物组织培养研究进展 植物组织培养是指将植物体的一部分接种在人工合成培养基上，进行离体无菌培 养。植物组织培养按其原始的意义，是指愈伤组织培养。发展至今，其研究范围日益扩 大，已包括植物和它的离体器官( 胚、花药、予房、根、茎和叶片) 、组织、细胞和原生 质体的培养技术。由于植物组织培养技术可以快速繁殖出大量试管苗，因此，该项技术 又称植物克隆育苗技术，这是一项能获得大量同源母本基因幼苗的生物技术，该技术具 有繁殖率高、可批量化生产、周年供应、便于运输等优点。尤其是有些观赏植物因靠球 根繁殖，易受病毒侵染，其产量、质量不断下降，采用茎尖脱毒离体培养技术，可以使 病株复壮。因此，近年来观赏组织培养及快繁脱毒技术越来越多地应用于观赏植物种菡 繁殖生产中u j ，并对组织培养中外植体材料的选取，组培中光照、温度、空气、相对湿 度、支撑材料以及组培苗污染的来源、污染菌类的检测及防治等方面进行了广泛地研究 得较多1 1 1 。 1 1 国内外花卉组培苗产业化发展动态 1 1 1 国外花卉组培苗产业化概况 1 9 6 0 年法国的莫瑞尔( m o r e l ) 建立的兰花组培苗工厂，标志着世界上第一家花卉组 培苗实现规模化生产。进a 2 0 世纪8 0 年代以后，观赏植物组培苗产业化生产得到了较快 发展，世界各国竞相投资，角逐激烈。美国已建立起2 0 0 多个生物工程公司【1 1 ，聘请大批 专家教授从事植物组培研究：日本也是组培技术发展较快的国家之一，把组培技术纳入 国家三大全新产业之一；英国已有1 0 0 多家生物工程研究机构，其中都有从事组培工作； 世界最大的花卉王国荷兰，其花卉种苗的组织培养已相当普及，许多大公司都拥有自己 的组培室，在无性繁殖的观赏植物种苗中，8 0 以上是通过组培繁殖的；以色列花卉种 苗的组织培养也发展迅速，如在盆花组培苗生产方面，以色列的本泽( b e n z u r ) 苗圃可提 供盆栽观赏植物1 0 0 种以上的组培苗；泰国采用组培方法，很好地解决了热带兰花用常 规方法繁殖速度慢的矛盾，将大量热带兰畅销世界各国。目前，世界上可进行规模化商 业化生产的观赏植物种类约包括6 0 余科，近1 0 0 0 种 2 1 ，组培苗生产量从1 9 8 5 年的1 3 亿株 猛增到2 0 0 2 年的1 0 亿株以上1 3 1 。 1 1 2 国内观赏植物组培苗产业化概况 我国, 9 , 2 0 世纪7 0 年代初开始研究组培技术，但发展速度较快，普及面较广，现已处 于国际领先水平，开发利用实现了规模化和产业化。在全国农业、林业、园林等领域里， 国家级、省级、市级、县级的科研单位、大专院校、包括个体的花卉公司等大都拥有揸 物组培室，尤其是部分省份或地区。如广东、海南、上海、云南、福建、浙江、广西等 地，花卉组培苗产业化生产已具规模。如：云南省农科院园艺所花卉研究中心花卉组培苗 已工厂化生产，目前建设的组培室周年不问断满负荷生产能力为5 0 0 0 万株川；广州花卉 研究中心工厂化生产观叶植物组培苗年产量也达千万株以上：中山大学、华南植物园、 广东省林科院年花卉组培苗均为几十万至几百万株；云南玉溪高新技术开发区实现了热 带兰花组培苗规模化生产。总体来说，中国观赏植物组培苗的科研和生产在技术水平和 产业化规模上与国际水平相当。正在与国际商业性生产接轨。发展前景广阔。 1 2 观赏植物组织培养中外植体材料的选取 1 2 。1 取材范围 植物组织培养是利用植物细胞的全能性，即生物个体上任何一个具有完整细胞核的 细胞，在一定条件下都可以重新再分化形成原来的个体。从这点来讲，越是具有全能性 的部位其组培的成功性越高。植物具有全能性的细胞通常有三类【3 l ；一是受精卵：二是 发育中的分生组织细胞：即分生组织、根尖、嫩尖、幼叶、花等；三是雌、雄配子及单倍 体细胞。因此，在观赏植物组织培养中，外植体的最佳选择也常因植物种类有所不同唧， 如裸子植物常用幼苗、芽和韧皮部细胞；被子植物常用胚、茎尖( 茎段) 、根、叶等组织和 器官：孢子植物f 藻类、蔽类、苔类等) 目前取材多为叶片。 1 2 2 取材的时期 大多数植物通常在生长开始的季节进行采样，生长末期或休眠期的外植体对诱导反 应迟钝嗍 i 2 3 取材的状态 沿观赏植物的主茎。越往上的部位经组培形成再生器官的时间越短，且越容易形成 花器官；而下部组织产生营养芽的比例较高嘲。 1 2 4 外植体的大小 以茎段或叶片为外植体培养时，通常取材3 5 m m 即可。但是，茎尖培养时，切取茎 尖的大小对培养的成活率影响很大。一般来说，切取0 5 - 0 8n l n l 带2 个叶原基茎尖进行 培养即可。茎尖取材越大，成活率越高，试管苗生长也越旺盛。但茎尖越大，越不易达 到脱毒的目的搠。 2 1 3 花卉组织培养条件的研究 1 3 1 光照 光照环境是影响组培苗光合作用和生长的重要因素1 7 1 。光照环境包括光量、光质和 光周期3 个因子。植物的光合作用随光量的增加而提高，当光量增加到一定限度后，光 合强度反而下降，这个临界的光量值就是光合作用的光饱和点嗍。大多数物种组培苗的 光饱和点较低，一般在1 0 0 1 5 0 t t m o l ( m 2 s ) ，当超过光饱和点后，光合作用的效率就会 下降，并造成光器官的不可逆损伤1 9 1 。光质对植物光合作用的影响是指不同波长的光对 光合作用的影响 9 1 。光周期对组培苗生长的影响是指在光合光量子通过量较大的情况下， 光期与暗期对组培苗生长的影响【1 0 l 。关于光质和光周期对光合作用影响的研究目前尚不 多见。 1 3 2 温度 组培室温度在空间和时间上的分布不均匀。k o z a i 等【9 】研究了日平均温度2 0 下的3 个不同温差，b o + 1 0 c 温差( 光期2 5 c 、暗期1 5 1 2 ) ，o 温差( 光期2 0 1 2 ，暗期2 0 c ) 、- 1 0 ( 3 温差( 光期1 5 c 、暗期2 5 0 ) 变温管理对组培苗的作用效果。结果表明，苗体高度随温差 的增大而增大、但组培苗的干重和鲜重不受温差值的影响。 1 3 3 空气 采用透气性封口膜进行培养时，植株的干重、生根率、叶面积、健壮程度均好于无 透气性封口膜。在培养瓶中增加c 0 2 浓度时，试管苗的生根率、健壮程度高于正常c 0 2 浓度的对照组材料1 1 0 1 。 1 3 4 相对湿度 培养瓶中相对湿度不能过高，否则会导致组培苗叶片生长不正常和蒸腾作用受抑制 i u 。 1 3 5 支撑材料 目前，组培常用的支撑材料是琼脂。但以聚乙烯发泡材料、岩棉、蛭石、陶瓷纤维 和植物纤维的扁平压制块作支撑材料，更有利于组培苗的生长【1 2 1 。 1 4 花卉组织培养污染防治的研究 1 4 1 污染来源 植物组培污染主要是霉菌、细菌和酵母菌引起的污染。霉菌和酵母菌在培养条件下 生长快，易识别，而细菌潜伏期较长，很难在前期观察到症状【瑚。l e i f e r tc 等【1 4 1 认为细 菌污染的主要来源有3 个：其一，材料内部灭菌不彻底，这样造成的污染约占污染总数的 l 3 1 2 ；其二，在正常的灭菌条件下，内生菌能够成活，由此产生的污染约占污染总 数的l 4 ；其三是来自寄主植物的污染，约占污染总数的l ，4 1 2 。j e n n e t b l a k e 掣b l 认 为：牧草上的虫和螨体表带有的霉菌的孢子和细菌，在9 、1 0 月份是重要的污染源。g r e u s f l e 等( 1 9 8 8 ) 【1 5 ，也报告8 月和9 , 9 牧草的虫体大量繁殖阶段，会造成了组培外植体污 染的严重发生。f e n j a l r i c 等( 1 9 8 8 ) i 1 在对三叶胶初级培养污染的研究中发现，高温、多 3 雨的环境更易于污染的发生，而且随着植物材料年龄的增长，植物材料的健康状况不断 恶化，组培污染也会更加严重。经fe n j a l t i c 等研究认为外植体带菌多少的顺序为：腋芽( 茎尖 试管苗 田问苗 根芽 插条 种子，这主要 与射线引起诱变的间接作用枫理有很大关系。因为这些材料中愈伤组织含水量高达8 0 以上，在射线处理下，会产生很多氧自由基破坏核酸和蛋白质等生物大分子。另外，愈 伤组织的代谢系统还不健全，对损伤的修复程度低，敌对射线最为敏感。种子对射线的 敏感性最差，因为其含水量一般低于2 0 ，射线处理时产生的间接损伤作用不大。另外 种子处于休眠状态，一些大的生物分子被保护，不易被射线所破坏，故种子与其它类型 材料相比对射线敏感最弱。表l 是部分观赏植物曾经使用过的的诱变材料和辐射剂量。 表1部分观赏植物辐射诱变材料和剂量统计表 2 2 2 辐射诱变机理 辐射产生诱变的主要原因包括两方面：一是辐射后引起遗传物质的突变，如染色体 的畸变或d n a 分子的变异。二是r n a 、蛋白质的生物合成受到抑制，生长素及酶等生理 活性物质的代谢受到破坏，表现出细胞死亡、细胞突变。射线与被照射物质直接发生作 用，使生物大分子发生电离或激发而引起原发反应。h o e r t i n g e r 等t 5 9 j 把生物体内引起的 辐射作用过程划分为四个阶段：物理阶段、物理化学阶段、化学阶段和生物效应阶段。 6 在辐射处理材料的有丝分裂和减数分裂细胞中都观察到了染色体畸变，即辐射诱发染色 体数量、结构和行为畸变。染色体数量的变化往往导致单倍体及非整倍体类型的出现， 金鱼草、月见草属等经辐射诱发了单倍体的产生、染色体断裂、结构重排 s 4 1 。j a c k s o n 等l 鸽l 对百合、矮牵牛花粉辐照后d n a 单链断裂方式、修复体系等分子机理进行了研究。 同时在鸭跖草辐射研究中观察到染色体行为变异，如染色体桥的出现、染色体落后等。 通过诱变产生的缺失，可进行精细的遗传图谱构建，并使传统遗传图与分子标记的遗传 图加以整合f 4 刀。张克中印( 2 0 0 3 ) 研究表明：植物雄性不育突变体，可能是由基因突交( 遗 传因素) ，不良环境条件的改变( 如高温、干旱、不良光照等非遗传因素) 及辐射产生的 生物学效应( 诱导因素) 等所引起的。 2 2 3 辐射效应的研究 用神c o - 3 , 射线辐射植物材料后，辐射产生生理效应表现在叶绿素a 、叶绿素b 、类胡 萝卜素、类黄酮等含量和s o d ( s u p e r o x i d e d i s m u t a s e , 超氧化物歧化酶) 、c a t ( c a l a l a s e ， 过氧化氢酶) 活性发生改变。k r y s t y 皿m u s i a i 等1 6 0 ( 1 9 9 9 ) 用7 0 0 g y 和9 0 0 g y 的o 吖射 线对猕猴桃的花粉照射，授粉后观察胚细胞核的大小是对照的一半，种子中近9 0 只有 胚乳，只有1 0 0 , 6 的种子包含胚乳和胚。强继业等【6 l 】研究了射线辐射后对球根海棠、 蝴蝶兰、仙客来、大丽花生长速率和叶绿素含量的影响，表明低剂量辐射处理的花卉前 期生长速率较高，长势优于对照， 高剂量辐射处理的花卉后期生长速率高。经1 0 c , y 辐 射处理后球根海棠( 籽) 、蝴蝶兰、大丽花与高剂量辐射处理后球根海棠( 根) 、仙客来( 籽 均有较高的光合作用和抗逆性，其中球根海棠( 根) 经辐射处理后花色、瓣形出现明显变异 1 3 1 。翁伯琦等 m l ( 2 0 0 4 ) 研究辐射对决明品种植株营养成分的影响，表明决明经辐照 处理后植株总n 含量比对照提高了3 7 2 ，其植株总p 含量、总k 含量均比对照显著下降。 b a n e l j ib i c 等t e a l ( 1 9 9 1 ) 研究假俭草( 草坪植物l o 个选系) 的种子经吒州射线照射后， 7 植株矮化，数个株系抗寒性超过对照。荷花种藕经射线处理后，多数荷花生长受到 抑制，致使开花期延迟1 0 - 1 5 d ，植株高度低于对照1 0 - 2 5 c m ，但在花色、花型等方面没 有发生明显变异嗍。不同辐射材料产生诱变率也有差异，如b r o 锨 j e s ( 1 9 7 6 ) 荦j 甩菊花 花梗、叶片和花瓣作为外植体，适宜剂量为8 1 0 g l y ，获得突变体的数量以花梗外植体为 最多，其突变率达2 1 6 ”。辐射百合不定芽植株后代变异中，雄性不育变异率最高，变 异类型最丰富嘲。 激光作用也可使生物膜的通透性、流动性、酶活性、可溶性蛋白含量和电解质漏渗 等发生交化，从而对生物产生促长或抑制作用。庄南生等1 4 刀( 2 0 0 4 ) 研究了激光照射柱 花草种子时间与草生长效果表明：以激光照射种子4 0 s 的促长效果较为理想，用l o s 和2 0 s 的处理，对种子发芽势和发芽率均有促进作用，对初生胚根的生长f 萌发的第四天测量 根长) 则表现l o s 时有抑制作用，2 0 s 时有显著促进作用；而对盆栽后幼苗根长( 盆栽后2 5 d 测量根长) 的影响则相反，l o s 时有促长作用，2 0 s 时有抑制作用。 荷能离子被注入生物体后所表现的生物学效应具有局部性、双重性和不易修复性 1 4 6 1 。微波处理后的m l 代不同于t 射线辐射后的m 1 代产生明显的损伤效应。适当的剂量 可以促进种子萌发，提离发芽率。 在辐射诱变产生的变异程度方面的研究有许多报道，同一诱变材料由于基因的差 异，产生的变异率也有显著差异。通过对菊花辐射育种的研究表明：辐射诱变后代性状 的变异程度以花色最大，其变异谱也最广，其次是花型、花期、叶型和株型。组培苗用 电子束辐射处理，从移栽植株数与变异株数的比率看， 3 0 5 0g y 的变异率高，且在这 一范围内，剂量越高，变异率越低【跚。用电子束辐射唐菖蒲种球，结果表明后代的花色、 花型、花序、开花期等性状均发生较大程度的变异，其变异率为8 。7 - 3 0 g l s o l 。 2 2 4 今后观赏植物辐射诱变育种的研究方向 日前，我国利用辐射诱变育种的观赏植物种类有限，主要集中在菊花、月季、梅 花、水仙等中国名花及部分草坪植物，对多数草花、观叶植物等种类尚未开展诱变育种 研究工作。我国花卉辐射诱变研究水平仍局限于形态与组织解剖上，辐射诱变源单一， 今后应从以下几方面加强研究。 ( 1 ) 深入研究辐射诱变机理 加强辐射后植物形态解剖、生理生化、分子水平变化、诱变机理等的研究。对辐射 后染色体的结构与行为变异、d n a 损伤与修复及其与突变形成的关系等进行深入研究。 ( 2 ) 辐射育种与组织培养相结合 辐射诱变与组织培养相结合的育种技术与单纯的辐射育种相比有许多优点：可 以提高变异的保存率，克服扦插分离不彻底的缺点，加快变异的纯合，从而缩短育种周 期【6 7 侧：组培可以克服“二倍体选择”，提高细胞突变的显现几率。被辐射处理的 愈伤组织的突变率比扦插苗高，且有同质突变体；组培辐射育种技术所使用的外植体 可以是叶片、芽、茎段等营养器官，也可以是花托、花瓣、雌雄蕊、花粉、子房等生殖 器官，材料种类比单独使用辐射育种时选择余地大，同时组培环境可以人为控制。所以 辐射诱变与组培相结合的育种技术在观赏植物育种中具有广阔的应用前景。 ( 3 ) 诱变材料的扩展 以缅胞悬浮系作为诱变材料一次可大量进行诱变处理，在一个普通的试管中可容 纳1 0 l 1 0 s 个单细胞，这一数量相当于一公顷的面积上有1 0 5 1 0 6 个植株，既在不大的容积 内就可以对大量材料进行诱变处理。因而。可以提高育种效率，缩短育种周期。p r e i l 等 7 0 l j 拄行悬浮细胞辐射诱变选择耐低温菊花突变体的研究，并对目标优良体的选择方法 作了探讨，发现在离体低温胁迫条件下，能有效筛选出耐低温突变。 ( 4 ) 花卉育种与航天育种相结合 太空的空间环境对植物种子诱变作用较强，导致作物基因变异幅度较大，有益变 异也较多，有利于加速育种进程和改进品质。因此，今后应利用空间搭载技术，进行多 种诱变的综合研究。 3 研究的目的和意义 近年来，植物组织快繁技术作为我国农业高新技术创新的重点内容，受到各级政府 和科技部门的高度关注和重点支持，并在马铃薯、甘薯、姜、苹果、鲜切花等方面实现 8 了商品化、产业化生产。国外发达国家中，园艺植物良种育苗和推广绝大部分采用组培 快繁及工厂化育苗技术，不仅带来了巨大的经济效益，而且培育出众多的名优品种。 但是，我国蝴蝶兰组培快繁和品种选育还处于起步阶段，与国外相比还存在很大差 距。蝴蝶兰繁殖技术主要采用分株或种子繁殖，进行组培快繁还处于试验阶段，影响了 我国蝴蝶兰生产的健康发展。 国内的研究仅限于在传统无性繁殖的基础上进行组培技术研究。为了保证国内蝴蝶 兰生产的健康发展，应尽快建立蝴蝶兰的经济、高效、快速繁殖的组培技术体系，并利 用原球茎变异和基因导入技术选育蝴蝶兰新品种。 日本、韩国、美国、荷兰等国家对洋兰有所研究，其所培育品种无论在气候适应特 点上还是在审美情趣上都不太适合中国国情，且组培技术也对中国实行严格的技术限 制。国内进行兰花研究的机构很多，由于品种资源及技术方面的原因，形成具有自主知 识产权品种产业的几乎没有。作为引进的蝴蝶兰杂交种用种子进行繁殖比较困难，直接 进口价格昂贵，不能满足市场需要。 随着人们生活水平的不断提高，对衣食住行提出了更高的要求，与之相对应的花卉 生产越来越趋向于高档化、精品化，各种高产、优质、无公害的生产基地在全国各地如 雨后春笋般地发展起来。蝴蝶兰己成为我国花卉出口的主要花卉种苗。 基于上述情况，本试验研究的主要目的在于： ( 1 ) 对蝴蝶兰外植体的筛选、原球茎状体诱导、原球茎增殖技术进行详细研究，筛选出 适宜的培养基配方，优化蝴蝶兰组织培养快繁技术，建立蝴蝶兰经济、高效、快速繁殖 的组培植株再生技术体系。 ( 2 ) 利用射线对蝴蝶兰原球茎进行辐射，建立蝴蝶兰诱变育种的新途径，为蝴蝶兰诱交 育种的新品种选育奠定一定的理论基础。 9 研究内容 一、原球茎的诱导研究 1 材料与方法 i i 蝴蝶兰材料 供试的蝴蝶兰( p h a l a e n o p m sa p h r o d i t er c h b f ) 品种c o c - 2 0 9 f h 吉林省国联花卉公司 提供。 1 2 实验方法 1 2 1 蝴蝶兰花梗腋芽诱导培养 1 2 1 1 花梗腋芽外植体的灭菌处理 选取带腋芽的幼嫩花梗，用洗洁精水溶液浸泡和清洗1 5 m i n ( 置于三角瓶内，不断摇 晃) 后，再用清水反复冲洗干净。然后，用7 5 的酒精消毒l m i n ，最后，再用o 1 的氯 化汞分别消毒5 ，1 0 ，1 5 ，2 0 或2 5 r a i n 。用无菌水冲洗5 次，然后置于无激素的改良 m s 培养基上进行培养，每瓶接种1 0 块外植体材料，3 0 d 后调查o 1 的氯化汞不同灭菌 时间处理组的灭菌效果。每个试验处理设3 次重复，下同。 1 2 1 2 蝴蝶兰花梗腋芽培养 按照1 2 1 1 中的方法和筛选出的最佳灭菌时间( 2 0m i n ) 进行花梗腋芽的灭菌处理， 接种在h y i h y 9 培养基上。培养基基本成分为：花宝一号3 9 ，l 蔗糖2 0 9 i 琼脂粉7 5 g ，l + 活性炭1 5 9 l ，p n 5 4 ，其不同培养基的激素组合详见表1 1 。每种培养基上接种3 0 个花梗腋芽。培养温度2 5 士2 c ，光照强度1 , 5 0 0 l x ，光照时间1 2 h d ，3 0 d 后统计腋芽 花梗培养的试验结果。 表1 - 1 花梗腋芽启动培养的培养基配方 l o 1 2 2 蝴蝶兰不同外植体原球茎的诱导 利用花梗腋芽诱导苗的幼嫩叶片、茎尖( 约0 i o m ) 和根尖作为外植体，接种在花 宝一号3 9 l + 6 - b a 5 0 m g l + n a a 0 i m g l + 蔗糖2 0 l + 琼脂粉7 5g ，l + 活性炭1 0 9 l ， p h 5 4 的培养基上。每个处理接种3 0 个外植体。培养温度2 5 士2 ，光照强度 1 , 2 0 0 - 1 ，5 0 0 l x ，光照时间1 2 h d ，3 0 d 后统计不同外植体原球茎的诱导试验结果。 1 2 3 蝴蝶兰叶片原球茎培养 1 2 3 1 叶片原球茎诱导培养基的筛选 蝴蝶兰原球茎外观与瘤状愈伤组织相似，表面球状物不明显，在增殖过程中可见表 面一个个圆球突起物，部分表面细胞分化出根毛状物。 取花梗腋芽试管苗的幼嫩叶子，用手术刀将叶片切成约l c m 2 的小块，然后接种在 诱导原球茎的l y l y 培养基上。培养基的基本成分为：花宝一号3 9 l + 蔗糖2 0 9 l + 琼脂粉7 5 9 l + 活性炭1 5 9 l ，p h 5 4 。外源添加物，如6 - b a 、n a a 、c m 和蔗糖的配 制比例，按照四因素三水平正交试验设计进行培养基的配制( 详见表1 - 2 ) 。每种培养基 上接种3 0 个叶片小块。培养温度2 5 士2 1 2 ，光照强度1 , 2 0 0 - 1 。5 0 0 l x ，光照时间1 2 h d ， 培养时问为6 0 d 。 表i - 2 叶片诱导原球茎不同培养基添加物的组成成分 注：c m ( c o c o n u tm i l k ) 椰乳。 1 2 3 2 叶片原球茎增殖培养基的筛选 将叶片诱导的原球茎块接种在改良的m s ，1 2 m s 或花宝一号为基本培养基的 y q - y q 培养基上进行3 种基本培养基的比较分析，其外源激素添加物的配比含量 详见表1 3 。每个处理接种3 0 个原球茎块，切块直径大小约3 m m ，三次重复。培养温 度2 5 士2 ，光照强度1 , 2 0 0 - 1 5 0 0 l x ，光照时间1 2 1 r i d ，培养时间为3 0 d 。 为了比较椰乳和香蕉汁对叶片原球茎增殖的影响，我们将叶片诱导的原球茎接种 在含有不同数量椰乳和香蕉汁的改良y q 培养基上。每个处理接种3 0 个原球茎块，切 块直径大小约3 n u n , 3 次重复，参见表1 4 。培养温度为：2 5 士2 c ，光照强度 1 , 2 0 0 - 1 ，5 0 0 l x ，光照时间1 2 h d , 培养3 0 d 后调查叶片诱导原球茎的试验结果。 表1 - 3 叶片原球茎增殖基本培养基的成分 揸差基绝呈基奎揸差基= 璺【堡型b ) 毯【磐g 坐) 丛l 里b 坐2 。 c o o ) m s1 0 1 1 5 0 y o ( 参m s 30 31 5 0 v q m s5 0 5 1 5 0 v o 1 2 m s l0 31 5 0 y q 1 2 m s 30 5 1 5 0 y q i 2 m s50 11 5 0 r o e花宝一号3 9 l 10 51 5 0 y q 花宝一号3 9 n , 30 11 5 0 y q 花宝一号3 9 ，l 50 3 1 5 0 注：每种培养基+ 蔗糖2 0 9 l + 琼脂粉7 5 9 l + 活性炭1 5 9 l ，p h 5 4 。 椰乳的制备方法。将新鲜的椰子去皮，将椰乳倒入密封容器内，用封口膜封口，放 入高压灭菌锅中，1 2 1 高压灭菌1 0 m i n ，冷却后备用。 香蕉汁的制备方法：将新鲜的香蕉去皮，装入扎汁机，榨成果汁后倒入密封容器内， 用封口膜封口，放入高压灭菌锅中，1 2 1 高压灭菌1 0 m i n ，冷却后备用。 表1 4 果汁对原球茎增殖影响的培养基配方 注：基本培养基为y q 培养基。 2 结果与分析 2 1 蝴蝶兰花梗腋芽诱导培养 2 1 i 氯化汞灭菌时间对蝴蝶兰花梗腋芽外植体灭菌效果的影响 本试验的统计结果表明( 参见表2 - 1 ，图2 - 1 ) ，在用o 1 氯化汞灭菌的各个实验组 中，灭菌效果与灭菌时间2 0 m i n 和2 5 m i n 实验组的灭菌效果较好，污染率较低，分别为 6 7 和3 3 。但是，实验观察结果表明灭菌2 5 r a i n 钟后的花梗腋芽萌发慢，长势弱， 这可能是由于氯化汞毒性作用所导致的结果。综合氯化汞灭菌效果与成活率的关系，我 1 2 们认为o 1 氯化汞对蝴蝶兰花梗灭菌2 0 m i n 为最佳的灭菌时间。 表2 - 1 不同灭菌时间对腋芽成活率的影响 赠( r a i 咖n ) 臀鬻需鬻嚣腋芽长势 ( 个) ( 个)( 个) ( 9 磅( ) 。 1 0 0 邑8 0 篓6 0 餐 犀4 0 需 萎2 0 o 51 01 52 0 2 5 灭菌时间( m i n ) 图2 - l 不同灭菌时问对腋芽成活率和污染率的影响 2 1 2 激素组合对花梗腋芽启动培养的影响 许多植物的花梗腋芽是休眠的花芽。将带有腋芽的花梗茎段接种在适宜的人工培养 基上。在外源激素的诱导下可以转化为营养芽，进一步发育成为一个新的小植株叫l 。 表2 - 2 激素组合对花梗腋芽启动培养的影响 培养基编号6 - a a ( m g l ) n a a ( m g l ) 接种个数( 个)出芽数( 个) 出芽率( ) 毋 v 糌 轴 珀 帆门m 1 1 1 f l 1 1 1 f 21 1 1 31 1 1 41 1 1 5h y 61 1 1 f 7y 81 1 1 f 9 培养基编号 图2 - 2 不同激素浓度对花梗腋芽诱导的影响 本试验观察结果表明，蝴蝶兰花梗腋芽接种1 0 d 时开始萌动膨大，约3 0 d 可以发育 成带有小叶的无菌小植株。外源激素种类和浓度对蝴蝶兰的花梗腋芽启动培养有很大的 影响。由表2 2 和图2 - 2 所示的试验统计结果不难看出，在一定n a b 浓度下，随6 - b a 浓度的增加，营养芽的出芽率也随之增加：然而，在一定6 b a 浓度条件下，随着n a a 浓度的增加，营养芽的出芽率反而随之降低。这说明，花梗腋芽在其转化为营养芽的过 程中，外源激素6 - b a 有着明显的促进作用，而n a a 则对其有抑制作用。本文设计的9 种腋芽启动培养基中，h y 6 号培养基诱导营养芽的出芽率最高，高达9 0 。 2 2 不同外植体原球茎的诱导效果 以蝴蝶兰的幼叶、茎尖和根尖为外植体，在h y 9 培养基上均能诱导出原球茎，但 是，不同外植体对原球茎诱导影响很大( 详见表2 3 和图2 3 ) 。其中，以幼叶的诱导率最 高，其原球茎诱导率高达8 6 7 ；其次是茎尖，茎尖的诱导率为6 0 * 6 ；根尖的诱导率最 低，只有6 7 。 表2 - 3 不同外植体原球茎的诱导效果 显然，原球茎诱导率的差异是由不同外植体的内在生理因素造成的。不同的外植体 之间生理因素的差异，目前还不清楚，还有待于今后进一步深入的探讨，这对于分析植 物分化的组织向原球茎转化机理是十分有意义的。 1 4 舌踮m的m 0 邑 静 静 憋 堋 箭 喙 茎尖 外植体来源 口 根尖 图2 - 3 不同外植体原球茎的诱导效果 2 3 蝴蝶兰叶片原球茎的诱导 在本试验中发现，不同外源激素组合和添加物对叶片原球茎的诱导率影响很大( 表 2 - 4 ) 。尽管l y l y 九种培养基都可以诱导出原球茎，但是，由l y 、l y 和l y 诱导出的原球茎诱导率很低，仅为l 。i 3 3 ：且诱导出的圆球茎很难增殖，有一些不能 正常生长，甚至有一些直接死亡然而，在l y 到l y 组合的六种培养基上圆球茎的 诱导率均超过2 0 以上，最高的诱导率可达7 2 2 ，诱导出的原球茎也都能正常生长和 增殖。 表2 4 不同培养基添加物对叶片诱导原球茎形成影响的极差分析 培养基编号 6 - b an a ac m蔗糖 接种数( 个) p l b s 诱导数( 个) 诱导率( ) l y l y l y l y l y l y l y l y l y t l1 0 8 81 1 7 7 6 5 57 1 1 幸 t 22 8 9 5 时唪 6 5 51 1 2 1 幸 6 3 2 t 36 65 3 35 8 9 6 3 2 x l 3 6 2 7 3 9 2 3 2 1 8 32 3 7 0 * x 29 6 翮辑2 1 8 33 7 3 7 * 2 1 0 7 x 3 2 2 0 1 7 7 71 9 6 32 1 0 7 r a n g e 9 4 3 02 1 4 71 7 7 32 6 3 注；p l b s ( p r o t o e o r m - l i k eb o d y s ) 原球茎。 1 5 他m o 2 j 9 2 j 2 3 2 铊然记拍挖置l 2 鲳弘撕：8 m ，2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 如如如如 b加筋巧坫加筋：2卯卯 l 1 2 l 2 l 2 1 l l 5 l 5 l 5 叭晒。叭。叭帖。 l 1 l 5 5 5 m 吣m 1 0 0 8 0 芭6 0 褥 曲4 0 憋 2 0 o 6 一队1 06 一b a 5 06 一队1 0 0 n a , a 0 1 n a a 0 5 n a a l 。0 激素浓度( r a g l ) 图2 - 4 不同外源激素含量对叶片诱导原球茎的影响 比较表2 - 4 中不同外源激素( 6 - b a 、n a a ) 对叶片圆球茎诱导率的影响结果可以看 出，6 - b a 浓度的使用范围在1 5m g l 时，叶片圆球茎的诱导率是随着6 - b a 浓度的增 加而不断升高的。但是，当6 - b a 的浓度达到1 0m g l 时，圆球茎的诱导率却明显下降。 这表明，6 - b a 在一定浓度范围内对叶片圆球茎的诱导有促进作用。显然，本实验结果 显示，时片圆球茎诱导的最佳6 - b a 浓度为5 om e l 。然而，n a a 在圆球茎诱导中的作 用与6 - b a 是完全相反的。根据表2 - 4 中统计的实验结果显示，n a a 含量的变化与圆 球茎诱导率呈现出负相关性，即n a a 含量越高，圆球茎诱导率越低。这说明，n a a 对 叶片圆球茎诱导具有一定的抑制作用( 见图2 - 4 。 通过极差分析，我们得出影响叶片诱导原球茎的最主要因子为6 - b a ，其次是n a a 、 c m 和蔗糖，但是，n a a 、c m 和蔗糖三个因子影响比较小( 详见表2 - 4 ) 。据此，我 们推测诱导蝴蝶兰叶片原球茎发生的最优培养基配方为；花宝一号3 9 l + 6 - b a 5 0 m g l + n a ao i m g l + c m1 5 0 m l l + 蔗糖1 s g l 。 2 4 蝴蝶兰原球茎的增殖 2 4 1 不同培养基对叶片诱导原球茎增殖的影响 将叶片诱导的原球茎置于不同基本培养基中培养后发现，不同基本培养基对于原球 茎增殖速度影响较大( 参见表2 5 ) 。在以花宝一号( 其氮磷钾的含量分别为7 、6 、1 9 ， 美国生产的兰花专用肥) 为基本培养基的处理组的中，原球茎增殖速度最快，平均增殖 系数为8 4 3 ( 最高为i o 8 ) ；1 2m s 处理组的增殖速度次之，平均增殖系数为5 2 3 ( 最 高为6 5 ) ；m s