（食品科学专业论文）高压脉冲电场对POD活性及各级结构的影响研究.pdf

福建农林大学硕士学位论文高压脉冲电场对p o d 活性及各级结构的影响研究 摘要 高压脉冲电场( p u l s e de l e c t r i cf i e l d ，简称p e f ) 是非热食品处理技术中最具有 发展前景的技术，也是近年来国内外食品加工行业研究的热点问题之一。目前较 多的研究集中在杀菌的机理和动力学方面，高压脉冲电场对酶影响的相关研究开 展的较少，酶在脉冲电场作用下的活性变化机理也尚不清楚。研究者只是在对酶 失活的比率进行测试时提出了几种失活可能性的假说，并没有得到相关的论证和 深入的研究。 本研究使用大连理工大学设计的高压脉冲系统，选取热稳定性较高的辣根过 氧化物酶( p o d ) 为目标酶，从理论和实验两方面对高压脉冲电场处理条件下酶 失活和酶构象的改变进行了系统的研究，并应用计算机分子模拟技术形象地模拟 了酶三级构象的改变。从而对先前进行的有关酶失活动力学的研究进行了验证。 1 、本实验使用的高压脉冲电场设备，电压范围0 , - - , 2 2 k v ；脉冲宽度5 - - - , 2 0 p s ； 采用c o f i e l d 连续处理室，流速范围5 - - - 1 0 0 m l m i n ：脉冲周期1 0 - - , 1 k h z ；单 极脉冲；波型为方波。 2 、p e f 处理可以钝化p o d 活力：方波条件下，脉冲宽度为1 7 1 a s ，p e f 电 场强度对p o d 酶失活有显著影响( p 0 0 1 ) ，随脉冲电场强度( 0k v c m 一2 0 k v c m ) 的增强，p o d 酶活钝化效果增强。 动力学方舰羔三二陬脚c ”链删描黼压脉冲电 场作用与酶失活的关系，且酶失活过程存在有临界场强e c ( 1 0 1 2 - 1 ：0 3 4k v c m ) 。 3 、尺寸排阻色谱分析表明：高压脉冲电场条件下，p o d 的蛋白质肽链没有 发生断裂，酃p o d 的一级结构未发生明显改变。 4 、红外光谱分析表明：高压脉冲电场条件下，p o d 的二级结构单元( a 螺 旋、p 折叠、b 转角和无规卷曲) 随着电场强度的增加，呈非单调型变化。并且 高压脉冲电场的作用，使p o d 二级结构单元中的p 转角和无规卷曲向螺旋和 p 折叠转化。 5 、荧光光谱分析表明：高压脉冲电场处理p o d 可以使其荧光强度产生不同 程度的下降，从而改变了p o d 的局部三级构象，并且电场强度越大，作用越明 显。研究还表明，荧光淬灭过程存在与酶失活过程相同的临界场强e c ，说明酶 福建农林大学硕士学位论文高压脉冲电场对p o d 活性及各级结构的影响研究 三级构象改变与酶活改变关系密切。 6 、计算机分子模拟分析形象地验证表明了：高压脉冲电场条件未改变p o d 分子片段的整体结构，但改变其部分基团的构象。 关键词：高压脉冲电场( p e f ) ；过氧化物酶( p o d ) ；酶活；结构；分子模拟 福建农林大学硕士学位论文高压脉冲电场对p o d 活性及各级结构的影响研究 a b s t r a c t p u l s e de l e c t r i cf i e l d ( p e f ) i sav e r yp r o m i s i n gn o n - t h e r m a lf o o d p r o c e s s i n g t e c h n o l o g y , a n di th a sb e c o m et h eh o ts p o to ff o o di n d u s t r yr e c e n t l y c u r r e n t l ym o s t r e s e a r c h e sf o c u s e do nt h em e c h a n i s ma n dk i n e t i c so fm i c r o b i a li n a c t i v a t i o n , h o w e v e r , f e wr e s e a r c h e sr e l a t e dt ot h ee f f e c t so fp e fo ne n z y m e s ，a n dt h em e c h a n i s mo f e n z y m ei n a c t i v a t i o nu n d e rp e fi s s t i l lu n c l e a r s e v e r a l h y p o t h e s e sa b o u tt h e i n a c t i v a t i o no fe n z y m ew e r ep r o p o s e db u tt h e s eh y p o t h e s e ss t i l lh a sn o tb e e np r o v e d y e t p e ft r e a t m e n tw a sp e r f o r m e db yu s i n gal a b o r a t o r ys c a l ep u l s eg e n e r a t o rs y s t e m ( d e s i g n e db yd a l i a nu n i v e r s i t yo ft e c h n o l o g y ) t h er e l a t i v er e s i d u a la c t i v i t yo f c o m m e r c i a le n z y m e so fh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ( p o d ) w h i c hi st h e r m a lr e s i s t a n c e w a si n v e s t i g a t e d t h ei n a c t i v a t i o na n dc o n f o r m a t i o n a lt r a n s i t i o n so fp o db yp e fw e r e s t u d i e ds y s t e m a t i c a l l yf r o mt h e o r i e sa n de x p e r i m e n t s t h ec h a n g ei nt e r t i a r ys t r u c t u r e o fp o du n d e rp e fa l s ow a ss t u d i e db yc o m p u t e rm o l e c u l a ri m i t a t i o n b yd 0 吨s ot h e e n z y m ei n a c t i v a t i o nk i n e t i c ss t u d i e dp r e v i o u s l yw a sv e r i f i e d 1 、t h ep e f - t r e a t m e n ts y s t e mc o n s i s t e do fas q u a r ew a v eg e n e r a t o r , ac o f i e l d t u b u l a rt r e a t m e n tc h a m b e ra n dac o o l i n gs y s t e m t h ev o l t a g e ，p u l s ed u r a t i o na n d p u l s ef r e q u e n c yw e r ea v a i l a b l ef r o m0t o2 2k v , 5t o2 0 婶a n d10t ol0 0 0 h z r e s p e c t i v e l y 2 、t h ea c t i v i t yo fp o dd e c l i n e ds i g n i f i c a n t l ya f t e rp e ft r e a t m e n t ：t h ep a r a m e t e r si n t h ee x p e r i m e n ti n c l u d e ds q u a r ew a v ep u l s e so f17 1 a s ，e l e c t r i cf i e l ds t r e n g t h ( 0 k v c m 2 0k v c m ) t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ei n a c t i v a t i o no fp o dw a s s i g n i f i c a n t l y ( p o 0 1 ) a n dw i t ht h ei n c r e a s i n go fe l e c t r i c f i e l ds t r e n g t h ，t h e i n a c t i v a t i o ne f f e c to fp o de n h a n c e d t h ek i n e t i c e q 删o n 尺= l e 2 5 0 u m g ) 。 主要试剂：氯化钠、乙酸、乙酸钠、氢氧化钠、邻甲氧基酚、3 0 过氧化氢， 磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，实验所用的化学试剂都为分析纯。 1 1 2 仪器 高压脉冲系统，d k 9 8 1 型电热恒温水浴锅( 天津设市泰斯特仪器有限公 司) ，s a r t o r i u s p b - 1 0 精密p h 计( 北京市赛多利斯仪器系统有限公司) ，u s b d a t ea c q u i s i t i o nm o d u l e s 数据采集器( i o t e c h ，i n c u s a ) ，订- t 3 6 s l e 热电 偶( o m e g ae n g i n e e r i n g ，i n c ) ，a 6 2 1 电流探头( 美国t e k t r o n ) ， t d s 3 0 1 2 b 数字荧光示波器( 美国t e k t i d ( ) ，p 6 0 15 a 示波器探头( 美国 t e k t r o n ) ，b s 2 1 s 型电子天平( 北京赛多利斯天平有限公司) ，p r o l i n e 型 k h b 单道可调移液器( 上海科华实验系统有限公司) ，u n i c 0 2 0 0 0 分光光度计 左占 奇4 1 2 试验方法 1 2 1p o d 酶液配制 p o d 晶体溶解于水中，配成p o d 水溶液( p h = 6 4 ) ，使p o d 浓度达到 0 1 i n g m 1 ，4 c 冷藏，等待高压脉冲处理及热或作为对照样做酶活力检测。 1 2 2p o d 酶活试验试剂配制 0 0 0 8 m o l l 过氧化氢溶液：取0 2 0 8 m i3 0 h 2 0 2 ，用蒸馏水稀释到2 5 0 m l 。 1 7 福建农林大学硕士学位论文高压脉冲电场对p o d 活性及各级结构的影响研究 o 1 m o l l 磷酸缓冲液( p h = 7 o ) 。 0 0 18 m o l l 邻甲氧基酚溶液：1 2 2 5 9 邻甲氧基酚溶于蒸馏水并定容至5 0 0 m l 。 1 2 3 高压脉冲电场处理对p o d 酶活力影响的试验方案设计 高压脉冲电场影响酶活力的主要因素有电场强度、脉冲数目、脉冲波形、脉 冲宽度和频率等。试验过程中脉冲波形设定为方波，固定脉冲宽度为1 7 1 x s ，而 频率最终可转化为脉冲数目进行计算，所以本试验分别只对高压脉冲电场电场强 度和脉冲数目进行两因素重复试验，每个试验在相同条件下重复3 次，取其平均 值以确定各因素的影响效果。 试验波形为方波，脉冲宽度1 7 1 t s ，频率1 2 8 h z ，设计了5 个电场强度梯度， 分别为1 0k v c m ，1 2 5k v l c m ，1 5k v l c m ，1 7 ，5k v c m 和2 0k v e m ；四个脉冲 数目梯度，分别为2 0 、4 0 、6 0 及8 0 ，进行两因素重复试验，测定p o d 相对残 余活力。 1 2 4p o d 相对酶活力测定 向比色杯中加入0 0 0 8 m o l lh 2 0 2 溶液0 0 5 m l 、o 1 m o l l 磷酸缓冲液( p h 7 o ) 2 8 m l 、邻甲氧基酚0 0 5 r n l 。于2 5 c 水浴中恒温1 0 m i n ，迅速加入待测酶液o 1 m l ， 以磷酸缓冲液代替酶液作空白对照，反应液总体积为3 m l 。用分光光度计于4 3 6 n m 波长下测定光吸收值( a ) 3 1 。每隔1 0 s 读数一次，共读3 m i n 。按上述步骤重复 测定3 次，取其平均值对a 对时间作图，取反应最初线性部分，计算出每分钟a 的增加值为弛3 阳m i n = a a 样m i n - 避a m i n 。 过氧化物酶的活力：分解l p m 。1h 2 0 j m i n ) = 垒譬 式中：2 5 5 四邻甲基酚在波长4 3 6 n m 处的摩尔消光系数为2 5 5 x 1 0 6 。 相对酶活( m ，= 箍黟蔗 对照p o d 酶液( 未经高压脉冲电场处理) 不加电压，其它条件相同的情况 下在回路中循环1 次。 1 2 5 高压脉冲电场强度与酶失活动力学模型的建立以及数据处理方法 酶的失活程度与所处的电场强度e 直接相关，假设在电场强度低于某个值 时，该电场对酶没有钝化作用，电场强度达到该值时对酶开始有钝化作用，则称 该值为临界电场强度，用e c 表示。在e e c 时，酶的活力不随电场强度的变化 1 8 福建农林大学硕士学位论文高压脉冲电场对p o d 活性及各级结构的影响研究 而发生变化就，即可表示为d a d e = 0 ；在电场强度大于临界值时，酶的失活随 电场强度的增强而变化，假设酶失活程度随电场强度变化程度与酶的活力成正 比，即呈一级反应关系，比例系数为k 。即可表示为d a d e = 一k a ，负号表示随 着电场强度e 的上升，酶的活力减少。 将以上二式合并在一起就构成了一表示酶失活的动力学方程，如( 3 1 ) 式 所示。 坐：o e & d e 即 l 焉d a ：一k d e & 一= 一 丘2 止， d e 。 ( 3 - 1 ) 丝：一施e 4 ( 3 - 2 ) 肛= f o 木d e 睁一眦 。3 l n 丢“( e 吲 e 岛 。舢 尺= 1e e ， r ：晰七( e 一臣) ) c e ( 3 - 5 ) 该函数与h m s h e g e 提出的模型( 3 6 ) s = e - k c e e c )( 3 6 ) 1 9 福建农林大学硕士学位论文 高压脉冲电场对p o d 活性及各级结构的影响研究 系数，表示酶对高压脉冲电场敏感性的参数，其值越大，酶对电场越敏感，与酶 的种类和介质有关；e 为电场强度；e c 为l 瞄界电场强度，表示酶钝化所需要的 最低电场强度。 将在不同电场强度下对酶进行处理后测定的残余活力a 比原始活力舢，得 到酶的相对活力r = a a o ，将相对酶活力r 与对应的电场强度e 按 r = e x p ( - k 。( e - & ) ) 进行非线性拟合。 采用g a u s s - n e w t o n 迭代法进行迭代计算，求得参数七1 ，和k 2 ，k 2 是临界电场 强度e c 。也是分段函数的交点，根据e = 0 时n n 0 - 1 得到 r = 1 e 2 5 0 u m g ) 。溶剂为：双蒸水( 分析纯) 。 1 1 2 仪器 高压脉冲系统，w a t e r s2 6 9 5 高效液相色谱仪( w a t e r s 公司) ，w a t e r s2 9 9 6 型二极管阵列( p d a ) 检测器，葡聚糖凝胶( g p c ) 柱( 型号：u l t r a h y d r o g e ll i n e a r ) ， a 6 2 1 电流探头( 美国t e k t r o n i x ) ，t d s 3 0 1 2 b 数字荧光示波器( 美国 t e k t r o n ) ，p 6 0 1 5 a 示波器探头( 美国t e k t r o n ) ，p r o l i n e 型k h b 单 道可调移液器( 上海科华实验系统有限公司) 等。 1 2 试验方法 1 2 1p o d 酶液配制 p o d 晶体溶解于双蒸水中，配成p o d 水溶液，溶液浓度为o 1 m g m l ，4 c 冷藏，等待进行高压脉冲处理和作为对照样。 福建农林大学硕士学位论文高压脉冲电场对p o d 活性及各级结构的影响研究 1 2 2 试验方案的设计 p e f 系统处理酶过程中的主要参数有电场强度、脉冲数目、脉冲波形、脉冲 宽度和频率等。本试验设计中脉冲波形设定为方波，固定脉冲宽度为1 7 1 a s ，主 要研究在固定脉冲数目的条件下，不同电场强度条件处理下的单因素变化试验。 试验波形为方波，脉冲宽度1 7 邮，频率1 2 8 h z ，设计了4 个比较具有代表性 的电场强度梯度，分别为5k v c m ，1 0k v c m ，1 5k v c m 和2 0k v c m ，将1 2 1 中配制的酶溶液，分别经过各电场条件处理，处理的脉冲数目为n = 8 0 ，其他各 条件均一致。接着，将照样和处理后的样品进行下述的尺寸排阻色谱分析。 1 2 3 尺寸排阻色谱法 1 2 3 1 尺寸排阻色谱分离原理 尺寸排阻色谱是按分子大小顺序进行分离的一种色谱方法。其固定相为化学 惰性多孔物质凝胶，它类似于分子筛，但孔径比分子筛大闭。凝胶内具有一 定大小的空穴，体积大的分子不能渗透到空穴中去而被排阻，较早地被淋洗出来； 中等体积的分子部分渗透；小分子可完全渗透入内，最后洗出色谱柱。这样样品 分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。因此，试样物质将按相对分子 质量降低的次序被洗脱。 1 2 3 2 尺寸排阻色谱法 本研究采用的色谱条件为：w a t e r s2 6 9 5 高效液相色谱仪( w a t e r s 公司) ； w a t e r s2 9 9 6 型二极管阵列( p d a ) 检测器；色谱柱：水相葡聚糖凝胶( g p c ) 柱( 型号：u l t r a h y d r o g e ll i n e a r ) ；流动相：双蒸水；进样体积：2 0 i - t l ；流速：0 5 m l m i m 柱温：2 5 士5 ；数据采集时间：3 0 m i n ； 样品处理：样品浓度为o 1 m g m l ，经0 2 2 1 m a 微孔滤膜过滤。 2 结果与分析 2 1 不同电场强度处理下p o d 的高效液相二维重叠色谱图 下面各图为不同电场条件处理下的辣根过氧化物酶溶液，经过尺寸凝胶排阻 法后经紫外分光二极管阵列检测器所检测出在波长为2 1 0 n m 处的二维色谱图。 福建农林大学硕士学位论文高压脉冲电场对p o d 活性及各级结构的影响研究 图4 1 电场强度e = ok v c m 条件下p o d 的二维色谱图 f i g 4 - 1t h et w o - d i m e n s i o n a lc l l r o m a t o g r a mo f p o d a tt h ee l e c t r i cf i e l di n t e n s i t yo f ok v c m 图4 - 2 电场强度e = 5k v c m 条件下p o d 的二维色谱图 f i g 4 - 2t h et w o - d i m e n s i o n a lc h r d m a l o g 即mo fp o d a tt h ee l e c t r i cf i e l di n t e n s i t yo f5k v c m 图4 3 电场强度e = i ok v l c m 条件下p o d 的二维色谱图 f i g 4 - 3t h et w o - d i m e n s i o n a lc h r o m a t o g r a mo f p o d a tt h ee l e c t r i cf i e l di n t e n s i t yo f1 0k v c m 福建农林大学硕士学位论文 高压脉冲电场对p o d 活性及各级结构的影响研究 图4 - 4 电场强度e = 1 5k v c m 条件下p o d 的二维色谱图 f i g 4 - 4t h et w o - d i m e n s i o n a ld 删o g 阳mo fp o d a tt h ee l e c t r i cf i e l di n t e n s i t yo f15k v c m 图4 - 5 电场强度e = 2 0k v c m 条件下p o d 的二维色谱图 f i g 4 5t h et w o - d i m e n s i o n a lc l l r o m a t o g r a mo fp o d a tt h ee l e c t r i cf i e l di n t e n s i t yo f2 0k v c m 从上面各图可以看出，高压脉冲电场处理前后，p o d 溶液经过尺寸排阻后 的色谱图没有变化，波峰基本上一致。从信号强度对比来看，未经过高压脉冲电 场处理( 即e = ok v c m ) 条件下所检测出的信号稍微强一点，其他各电场条件下 的信号值均一样，这可能是由于实验误差引起的。 从整体来看，高压脉冲电场处理前后该溶液均出现两个特征峰，可以说只 有两种不同相对分子量的物质，其中一个出峰时间在1 2 分钟左右，另外一个出 峰时间在1 5 分钟左右。并未出现其他特殊的峰，即脉冲电场处理过程并未产生 新的分子。 福建农林人学硕士学位论文高压脉冲电场对p o d 活性及各级结构的影响研究 图4 - 6 是所检测出的三维色谱图，由于各处理条件下，所得色谱图除了信 号值有少许差别外，其他结果均一致，因此其三维色谱图也大致相同，本文将不 一一列出。 3 di 刳 分纠 图4 6p o d 的三维色谱图 f i g 4 - 6t h et h r e e - d i m e n s i o n a lc h r o m a t o g r a mo fp o d 从图4 - 6 中也可以很明显地看出，该酶溶液在2 1 0 n m 处有只有两个特征峰， 其中一个出峰时间在1 2 分钟左右，另外一个出峰时间在1 5 分钟左右。这可以为 将来研究p o d 的性质和结构提供理论依据。 2 2 尺寸排阻法分析高压脉冲电场条件下p o d 的一级结构变化情况 酶作为一种具有催化功能的蛋白质，它具有一般蛋白质分子所有的一级结构 和高级结构【3 1 。而蛋白质的一级结构通常是指蛋白质肽链的氨基酸残基的排列顺 序，也称为残基或氨基酸的序列。对由多个亚基组成的蛋白质而言，它们的一级 结构应该包括各个亚基肽链的一级结构【4 1 。 因此，蛋白质一级结构的变化，主要表现为肽链的断裂，或者亚基间二硫键 的断裂。 从本实验的结果来看，高压脉冲电场处理前后并没有新的小分子物质，所以 可以推论出整个过程蛋白质的肽链没有发生断裂，即蛋白质的一级结构未发生明 显改变。 福建农林大学硕士学位论文 高压脉冲电场对p o d 活性及各级结构的影响研究 3 结语 3 1 高压脉冲电场处理前后，p o d 溶液经过尺寸排阻后的色谱图没有变化，波峰 基本上一致。 3 2 高压脉冲电场处理前后该溶液均出现两个特征峰，其中一个出峰时间在1 2 分钟左右，另外一个出峰时间在1 5 分钟左右。并未出现其他特殊的峰，即脉冲 电场处理过程并未产生新的分子。 3 3 高压脉冲电场处理前后并没有新的小分子物质，所以可以推论出整个过程 p o d 蛋白的肽链没有发生断裂，即p o d 的一级结构未发生明显改变。 福建农林大学硕士学位论文 高压脉冲电场对p o d 活性及各级结构的影响研究 第五章红外光谱法分析高压脉冲电场处理条件 下p o d 二级结构的改变 红外光谱又称为分子振动转动光谱，是一种分子吸收光谱。当样品受到频率 连续变化的红外光照射时，分子吸收了某些频率的辐射，并由其振动或转动运动 引起偶极矩的净变化，产生分子振动和转动能级从基态到激发态的跃迁，使相应 于这些吸收区域的透射光强度减弱。记录红外光的百分透射比与波数或者波长关 系的曲线，就得到红外光谱【1 1 。红外光谱法不仅能进行定性和定量的分析，而且 从分子的特征吸收可以鉴定化合物和分子结构 2 1 。 本研究以p o d 酶制剂为试验材料，以高压脉冲对酶构象的改变为讨论因素， 采用红外光谱法，分析经过高压脉冲电场处理后，p o d 二级结构的改变情况， 为酶在高压脉冲电场条件下的酶失活机理提供了理论依据。 1 材料与方法 1 1 材料与仪器 1 1 1 材料 过氧化物酶：辣根过氧化物酶结晶粉末( r o c h e ；产品编号：p 1 2 1 6 0 6 ；l 屹= 3 0 ； 酶活力 2 5 0 u m g ) 。溶剂为：双蒸水( 分析纯) 。 1 1 2 仪器 高压脉冲系统，尼高力傅立叶变换红外分光光度计( i i 匕0 0 ，美国尼高力公 司) ，a 6 2 1 电流探头( 美国t e k t r o n ) ，t d s 3 0 1 2 b 数字荧光示波器( 美 国t e k 限o n ) ，p 6 0 1 5 a 示波器探头( 美国t e k t r o i n ) ，p r o l i n e 型k h b 单道可调移液器( 上海科华实验系统有限公司) 等。 1 2 试验方法 1 2 1p o d 酶液配制 p o d 晶体溶解于双蒸水中，配成p o d 水溶液，溶液浓度为0 1 m g m l ，4 。c 冷藏，等待进行高压脉冲处理和作为对照样。 1 2 2 试验方案的设计 p e f 系统处理酶过程中的主要参数有电场强度、脉冲数目、脉冲波形、脉冲 宽度和频率等。本试验设计中脉冲波形设定为方波，固定脉冲宽度为1 7 f t s ，主 要研究在固定脉冲数目的条件下，不同电场强度条件处理下的单因素变化试验。 2 9 福建农林大学硕士学位论文高压脉冲电场对p o d 活性及各级结构的影响研究 试验波形为方波，脉冲宽度1 7 邺，频率1 2 8 h z ，设计了6 个电场强度梯度， 分别为1 0k v c m ，1 2 5k v c m ，1 5k v c m ，1 7 5k v c n l ，2 0k v c m 和2 2 5k v c m ： 将1 2 1 中配制的酶溶液，分别经过各电场条件处理，处理的脉冲数目为n = 8 0 ， 其他各条件均一致。接着，将照样和处理后的样品进行下述的红外光谱分析。 1 2 3 红外光谱法 将未经过电场处理的原酶液和经过不同电场强度处理后的酶溶液，滴入晶片 上，放入吸收池，采用衰减全反射法，进行红外光谱测定。红外光谱测定采用瓜 2 0 0 傅立叶变换红外光谱仪( n i c o l e t 公司) 。红外光谱测试范围为7 8 0 0 3 7 5 c m 1 ， 分辨率lc m 1 ，经2 0 次扫描获得红外图谱。 用仪器自带的o m n i ce s p 5 1 软件包对所得红外光谱酰胺i 带进行两点基 线校正，并进行7 点s a v i t s k g o l a y 函数平滑处理，再作二阶导数和傅立叶去卷 积处理【3 】，参数取值：半峰全费：( b a n d w i d t h ) 1 8 ，增强因子( e n l 眦e m e n tf a c t o r ) 2 3 。 结合二阶导数谱和去卷积谱得到的子峰峰位，进行相应的溶液分子的二级结构构 象指认。根据各子峰的吸收频率，利用m i c r o s o f to 啦血数学软件对谱图进行高斯 曲线拟合，多次拟合使残差最小。 2 结果与分析 2 1p o d 的红外光谱图 下图5 1 是i r 2 0 0 傅立叶变换红外光谱仪所检测出的辣根过氧化物酶的红外 光谱图，其中纵坐标代表百分透射比( t ) ，横坐标代表波数( w a v e n u m b e r c m - 1 ) ，因而吸收峰向下，向上则为谷。 福建农林大学硕士学位论文高压脉冲电场对p o d 活性及各级结构的影响研究 4 0 0 0 3 0 0 02 0 0 01 0 0 0 w a v e n u m b e r s ( c , r n 1 ) 图5 1p o d 的红外光谱图 f i g 5 - 1t h ei n f r a r e dp h o t o g r a p h i co fp o d， 从图5 1 中可以看出，p o d 的红外光谱中，主要的特征峰有两个，一个分布 在波数为1 6 0 0 1 7 0 0 c m - 1 范围内，另外一个分布在3 2 0 0 3 4 0 0 c m 1 范围内。依据 有关文献，查相关表【4 】得出，波数在1 6 0 0 1 7 0 0 c m 1 范围内的吸收带为酰胺i 带， 主要振动模式是c = o 伸缩振动，而波数在3 2 0 0 3 4 0 0 c m 一1 范围内的吸收带为酰 胺a 带，主要是n h 的伸缩振动。其中最常用于二级结构分析的是酰胺i 带， 它的振动频率取决于c = o 和h - n 之间的氢键性质，即特征振动频率反映了多肽 或蛋白质的特定二级结构( 0 【螺旋、p 折叠、p 转角和无规卷曲) 【4 】。 2 2 红外光谱法分析不同电场强度条件下p o d 二级结构的变化 下图为辣根过氧化物酶经过红外光谱得出的酰胺i 带的区卷积谱，对照组酰 胺i 带存在8 个子峰：1 6 9 3 、1 6 8 1 、1 6 7 0 、1 6 6 1 、1 6 5 1 、1 6 4 3 、1 6 3 2 和1 6 2 3 c m 由图可以看出，经过不同电场强度处理后，辣根过氧化物酶去卷积谱的各子峰峰 位没有明显移动，但峰强度有不同程度的变化。与未经过高压脉冲电场处理的对 照组相比，经过电场处理后：1 6 2 3 c m 、1 6 3 2 c m d 和1 6 9 3 c m 1 峰相对较强，除了 在1 0 k v c m 略有降低，其他场强下均为增加：1 6 4 3c m q 峰相对强度在l o k v c m 和2 0 k v c m 场强时有明显降低；在l o k v c m 和1 5 k v c m 场强时，1 6 6 1c m 。1 和 1 6 5 1c m 1 峰相对增强，1 6 7 0c m 、1 6 8 1c m d 峰相对强度普遍下降。 西uiec廷一乒 福建农林大学硕士学位论文 高压脉冲电场对p o d 活性及各级结构的影响研究 7 加1 7 潮1 戳1 8 4 0 渤l 湖 v a l v en u m 的r ( c r n 一脚蠹y ? 沌n 锄 一鼢j 缴移饿黔盼 7 2 0t 7 0 01 湖1 01 溯 嘲1 湖 _ 馐镩嘲m b e r 丽d 参哦镰铲庇t 精面 一鼢j 错v 峨嶷鼬 w a v en l 柳蝤瞳f 【耐 一l 撇够7 e 曩i 铷田 一黪蚋妒一馄 确酪 w a v en m b e r ( c r n 4 ) ”嗣强 孵 一肛j 2 骚粥瞧胎鳓 黔溅影e 曩曩印 一鼢l 无辍黪踟 1 7 2 0 7 渤懒d1 蝴1 鼢1 朔 蝴n 堋慨r l 册，l 一鳅矿，c 髫神 一溅辍矿1 饥煳 图5 - 2 不同电场强度下p o d 的酰胺i 带区卷积谱对照图 f i g 5 2t h ec o n v o l u t i o ns p e c t r u m so f a m i d e io np o dw i t hd i f f e r e n ti n t e n s i t yo fe l e c t r i cf i e l d 3 2 d亡口xzt日 矗蚤要薹o 5 4 3 2 ， o ， o o o 谯 & n n -嚣iueq毫 福建农林大学硕士学位论文高压脉冲电场对p o d 活性及各级结构的影响研究 从上面的图，可以很明显的看出，不同高压脉冲电场条件下，辣根过氧化物 酶的酰胺i 带特征峰的具体变化情况。 根据文献报道【5 一，可将辣根过氧化物酶酰胺i 带各子蜂归属为不同的二级 结构：1 6 5 1c m ，1 6 6 1c m 一，峰归属为a 螺旋结构；1 6 2 3c m 一、1 6 3 2c m 、1 6 9 3 c m 1 峰归属为p 折叠结构；1 6 7 0c m 1 、1 6 8 1c m 1 峰归属为p 转角结构；1 6 4 3c m 1 峰归属为无规则卷曲结构。由上面的去卷积图变化情况，可以看出：经过高压脉 冲电场处理后，仅螺旋结构和p 折叠结构的特征峰相对强度增强，表明它们的结 构含量增加；p 一转角与无规卷曲的特征峰相对强度降低，表明它们的结构含量减 少。 对酰胺i 带去卷积谱进行曲线拟合。下表给出各电场处理条件下辣根过氧化 物酶二级结构含量计算结果。 表5 1 不同电场强度处理后的p o d 二级结构含量( 脉冲个数为8 0 ) t a b 5 - 1t h ec o n t e n t so f s e c o n d a r ys t r u c t u r eo f p o dt r e a t e dw i t hd i f f e r e n t i n t e n s i t i e so fe l e c t r i cf i e l d ( n u m b e r = - 8 0 ) 电场强度 ( k v c m ) 各结叶螺旋 3 2 53 5 23 2 33 4 33 3 93 2 53 3 3 构含 p 一折叠 2 4 32 3 92 5 4。2 4 42 4 52 5 32 4 8 量( ) p 一转角 3 1 02 9 13 0 02 9 12 9 53 0 63 0 5 无规卷 1 2 21 1 81 2 31 2 21 2 11 1 61 1 4 曲 由表5 1 可知，辣根过氧化物酶二级结构主链以仅螺旋结构为主，这点与已 有的报道基本一致 g - 0 。计算表明：辣根过氧化物酶的二级结构单元的变化，随 着电场强度的增加，呈非单调型变化。 由表5 1 可以得出以下结论：( 1 ) a 螺旋结构的含量：与对照组相比，除了电 场强度为1 2 5 k v c m 时有所降低，降幅为0 2 外，其他电场条件下均为增加， 其中电场强度为1 0 0 k v c m 时，增幅最大，达到2 7 ；( 2 ) 3 - 折叠结构的含量： 与对照组相比，除了电场强度在1 0 0 k v c m 时有所降低，降幅为o 4 ，其他电 福建农林大学硕士学位论文高压脉冲电场对p o d 活性及各级结构的影响研究 场条件下均为增加，其中电场强度为2 0 0 k v c m 时增幅最大，达到1 o ；( 3 ) 1 3 转角的含量：与对照组相比，含量呈现下降趋势，其中电场强度为1 0 0 k v c m 和 1 5 0 k v c m 时，降幅最大，为1 9 ，电场强度为2 0 0 k v c m 时，降幅最小，为 o 4 ；( 4 ) 无规卷曲：与对照组相比，除了电场强度为1 2 5 k v c m 时有所增加， 增幅为0 1 外，其他电场条件下均有下降趋势，其中电场强度为2 2 5 k v c m 时 降幅最大，达到o 8 。 研究结果表明：高压脉冲电场对辣根过氧化物酶的作用，可使辣根过氧化物 酶的二级结构中的p 转角和无规卷曲向a 螺旋和b 折叠转化。由已知文献【1 0 】我 们知道：蛋白质的二级结构是指多肽链骨架中局部肽段的构象，a 一螺旋和d 折叠 结构中存在较多的氢键，导致规n - 级结构具有一定的刚性：p 转角和无规卷曲 中不存在氢键或其他的相互作用，使肽段中的各个残基间有更大的自由度，没有刚 性，从而表现出极大的柔性。蛋白质分子a 螺旋和b 折叠的稳定性主要取决于分 子内部的氢键。蛋白质分子中氢键是其中一个氨基酸残基上的氢原子与另一个氨 基酸残基上的氧原子由于静电引力而形成。因此，通过我们的实验结果，可以表 明电场的作用，会导致辣根过氧化物酶二级结构的变化，从而引起酶构象的改变， 最终导致了酶活力的改变。 3 结语 3 1 经过不同电场强度处理后，p o d 去卷积谱的各子峰峰位没有明显移动，但峰 强度有不同程度的变化。 3 2 经过不同电场强度处理后，p o d 的二级结构单元( a 螺旋、p 折叠、p 转角 和无规卷曲) 的变化，随着电场强度的增加，呈非单调型变化。 3 3 高压脉冲电场对p o d 的作用，可使p o d 的二级结构中的d 转角和无规卷曲 向a 螺旋和d 折叠转化。 3