结核病鉴别诊断相关实验室检测项目PPT课件.ppt

结核病鉴别诊断相关实验室检测项目乐军上海市结核病重点实验室同济大学附属上海市肺科医院,1,题纲,1.结核与肺癌鉴别诊断相关实验室检测2.结核与不典型肺部感染相关实验室检测3.结核与肺部真菌感染相关实验室检测4.结核与肺吸虫感染相关实验室检测5.T-SPOT技术在结核鉴别诊断中应用价值,2,第一.结核与肺癌鉴别诊断相关实验室检测,3,DiagnosisofPrimaryTumor原发性肿瘤的诊断,SputumCytology痰液脱落细胞学FlexibleBronchoscopyandBiopsy纤维支气管检测TTNAtransthoracicneedleaspiration经皮肺穿刺CellTypeAccuracy细胞分型准确性,4,中央的病变、支气管镜检查是确定恶性肿瘤诊断的最灵敏的方法。小的（ie,70单位-诊断如果胸膜液干扰素高-诊断胸膜活检肉芽肿-诊断如果淋巴细胞的渗出液和PPD阳性，如果胸膜液ADA超出40，对结核病胸膜炎治疗如果淋巴细胞的渗出物和阴性的PPD，5周后重新试验PPD，如果阳性治疗。,25,第二，结核与不典型肺部感染相关实验室检测,26,社区获得性肺炎的诊断,27,CAP的症状特点,1.细菌急性发作，高烧、咳嗽，脓性痰，CRP浓度高，典型临床的发现和Xray2.非典型起病缓慢，发烧（常常没有咳嗽）、痰液少见或没有、低到中度CRP水平、无特异性的临床的发现、X光显示肺炎,28,社区获得肺炎（CAP）,细菌肺炎链球菌，嗜血杆菌、莫拉氏菌属、革兰氏阴性杆菌，其它非典型“肺炎支原体、衣原体、军团菌、病毒,29,非典型肺炎的致病因子,Mycoplasmapneumoniae肺炎支原体Chlamydiapneumoniae肺炎衣原体Legionellasp.军团菌Viruses病毒,30,肺炎支原体,每45年爆发流行可检测散在病例主要儿童和青年人,31,肺炎支原体诊断,病原体直接检测培养抗原检测DNA检测(PCR)抗体检测,32,病原体直接检测,培养慢,敏感性低抗原检测未广泛使用,敏感性低DNA检测(PCR)非常有希望主要问题是符合要求标本,33,抗体检测,补体结合反应(CBR)抗体滴度4倍升高最灵敏和最特异酶联免疫检测(EIA)IgG,IgA,IgM种类根据不同试验厂家，结果有差异。,34,EIA试验的比较,不同的厂商5种试剂盒所有血清检测IgG、IgA,IgM抗体一组CBR阳转和CBR阴性的血清,35,结果,敏感性IgA68-97%,IgM87-97%特异性IgA76-100%,IgM60-99%阳性预测值PPVIgA91-99%,IgM90-99%阴性预测值NPVIgA50-90%,IgM78-91%,36,EIA试验缺陷,高灵敏度结合低特异性，反之亦然没有一个厂家IgA和IgM两者检测都具有高品质第一个标本检测可正确诊断大约40%的病例,37,结论(支原体),仔细的选择厂商并且使用试剂是非常重要。没有一种方法是十全十美，高灵敏度具有低特异性。第一标本检测可诊断40%病例。,38,肺炎衣原体,常见于老年人，导致其它的疾病患者并发症。局部地爆发，没有典型的周期性。多数病例是散在的。,39,肺炎衣原体诊断,病原体直接检测培养抗原检测DNA检测(PCR)抗体检测,40,病原体直接检测,培养困难抗原检测特异性和敏感性低DNA检测(PCR)非常有希望主要问题是符合要求标本,41,抗体检测,EIA酶免疫属特异的、在感染初期灵敏较差、疾病痊愈后一段时间检出抗体Imunofluorescenttest(MIF)免疫荧光金标准，耗时间和费力Immunoblott免疫印迹验证方法,42,免疫印迹检测急性感染的结果,一组有临床的和微生物学的标志，急性的肺炎衣原体感染患者43份血清一致结果(MIFandIB)63%免疫印迹阴性或临界IgA21%IB阴性,MIF阳性16%恢复期患者血样结果证明诊断C.trachomatis呼吸道感染患儿(6)100%,43,慢性的衣原体感染免疫印迹检测结果,检测一组80份若干月持续IgG和IgAMIF肺炎衣原体抗体血清IB阳性IgGandIgA31%IB阳性仅仅IgG51%IB阴性18%,44,抗体不是疾病，没有相应疾病抗体水平治疗是严重的错误。导致不合理使用抗生素和抗生素耐药性增加。,45,结论(衣原体),IB免疫印迹是一种验证方法。IB敏感性比MIF低（急性感染早期可能为阴性)。结果的解释应该根据实验室和临床资料以及患者病史。所谓持续感染是诊断的问题。只有长期患者随访和重复测试才有帮助。,46,结论,肺炎支原体和肺炎衣原体的诊断主要依靠抗体检测试验。培养和PCR有其各自局限性(符合要求标本)仔细选择试验以及利用临床资料合理解释结果似乎是主要的。没有解释，结果造成误导。,47,第三，结核与肺部真菌感染鉴别诊断相关实验室检测,48,检验特点,形态学检查为检测真菌的重要手段抗原检测适合血清和脑脊液中隐球菌、念珠菌、荚膜组织胞浆菌。血清学诊断适用于深部真菌感染。,49,检测程序,标本,直接镜检,抗原检出,分离培养,不染色,乳酸酚棉蓝染色,墨汁染色,氢氧化钾消化后涂片镜检,二相性真菌,脑心浸液,脑心浸液,沙氏培养基,病原性真菌,血琼脂平板,观察菌落性状和菌丝孢子形态,50,显微镜检查-湿片法或直接涂片高倍视野镜检，见有菌丝孢子或单细胞真菌（有诊断价值，但不能确定真菌种类）,51,52,53,54,55,56,57,真菌的菌落-真菌分类重要的依据,真菌的菌落一般是指在一定基质上，接种某种真菌的一个孢子或一段菌丝，经过培养，向四周蔓延生长出丝状的群体称为真菌菌落。菌落呈放射状生长，因而菌落外周的生命力最旺盛。在不同成分的培养基上和不同条件下培养，同一种真菌，形成的菌落也有差别。因此，菌落的形态观察是指在固定的条件下，菌落所表现的形状、大小、色泽和结构等。不同的真菌菌落所表现特征差别显著，它为真菌分类工作提供了重要的依据。,58,菌落颜色,除酵母菌的菌落比较简单，丝状真菌的菌落形态各种各样。常以下述特征加以描述。其颜色的多样很难用色泽描述，常借助于色谱加以鉴别。很多真菌产生多种颜色的色素，使菌落的背面染有颜色，有的甚至分泌可溶性色素，扩散到全部基质中去。,59,菌落质地,气生菌丝构成表面菌丝体质地。底部菌丝体埋伏于培养基中或紧贴培养基表面向四周蔓延，由底部体直接生出分生孢子梗，菌落外观呈短茸毛状，由底部菌丝体生出气生菌丝，再由它生出分生孢子梗，因而往往有缠绕的气生菌丝团，一般菌落较厚，呈絮状。也有部分气生菌丝扭结成绳索、还有分生孢子梗自底部菌丝成束地生长，在菌落的外观上成粒状或粉状。有些真菌产生子实体或菌核，则菌落表面呈颗粒结构。有的菌落出现同心环或辐射状沟纹。有的真菌只在菌落中间区域生出分生孢子头，边缘菌丝则不生育。菌落的大小也大有不同，有些种的菌落可蔓延扩展到整个培养基，而另一些种的菌落则局限生长。,60,真菌菌落外观结构描述,菌落表面平滑或具皱纹、致密或疏松、同心环或辐射状沟纹等；菌落质地绒毛状、毡状、棉絮状、羊毛状、束状、绳索状、粉粒状、明胶状或皮革状等；菌落的边缘可呈全缘、锯齿状、树枝状或纤毛状等；菌落高度扁平、丘状隆起、中心部分突起或凹陷等。,61,62,193patients(392samples);43withICSensitivitySpecificityMannan(ag)40%98%Antimannan(ab)53%94%agand/orab80%93%,（一）抗原：甘露聚糖DetectionofMannan/AntimannaninSerumofPatientswithInvasiveCandidiasis,SendidBetal,JClinMicrobiol1999;37:1510-7,63,（二）抗原：半乳甘露聚糖SerialAspergillusGalactomannanScreening,n=362high-riskneutropenicpatientsSandwichELISA2timesweekly,11.7%positiven=30provenIAn=9probableIAn=264withnoIASensitivity89.7%Specificity98.1%PPV87.5%NPV98.4%,MaertensJetal,Blood2001;97:1604-10,64,GM抗原检测用于侵袭性曲霉病诊断,与临床诊断和疗效反应有良好的一致性。检测方法有ELISA、放射免疫分析（RIA）和乳胶凝集试验等，但敏感性低。ELISA检测24只兔(王莉，等。2003)敏感性和特异性：血清95%78%尿液90%51.4%,65,检测曲霉GM抗原的ELISA试验,66,GM抗原ELISA检测方法（Platelia试剂盒）,48例患者：确诊IA4例，3例阳性；高度怀疑IA13例，8例阳性；可疑IA31例，2例阳性。,灵敏性为64.7%特异性为93.5%假阳性率为6.5%假阴性率为35.3%,67,（三）新生隐球菌乳胶凝集试验,68,（四）-1,3葡聚糖,使用仪器及配套试剂盒能快速地检测出血液和体液中真菌-1,3葡聚糖的实际含量，对真菌的早期诊断具有重要意义。,69,-1,3-D-葡聚糖检测阴性是否需要作进一步的复查？,Furuya的报道即使是确诊的深部真菌感染患者,-1,3-D-葡聚糖检测也有可能是阴性,因此单次-1,3-D-葡聚糖检测阴性并不能排除深部真菌感染的可能，必須在疾病的过程中重复进行-1,3-D-葡聚糖检测。,FuruyaTetal.Usefulnessof-D-glucanmeasurementfordiagnosisofdeepmycosis,JnpJAntibiot1993;46(6):437-443,70,确诊深部真菌感染病人病史調查,临床表现及影像学检查:,1)发热、咳嗽、痰血10余天,2)抗生素治疗效果不佳,3)胸部CT检查,发现左肺阴影,支氣管鏡活組織檢查:,找見真菌,71,真菌分子生物学的鉴定方法,核酸碱基GC比分析限制性片段长度多态性Southern印迹分析脉冲场凝胶电泳（PFGE）PCR随机扩增多态性(RAPD)DNA片段测序等,72,分子流行病学研究,YuJ，etal.Mycopathologia,2004.,引物OPI07RAPD扩增结果,引物OPK20RAPD扩增结果,IGS区扩增结果,73,真菌感染检查项目的选择和应用,浅部真菌直接显微镜检查深部真菌标本培养、观察培养物性状并借助理化特性作鉴别。,74,DirectExamination,Itishighlyrecommendedthatadirectmicroscopicexaminationbemadeonmostthisprovideanimmediatepresumptivediagnosisforthephysician,butitmayalsoaidintheselectionofanappropriateculturemedium.Aphase-contrastmicroscopeisavaluableadjunctinthedirectexaminationofspecimens.Theadvantagesincludethefollowing:1)mountscanbemadeandexaminedquickly;2)thereisnoneedfordirectstaining;and3)theobjectscanbeclearlyvisualized.,75,Testsfordetectionoffungalantibodies(1),Determinationofantibodyand/orantigentitersmaybeusefulindiagnosingfungalinfectionsandwhenperformedinaserialfashionalsoprovideameansofmonitoringtheprogressionofdiseaseandthepatientsresponsetotherapy.,76,Withtheexceptionofantibodytestsforhistoplasmosisandoccidioidomycosis,however,mosttestsdesignedtodetectanantibodyresponseasameansofdiagnosinginvasivefungalinfectionslacksensitivityandspecificity,arepoorlystandardizedandarenotwidelyavailable,Testsfordetectionoffungalantibodies(2),77,Testsfordetectionoffungalantibodies(3),AntibodytestsforCandidaandAspergillus.AreoftenunabletodistinguishactivefrompastinfectionandColonizationfromtransientfungemia,78,Testsfordetectionoffungalantibodies(4),Inaddition,anegativetestforfungus-specificantibodiesdoesnotruleoutinfectionbecauseimunocompromisedpatients,andsomeindividualswithdisseminatedinfectionmaynotmountanantibodyresponsetotheinfectingorganism.,79,Testsfordetectionoffungalantigens(1),Detectionoffungalantigensormetabolitesinserumorotherbodyfluidsrepresentsthemostdirectmeansofprovidingaserologicdiagnosisofinvasivefungalinfection.BoththeRIAandtheEIAtestshavebeenshowntoberapid,sensitive,specific,rapid,andreproducible.,80,Testsfordetectionoffungalantigens(2),Althoughsignificantadvanceshavebeenmadeinrecentyears,mostmethodsforrapiddetectionoffungalantigensareavailableonlyinresearchlaboratories.NotableexceptionsarethetestsfordetectionofthepolysaccharidrideantigensofC.neoformansandH.capsulatumd.,81,Testsfordetectionoffungal-specificnucleicacidsequences(1),TheuseofthePCRtodetectfungalnucleicacidsdirectlyinclinicalmaterialoffersgreatpromisefortherapiddiagnosisoffungalinfections.,82,Testsfordetectionoffungal-specificnucleicacidsequences(2),Inadditiontodetectionoffungalpathogensinclinicalterid,immunologicandmolecularapproacheshavebeenappliedsuccessfullytotheidentificationoffungiinculture.,83,第四，结核与肺吸虫感染相关实验室检测,84,卫氏并殖吸虫,Paragonimuswestermani,（肺吸虫）,85,一.形态,(一)成虫形态特征:1.外部形态:（1）形状椭圆形肥厚背隆起腹扁平半粒黄豆状（2）大小长7.512mm宽46mm（3）颜色活时半透明肉红色固定后灰白色（4）口、腹吸盘位置及大小比例：口吸盘：前端腹面与腹吸盘大小相仿腹吸盘：腹中横线稍前,86,2.内部结构:(1)生殖系统雌雄同体特征“并列排列”雄性生殖系统1对睾丸边缘分支左右并列于虫体后1/3处雌性生殖系统卵巢分叶子宫管状弯曲盘绕内含虫卵二者左右并列(2)消化系统同概论但2支肠管呈螺旋状弯曲,87,肺吸虫成虫,88,肺吸虫虫卵,89,二.生活史,(一)发育过程:,虫卵,粪便,入水,川卷螺,毛蚴,胞蚴,母子雷蚴,尾蚴,出螺入水,淡水蟹、喇蛄,囊蚴,（肺）成虫,人食入,童虫,成虫,第一中间宿主（无性增殖）,第二中间宿主,终宿主（有性生殖）,90,91,肺吸虫囊蚴脱囊而出,92,川卷螺,93,94,（二）生活史要点,1.宿主关系:第一中间宿主:川卷螺第二中间宿主:淡水蟹喇蛄终宿主:人保虫宿主:食肉动物如猫、犬、虎、豹、狼、狐等转续宿主:野猪等2.感染阶段：囊蚴感染途径与方式：经口感染,食入含囊蚴的淡水蟹、喇蛄而感染3.寄生部位（成虫）：肺异位寄生部位:皮下组织肝脑脊髓等处成虫寿命:一般56年,95,三.致病,临床分型:1.胸肺型肺吸虫病似肺结核症状2.腹型肺吸虫病3.脑型肺吸虫病4.皮下型肺吸虫病皮下多处结节5.肝型肺吸虫病,96,肺吸虫寄生于肺,97,98,四.实验诊断,病原检查：1.检查阶段：虫卵或童虫2.取材：粪便痰液3.方法：查虫卵(1)生理盐水直接涂片法(2)集卵法氢氧化钠消化法查童虫皮下结节活组织检查免疫学诊断,99,五.流行及防治,关键因素:当地人群有生食或半生食含囊蚴的淡水蟹、喇蛄的习惯防治关键:勿生食淡水蟹、喇蛄生、熟食菜板要分开,100,第五，T-SPOT技术在结核鉴别诊断中应用价值,101,T-SPOT.TB结核感染T细胞斑点实验,全球最准确的快速结核感染检测,102,效应T细胞的检测干扰素释放实验,原理：结核感染者体内存在特异的效应T淋巴细胞，效应T淋巴细胞再次受到结核抗原刺激时会分泌多种细胞因子（IFN-）。因此，检测效应T淋巴细胞可用于结核病或结核潜伏感染者的诊断。由于效应T细胞存活时间很短，而且具有特异性，因此可以作为机体是否正处于被感染的指标，无论是否有临床症状。,103,T-SPOT.TB技术,利用结核杆菌感染者外周血单核细胞中存在结核特异的效应T淋巴细胞，这些淋巴细胞在受到结核杆菌特异抗原刺激后分泌IFN-而设计的T细胞免疫斑点试验。利用高灵敏的酶联免疫试验(ELISPOT)检测对结核菌特异的T淋巴细胞的方法，为结核病快速诊断开辟了一条新的思路。,104,检测用的抗原ESAT-6、CFP-10,Mahairas等在1996年发现的一段存在结核分枝杆菌(简称结核杆菌)中名为“RD1”的基因序列，而在卡介苗菌株和大部分环境分枝杆菌的基因中则缺乏RD1序列。RD1编码产生2种蛋白：ESAT-6（earlysecretedantigenictarget6）和CFP-10(culturefiltrateprotein10)，ESAT-6和CFP-10作为特异性抗原刺激机体特异性T细胞产生IFN-。,105,BCG进化过程,106,ELISPOT和结核特异抗原整合结核感染诊断技术TSPOT-TB,ELISPOT的灵敏性决定了TSPOT-TB的灵敏性ESAT-6和CFP-10两个抗原的特异性决定了TSPOT-TB的特异性,107,检测过程,108,109,110,111,112,113,实际结果,114,优点,特异性高：只针对结核分枝杆菌复合群敏感，对BCG和大多数环境分枝杆菌不敏感，特异性99%。灵敏度高：对活动性结核及肺外结核，敏感性96%。快速简便：简单的实验室血液检查，24小时报告结果。,115,国外临床应用总结-灵敏度,116,国外临床应用总结-特异性,117,T-SPOT.TB,Guidelines,118,NICEguidelines,SpecificallymentionedIGRAsforthefollowinguses:Children(4weeksto2years)NHSemployeesContacttracingNewEntrants,119,DraftInterimHPAGuidance,InLTBITSTshouldbecarriedoutfirstandthosethatarepositiveshouldbeconsideredforIGRAtestingifavailable.Thiswouldalsoapplytonewentrantscreening.IGRAsshouldbetheonlytestusedinthefollowingsituations:WhereTSTmaybefalselynegativeduetoimmunosuppressionWhenscreeningalargenumberofpeopleaspartofapublichealthinvestigationssincerepeatedvisitswouldbeimpracticalSpecificapplicationsofIGRAswerementioned:NewhealthcareworkersshouldbetestedwithIGRAsInpre-TNFalphascreeningIGRAsmaybeasuitablealternativeinBCGvaccinatedsubjects.,120,SwissLungAssociationBulletin45/10,TheseguidelineswereissuedinNovember2005:ConfirmpositiveMantouxtestswithabloodtestUseonlyabloodtestinimmunocompromisedsubjectsChildrenareexcludedfrombeingtestedwithbloodtestsInDecember2007guidelinesforTNFscreeningwerereleased:AllpatientsbeingconsideredforTNFtherapyshouldbescreenedforLTBIScreeningshouldbebasedonhistory,chestx-rayandIGRATSTisnolongerrecommendedPatientswithabnormalx-rayshouldfurthertestingandbetreatedaccordinglyPreventivetreatmentshouldbegivenwhereLTBIissuspectedasaresultof:PositiveIGRAAbnormalx-raysuggestingTBwhichwasnotadequatelytreate