（农产品加工及贮藏工程专业论文）菊粉酶高产菌株的生物学特性研究.pdf

摘要 本论文以菊粉酶的高产菌株a s p n i g e rm 8 9 、a s p n i g e rh 8 和突变菌株 a s p n i g e ruy - 2 为研究对象，对三株菌的主要生物学特性进行了研究。研究内容 包括菌株形态学研究、菌株所产酶系的研究和菊粉酶基因序列的研究。 在菌株形态学研究方面，对三株高产菊粉酶菌株在察氏培养基、麦芽汁培养基、 p d a 培养基、同化亚硝酸盐培养基中的菌落形态；显微镜下的分生孢子头、分生孢子 梗、足细胞、顶囊等个体形态；扫描电镜下的分生孢子表面形态等方面做了较系统的 研究。根据资料可将菌株a s p n i g e rm 8 9 和a s p n i g e rh 8 鉴定为黑曲霉群泡盛酒 曲霉种( a s p e r g i l l u sa w a m o r i ) ，诱变菌株爿印n i g e r uy 一2 可鉴定到黑曲霉群臭曲 霉种( a s p e r g i l l u s ，0 e t i d e s ) 。诱变使菌落形态发生了很大的变化。并且通过此方 面的研究建立起一套简便有效的用于霉菌形态鉴定当中样品的处理方法。 对菌株所产酶系的研究方面，分别测了菊粉酶、蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、纤维 素酶的产生曲线。此三株菌株除高产菊粉酶外，均产生不同水平的蛋白酶、淀粉酶、 果胶酶、纤维素酶，其中菊粉酶的产酶水平较高，产其他酶系的活力相对较低。诱变 菌株除菊粉酶活力大幅度提高以夕 ，淀粉酶和果胶酶也有明显提高。对于同一菌株来 说酶系中不同酶的产酶高峰不同，酶量高峰出现的早晚不同。其酶活力高峰随发酵时 间依次是蛋白酶、淀粉酶、菊粉酶和果胶酶，纤维素酶因不同菌株有一定差异。 针对6 e n b a n k 所报道的四种来源于黑曲霉菌株的菊粉酶序列，分别设计引物，以 本研究菌株基因组d n a 为模版，进行p c r 扩增，并进行了核苷酸序列的测序。测序结 果与原序列进行了同源性比较分析，同源性并不高，可以推测本研究菌株所产菊粉酶 基因序列与所报道的有所不同。 关键词：黑曲霉：菊粉酶：生物学特性；形态学；酶系；分子生物学 s t u d yo nb i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so fs t r a i n sw i t hh i g hi n u l i n a s e “ a c t i v i t y a u t h o r ：z h a n g ，r u i l i n g t u t o r ：j i a ，y i n g m i n m a j o r ：f o o dm i c r o b i o l o g y a b s t t a c t a s p e r g i l l u sn i g e rm 8 9 ，a s p n i g e rh 8a n da s p e r g i l l u sn i g e ru 丫一2 a r ea l l i n u l i n a s eh i g h y i e l d i n gs t r a i n s ，w h o s em a j o rb i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c sh a v eb e e ns t u d i e d i nt h i sp a p e r t h er e s e a r c hc o n t e n ti n c l u d e st h es t u d i e so nm o r p h o l o g y ，m a j o re n z y m e s y s t e m so ft h es t r a i n sa n dt h ep r e l i m i n a r ys t u d yo fi n u l i n a s eg e n e s f o rr e s e a r c h i n gt h em o r p h o l o g i e so ft h es t r a i n s ih a dt u r n e dt h es t r a i n sr e s p e c t i v e l y i nc z a p e k 、m e a 、p d aa n dc u l t u r em e d i at h a tc o u l da s s i m i l a t en i t r o u sa c i ds a l tt oo b s e r v e t h ec h a r a c t e r so ft h em o r p h o l o g i e so ft h ec o l o n i e s a tt h es a m et i m et h eo b s e r v a t i o no ft h e m i c r o s c o p i c a lf e a t u r eo ft h ei n d i v i d u a ls t r a i na n d t h eo b s e r v a t i o no ft h ec o n i d i u mo ft h e s t r a i nb yt h es c a n n i n ge l e c t r o n i cm i c r o s c o p ea r ed o n e a c c o r d i n gt ot h ei n f o r m a t i o nw e d i v i d ea s p n i g e rm 8 9a n da s p n i g e rh 8i n t oa s p e r g i l l u sg e n u s ，a s p e r g i l l u sn i g e r s e c t i o n a s p e r g i l l u sa w a m o r is p e c i e s t h em u t a n t s t r a i na s p n i g e r i a 丫一2c a nb e d i v i d e di n t o a s p e r g i l l u sg e n u s ，a s p e r g i l l u sn i g e rs e c t i o na s p e r g i l l u s f o e t i d e ss p e c i e s t h em u t a n tm a k e st h em o r p h o l o g yo ft h ec o l o n yc h a n g e dg r e a t l y as e to fe a s ya n d h i g h e f f i c i e n tm e t h o d su s e dt oi d e n t i f yt h em o r p h o l o g i e so ft h em o u l dw e r es e tu pt h r o u g ht h o s e s t u d i e s o nt h er e s e a r c ho fe n z y m es y s t e mp r o d u c e db yt h es t r a i n s ，w eh a dm e a s u r e dt h e g r o w i n gc u r v e so ft h ei n u l i n a s e 、p r o t e a s e 、a m y l a s e 、a m y l a s e 、 a n dc e l l u l o s ee n z y m e e x c e p t i n gt h eh i g hy i e l d i n gi n u l i n a s e ，t h i st h r e es t r a i n sa l s oh a v ed i f f e r e n tl e v e l si n p r o t e a s e 、a m y l a s e 、p e c t i n a s e 、a n d c e l l u l o s ee n z y m e a m o n gt h e s e ，t h ep r o d u c t i o no ft h e i n u l i n a s ei sh i g h e rt h a nt h eo t h e r s b e s i d e st h ei n u l i n a s ea c t i v i t yo fm u t a n ts t r a i na s p n i g e r uy - 2r a i s e ds u b s t a n t i a l l y a m y l a s ea n dp e c t i n a s ea l s oh a v eb e e no b v i o u s l yr a i s e d f o r d i f f e r e n te n z y m eo ft h es a m es t r a i n ，t h et i m ei sd i f f e r e n c et h a tr e a c h e st h eh i g h e s te n z y m e a c t i v i t y f o l l o w e dt of e r m e n tt i m e ，p r o t e a s e ，a m y l a s e ，i n u l i n a s ea n dp e c t i n a s er e a c h e st h e h i g h e s te n z y m ea c t i v i t y c e l l u l o s ee n z y m eh a sc e r t a i nd i s c r e p a n c yb e c a u s eo fd i f f e r e n t s t r a i n s a c c o r d i n gt ot h ef o u rk i n d so fs e q u e n c ef r o ma s p e r g i l i u sn i g e rs t r a i n sr e p o s e db y g e n b a n k ，p r i m e ra r ed e s i g n e dr e s p e c t i v e l y ，g e n o m i cd n a o ft h e s et h r e es t r a i n sa r e t a k e na sm o u l d t h e np c ri sc a r r i e do u ta n dn u c l e u ss e q u e n c ei st ob em e a s u r e dn e x t t h e r e s u l to fm e a s u r e m e n ta n do r i g i n a ls e q u e n c e 黜a n a l y z e d w h i c hp r o v e dt h a tn u c l e o t i d e s e q u e n c ei d e n t i f i e sa r en o th i g h i ti sp o s s i b l et od r a wac o n c l u s i o nt h a tg e n es e q u e n c eo f i n u l i n a s ef r o ma s p e r g i l l u sn i g e ri sd i f f e r e n tf r o mt h a tr e p o r t e d k e y w o r d ：a s p e r g i l l u sn i g e r ；i p u l i n a s e ；b i o l o g i c a lp r o p e r t y ；m o r p h o l o g y e n z y m es y s t e m ：m o l e c u l a rb i o l o g y 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包 含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得洹j t 壅些太堂或其它 教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的 任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：j 鬈嘶玲 签字日期： c j 即4 年f 月书日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解泣j 盔些太堂有关保留及使用学位论文的规定，有 权保留并向国家有关部门( 机构) 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查( 借) 阅。本人授权洹j s 壅些太堂可以将论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等方法加以保存或编成学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 学位论文作者签名： 易哳於 签字日期：o z r o , t 年月玛日 导师签名 圜 签字日期： 一一厶年月矗e t | 菊粉酶高产菌株的生物学特性研究 1 1 本研究的意义和目的 1引言 菊粉酶( i n u l i n a s e ，e c 3 2 1 ) 是一类水解菊粉b 一2 ，1 - 果糖苷键的酶”。1 。菊粉酶按其对底物 的作用方式分为两类：一类是b - d 呋喃果糖苷水解酶( b - d f r u c t a nf r u c t a n o h y d r c l a s s e ， e x o i n u l i n a s e ，e c3 2 1 8 0 ) 。为外切酶，它作用于菊粉链的非还原末端，逐一释放果糖，产物为果 糖及少量葡萄糖，用于制各高纯度果糖。另一类是2 ，1 - b - d 果聚糖水解酶( 2 ，! 一b - d f r u c t a n f r u c t a n o h y d r o l a s s e ，e n d o i n l i n a s e ，e c 3 2 1 7 ) ，属内切酶，它随机地切断菊粉内部的某个b - 2 ，1 糖苷 键，生成低聚果糖及少量果糖，用于制备低聚果糖。 制备果糖可通过酸法和酶法生产得到。酸水解法需在高温条件下进行，一方面色素重，无机 离子含量高，副产物多，分离精制难，去除它们不但增加成本，且污染环境；另一方面生产的果 糖褐变严重，改变果糖应有的风味因此具有一定的局限性。酶法生产是在温和条件下进行。目 前工业化生产果糖糖浆是采用玉米淀粉为原料，通过。一淀粉酶和糖化酶的作用，将淀粉水解为葡 萄糖，又通过葡萄糖异构酶将葡萄糖异构转化为果糖，生成含4 2 一4 5 果糖的果葡糖浆。并且 如果想提高果糖的含量就需要增加许多纯化步骤，如通过离子交换柱法去除葡萄糖和剩余的蔗 糖。此工艺过程复杂，转化率低，成本高。难以满足市场的需要。而利用菊粉酶一步法水解菊粉 生产果糖产品，不仅工艺简单，而且果糖含量可提高到9 0 9 5 v “1 ，由于其果糖含量高，亦可 称为“超高果葡糖浆”( u h f g s ) ( u l t r ah i g hf r u o t o s eg l u c o s es y r u p s ) 。菊粉酶是一步法生产高果 糖浆的唯一重要酶种。此法是果糖生产的理想途径，具有巨大的工业化生产潜力。 工业上低聚果糖的生产通常采用两种方法：一种是由蔗糖经b 一果糖转移酶( 1 3 - f r u c t o s y l t m n s f c r a s e ) 或转化酶( i n v e n a s e ) 的转果糖基反应而生成的蔗果糖类，其产品中副产物葡萄 糖和蔗糖多，反应不易控制。而另一种力法由内切型菊粉酶水解菊粉生成低聚果糖时。产物仅为 低聚果糖和少量果糖，纯度高，成本低，降解率通常可达7 0 左右“4 。 因此利用菊粉酶是制备果糖或果糖糖浆制品极具发展潜力的有效途径。 果糖热量低，甜度高( 是蔗糖的1 5 2 倍) ，代谢不依赖胰岛素，可以很好地克服葡萄糖、 蔗糖所带来的影响矿物质元素吸收，引起儿童龋齿，中老年人糖尿病，高血压，肥胖症等副作用 ”】。因此，果糖是理想的食品用糖。低聚果糖( f r u c t o o l i g o s a c c h a r i d e s ，f o s ) 是一种功能性糖，其聚 台度一般为2 7 。低聚果糖是双歧杆菌的增殖因子，具有调节胃肠功能，提高免疫力，改善脂质 代谢，降低血脂和胆固醇促进微量元素铁、钙的吸收利用，有利于维生素的吸收，能量低，摄 入后不易致肥胖等多种生理功能。是一种纯天然、高效能、无公害的绿色食品和饲料添加剂。开 发低聚果糖产品具有广阔的市场前景”。在注重营养保健的今天，果糖及其果糖糖浆制品的开发 是食品：i ：业发展的需要。 菊粉，又称菊糖i n u l i n ，是由d 呋喃果糖分子通过0 2 ，1 果糖苷键相连而成的多聚果糖，其 还原端接一个葡萄糖残基，以a 1 , 2 键与之相连，呈直链结构。一般长约2 5 3 5 个果糖单位，分 子最约5 0 0 0 d a 。其链长及分子量大小随植物种类，气候条件，收获季节及作物成熟度有关1 。 河北农业大学硕士学位论文 菊粉微溶于4 。c 冷水中，易溶于8 0 。c 热水。与碘不呈颜色反应，无还原性，有旋光性，在水中为 左旋fa 】。2 0 柏。菊粉具有许多生理功能，特别是能选择性促进双歧杆菌、乳酸苗和醋酸杆菌的生 长，调节肠道内微生物区系的组成；并且还是一种膳食纤维复合物。菊粉是一种贮存性的多糖类 物质，广泛存在于菊芋( h e l i a n t h u st u b e r o s u s ) 、菊苣( c i c h o r i u me n d i v i a ) 、大丽花( p a h l i ap i n n a t a ) 、 牛蒡( a r c t i t ! ml a p p d ) 等多种植物中”2 ”j ，其中以菊芋晟具代表性。 菊芋( h e l i a n m “jt u b e r o s u s ) ，俗名洋姜。菊科，向日葵属，多年生草本植物”“。在菊芋 的块茎中含有人体所需的各种必需氨基酸，并含有较多的多糖，其中菊糖的含量尤为显著，能达 到干重的7 0 8 0 1 1 6 - 1 7 。人们在对鲜菊芋进行测定时，结果表明，鲜菊芋块茎中含水7 9 8 ，碳 水化合物1 6 ，6 蛋白质1 o ，粗纤维o 6 ，其中碳水化合物的7 8 为菊糖，除此而外，每1 0 0 9 鲜菊芋块茎含c a ：4 9 m g 、p ：1 1 9 m g 、f e ：8 4 m g ；含v r n ：0 1 3 m g 、v b 2 ：0 0 6 m g 、v p ：0 6 m g 、 v c ：6 m g 等n 8 】。而且菊芋这种植物分布广，在我国南北各地均有栽培：适应性强，耐贫瘠，耐寒， 耐早；种植简易，一次播种多次收获；产量高，价格低廉，是一种宝贵的半野生资源，是制各果 糖产品的良好原料，具有极大的开发利用价值。 因此，利用菊粉酶水解菊芋浸汁生产果糖产品，深入开展菊粉酶研究，开辟对人体具有保健 作用的果糖产品生产的新途径，不仅具有重大的经济价值，并且给食品工业的发展，改善人们的 饮食结构，提高食品的营养品质带来革命性进步。 菊粉酶主要产生于菊科植物及部分微生物当中。来源于菊科植物组织的菊粉酶底物专一性 强，仅作用于菊粉m 】；微生物菊粉酶普遍底物专一性较差，大部分都能水解有b 一2 ，1 呋喃果糖健 的菊粉，蔗糖和棉籽糖，属反应专一性。从菊芋( j e r u s a l e ma r t i c h o k e ) 块根、菊苣( c h i c o r y i n t y b u s ) 根或大丽花( d a h l i s p i n n a t a ) 等植物的根中都能提取到菊粉酶。但从植物中得到的菊粉 酶毕竟数量有限，不能形成生产规模，并且其作用范围和稳定性也不如微生物来源的酶类。而微 生物代谢旺盛，生长繁殖速度快，所以从微生物中挖掘菊粉酶的来源更有现实意义。利用微生物 所产的菊粉酶产量高，周期短，来源丰富，成本低廉。因此，对于微生物菊粉酶的进一步研究具 有重要的生产意义。可以说微生物是菊粉酶工业化应用的唯一来源。因此国内外对菊粉酶的研究 主要集中在微生物资源上，其中霉菌和酵母菌是微生物中研究的热点。从总体上看大多数微生物 产生的菊粉酶包括三部分，存在于细胞内的胞内酶、固定存在于细胞壁的细胞壁酶和分泌到细胞 外的胞外酶，不同菌种菊粉酶在细胞上的分布不一样。研究表明，酵母菌所产菊粉酶的含量中胞 内酶高于胞外酶 2 1 - 2 2 ，而由霉菌所产生的菊粉酶以胞外酶为主。胞外酶的分离提取更容易。所 产酶的最适温度，热稳定性很高，而且适宜偏酸性的环境，对于其在提高果糖产品的工业化应用 效率以及生产上防污染十分有利。 由于菊粉酶在食品工业中的巨大应用潜力，欧洲、日本等国家已经做了大量的t 作。包括菌 株筛选“，产酶条件诱变育种，酶的分离纯化“】及酶学性质，酶的固定化“等方面，另外关 于菊粉酶分子生物学方面的研究也有相关报道。国内关于菊粉酶的研究始于9 0 年代。目前关于 菊粉酶的生产化应用绝大多数仍停留在实验宝阶段，并且中试结果的报道也不多。阻碍其工业化 生，“的主要原因是由于产酶菌株产酶量低，产酶成本高”“1 。将菌株应用于工业化生产最大的要 求就是使微生物的产酶量大大提高，并且能够最大限度的外泌。而要解决此问题，进行菌株培育 以及构建基因工程菌株是探索提高菊粉酶表达量的重要方法。而对菌株的深入研究，有关信息的 全面掌握是更好地达到此目的的首要步骤。 菊粉酶高产菌株的生物学特性研究 霉菌当中的黑曲霉f a s p e r g i t l u sn 晡e r j 是自然界中普遍存在的一类真菌。由于其具有多种活性 强大的酶系，已被广泛的应用于工业生产。黑曲霉是美国f d a ( f o o da n dd r u ga d m i n i s t r a t i o no f u s a ，食品与药品管理局 美 ) 批准为用于食品工业的安全菌种之一，具有g r a s ( g e n e r a l l y r e c o g n i z e da ss a f e ) 资格。因此由黑曲霉所产的酶类也便具有了安全性好，应用范围广的优点。 目前，国内外学者对很多食品用酶类的研究集中在黑曲霉来源上。研究较多的主要有蛋白酶”+ 圳 果胶酶”1 、淀粉水解酶1 3 3 - 3 a j 、纤维素酶1 3 5 3 等等。由于黑曲霉在制曲过程中产生丰富的淀粉酶、果 胶酶、纤维素酶等常被用于谷物原料的分解。1 9 5 3 年起，我国的酒精工业开始采用黑曲霉制曲， 使淀粉利用率由米曲霉的7 0 增加到8 0 以上。国内酶法生产葡萄糖所选用的高活性糖化酶生产 菌种也都是黑曲霉的突变株。另外，目前国内外饲料工业中为了提高饲料的利t l = j 率，越来越广泛 地使用酶添加剂，其原因是，人们对动物食品的需求不断增长，但是生产饲料的原料却越来越贫 乏，同时，使用刺激生长的药物或化学试剂，其效果有一定的局限，而且还受到消费观念和各国 立法的限制。而添加酶制剂，不仅可开发利用低等原料、扩大饲料生产的原料来源，而且还可提 高饲料的消化率、消除饲料中的反营养因子、促进动物对营养物的充分利用。饲料用酶主要是由 蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、果胶酶等多种水解酶构成的复合酶。饲料酶制剂生产的关键是要有 产酶活性高的菌种，目前多采用霉菌作为饲料酶生产菌。其中黑曲霉不仅可以发酵生产多种水解 酶，大大降低成本，而且具有高度的安全性只要选用的原料符合饲料的卫生要求，即可直接作 为饲料掭加剂。另外，在世界需求量不断增长的柠檬酸行业中，黑曲霉所起的作用更是毋庸置疑 的。可见研究黑曲霉在工业生产中有着重大的实际意义。 黑哇扫霉多数情况下是作为群的概念而出现。黑曲霉群下种的划分，存在着形态以及生物学特 性的分布多样性。本研究室多年工作获得了高产菊粉酶的黑曲霉菌株a s p n i g e r m 8 9 和黑曲霉 a s pn i g e r h 8 。并且对野生菌株黑曲霉a s p n i g e r m 8 9 进行了四轮紫外线诱变和两轮“c oy 射线诱 变选育，得到了菊粉酶高产菌株a s p ，n 蛹e r uy - 2 。在前期的一 作中发现三株菌在营养条件、产酶 条件、酶活性大小等方面存在着显著差异“”j 。研究它们之间生物学特性的异同，是探讨整个黑 曲霉群生物学特性的窗口。对本实验室获得的菌株进行系统的研究具有重要的理论与实践意义。 可以进一步研究目前尚不完备的黑曲霉群中种的分类鉴定：可以发掘具有重要现实意义的生产复 合酶系的菌种；可以探讨各种酶类在黑曲霉的发酵生产中的彼此关系，相互影响；可以探讨菌种 诱变后，菊粉酶大量表达的诱变机理：可以进一步以已知菌株为基础，开展菊粉酶高产菌株的培 育，可以通过研究高产菌株的菊粉酶基因构成，建立p c r 技术，为进一步利用现代生物技术， 培育菊粉酶高产菌株提供理论依据，为菊粉酶能大量表达，高产酶活奠定基础。 1 2 该研究的国内外进展 1 2 1 微生物菊粉酶的来源 菊粉酶多来源于菊科植物和微生物，对于微生物来源的菊粉酶自1 9 1 4 年k l u y v e r 证实了 k l u y v e r o m y c e s f r a g i l i s 能利用菊粉，1 9 2 4 年p r i n g s h e i m 首次报道了a s p e r g i l l u sn i g e r 能产菊粉酶 以来脚，国内外学者对微生物菊粉酶的研究逐渐深入，尤其近1 5 年，取得了一定的避展。据不 完全统计，产菊粉酶的丝状真菌有1 7 个属4 0 余种，酵母菌有l o 个属2 0 余种，细菌有1 2 个属 河北农业大学硕士学位论文 1 0 余种。研究表明菊粉酶在微生物中的分布主要集中在酵母和霉菌上，细菌、防线菌报道的较少。 曾报道过的有节杆菌( a t h r o b a c t e rs p ) 3 ”，假单孢菌( p s e u d o m o n a ss p ) 蚓，枯草芽孢杆g g 自( b a c i l l u s j u b t i l i s ) t 3 9 - 4 1 】，链霉菌( 哗f 彬1 4 2 和棱状芽孢杆菌( c l o s t r i d i u mh e r t m o s u c c i n o g e n e s ) ”等。酵 母菌中研究最多的有脆壁克鲁维酵母( k 1 u y v e r o m y c e sf r a g i l i s ) “，马克斯克鲁维酵母 阢m 口r x i a h “j ) t 4 6 ，酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sm a r x i a n u s ) 4 7 l ，假丝酵母( c a n d i d a ) ”“德巴利酵 母属( d e b 口r 。m y c e s ) 等。霉菌有黑曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) f 2 。卯“1 0 4 1 无花果曲霉( a f i c u u m ) l 5 5 1 5 6 ，青霉( p e n i c i l l i u ms p ) f 2 】口”，尖链孢霉( f u s a r i u mo x y s p o r u m ) 网、木霉( t r i c h o d e r m a ) 5 9 1 等。下表为主要的微生物所产菊粉酶及其酶学性质。 表1 主要的徽生物所产菊糟酶及其酶学性质 t a b l e1m i c r o o r g a ni s m si n u li n a s ep r o d u ci n ga n di n u ll n a s ee n z y m o l o g y a s p e r g i l i u sn i g e r m 8 9 外切e x o ei ，e i i ，e i i i ，e i v p i e h i ay 1 0 9 b a c i u u sj “b t i l l s a s p e r g i l l u sn i g e r 正m a r x i a n u sc b $ 6 5 5 6 p e n i c i u i u ms pt n 一8 8 a s p e r g i l l u sn i g e r l 2 a s p e r g i u u sn i g e r 3 1 9 a s p f i c u u m 所产 n o v o z y m2 3 0 c o m m e r c j 鲥l n u l i n a s e 外切e x o 内切e n d o 外切e x o 内切e n d o 外切e x o 内切e n d o 内切e n d o 外切e x o 的五种外切c x o 三种内切c n d o k l u y v e r o m y c e s f r a g i l i s 外切e x o 州9 8 0 1 1 0 26 9 79 6 1 2 3 6 5 e i4 05 5 6 06 0 其余45 5 5 4 5 6 0 1 2 2 黑曲霉产菊粉酶的发酵条件优化及诱变育种 黑曲霉被许多国内外学者作为菊粉酶生产菌株的研究对象。在黑曲霉产菊粉酶的研究当中， 为了提高菊粉酶菌株的产酶能力，进行了大量的研究工作。一方砸优化培养条件。通过对培养条 件中各种碳源、氨源，温度、p h 值以及金属离子、微量元素的最佳种类与配比的研究，使菌株 4 矾 扣 6 6 孙 2 以 铂 靳 斛 5 3 o 4 4 5 5 4 8 拍 矾 挖 舛m 弘 踮 蛇 舛 0 l o 5 o 9 o 0 0 0 2 o 叭驺阻醅 勰w 斛 菊粉酶高产菌株的生物学特性研究 产酶条件达到最佳，生产出高活力的菊粉酶。碳源研究中发现，多数菊粉酶菌株产酶活力与菊粉 的诱导作用有关，通常情况以菊粉作为碳源比其他碳源能够产生更多的菊粉酶，表现出一定的底 物可诱导性，但d e r y c k e 研究的黑曲霉在产菊粉酶时与菊粉的存在与否无关，它的最佳碳源是麦 芽糖j 。麦芽糖、棉予糖、果糖可被多数黑曲霉菌株作为碳源，有的黑曲霉不能够利用乳糖作为 碳源产菊粉酶”“。另外实验表明，采用菊芋、菊苣提取液为发酵培养基的碳源，比以菊糖为碳源 的培养基，其产酶活性要高出几倍。本实验室培养的黑曲霉uy 2 以菊芋汁为碳源的培养基中产 酶活力是以菊糖为碳源的5 0 4 倍。其原因可能为抽提液中除含菊粉外，还含有一部分能有效诱导 菊粉酶合成的寡聚果糖和少量有利于菌体生长的果糖和葡萄糖。菊芋抽提液中含有菊糖中缺少的 生长因子生长因子有利于菌体生长产酶。氮源研究方面发现，通常添加无机氮源比添加有机氮 源效果好”“。金属离子有时对于酶活的提高有着相当的作用。k i m 和k a m u r a 研究发现o o lt o o l k c i 、0 0 1t o o lm g s 0 4 、00 0 1m o lf e s 0 4 对黑霉菌1 2 的菊粉酶的产生有促进作用，提高产量分别 为3 2 、2 6 、和1 2 1 。本研究室选育的a s p e r g i l l u sn 垃打uy 2 在加入1 1 5 m m o l l 的b a “时， 酶活力能够提高1 56 。最佳的产酶条件对于黑曲霉群中不同的菌种是不同的。 然而尽管培养条件得到了优化，但筛选出的野生菌株往往酶活很低且许多菌株合成菊粉酶的 能力受到分解代谢物的抑制，因此需对野生菌株诱变，以筛选出酶活高的菌株。p o o m a 等人对黑 曲霉经过诱变得到黑曲霉突变株，经产酶条件优化后酶活可达1 2 0 u m l t ”4 “。黎明兰等通过诱变 选育获得黑曲霉v n 一1 9 4 9 3 ，在最适发酵条件下酶活稳定在6 0 6 4 u m l 6 8 o罗英等对菊粉酶产 生菌a s 一4 进行了激光复合诱变获得了突变株a s p e r g i l l u sn i g e r a l 1 5 4 酶活达到1 4 6 3 u m l ，比原 始菌株提高了3 7 5 倍1 6 。印度的v i s w a n t h a n 和k u l k a r n l 用紫外光照射一株黑曲酶野生菌株获得 了a s p e r g i l l u s n i g e r t e l g h b 1 最高菊粉酶活力为3 7 7 u m l ，比原始菌株提高了3 倍”。n a k a m u r a 等人对an i g e r 进行6 0 c o 诱变。突变茁比野生菌酶活提高了4 倍”。本研究室通过对野生菌 m 8 9 分生孢子四轮紫外诱变和两轮y 射线诱变获得了一菊粉酶高产菌株a t ，i g e r u 7 2 酶活产力达 1 8 0 u m l ，是出发菌株产酶活力的3 4 5 倍”“。可见通过诱变育种，可以大大提高产酶活力，但仍 然很大程度上难以达到生产的需要。并且到目前为止，关于诱变处理后除菊粉酶大量表达外对菌 株别的生物学特性的影响以及其中的诱变机理研究甚少，并且对于菊粉酶菌株诱变后其形态特征 及酶学性质的研究尚不多见。 1 2 3 黑曲霉菊粉酶基因的分子生物学特点 随着9 0 年代生物技术的飞速发展，人们开始了对菊粉酶分子生物学方面的研究。以期通过 d n a 重组技术提高酶的表达水平及活性，通过构建工程菌株使菊粉酶在受体细胞中得到大量表 达，从而大幅度提高酶的产量。自1 9 9 1 年l a l o u x 首先构建了菊粉酶的基因文库“从k l u y v e r o m y c e s ，r m r x i a n u s 中克隆出外切菊粉酶基因i n u l 以来，国内外学者开始了对菊粉酶分子生物学方面的研 究。对于黑曲霉所产的菊粉酶基因的研究也相继出现。1 9 9 8 年o h t a ，k 【驯l 7 3 等人报道了a s p e r g i l l u s n i g e r l 2 中有两种内切酶基因i n u a 和i n l r b ，劳且在g e n b a n k 中成功注册。i n u a 口4 1 基因的垒长 为5 0 5 3 b p ，i n u b “”基因的全长是3 4 2 9 b p ，o r f 均为1 5 5 1 b p ，均编码5 1 6 个氨基酸，前2 3 个为 信号肽。阅读框中的同源性达到9 8 ，序列中有8 个氨基酸不同。g + c 分别为5 4 ，5 43 。阅 读框以外的序列同源性达到9 2 。2 0 0 1 年s i j i n g ，j 等人，报道了a s p e r g i i i u sn i g e r 中的内切菊粉酶 5 河北农业大学硕士学位论文 e n d o i n u t i n a s e 的克隆与在毕赤酵母中的成功表达。基因全长1 6 4 0 b p 。2 0 0 1 年w a n g ，y j 等人报道 黑曲霉a f i o 所产的菊粉酶基因全长1 5 5 1 u p 7 6 1 。2 0 0 2 年王建华等人研究的黑曲霉9 8 9 1 内切菊 粉酶基因获得了克隆并且在毕赤酵母中成功表达m 1 。基因全长1 5 7 7 b p 。尽管都是从黑曲霉菌株 中获得的菊粉酶基因克隆，但显示出了不同菌株之间基因水平上的多样性。 1 2 4 黑曲霉在菌物界中的分类地位” 在现代生物分类学中，苗物是一个界，称菌物界( f u n g i ) ，并和植物界、动物界鼎足而立。 分类单元( t a x o n 或c a t e g o r y ) ，也称分类单位、分类阶元或分类群。和其他生物分类一样，菌 物分类单元主要是界、门、纲、目、科、属、种，种是分类的基本单位。在种下还有亚种、变种、 变型等等。菌物的分类单元都有相应的拉_ ：r 词，在属以上的分类单元还有一定的拉丁词尾。以下是 菌物的型以上的分类阶元的中名、英名、拉丁名及拉丁名称的词尾： 界k i n g d o m ，拉r e g n u m ：菌物界( f u n g i 或m y c e t e a e ) 亚界s u b k i n g d o m ，拉s u b r e g n u m ：非必需分类阶元( 以下简称非必需) 门d i v i s i o n 或p h y l u m ，拉d i v i d i o 或p h u l u m ：词尾一m y c o t a 或- m y c o 曲y t a 亚门s u b d i v i s i o n ，拉s u b d i v i s i o ：词尾一m y c o t i n a 纲c l a s s ，拉cl a s s i s ：词尾一m y c e t e s 亚纲s u b c l a s s ，拉s u b c t a s s i s ：非必需，词尾一m y c e t i d a e 目o r d e r ，拉o r d o ：词尾a l e s 亚目s u b o r d e r 拉s u b o r d o ：非- 必需，词尾- i n e a e 科f a m i l y ，拉f a m i l i a ：词尾，a c e a e 亚科s u b f a m i l y ，拉s u b f a m i l i a ：- t e - 必需，词尾一o i d e a e 族t r i b e ，拉t r i b u s ：词尾一e a e 亚族s u b t r i b e ，拉s u b t r i b u s ：t # - 必需，词尾i n a e 属g e n u s ，拉g e n u s 亚属s u b g e n u s 拉s u b g e n u s 组s e c t i o n 拉s e c d o 亚组s u b s e c t i o n ，拉s u b s e c t i o ：非必需 种s p e c i e s ，拉s p e c i e s 亚种s u b s p e c i e s ，拉s u b s p e c i e s ：j b 必需 变种v a r i e t y ，拉v a r i e t a s 亚变种s u b v a r i e t y ，拉s y b v a r i t a s ：非必需 型f o r m , 拉f o r m a ：t 必需 黑曲霉通常情况是以群的概念出现。黑曲霉属于菌物界回l n g i ) ，真菌f q f e u m y c o p h y t a ) ，半知 菌纲( f u n g il m p e f f e c t i i ) ，丛梗孢目( m o n i l i a l e s ) ，丛梗孢科( m o n i l i a c e a e ) ，曲霉属( a s p e r g i l l u s g e n u s ) 黑曲霉群或称黑曲霉组( a s p e r g i u u sn i g e r ) 。根据坂口和饭冢的黑曲霉群检索表中将黑 曲霉群分为碳黑曲霉( a s p e r g i l l u sc a r b o n a r i u s ) 、日本曲霉( a s p e r g i l l u sj a p o n i c u s ) 、黑曲霉 ( a s p e r g i l l u sn i g e r ) 、宇佐美曲霉( a s p e r g i l l u su s a m i i ) 、斋藤曲霉( a s p e r g i l l u ss a i t o i ) 、乾氏 6 菊粉酶高产菌株的生物学特性研究 曲霉( a s p e r g i l l u si n u i i ) 、或叫琉球曲霉( a s p e r g i l l u sl u c h u e n s i s ) 、金黄曲霉( a 5 p e r g i l l u sa u r e u s ) 、 泡盛酒曲霉( a s p e r g i l l u sa w a m o r i ) 等。但瑞恩认为宇佐美曲霉、乾氏曲霉可能是泡盛酒曲霉的 异名。金黄曲霉是臭曲霉( a s p e r g i l l u s f o e d d e s ) 的异名。此外，尚有肉桂色曲霉，河内氏曲霉形 态上与黑曲霉极为相似，只是分生孢子颜色极淡，做肉桂色或浅褐色，瑞恩认为是黑曲霉的突变 种。而m a r e na k l i c h 在描述曲霉种时也提到了许多学者在对种之间的划分时存在争议。有人将 泡盛酒曲霉认为是黑曲霉的异名，有人认为是黑曲霉的变种。并且对于泡盛酒曲霉与臭曲霉的划 分也发生冲突。而m a r e na k l i c h 通过对菌种分生孢子的扫描电镜观察，认为他们属于不同的种。 黑曲霉群以下种的划分，至今没有太一致的意见。 1 2 5 黑曲霉的产酶酶系 黑曲霉能够产生多种胞外水解酶。现已成为工业应用常见的菌种之一。现主要的商品酶制剂 如淀粉酶、过氧化氢酶、纤维素酶、半乳糖苷酶、葡萄糖酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖苷 酶、半纤维素酶、橙皮苷酶、脂肪酶、柚苷酶、果胶酶、蛋白酶、单宁酶等都是来源于黑曲霉。 在美国f d a 批准的安全菌种之中以黑曲霉所产的酶类最多。我国酶制剂工业生产用菌种中，主 要的黑曲霉有黑曲霉u v l l 突变株、c p 8 5 2 1 1 和3 3 5 0 ，他们分别用于糖化酶、果胶酶、和酸性蛋 白酶的生产”“。黑曲霉酶类在工业上具有重要的作用。 黑曲霉所生产的酸性蛋白酶已在医药、食品制革等工业中广泛应用。根据黑曲霉在产酸一眭蛋 白时对氮源的需要量，有人将黑曲霉分为两类，一类需要低c n ，添加无机氮对产酶有利，属于 这一类的有斋藤曲霉、宇佐曲霉等，另一类黑色曲霉要求较高的c n ，例如泡盛洒曲霉、日本曲 霉，这一类往往酶活性较低。p “ 糖化酶作为淀粉糖化剂被广泛的应用到谷氨酸、柠檬酸、酒精等的发酵工业生产上。黑曲霉 生产的糖化酶具有更强的糖化力。黑曲