（细胞生物学专业论文）果蝇coxr基因的克隆及其蛋白质产物的亚细胞定位研究.pdf

：i 殳 寸 m o l e c u l a rc l o n i n g ，s u b c e l l u a rl o c a l i z a t i o na n a l y s i s ofc o x - ri nd r o s o p hi l am e l a n o g a s t e r at h e s i ss u b m i t t e df o rt h ed e g r e eo fm a s t e r c a n d i d a t e ：z h a n gj u n s u p e r v i s o r ：l ic h u n x u a n h u b e iu n i v e r s i t y w u h a n ，c h i n a mml川川i吣2呲7 3眦7，ii0l茎薹y 湖北大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律后果由本人承担。 敝储虢狨豢 日期：2 勿局年莎月f 多日 学位论文使用授权说明 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，并提供目录检索与阅览 服务；学校可以允许采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存学位论 文；在不以赢利为目的的前提下，学校可以公开学位论文的部分或全部内 容。( 保密论文在解密后遵守此规定) 作者签名： 指导教师签名： 日期：7 f 1 0 ，6 ，乡 醐：锄眇占| 1 摘要 c o x - r 基因是本实验室人员利用差异显示反转录p c r ( d d r t - p c r ) 技术，探讨黑腹 果蝇野生型( w t ) 及其突变体黑条体( b s r ) 的复杂性状分子机制时发现的一个与未知功 能基因c g 3j d d 7 重叠的新的色素相关基因( c 饼月基因) 。目前，关于c o x - r 基因的 结构和功能都未有相关报道。本实验对c o x - r 基因的全序列进行了分析，获得基因全 长7 2 3 b p ，该基因编码一个有1 7 6 个氨基酸组成的蛋白质。通过序列比对发现，全序列 中有9 个位点发生突变，编码的蛋白质有3 个位点发生突变。将c o x - r 基因的e d n a 与绿色荧光蛋白( e g f p ) 融合构建真核表达载体，在果蝇s 2 细胞中表达以探讨其亚细 胞定位，结果发现c 强足基因表达产物定位于细胞质中，但在预期的线粒体中显示不 清。该结果为进一步研究该基因的功能及作用途径提供了线索。 关键词：基因c g 3 1 0 0 7 ；基因c o x - r ；亚细胞定位；绿色荧光蛋白( e g f p ) ；s 2 细胞 a b s t r a c t 目录 前言1 1 黑腹果蝇新突变体的发现、表型特点及研究概况1 1 1 黑腹果蝇新突变体的发现及表型特点1 1 2 新突变体突变基因的研究概况2 2 c o x - r 基因的发现及其功能预测2 3 基因功能的研究方法4 3 1 基因转导技术5 3 2 反义技术6 3 3 基因敲除技术6 3 4 人工染色体的转导6 3 5 r n a 干涉7 3 6 基因诱捕技术7 4 细胞转染技术简介8 二 5 生物信息学研究现状和应用9 5 1 生物信息学的主要内容1 0 5 2 生物信息学的发展历程和前景1 0 6 蛋白质亚细胞定位技术j 1 1 6 1 研究蛋白质亚细胞定位的意义1 1 6 2 蛋白质亚细胞定位的种类1 1 6 3 绿色荧光蛋白的应用及研究进展1 2 7 实验研究的目的和意义1 4 材料与方法15 1 实验材料、试剂和仪器15 1 1 实验材料15 1 2 实验试剂15 1 3 主要溶液1 5 1 4 实验仪器1 5 1 5 引物合成16 2 实验方法和步骤16 2 1c 0 噼r 基因的克隆1 6 2 2 总r n a 的提取和电泳检测2 0 2 3 引物设计及p c r 扩增2 2 2 4 目的片段和载体的酶切及连接2 5 2 5s 2 细胞表达载体的构建2 6 2 6 细胞转染2 7 结果与分析2 9 1 黑腹果蝇突变体c o x - r 基因全序列扩增2 9 2 c o x - r 基因的e d n a 克隆2 9 2 1 用t r i z o l 提取的黑腹果蝇和突变体的总r n a 2 9 2 2c o x - r 基因的反转录及p c r 扩增3 0 3 基因c o x - r 和c g 3 1 0 0 7 序列比对及相关生物信息学分析3 1 3 1 基因全序列及编码的氨基酸序列的相关分析3 1 3 2c o x - r 基因编码的蛋白质结构和功能的相关分析3 2 4 载体的构建3 3 4 1c 例0 r p e g f p n 1 载体的构建3 3 4 2 扩增的融合基因的电泳检测3 4 4 3c o x - r i p r m h a - 3 载体的构建3 4 5 细胞转染及亚细胞定位的观察3 5 5 1 细胞转染3 5 5 2 亚细胞定位的观察3 5 讨论：3 7 参考文献3 9 附录4 4 致谢一j 4 5 i v 前言 1 上- j l - 月i j 吾 近百年来，黑腹果蝇作为遗传学研究的经典模式生物，不断有新突变体被发现、报 道和研究，通过对这些突变体突变位点、突变方式和突变效应等的深入探究，对于了解 和揭示相关基因的功能和调控网络都具有重要意义。在黑腹果蝇突变体中包括许多体色 表型发生变化的品系，由于果蝇体色发育机制可以简化的反映出更为复杂的机体发育机 制，而体色的进化发展也为我们研究相关基因的多效性和遗传机制提供了线索，所以其 相关体色发育过程的研究越来越被重视，近年来该领域一直是国外研究的热点( p a t r i c i a 甜a l , 2 0 0 9 ；p a t r i c i ae ta l2 0 0 3 ；w i t t k o p pe ta l ，2 0 0 2 ；w i t t k o p pe ta l ，2 0 0 3 ) 。 1 黑腹果蝇新突变体的发现、表型特点及研究概况 1 1 黑腹果蝇新突变体的发现及表型特点 本实验室人员在1 9 9 1 年时曾在黑腹果蝇的自然种群中发现了一只黑色雌蝇的突变 体，其主要特征是：背甲黑色，比已知黑檀体突变型略浅，其上有5 条深黑色纵行条纹， 腹部横纹较野生型黑并加宽，翅不透明，呈烟色，翅脉周围呈浓烟色，命名为黑条体 ( b s r ) ( 钱远槐，张菁等，1 9 9 4 ) 。且其后代连续互交并无分离现象。近年来，黑条体 体色己出现深黑褐色、浅黄色、深黑、褐色和浅黄色，背甲上的条纹也分化为5 条、3 条、1 条和无条纹，各种性状的表型并无显隐性之分，同一纹型个体互交，子代又有少 量交叉性状分离，体色与背甲条纹的关系是：5 条条纹的个体具褐体色或浅黄体色，0 条的都表现为浅黄体色，其他条纹的都是褐体色( 见图1 ) 。 簟_ k 二怕 一 图1 ：野生型( + 9 1 9 1 0 ) 及突变的黑条体( b s r ) 果蝇：可见不同体色及背甲的5 种 湖北大学硕士学位论文 黑色条纹图式。从左至右依次为深黑体色，褐体色5 条，3 条，1 条，野生型( + 9 1 9 1 0 ) 和浅黄体色0 条。 1 2 新突变体突变基因的研究概况 为了弄清上述新突变体体色分化的现象是如何产生的，近年来通过互补杂交实验 ( 标准杂交品系来自美国b l o o m i n g t o n 果蝇品系保存中心) ，已将黑条体的突变基因定 位在第3 染色体的9 3 d 处( 张菁等，2 0 0 1 ) ，表明该性状是黑檀体( e ) 的等位突变， 经与已发表的黑檀体等位突变型比较，是一种新的突变，黑条体( b s r ) 复杂的性状表 现是己知其他黑檀体突变系所没有的。关于突变表型的确定方面，本实验室研究人员在 对黑条体突变体进行e b o n y 基因克隆与测序研究中发现突变体中的e b o n y 基因比野生型 黑腹果蝇中的e b o n y 基因的d n a 序列少了9 5 3 个碱基，经对比分析，缺失的5 端区 域包含从第5 5 8 碱基到第1 1 5 3 碱基的共9 5 3 个碱基，其中包括第一个外显子的2 0 6 个 碱基及第一个内含子的7 4 7 个碱基。r t - p c r 结果显示基因的转录未被抑制，但在翻译 水平上受到第一个内含子的严重干扰，w e s t e r nb l o t t i n g 工作显示该突变体内无正常的黑 檀体蛋白存在( 金珊等，2 0 0 5 ) 。 2 c 删基因的发现及其功能预测 为了探究b s r 体色突变的分子机制，本实验室的人员利用差异显示反转录p c r 技 术比较了黑条体突变体( b s r ) 与野生型黑腹果蝇( w t ) 的基因差异表达，共得到6 个差异片段。经r t - p c r 验证，发现一长为2 1 5 b p 的阳性片段r t c y 0 4 在b s r 中的表 达水平明显低于在w t 中的表达。将获得的r t c y 片段采用单引物p c r 扩增技术，逐 段测序，并将重叠序列拼接，分别得到了8 4 4 b p 的w t 片段和8 0 4 b p 的b s r 片段，后 者比前者缺失了4 0 b p 。将8 4 4 b p 的w t 片段在n c b i 上b l a s t ，发现此片段的序列与 未知功能基因c g 3 1 0 0 7 重叠，因此通过对基因c g 3 1 0 0 7 的功能进行预测，可以初步分 析阳性差异r t c y 0 4 片段的功能。采用生物信息学工具搜索到基因c g 3 1 0 0 7 的蛋白质 序列中具有一个典型的c h c h 结构域( 【c o i l e dc o i l1 】一 h e l i x1 】- c o i l e d c o i l2 】- h e l i x 2 】 d o m a i n ) ( z h a n gl i y i n ge ta l ，2 0 0 5 ；w e s t e r m a ne ta l ，2 0 0 4 ) ( 如图2 ) c h c h 结构域是在蛋白质l o c l l 8 4 8 7 中发现的保守区域，目前人们已经在很多真 核生物中如酵母、植物、果蝇、线虫、小鼠以及人类蛋白质中都发现该蛋白质结构域， 而在原核生物中没有发现，意味着该蛋白质家族起源于真核生物。根据c h c h 结构域 h u 高 的二级结构将其分成三类亚群，分别是s ( s m a l l ，小蛋白) ，n ( n t e r m i n a le x t e n d e d ， n 末端扩展蛋白) 和c ( c t e r m i n a le x t e n d e d ，c 末端扩展蛋白) 。s 蛋白一般具有7 1 1 6 4 个氨基酸残基，c h c h 结构域位于蛋白质的中心位置，主要包括c 2 3 6 0 ，m r p l o p ，雌 激素诱导的基因2 ( e 2 i g 2 ) ，p 8 m t c p 7 等。n 末端扩展蛋白的c h c h 结构域位于蛋白质 的c 末端，其结构除了具有c x 9 c 基序外，在c h c h 结构域的n 末端有一个g x x x g h 基序，已发现的该类蛋白有啤酒酵母基因编码的1 l k d a 的c o x l 9 蛋白，存在于胞质和 线粒体中，为细胞色素c 氧化酶表达所必需( t a ye t a l ，2 0 0 4 ) 。c 末端扩展蛋白的c h c h 结构域位于蛋白质的n 末端附近，主要是指与n a d h 泛醌氧化还原酶亚单位有关的蛋 白质，其中在d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r 中，基因c g 5 0 1 0 、c g 3 1 0 0 7 、c g 3 1 0 0 8 、c g 7 9 5 0 所编码的蛋白质以及r h 2 3 0 4 3 p 均含有此结构域。只有r h 2 3 0 4 3 p 的功能已经确定为具 有n a d h - 泛醌氧化还原酶活性，其余四个基因所编码的蛋白质的功能还未确定。 1 a t gc c cc c ec 从c g tt c gg 从g g gc c gc g at c ca c ag g at c t a t gc g gc g cc 从a c ea g e 1 mpr q rsegprstgsmrr q ss 6 1e g ga c ea g cc a tg t c 丌cg e ea c a 从gc c gt c tc g tg g ga c ea c ea a gg a tc t gc c g g e t 2 lr ssh v fatkpsrgsskdlpa 1 2 1g t gc a gc a gc c ca a ga a gg a at c cc t gc c ag c tc e ag c tc c tg e tg e ct c gg c ag c ca c c 4 1v qq pkk eslpa a apaasaat 1 8 1 t c ca c ag a ga c aa a ag g tc c ta c ea c ac e ag a ta g gt t ca a gg a ca t gg c ca c ca c gc e g 6 lstetkgpstadrfkdmatta 2 4 1g c tg g cg t gg c a g c ag g at c a 8 1a g v aags g c tg t gg g cc a cg c tg t gg g c avghavg g c ag g ac t ca c gg g aa t g agltgm 3 0 1t t cc a gg g ac g tg g te a gg e ag c cc c gg c c 从gg a gc a gc c tc 从c a gg a gg g at c ct t g 1 0 1f q g rgqaapakeqp qq egsl 3 6 1g c ag i 可t c ag c tt c gc 从t c ag t ac c ga a a 1 2 1a asasqs v pk c c tc a a c t ag t gg a gg a tg g tc c ct g cg c c p 工 二 互 二口c a c o i1 e dc o i lr e g i o n1 4 2 1t t cg a gc t ga g gc a gt t cc t c 从gt g ca c cg a gg a ca a ca c ea g tg a tc t ct c cg t tt g c 1 4 1 e 量l基鱼垦k cted 三 二 工卫c h e l i x1c o l l e dc o l lr e g i o n2 4 8 1a a gg a gt t t 从cg a gg e aa t gc a gc a g 1 6 1 堕 曼婪星丛垒g h e l i x2 t g tc g gc g gc g ct a ta a tg t ct g a5 3 1 crrrynv 枣 图2 ：基冈c g 31 0 0 7 的核苷酸序列与氨基酸序列，黑框标出的氨基酸序歹0 即为c h c h 结构域 c g 3 1 0 0 7 基因编码产物中的c h c h 结构域属于n 末端扩展蛋白，与上述的c o x l 9 的c h c h 结构域同类，且采用p s o r t 程序对该预测蛋白质进行亚细胞定位，结果显示 体色图式 相关基因 黑腹果蝇体色图式的形成 组分，将电子从细胞色素c 传递给o ：分子 细胞色素c 在线粒体中h ：o ：的存在下可 以氧化儿茶酚胺生成黑色素 图3 ：差异表达基因c g 3 1 0 0 7 与黑腹果蝇体色图式的关系图 基因功能的研究方法 随着人类基因组计划和其他一些模式生物基因组研究的顺利进行，越来越多的新基 4 前言 因被发现，生命科学的研究已经进入后基因组时代，基因功能研究将成为生命科学领域 中的重大课题。目前基因功能的研究方法主要有基因转导、反义技术、转基因和基因敲 除、染色体转导、r n a 干涉等。 3 1 基因转导技术 将目的基因导入某一细胞，通过观察细胞生物学行为的变化来了解基因的功能，是 目前应用最多、技术最成熟的基因功能研究方法。由于基因表达受转导效率和是否持续 稳定表达两方面因素影响，因此需慎重选择转导系统( i n d e r ，1 9 9 8 ) 。常用的基因转导系统 分为非病毒性表达系统和病毒性表达系统。 ( 1 ) 非病毒性表达载体：通过d n a 直接注射或与阳离子脂、多聚赖氨酸类混合， 将目的基因导入细胞。由于不同的基因在细胞中转录、翻译以及翻译后加工的差异，所 以在选择表达载体时应该注意：选择强启动子和增强子及选择高效的多聚腺苷酸加尾信 号( p o l y a ) 增强基因的表达；而有些基因的内含子序列具有重要的调控功能，为了增加翻。、 译效率一般设计一段内含子序列；内部核糖体进入位点( i n t e r n a lr i b o s o m ee n t r ys i t e ，i r e s ) ( j a c k s o ne t a l ，1 9 9 0 ) 的设计便于构建双顺反子和多顺反子的表达，能够表达多个亚基 蛋白或多个作用相关的蛋白( 李新枝等，2 0 0 7 ) 。 ( 2 ) 病毒表达载体：以病毒为载体介导的基因转导技术转染效率高、目的基因可稳 定的表达，因而引用比较广泛，常用的表达载体有四种类型：腺病毒、腺相关病毒、单 纯疱疹病毒和慢病毒( s e u n ge ta l ，2 0 1 0 ) 。腺病毒载体载体转基因效率高，体外实验通 常接近1 0 0 的转导效率；可转导不同类型的人组织细胞，对于分裂期和静止期的细胞 均有效；进入细胞内并不整合到宿主细胞基因组，所以只能介导基因的短暂表达。与其 他病毒载体相比，腺相关病毒腺相关病毒载体是一种单链线状非致病性d n a 病毒，是 目前发现的唯一一种以点特异性方式整合在人1 9 号染色体上的真核病毒，对分裂期细 胞和静息细胞如神经元、肌细胞、造血干细胞等均较敏感，不伴随任何病毒基因表达， 是比较理想的基因转导和表达系统，也是第一个被用于中枢神经系统基因转移的载体系 统( k a p l i t te ta l ，1 9 9 4 ) 。i 型单纯疱疹病毒是一种亲神经元病毒，主要用于神经系统 基因转移。i 型单纯疱疹病毒载体转移基因片段的容量大，对细胞毒性较小，免疫反应 也小。慢病毒属于逆转录病毒家族，可携带外源基因整合到宿主细胞的基因组中，可和 宿主细胞同步复制，而且能稳定持久的表达，对分裂期和静止期的细胞均有效，而且宿 主范围广( l iy u e p i n ge ta l ，2 0 0 7 ；k i m ae ta l ，2 0 1 0 ) 。相信随着研究的不断深入，病毒 湖北大学硕士学位论文 表达载体在基因功能及其他方面的应用将越来越广泛。 3 2 反义技术 反义技术( 纪宗玲等，2 0 0 2 ) 是根据碱基互补原理，利用人工或生物合成的方法获得 针对特定靶序列的反义核酸，从而抑制特定基因的表达和蛋白质产物的合成，包括反义 r n a 、反义d n a 及核酶( r i b o z y m e ) 。反义寡脱氧核苷酸一般只有1 5 - 3 0 b p ，特异性 极强，进入细胞后，能和特定的靶序列结合从而在各个水平上干扰基因的表达， 包括基因的复制、转录、m r n a 的剪接加工乃至输出和翻译等各个环节。核酶是 具有酶活性的反义分子，可裂解与其互补的m r n a 及在d n a 内插入d n a 片段构 成三链结构。其中最常用的方法就是反义核酸，利用人工或生物合成的- 4 , 段核酸 去干扰基因的表达从而来探究目的基因的功能。( e l i z a b e t he ta l ，2 0 0 8 ；w a c h e c ke t a l ，2 0 0 6 ；j a m e se ta l ，2 0 0 2 ) 3 3 基因敲除技术 基因敲除( g e n ek n o c k o u t ) 又称基因打靶( g e n et a r g e t i n g ) ，就是利用同源重组的原 理将外源d n a 导入到胚胎干细胞( e m b r y o n i cs t e mc e l l ，e sc e l l ) ，使之与细胞中基因 组顺序相同或相近的靶基因发生重组而取代靶基因，利用突变的基因来敲除正常 的基因，从中筛选出突变个体，通过观察突变个体的生物学性状的变化进而探究 目的基因的功能和作用机制，这也是生物学上常用的研究基因功能的一种方法。 a n t h o n yl a l b i s t o n 等利用基因敲出技术敲除小鼠体内与胰岛素调控相关的氨基 肽酶，发现血管紧缩素i v 失去了结合位点，同时小鼠的空间感知能力也发生了变 化。通过基因敲除的手段探究了氨基肽酶的功能和调控机制( a n t h o n y e t a l ，2 0 0 9 ) 。 相信随着这项技术越来越成熟，更多的新基因可以通过基因敲除的方法去弄清楚 其生理功能。 3 4 人工染色体的转导 转基因技术是进行蛋白功能分析和基因表达调控的有力手段，但使用小的质粒重组 体存在表达水平低、缺乏组织特异性等缺点，若将大的d n a 片段克隆入酵母人工染 色体( y a c s ) 、细菌人工染色体中则可产生较好的表达水平和组织特异性，并可精确地 调节同源重组。y a cd n a 转导的方法主要有前核注射、脂质体介导和与酵母原生质 6 h ui 体融合等。采用y a c 转导基因的方式可使导入基因的水平与内源基因相当，并且具有类 似于天然的剪接机理，适用于复杂的基因功能分析。 3 5 r n a 干涉 r n a ( r n ai n t e r f e r e n c e ，r n a i ) 干涉是指外源或内源性的双链r n a ( d o u b l es t r a n d e d r n a ，d s r n a ) 导入细胞后引发生物体内基因的同源序列降解，从而使基因转录后表现出 沉默的现象。这种转录后基因沉默( p o s tt r a n s c r i p t i o n a lg e n es i l e n c i n g ，p c s ) 机制首先在 线虫( c a e n o r h a b d i t 如e l e g a n s ) 得以证实。随后的研究进一步发现，在多种生物如果蝇、 拟南芥、小鼠及哺乳动物等成体细胞中均存在r n a i 现象。这表明r n a i 是生物界普 遍存在的r n a 水平上调节基因表达的方式。它提供了一种特异性失活功能基因的简易方 法，因此r n a i 己成为目前进行大规模遗传筛选和基因功能鉴定的最佳手段( 兰小平， 2 0 0 4 ) 。一方面它能特异性抑制目的基因的表达，且实验结果可在2 3 天内完成，这 一点是其它传统实验技术无法比拟的；另一方面，由于r n a i 广泛存在于各类真核生 物中，这为利用该技术研究真核生物基因功能提供了条件，且与经典遗传学方法不同的 是它把变异性和具体的序列信息联系在一起( 毛健民，王红星：2 0 0 3 ) 。r n a i 在基因功 能研究中的应用方式是通过人工导入d s r n a 或s i r n a ( s m a l li n t e r f e r i n gr n a ) 来实现 的，应用的范围从最初的线虫功能基因组学的研究发展到目前对果蝇等无脊椎动物以及 哺乳动物和植物基因功能的研究( 吴元明，陈苏民；2 0 0 3 ) 。 3 6 基因诱捕技术 基因诱捕( g e n e t r a p ) 是基于小鼠胚胎干细胞( e s 细胞) 和诱捕载体所建立 的一种高通量的基因突变技术，也是近几年发展起来的研究基因功能的技术( 刘楠梅， 2 0 0 0 ) 。诱捕载体主要包含不含启动子的报告基因( r e p o r t e rg e n e ) 、剪接受体( s p l i c e a c c e p t o r ，s a ) 、转录终止序列( p o l y a ) 等遗传标记。基本原理是：插入的诱捕载 体在内源性基因的顺式调控元件启动子、增强子的转录活性作用下，通过m r n a 前 体的剪接，上游编码基因与报告基因产生融合转录( f u s i o nt r a n s c r i p t ) ，融合转录 载体在插入位点能够模仿内源基因的表达，使得内源基因表达终止，达到突变内 源基因从而研究该基因的表达特性及功能的目的。 近年来，生物信息学的快速发展也为基因功能的研究提供的便利，利用相应的生物 软件和网络数据库对未知基因的结构和功能进行分析和预测，再通过实验加以验证，大 湖北大学硕七学位论文 大提高了实验的效率( j iz h o n g l i ne ta 1 , 2 0 0 2 ) 。本文中主要是通过对该基因编码蛋白质的 位置进行分析，因为每种蛋白质在细胞中的位置都与其功能是相关的。确定该基因产物 在细胞中的具体位置，为更进一步了解该基因的功能奠定基础。 4 细胞转染技术简介 转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深 入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化 学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导 入细胞的范例：化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法和多种 阳离子物质介导的技术；生物介导方法中有较为原始的原生质体转染和现在比较多见的 各种病毒介导的转染技术。理想的细胞转染方法应该具有转染效率高、细胞毒性小等优 点。病毒介导的转染技术是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。 但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室 中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。需要指出的一点，无论 采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转 染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细 节，都需要考虑。 以下是几种常见转染方法的原理及各自的特点： 转染方法原理应用特点 不适用于原代细胞，操作简 磷酸钙d n a 复合物吸附细胞膜稳定转染，瞬时性 磷酸钙法便但重复性差，有些细胞不 被细胞内吞转染 适用 带正电的d e a e 一右旋糖苷与核 相对简便、结果可重复，但 d e a e 一右旋 酸带负电的磷酸骨架相互作瞬时性转染对细胞有一定的毒副作用， 糖苷法 用形成的复合物被细胞内吞 转染时需除血清 适用性广但细胞致死率高， 高脉冲电压破坏细胞膜电位，稳定转染，瞬时性d n a 和细胞用量大，需根据 电穿孔法 d n a 通过膜上形成的小孔导入转染，所有细胞不同细胞类型优化电穿孔实 验条件 h u 再 通过侵染宿主细胞将外源基可用于难转染的细胞、原代 病毒介导法 稳定转染 因整合到染色体中 细胞，体内细胞等 但携带基因不能太大细胞， 通过侵染宿主细胞将外源基 逆转录病毒特定宿主细胞需处分裂期，需考虑安全冈 因整合到染色体中 素 通过侵染宿主细胞：t 每m - 源基瞬时转染，特定宿可用于难转染的细胞，需考 腺病毒 因整合到染色体中主细胞虑安全因素 带正电的脂质体与核酸带负适用性广，转染效率高，重 阳离予脂质稳定转染，瞬时性 电的磷酸基团形成复合物被复性好，但转染时需除血清。 体法转染，所有细胞 细胞内吞转染效果随细胞类型变化大 将d n a 用显微重金属颗粒沉 可用于人的表皮细胞，纤维 b i o l i s t i c 颗 淀，再将包被好的颗粒用弹道 瞬时性转染原细胞，淋巴细胞系以及原 粒传递法装置投射入细胞，d n a 在胞内 代细胞 逐步释放，表达 转染细胞数有限，多用于工 用显微操作将d n a 直接注入靶稳定转染，瞬时性 显微注射法 程改造或转基冈动物的胚胎 细胞核转染 细胞 本实验采用的是阳离子脂质体转染，对于体外培养的细胞，选用合适的转染试剂， 调整转染过程中各种配比关系可以提高转染效率。 5 生物信息学研究现状和应用 生物信息学( b i o i n f o r m a t i c s ) 是生物学与计算机科学以及应用数学等学科相互交叉 而形成的- - f 7 新兴学科。它通过对生物学实验数据的获取、加工、存储、检索与分析， 进而达到揭示数据所蕴含的生物学意义的目的。由于当前牛物信息学发展的主要推动力 来自分子生物学，生物信息学的研究主要集中于核苷酸和氨基酸序列的存储、分类、检 索和分析等方面，所以目前生物信息学可以狭义地定义为：将计算机科学和数学应用于 生物大分子信息的获取、加工、存储、分类、检索与分析，以达到理解这些生物大分子 信息的牛物学意义的交叉学科( 吴曼，1 9 9 8 ) 。 9 湖北大学硕士学位论文 5 1 生物信息学的主要内容 ( 1 ) 序列比对( s e q u e n c ea l i g n m e n t ) ( 2 ) 蛋白质结构比对和预测 ( 3 ) 基因识别，非编码区分析研究 ( 4 ) 分子进化和比较基因组学 ( 5 ) 序列重叠群( c o n t i g s ) 装配 ( 6 ) 遗传密码的起源 ( 7 ) 基于结构的药物设计 ( 8 ) 生物系统的建模和仿真 ( 9 ) 生物信息学技术方法的研究 ( 1 0 ) 其他。如基因表达谱分析、代谢网络分析；基因芯片设计和蛋白质组学数据 分析等，逐渐成为生物信息学中新兴的重要研究领域；在学科方面，由生物信息学衍生 的学科包括结构基因组学，功能基因组学，比较基因组学，蛋白质学，药物基因组学， 中药基因组学，肿瘤基因组学，分子流行病学和环境基因组学。从现在的发展不难看出， 基因工程已经进入了后基因组时代。我们也有应对与生物信息学密切相关的如机器学 习，和数学中可能存在的误导有一个清楚的认识。 5 2 生物信息学的发展历程和前景 5 2 1 生物信息学的发展历程 生物信息学的发展大致经历了三个阶段。前基因组时代。标志性工作包括蛋白质 序列分析。例如，2 0 世纪8 0 年代美国洛斯阿拉莫斯国家实验室建立g e n b a n k ，但数据 量增长较慢；n e e d l e m a n 和w u n s c h ( 1 9 7 0 ) 以及s m i t h 和w a t e r m a n ( 1 9 8 1 ) 分别提出了全 局和局部的序列对位排列算法等。基因组时代：标志性工作包括基因寻找和识别、网 络数据库系统的建立和交互界面的开发等。例如，建立与发展e s t 数据库以及电子克 隆技术等。后基因组时代：标志性工作是大规模基因组分析、蛋白质组分析以及各种 数据的比较和整合。例如，蛋白质组学的产生以及分析人类基因组草图等。 5 2 2 生物信息学的发展前景 完整基因组的测序是一种重大的成就，但这仅仅是理解生命的开始。更重要的是通 过相似性搜索而建立与已知序列的关联，利用进化关系分析来推测或判断基因的功能， h u 鬲 并使用已知的或者模型衍生的蛋白质结构推断基因产物的功能等。特别值得指出的是， 当今生物学数据的巨大积累将会导致重大生物学规律的发现。而这些方面的研究都属于 生物信息学的范畴。所以，生物信息学是当前生物学领域的研究热点，预计在未来的若 干年它将变得越来越重要。当前是生物信息学研究的一个有活力的新时代，是人类基因 组研究的收获时代，它将揭示各种基础研究潜在的重要成果，从而带来巨大的经济效益 和社会效益。在未来的几年中d n a 序列数据将以意想不到的速度增长，这是一个难得 的机会。我国应尽早利用这些数据和生物学信息技术，以使我国在该领域占据国际科学 界的领先地位。 蛋白质亚细胞定位技术 6 1 研究蛋白质亚细胞定位的意义 亚细胞水平是指在亚显微水平下观察到的细胞结构，细胞器主要包括内质网、高尔 基体、线粒体、核糖体、过氧化物酶体、溶酶体、液泡、叶绿体等。线粒体是细胞的“动 力工厂”，在细胞代谢中起重要作用：溶酶体内含有多种水解酶，参与蛋白质、糖脂、糖 胺聚糖及其他大分子的降解；核糖体是蛋白质的合成场所；内质网和高尔基体在蛋白质 的合成及翻译后修饰中起重要作用。蛋白质是生物学功能的主要承担者，不同的蛋白质 通常分布在细胞的不同部位行使不同的功能，蛋白质功能与它的亚细胞位置有着密切的 关系，亚细胞位置是基因产物( 比如蛋白质) 的一个关键的功能性特征。我们要想真正了 解蛋白质的功能就需要知道蛋白质在细胞中所处的空间位置。因此，研究蛋白质亚细胞 定位很有必要，它能帮助我们应用生物信息学的研究来促进蛋白质结构和功能的测定。 蛋白质亚细胞定位能够为我们更有效更快捷地发现有特殊意义的基因表达产物，更深入 理解其生物功能提供重要线索，并为全面展示和分析蛋白质组提供更多信息。 6 2 蛋白质亚细胞定位的种类 亚细胞定位的方法主要有以下几种：1 ) 应用激光扫描共聚焦显微成像系统及荧光定 量分析方法进行亚细胞结构中的精确定位：2 ) 借助免疫荧光技术和绿色荧光蛋白( g f p ) 标签技术，在激光共聚焦显微镜下，利用免疫荧光标记技术检测蛋白质的亚细胞定 位：3 ) 对细胞内光敏剂和细胞器探针的荧光图像进行比较分析，是光敏剂亚细胞定位研 究的通用技术手段：4 ) 应用倒置荧光显微镜和致冷c c d 探测荧光光敏剂和细胞器探针 湖北大学硕七学位论文 5 ) 应用于光敏剂亚细胞定位：应用细胞器、细胞组份分离技术和与多维色谱联用的串联 质谱分析，研究蛋白质亚细胞水平的定位和移位：6 ) 利用离散量与离散增量的概念从全 序列的角度出发来预测蛋白质的亚细胞位置：7 ) 免疫荧光定位，用直接荧光和间接荧光 两种观察方法证明蛋白质的亚细胞定位：8 ) 利用免疫金免疫电镜定位技术进行蛋白质的 亚细胞定位：9 ) 绿色荧光蛋i 白( g f p ) 融合蛋白技术确定亚细胞定位等等。除免疫金标记 技术以外还有放射免疫标记、荧光标记以及酶标记，它们具有相同的敏感性和特异性。 而本实验采用的绿色荧光蛋白标签技术，比较其他方法具有更多的优越性。 6 3 绿色荧光蛋白的应用及研究进展 6 3 1 绿色荧光蛋白发现及其性质 1 9 6 2 年，s h i m o n u r a 和j o h n s o n 等从多管水母类动物a e q u o r i av i c t o r i a 中分离、 纯化出一种可发出荧光的蛋白质，称为绿色荧光蛋白( g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t i n s ) ( y if u e ta l ，2 0 0 8 ；陬a p a p a nt e e r a w a n i c h p a ne ta ，2 0 0 7 ；s h i m o m u r a ，2 0 0 5 ) 。此后，人们对绿色荧 光蛋白的结构、性质、发光机制、分子生物学进行了深入的研究。自从1 9 9 4 年c h a l f i e 等人将g f p 作为基因表达的标记在生物技术领域应用以来，g f p 已成为现代细胞生物 学与分子生物学研究领域的新标记物。由于其特有的生物化学性质，分子量小、且该基 因在异源细胞内的表达并产生强烈的绿色荧光、不需要任何辅助因子参加、对细胞没有 毒性等，使其在生命科学，特别是生物技术领域具有广泛的前景( p r a p a p a n t e e r a w a n i c h p a ne ta l ，2 0 0 7 ；l i p p i n c o t t s c h w a r t ze ta l ，2 0 0 3 ) 。g f p 是一种只含2 38 个 氨基酸小分子蛋白，分子量为2 3 k d a 。g f p 之所以能产生荧光是因为它含有一个生色基 团，位于6 5 7 位的3 个氨基酸，g f p 的生色基团是蛋白质自身催化环化的结果( 刘 组强等，2 0 0 0 ) 。 6 3 2 利用绿色荧光蛋白作为标记基因的优点 g f p 用作标记蛋白，具有以下优点：能发射稳定的荧光。由于g f p 蛋白本身紧 密坚实的结构保证了其稳定和抗热、抗变性剂等特点。g f p 对光漂白有较强的耐受性， 能耐受长时间的光照；g f p 对高温( 7 6 。c ) ( w a r d ；2 0 0 6 ) 、p h 、有机溶剂和大多数普通 酶( 链霉蛋白酶p r o n a s e 除外) 都有较强抗性( a l k a a b i ；2 0 0 5 ) ；检测方便。由于g f p 本身能发射强烈的荧光，直接可以利用荧光显微镜进行活体观察，对细胞和组织没有任 何副作用；公用性和通用性，无论是原核细胞还是真核细胞都可以正常表达。c h a l f i e 等( c h a l f i ee la l ，1 9 9 4 ) 于1 9 9 4 年率先在大肠杆菌和线虫中表达g f p ，随后在酵母、果 h u 舌 蝇、h e l a 细胞、植物、转基因鼠、昆虫细胞等中表达成功而且不受细胞种类和位置的 限制，在各个部位都可以表达。( w up e i q i a oe ta l ，2 0 0 9 ；汪恒英等，2 0 0 4 ) ； g f p 对受 体细胞基本无毒害，s h e e nj 等证实在玉米转g f p 基因植株中，即使g f p 在细胞中的 表达量很高时，对细胞也不会产生明显毒害；不需任何反应底物和辅助因子。可以 进行定量分析。以前荧光蛋白的定量分析需要借助昂贵的荧光光度计，现在已经有研究 表明能直接利用聚丙烯酰胺凝胶成像系统对荧光蛋白进行定量分析( c h e w e l a l ，2 0 0 9 ) 。 6 3 3 绿色荧光蛋白在生物技术上的应用 1 ) 用于基因表达的亚细胞定位 利用g f p 作为报告基因与目的基因构建融合表达载体，将重组载体导入细胞中， 根据细胞中荧光的分布来确定蛋白质在细胞中的定位情况。g f p 分子量小，可以和很多 蛋白质融合且不影响蛋白质的天然构象和特性，是研究蛋白质定位的理想报告基因。白 雪源等利用g f p 作为报告基因，构建了人胆酸转运蛋白基因a s b t 蛋白的真核表达载 体，转染到肾小管上皮细胞，结果表明a s b t 蛋白主要表达于近端肾小管上皮细胞管腔、 侧细胞膜( 白雪源等，2 0 0 8 ) 。另外，g f p 作为细胞内蛋白质的标记分子，可以利用荧光 共振能量转移显微技术研究细胞内蛋白质之间的相互作用。吴燕等利用构建的 p e g f p n l s e m a 4 c 和p d s r e d g i p c 分别共转染h e k 2 9 3 和c o s 7 细胞，观察两者 的荧光共定位情况，结果表明s e m a 4 c 主要在胞膜和胞浆内表达，g i p c 主要在胞浆内 呈斑块样聚集分布；s e m a 4 c 和g i p c 之间存在荧光共定位( 吴燕等，2 0 0 8 ) 。 2 ) g f p 用于发育分子机理的研究 生物个体的发育从分子水平上说，就是基因在不同时间和空间选择性表达的结果。 g f p 作为活体标记，利用其发荧光的