（农产品加工及贮藏工程专业论文）米根霉L乳酸高产菌株的选育及发酵条件优化.pdf

米根霉l 一乳酸高产菌株的选育及发酵条件优化 摘要 本文采用紫外线( u v ) 与亚硝基胍( n t g ) 对米根霉a s 3 3 4 6 1 进行复合诱变，根 据大通量快速筛选思想和代谢控制育种理论初步建立起两种筛选方法：琼脂块一变 色乎板法和丙烯醇y p d 平板法，获得乳酸产量提高的正突变株分别为4 株与8 株。 由后种方法获得的变异菌株h b f - 1 2 为最优突变株，该菌株产乳酸与乙醇分别为 8 8 4 9 l 与4 4 9 l ，分别比亲株提高了3 0 与降低了7 4 。确定丙烯醇y p d 平板 法为高效初筛模型。 通过单因素试验和正交试验，优化菌株h b f 1 2 摇瓶发酵条件。确定最佳发酵 培养基组成：1 2 0 9 l 葡萄糖，4 9 l ( n h 。) 。s o 。，0 4 9 l m g s 0 4 7 h z 0 ，0 1 9 l z n s o 。- 7 h z 0 ， 0 3 9 l k h 。p 吼，6 0 9 l c a c 0 3 。最佳培养条件：装液量2 0 ，摇床转速2 0 0 r m i n ，好 氧发酵，温度3 2 。c 。在此条件下，突变株h b f 一1 2 的l 一乳酸产量达到9 6 2 1 9 l ，斜 面转接六代后该菌株的摇瓶生产能力比较稳定。最优条件下用7 l 发酵罐进行放大 实验，发酵曲线显示：与亲株相比，突变株h b f 一1 2 的乙醇产量与乙醇脱氢酶( a d h ) 活力分别下降了7 3 6 与7 4 ，乳酸产量与乳酸脱氢酶( l d h ) 活力分别提高了3 9 6 与1 6 2 。 针对突变株h b f - 1 2 是乙醇脱氢酶减弱型突变株，研究了米根霉中乙醇脱氢酶 的基本酶学性质：最适反应温度为2 5 c ；最适p h 值7 5 ；热稳定性范围3 5 。c 以下； 酸碱稳定性范围p h 6 5 - 7 5 ；z n ”对酶活存在明显的激活作用，m g “对酶活有轻微抑 制作用。得到该酶以乙醛为底物的米氏常数为1 7 5 0 x1 0m o l l ，n a d h 为底物的米 氏常数为2 0 4 9x1 0 、1m o l l 。 关键词：米根霉 育种l 一乳酸 发酵条件优化乙醇脱氢酶 s c r e e n i n go fr h i z o p u so r y z a eo v e r p r o d u c i n g l - l a c t i ca c i da n d o p t i m i z a t i o no ff e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s a b s t r a c t r h i z o p u so r y z a ea s 3 3 4 6 1w a sm u t a g e n i z e dw i t hu l t r a v i o l e tr a d i a t i o n ( u v ) a n d n - m e t h y l - n - n i t r o - n n i t r o s o g u a n i d i n er n t g ) t o g e t h e r , a n dt w ok i n d so fs e l e c t i n g m e t h o d sw e r eu s e da c c o r d i n gt ol a r g e s tt h r o u g h p u ts c r e e na n dm e t a b o l i cc o n t r o l l i n g s c r e e nt h e o r yt h a tw e r ea g a r - i n d i c a t o rp l a t ea n dy e a s t p e p t o n e d e x t r o s e ( y p d ) p l a t e c o n t a i n i n ga l l y la l c o h 0 1 a sar e s u l t ，f o u ra n de i g h tm u t a n ts t r a i n so v e r p r o d u c i n g l 1 a c t i ca c i dw e r eo b t a i n e dr e s p e c t i v e l yb yu s i n ga b o v et w om e t h o d s c o m p a r e d 、i t h o t h e rm u t a n t s 。t h e1 2 “1m u t a n ts t r a i n ( n a m e da sh b f 一1 2 1o b t a i n e df r o mt h e1 a t t e r m e t h o ds h o w st h eh i g h e s tl 1 a c t i ca c i dy i e l d8 8 4 9 lw h i c hi n c r e a s e s3 0 t h a nt h a to f t h ep a r e n ts t r a i n b u te t h a n o ly i e l di so n l y4 4 9 lw h i c hd e c e r e a s e s7 4 t h ee 珩c i e n t s c r e e nm o d e lo f y p dp l a t ec o n t m n i n ga l l y ia l c o h o lw a sf o u n d e d b yu n i f a c t o ra n do r t h o g o n a ld e s i g no fe x p e r i m e n t ，t h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so f t h em u t a n th b f 1 2w e r eo p t i m i z e dw i t hf l a s k t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m u m f e ：r m e n t a t i o nm e d i u ma r eg l u c o s e1 2 0 9 l ，( n h 4 ) 2 s 0 4 4 9 l ，m g s 0 4 7 h 2 0 0 4 9 l ， z n s 0 4 。7 h 2 0 0 1g l ，k h 2 p 0 4 0 3 9 l ，c a c 0 3 6 0 9 l ，a n dt h eo p t i m u mc u l t u r ec o n d i t i o n s a r el i q u i dv o l u m e2 0 ，r o t a t i n gr a t e2 0 0 r m i n ，c u l t u r et e m p e r a t u r e3 2 u n d e rt h e o p t i m u mc o n d i t i o n s t h el 1 a c t i c a c i dy i e l do fm u t a n th b f 1 2r e a c h s9 6 2 1 e e l h e r e d i t a r ys t a b i l i t yt e s td e m o n s t r a t e dt h a tt h ep r o d u c t i v i t i e so fm u t a n ts t r a i nf r o m1 s it o 6 “s e r i a lp a s s a g ea r es t a b l e f e r m e n t a t i o nc u r v e sw e r ei n v e s t i g a t e db yu s i n g7 l b i o r e a c t o ru n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n s b yc o n t r a s tw i t ht h ep a r e n ts t r a i n t h ee t h a n o l y i e l da n dt h ea l e o h 0 1d e h y d r o g e n a s e ( a d h ) a c t i v i t yo fh b f 1 2d e c r e a s e7 3 6 a n d 7 4 ，r e s p e c t i v e l y w h e r e a s ，t h el l a c t i ca c i dy i e l da n dt h el a c t a t ed e h y d r o g e n a s e f l d h ) a c t i v i t yo f h b f 1 2i n c r e a s e3 9 6 a n d1 6 2 t h a nt h o s eo f t h ep a r e n ts t r a i n r e s p e c t i v e l y b e c a u s et h ea c t i v i t yo fa d hi nm u t a n th b f 1 2d e c r e a s e sm a r k e d l y t h e e n z y m o l o g yc h a r a c t e r i s t i co f a d hf r o mr h i z o p u so r y z a ew e r es t u d i e di no r d e rt ok n o w m o r ea b o u tm u t a g e n e s i sm e c h a n i s m t h eo p t i m u ma c t i v i t yo fa d hi so b s e r v e da tt h e t e m p e r a t u r e 2 5 6 ca n da tp h 7 5 1 1 1 er a n g eo ft e m p e r a t u r es t a b i l i t yi sb e l o w3 5 c t h e r a n g eo fp hs t a b i l i t yi sf r o m6 5t o7 5 t h ea c t i v i t yo fe n z y m ei sa c t i v a t e db vz 一+ d r a m a t i c a l l ya n di n h i b i t e db ym g ”s l i g h t l y t h ek mc o n s t a n t sb a s e do nt h es u b s t r a t so f a l d e h y d ea n dn a d ha r e1 7 5 0 1 0 m o l l a n d2 0 4 9 x 1 0 。m o i lr e s p e c t i v e l y k e yw o r d s ：r h i z o p u so r y z a es c r e e n i n g l l a c t i ca c i d f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o no p t i m i z a t i o n a l c o h o ld e h y d r o g e n a s 插图清单 图1 1l 型和d 型乳酸的结构式1 图1 2 米根霉细胞的葡萄糖代谢模型6 图2 1 还原糖含量标准曲线1 7 图2 2 乙醇含量标准曲线，1 7 图2 - 3 蛋白质含量标准曲线一1 9 图2 - 4 米根霉a s 3 3 4 6 1 育种实验方案流程图2 1 图2 5 紫外线照射孢子的致死率和正突变率曲线2 3 图2 6n t g 处理孢子的致死率和正突变率曲线2 4 图2 7 琼脂块一变色平板筛选2 5 图2 - 8 丙烯醇对米根霉a s 3 3 4 6 1 的致毒作用2 6 图2 - 9 含丙烯醇0 6 的y p d 平板筛选2 6 图2 1 0a d h 突变株的筛选结果2 7 图2 - 1 1 出发菌株的发酵特性2 8 图2 1 2 出发菌株的a d h 与l d h 活性2 8 图2 1 3 突变株h b f 1 2 的发酵特性2 9 图2 1 4 突变株h b f 1 2 的a d h 与l d h 活性2 9 图3 - 1 碳源不同浓度对产酸的影响3 4 图3 2 氮源不同浓度对产酸的影响一3 4 图3 3z n 2 + 对突变株产乳酸乙醇的影响3 5 图3 - 4m 9 2 + 对突变株产乳酸乙醇的影响3 5 图3 5 装液量对发酵的影响一3 8 图3 - 6 转速对发酵的影响一3 8 图3 7 分别在好氧和厌氧条件下出发菌株和突变株的发酵结果3 9 图4 1 h p l c 法l 一乳酸含量标准曲线4 1 图4 2 h p l c 法富马酸含量标准曲线4 2 图4 - 3 h p l c 法节果酸含量标准曲线4 2 图4 - 4 突变株h 3 f 1 2 与出发菌株罐发酵过程中产物累积和还原糖利用特性4 4 图4 5 突变株h b f 一1 2 与出发菌株罐发酵过程中a d h 与l d h 活性比较4 5 图5 1 不同温度下保温3 0 m i n a d h 活性， 图5 2 不同温度对a d h 活性的影响 图5 3 不同p h 值对a d h 活性的影响 图5 4z n ”与m 9 2 + 对a d h 活性的影响 图5 5 不同乙醛浓度对a d h 活性的影响 图5 - 6a d h 对乙醛反应动力学的双倒数图 图5 7 不同n a d h 浓度对a d h 活性的影响 图5 - 8a d h 对n a d h 反应动力学的双倒数图 的 如如钉跎铉够” 表格清单 表1 1 乳酸异构体的理化性质1 表2 1n t g 最适诱变剂量的实验设计2 0 表2 ，2u v 照射不同时间的孢子悬液培养2 4 h 后菌落计数结果2 2 表2 3 不同浓度n t g 处理的孢子悬液培养2 4h 后菌落计数结果2 3 表2 - 4 原始菌株与正突变株的发酵特性参数2 5 表2 5 突变株h b f 一1 2 生产稳定性考察一3 0 表3 1 正交试验因素水平表3 3 表3 2 发酵培养基中不同浓度z n 2 十与m g ”对突变株菌体形态和菌丝体量的影响3 6 表3 3l 9 ( 3 4 ) 正交试验设计及试验结果3 7 表3 - 4 方差分析表3 7 表5 1 不同温度不同保温时间条件下乙醇脱氢酶活性测定结果4 9 表5 - 2 乙醛浓度对a d h 酶活和反应速率的影响5 l 表5 - 3n a d h 浓度对a d h 酶活和反应速率的影响5 3 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据 我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的 研究成果，也不包含为获得金月b 王些鑫堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：力奇海 签字日期：跏6 年z 月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解盒目g 王些太堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权金 妲王些太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：另寸拜 签字日期：b of 年g 月y 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位 通讯地址 导师签名 胁潭 。 j 签字目期：力略年6 月r 日 电话：2 笄f f 。一9 3 t 守 r 邮编 致谢 本论文是在我的导师潘丽军教授的悉心指导和自己的刻苦努力下完成的，从 论文的选题到实验方案的制定、论文的修改完稿，都得到了潘老师无微不至的关 怀和帮助，潘老师严谨求实的治学作风、对科学的执着追求以及对人生的深刻理 解，使我受益匪浅。在此向潘老师致以最诚挚的谢意和崇高的敬意! 本课题论文的完成足对我三年研究生所学知识和技能的一个大总结，更是对 以前知识的巩固和提升，不仅使我的动手能力得到了很大提高，也使我的创新思 维得到了很好发展。感谢校、院系领导和实验室老师为我们营造了一个的浓厚的 学术氛围和良好的实验环境，为我们今后的工作和学习打下了坚实的基础。 感谢姜绍通教授、郑志老师、罗水忠老师、李兴江老师、操丽丽老师、陈小 燕老师给了我许多指导和帮助。此外，同学许彬和陆香庆等及本科生刘辕和曾伟 峻在实验过程中给予了大力帮助。同时还得到了其它实验室各位同学自始至终的 真诚指导和帮助。他们的帮助和支持使我的论文得以顺利完成，这里谨向他们致 以最衷心的感谢! 三年的研究生生活即将结束，这三年将是我人生最宝贵的财富，再次感谢所 有关心和帮助我的领导、师长、同学及朋友们! 第一章前言 1 1 乳酸的性质、应用及生产方法 1 1 1 乳酸的结构与性质 乳酸( 1 a c t i ca c i d ) ，学名a 羟基丙酸( o t h y d r x y p r o p i o n i ca c i d ) ，分子式 c h l c h o h c o o h ，分子量为9 0 0 8 ，在2 5 时相对密度约1 2 0 6 。乳酸分子中有一 个不对称的碳原子，因此乳酸具有旋光性，l ( + ) 乳酸为右旋型，d ( 一) 一乳酸为左旋 型，d l 乳酸为消旋型，结构式如图1 1 ，它们的理化性质如表1 1 【i 。2 】。 纯净的无水乳酸是白色的晶状固体，熔点1 6 8 ，沸点1 2 2 ( 2 k p a ) ，相对 密度1 2 4 9 。乳酸通常为无色或黄色液体，易与水互溶，还易与乙醇、乙醚、丙二 醇、甘油、丙酮混溶，几乎不溶于氯仿、石油醚、二硫化碳和苯p j 。当乳酸浓度达 到6 0 以上。具有很强的吸湿性。商品乳酸含量通常为6 0 ，食品级乳酸含量为 8 0 以上，药典级乳酸含量为8 5 9 0 。在6 7 1 3 3 p a 的真空条件下反复分馏， 可得到高纯度的乳酸，进而获得单斜晶体的结晶乳酸。乳酸分子内有羟基和羧基， 可以参与氧化、还原、缩合、酯化反应【4 】，而且具有自动酯化的能力。乳酸越浓， 这种趋势就越强。 h o o c h o 3 h l 1 - 1 3 ( 3 l - ( + ) - 乳酸 c o o h h 三o h ( 2 1 - t 3 d - ( 一) 一乳酸 图1 1l 型和d 型乳酸的结构式 f i g i - i m o l e c u l a r f o r m u l a o f l a n d d l a c t i ca c i d 表1 - 1 乳酸异构体的理化性质 t a b l e 1 一it h ep h y s i c a la n dc h e m i c a lc h a r a c t e r so f l a c t i ca c i di s o m e r 1 1 2 乳酸的应用 作为一种古老而重要的有机酸，乳酸自1 7 8 0 年首次发现至今已广泛应用于食 品、医药、农业和化工等方面 5 - 9 1 。由于人体只能代谢l 哥l 酸，d 乳酸或d l - 乳酸 的过量摄入则有可能引起代谢紊乱甚至中毒。因此，世界卫生组织限制人体每天 摄入d 乳酸在1 0 0 m g k g 以下，d 乳酸或d l 一乳酸不能添加到3 个月以下婴儿的食 品中【10 1 。 l 一乳酸对人体无副作用，易吸收，可直接参与体内代谢，酸性柔和且稳定，有 助于保护食品的口味，因此l 乳酸及其衍生物已逐渐取代其它有机酸，作为酸味 剂、杀菌剂、乳化剂、保鲜剂等广泛应用于食品工业j 。可用于清凉饮料、果汁、 果子露、水果糖、糖浆、面包、面条、果冻、干酪、果酱、冰淇淋、腌菜、肉类 加工品，还可用作酱油的香味缓冲剂。在啤酒制造上，美国禁止使用磷酸等无机 酸调节p h ，而全部使用乳酸。 l 乳酸对人畜无害，而且有很强的杀菌作用，其杀菌能力是柠檬酸、酒石酸、 琥珀酸的几倍，可以直接用作手术室、病房、实验室、车间等场所的消毒剂i l “。 l 哥l 酸、l 一乳酸钠与葡萄糖、氨基酸等复合配制成输液，可治疗酸中毒及高钾血症。 l 乳酸的铁、钠、钙盐等溶解性好，是补充金属元素的良好药品。 乳酸可以用作为纺织品的助染剂，在电子、航空和航天及半导体工业中作为 精细清洁剂。在化妆品和清洁卫生用品方面，乳酸和乳酸钠可作为滋润剂、皮肤 增白剂、p h 调节剂、保温剂、抗菌剂、乳化剂、稳定剂，延长产品的保质期，提 高产品的质量。在皮革工业中，可用4 0 乳酸除去鞣皮中石灰，提高皮革质量。 在卷烟工业中，可用乳酸除去烟草中杂质，清除辛辣味，提高烟草档次。l 乳酸 还可作为植物生长活力剂，水产用生菌剂等应用于农、渔业上，具有十分诱人的 开发前景 1 2 , 1 3 】。 聚l 乳酸是以l 乳酸为单体经聚合制成的一类高分子材料，无毒、无刺激性， 具有良好的生物相容性，可生物降解吸收，强度高，可塑性加工成型。它易被自 然界中的各种微生物或动植物体内的酶分解，最终形成二氧化碳和水，不会造成 “白色污染”，对实现可持续发展战略具有重要意义，可广泛应用于缓释胶囊制剂、 生物降解纤维的生产，生物降解材料的生产及生物植片制造等方面，因而被认为 是最有前途的可生物降解高分子材料 1 4 - 1 7 】。 随着乳酸在各个领域中的广泛应用，各国都将乳酸产业作为重点工业项目。 目前，全世界的乳酸产量约为1 0 万t ，其中1 0 采用化学合成法，9 0 采用发酵 法【l ”。在我国，随着乳酸及其衍生物应用领域的不断扩大和消费量的增加，乳酸 的需求量也不断增加。我国乳酸最大的消费领域是香料和香精行业，其用量约占 乳酸总消费量的4 0 。随着世界经济一体化和我国进入w t o ，将为我国乳酸工业 发展提供更加广阔的前景。 1 1 3 乳酸的生产方法 目前，乳酸的生产方法主要有微生物发酵法、化学合成法和酶法。 发酵法制备乳酸是以淀粉、葡萄糖等糖类或牛乳为原料，经微生物发酵制得。 目前使用的菌种中细菌主要有乳杆菌、链球菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、凝结芽孢杆 菌，霉菌主要有米根霉。与细菌相比，米根霉( r h i z o p u so r y z a e ) 由于具备好氧发 酵、可直接利用淀粉做c 源、发酵产物l 一乳酸纯度高、易于分离等特点，而成为目 前制备l 乳酸的主要菌种 t , 1 9 1 。 化学合成法生产乳酸可通过多种途径进行，其中具有现实意义的是乳腈法 【2 0 1 。该法是乙醛与氢氰酸经碱性催化剂作用生成乳腈，这是一个液相反应，在常 压下进行，粗乳腈通过蒸馏回收纯化并用浓盐酸或硫酸水解为乳酸，还产生相应 的氨基酸副产物，粗乳酸用甲醇酯化得乳酸甲酯，精馏后再水解为乳酸。由于原 料是乙醛和剧毒物氢氰酸，因而此合成法生产乳酸大大受到限制。乳酸的其它一 些可行的化学合成法包括糖的碱性催化水解、丙烯乙二醇氧化、乙二醇的硝酸氧 化等。 酶法生产乳酸主要有2 氯丙酸酶法转化和丙酮酸酶法转化【1 2 l j 。日本东京大学 的木崎等人( 1 2l 1 研究了酶法生产乳酸，他们从恶臭假单胞菌细胞中纯化出l 2 卤代 酸脱卤酶，从单胞菌1 1 3 细胞中纯化d l 一2 卤代酸脱卤酶，将这两种酶作用于底物 d l 2 氯丙酸，就得到l 一乳酸或d 乳酸。h u m m e l 等人【l 】从混乱乳杆菌d s m 2 0 1 9 6 菌体中得到d 乳酸脱氢酶，然后将其作用于无旋光性的底物丙酮酸得到d 乳酸。 化学合成法的缺点是产品为外消旋d l 乳酸，并且其原料是乙醛和剧毒物氢氰 酸，使得人们对其产品的安全性不放心，况且其成本也较高，因此该法不能形成 技术上或经济上可持续发展的过程，早己不是乳酸的生产技术发展方向；酶法生 产乳酸虽可以获得单一光学纯度乳酸，但工艺比较复杂，难于工业化；微生物发 酵法生产乳酸，可以通过菌种和培养条件的选择而获得具有立体专一性d 乳酸、 l 乳酸或两种异构体以一定比例混合的消旋体。另外发酵法生产乳酸不仅能以葡 萄糖、乳糖等单糖为碳源，还能利用淀粉、纤维素等为原料发酵生产乳酸，因此 微生物发酵法生产乳酸因其原料来源广泛，生产成本低，产品光学纯度高，安全 性高等优点而成为生产乳酸重要的方法。 1 2 米根霉发酵生产l ( + ) 一乳酸研究进展 根霉属中产l ( + ) 一乳酸的菌种很多，有米根霉、黑根霉、华根霉、行走根霉、 小麦曲根霉和美丽根霉，其中米根霉生产l ( + ) 乳酸的能力最强。但发酵周期长， 糖转化率低等缺点限制了其在实际生产中的应用。因此，国内外许多学者对米根 霉的菌种改良做了大量研究，主要集中在发酵工艺的改进、高产菌株的选育、代 谢机理研究及代谢通量分析、代谢关键酶的研究等方面。 1 2 1 发酵工艺研究 近年来对根霉发酵生产l f + ) 乳酸的发酵工艺研究主要集中在发酵原料的选 择、发酵条件的优化和菌丝形态等方面。为了提高乳酸生产率，改进分离过程， 围绕乳酸生产各个单元过程开发了许多新技术f 2 ”：采用半间歇或连续操作改进 生产；采用固定化技术或细胞循环反应器得到高浓度细胞提高乳酸产量；采用发 酵一分离耦合的萃取发酵技术等。 1 9 8 5 年河合启一申请了固定化米根霉生产l 乳酸的专利1 2 8 】。1 9 8 9 年h a n g 等i ”】 研究报道了用海藻酸钙固定化米根霉生产l ( + ) 乳酸的方法，实验结果表明乳酸产 量和葡萄糖的利用率均高于使用游离细胞进行发酵。t a m a d a 等【3 0 j 将米根霉细胞固 定化到以聚二甲基丙烯酸乙二醇酯为单体用y 射线诱导得到的高分子载体上，固 定化后的乳酸得率大于6 5 ，产酸速率比游离菌( o 1 4 g 干细胞m ) 高1 8 倍。y i n 等 人p l 】采用气升式发酵罐接种米根霉发酵，由玉米淀粉直接生产l 乳酸，所得乳酸 的质量浓度为1 0 2 9 l ，得率为8 5 。林建平等 2 2 _ 2 4 】对转盘反应器固定化米根霉的l 乳酸发酵进行了研究，结果表明：此法进行乳酸发酵具有发酵速度快、l 一乳酸得 率高及既能用于连续又能用于间歇发酵等优点，同时他利用发酵与离子交换分离 耦合技术进行乳酸发酵研究，简化了后续分离步骤。天津大学孙彦等人 2 5 , 2 6 】采用 聚氨醋泡沫法固定化米根霉发酵生产l 一乳酸，速率提高了3 倍。美国p u r d u e 大学的 l e e 及j s a o 首先将p v p 树脂用于乳酸发酵和分离过程，并取得良好的效果。t a y 等人 口到使用旋转的纤维床生化反应器( r o t a t i n gf i b r o u s b e db i o r e a c t o r ) ，将米根霉固定在 搅拌棒上的衬基上，使得细胞在其上生长而不是游离于整个发酵罐。这种方法克 服了传统的固定化中不利于营养物质、氧的传递等缺点。为了有效移走发酵液中 的乳酸，y a b a n n a v a r 2 j 使用a l a m i n e 3 3 6 叔胺和油醇的混合物来萃取乳酸。在膜法发 酵方面，t e j a y a d i 着n x a n i e r 等【2 】进行了研究。t e j a y a d i 等采用反渗透与发酵耦合起来 成为膜生物反应器，在4 0 9 l 的游离菌浓度下连续操作，乳酸赫浓度达8 9 9 l ，转化 率为8 9 。x a n i e r 等采用管式超滤膜细胞循环生物反应器进行乳酸发酵。长期发酵 的结果，乳酸浓度和生产率部高于高密度发酵的结果。 1 2 2 米根霉产l ( + ) 一乳酸代谢机理研究 米根霉能攘大部分糖转化为乳酸，但同时伴随产生乙醇、富马酸、琥珀酸、 苹果酸、乙酸等其它产物。它们之间的比例随着菌种和工艺的不同而异。目前人 们对米根霉发酵生产乳酸的代谢机理还不十分清楚。米根霉的糖代谢主要有以下 几种反应f 3 3 ： ( 1 ) 正常呼吸c 6 h i 2 0 6 + 6 02 6 c o2 + 6 h 2 0 ( 2 ) 同化作用( 生成菌丝体) 干菌体的9 5 来自碳水化合物 ( 3 ) 富马酸发酵 c 6 h i2 06 + 3 02 一c 4 hd o4 + 2 c o2 + 4 h2 0 ( 4 ) 酒精发酵 c 6 h i ，o 。- - 2 c ，h ，o h + 2 c o ， ( 5 ) l 乳酸发酵c 6 h 】2 0 6j 2 c3 h 6 0 3 近些年来，代谢通量的分析应用日趋广泛，许多发酵物系已有很多应用代谢 工程的研究实例。在代谢工程的基础研究中，目前应用最为广泛的方法是代谢通 量分析( m e t a b o l i cf l u xa n a l y s i s ，m f a ) 。m f a 可以根据已知代谢网络的输入输出量 确定通过代谢网络各途径的通量。m f a 最大的优点是不需要知道代谢网络中各种 酶的动力学特征就可以得到关于微生物代谢的许多重要信息。对于个已知的过 程，m f a 可以直接用来确定合成产物的代谢流量的比例，考察过程条件对代谢通 量改变的影响，可以预测另外增加新的途径对整个系统的影响。关于乳酸发酵过 程的研究，都是从外部宏观的角度，从工程的角度出发，而关于菌体内部代谢方 面的研究较少。 w r i g h t 等【3 4 】应用c 1 4 放射性同位素标记的方法建立了米根霉产l 乳酸的代谢 网络( 见图1 2 ) 。该网络表明，葡萄糖进入细胞内，通过糖酵解途径( e m p ) 生 成丙酮酸。丙酮酸在细胞内主要有四种去向：一是通过丙酮酸脱羧酶( p d c ) 、乙 醇脱氢酶( a d h ) 进入产乙醇的途径；二是通过丙酮酸羧化酶( p c ) 形成草酰乙 酸，再通过苹果酸脱氢酶和富马酸酶生成苹果酸和富马酸；三是通过l 一乳酸脱氢 酶( l d h ) 直接生成l 哥l 酸，这是目标产物形成途径；四是通过丙酮酸脱氢酶系 ( p d h ) 将丙酮酸转化成乙酰c o a 后进入三羧酸循环( t c a ) 以维持生物量平衡 后的基本代谢。 在国内，根据前人研究结果及对代谢副产物的研究，白冬梅等 3 2 j 构建出 r h i z o p u so r y z a er 1 0 2 1 利用葡萄糖进行代谢的网络图谱和代谢通量模型，确定p y r 是米根霉代谢网络上的关键节点，此节点的通量分配比影响着乳酸的最终产率， 分析了该菌株在分批发酵过程中不同阶段、不同氮源浓度、不同供氧量条件下的 代谢通量分布，研究了氮源n h 4 n 0 3 浓度和通气速率对胞内代谢通量分布的影响， 通过对模型进行优化计算得到乳酸的最大理论得率y m ，为发酵过程操作参数的选 择提供了定量的指导。 可以看出，l 一乳酸是米根霉发酵的目标产物，但由于p d c 、p c 和p d h 对载 流途径中丙酮酸流量的分配分流，使得目前米根霉l 乳酸对原料的转化率很难超 过8 0 1 3 ”，发酵液中可以检测到副产物乙醇、富马酸、苹果酸等，米根霉发酵被 视为“异型乳酸发酵”菌株。要想提高乳酸的产量，就必须降低丙酮酸进入其它代谢 途径的可能性。根据米根霉发酵乳酸的代谢机制可以看出，提高l d h 活性，减弱 丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶和丙酮酸羧化酶的活性，将有利于促进乳酸的产生。 图1 - 2 米根霉细胞的葡萄糖代谢模型 说明：e x t - 细胞外g 6 p6 - 磷酸葡萄糖，f - 6 p6 - 磷酸果糖，f - 1 ，6 一b p1 , 6 二磷酸果糖 f i g 1 - 2m o d e lo f g l u c o s em e t a b o l i s mi nr h i z o p u so r y z a e e x t - s t a n d sf o re x t r a e e l l u l a r , g 一6 - pf o rg l u c o s e - 6 - p h o s p h a t e ，f - 6 - pf o rf r u c t o s e 一6 - p h o s p h a t ea n d f 1 ，6 一b pf o rf r u c t o s e - 1 ，6 - b i s p h o s p h a t e 1 2 3 米根霉菌种改良 米根霉在分类上属于接合菌f ( z y g o m y c o t a ) ，接合菌纲( z y g o m y c e t e s ) ，毛霉 目( m u e o r a l e s ) ，毛霉科( m u c o r a e e a e ) ，根霉属( r h i z o p u s ) 。菌落疏松或稠密，最初呈 白色，后变为灰褐色或黑褐色。菌丝匍匐爬行，无色。假根发达，分枝呈指状或 根状，呈褐色。孢囊梗直立或稍弯曲，2 4 株成束，与假根对生，有时膨大或分 枝，呈褐色，长2 1 0 2 5 0 0 岬，直径5 1 8 叫1 。囊轴呈球形或近球形或卵圆形， 呈淡褐色，直径3 0 2 0 0 衄1 。囊托呈楔型。孢子囊呈球形或近球形，老后呈黑色， 直径6 0 2 5 0 岬。孢囊孢子呈椭圆形、球形或其他形，呈黄灰色，直径5 8 岬。 有厚垣孢子，其形状、大小不一致，未见接合孢子。该菌于3 7 4 0 能生长口”。 19 9 4 年w s u n t o m s u k 和y d h a n 9 1 3 8 j 通过紫外线诱变或亚硝基胍诱变处理米根 霉n r r l 3 9 5 ，得到3 株高产l ( + ) 一乳酸的米根霉菌株1 n 1 、3 n 4 和4 n 6 ，产酸分别 为1 7 6 、1 7 6 和1 9 8 l ，至少比原始菌株提高5 7 ，其中3 n 4 菌株的糖化酶活力 比原始菌株提高了5 4 ，为直接利用淀粉发酵生产乳酸奠定了基础。江苏省微生 物研究所曹本昌等【3 9 1 选育出一株产l ( + ) 哥l 酸的根霉菌株j s m i r 7 3 ，对该菌的性 能及产酸条件进行了研究，在5 0 0 l 发酵罐中进行扩大实验，当葡萄糖浓度为1 0 0 9 l 时产酸7 0 9 l 以上，1 3 0 9 l 时产酸1 0 1 9 l 以上。该菌株能以玉米粉作培养基，当 玉米粉浓度为1 2 0 9 l 时产酸7 0 l 以上，2 0 0 9 l 时产酸1 0 5 9 l 以上，其中l ( + ) 一 乳酸纯度最高可达到9 9 。山西省微生物研究所蒋明珠等【4 0 j 从5 6 株根霉菌株中筛 选出1 0 株产l ( + ) 乳酸较高的菌株，其中根霉r 4 7 产l ( + ) 一乳酸最高并且产酸稳定， 在摇瓶培养条件下，初始葡萄糖浓度为1 5 0 9 l ，3 5 、4 8 h 产酸1 1 8 4 9 l ，对糖转 化率达7 8 9 。福州大学杨虹等【4 “3 j 利用淀粉酸性培养基富集培养，并结合 k m n 0 4 ，k c l 平板检出的方法从土壤中筛选出根霉r 2 菌株，产乳酸8 l l ，并以 其为出发菌株经紫外线诱变，从琥珀酸平板上获得了变异株r 一2 9 1 ，以葡萄糖为 碳源产酸1 0 3 9 l ，对糖转化率为6 8 9 。上海市工业微生物研究所虞东胜等【舭l 从 黄酒酒曲中分离筛选得到产乳酸菌株米根霉r s 8 2 2 ，经过”c o y 射线- - d e s 一”c o y 射线一系列诱变处理得到产酸最高的变异株r s 9 2 8 。在6 0 t 发酵罐中，当葡萄糖平 均浓度为1 7 4 9 l 时，5 罐平均产l 乳酸1 4 0 l g l ，对糖转化率8 0 4 ，发酵周期6 1 h ， l 哥l 酸纯度9 7 9 。乔长晟等 4 5 , 4 6 1 对米根霉n r r l 一3 9 5 进行紫外诱变，用溴钾酚紫 乎板、高锰酸钾平板、高糖平板、高酸平板、纯裂酸平板、琥珀酸平板，筛选得 到一株高产l 一乳酸的正向突变菌株n a f 一0 3 2 ，其平均产酸率为7 3 0 5 l ，对糖转 化率为6 8 3 。并对摇瓶发酵条件作了初步研究，在优化条件下产酸可达9 4 2 8 l 。 白冬梅等人【47 j 利用酸性馒头片富集培养，用含脱氧胆酸钠和溴甲酚绿平板检出的 方法，从土壤中选出了根霉菌r o r y z a er 3 0 1 7 。并利用u v 、硫酸二乙酯和6 0 c o 对 菌株r o r y z a er 3 0 1 7 进行了诱变选育，得到突变株r 1 0 2 1 48 1 。当初始玉米淀粉浓度 为1 2 0 9 l ，摇瓶发酵6 0 h 后，该菌株产乳酸7 9 4 9g l ，比出发菌株提高5 2 ，l 乳酸纯度达到9 9 0 5 。古绍彬等人【4 4 ”】采用低能离子诱变方法，对出发菌米根霉 p w 3 5 2 进行改良，获得高产l 乳酸菌株r e 3 3 0 3 ，其产酸比亲株提高7 5 。在最 优条件下，其产酸量可达1 3 1 1 3 6 9 l ，最高可达1 4 0g l ，糖转化率为8 6 9 0 。 上述研究主要围绕米根霉高产菌种的诱变筛选，虽然在一定程度上提高了米 根霉对l 一乳酸的转化率，但诱变选育存在工作量大、盲目性与随机性大、突变菌 株易退化、发酵参数不稳定等缺点，效果并不理想，因此急需建立一种快速高效 的筛选方法。并且在这些诱变方法中较少涉及代谢控制育种，没有将微生物遗传 学的理论与育种实践密切结合起来，对突变株的变异机理不能深入了解，有待进 一步通过研究目的产物的生物合成途径、遗传控制及代谢调节机制来进行定向选 育。 1 2 4 米根霉酶学方面的研究 近年来欧美一些学者开展了一些对米根霉酶学、分子生物学方面的研究，对 于米根霉乳酸发酵过程的控制有重要意义，它为过程的优化控制提供了理论基础 和方向。 乳酸脱氢酶是一种寡聚酶，由四个亚基组成，相对分子量大约为3 6 0 0 0 道尔 顿，每一个亚基具有相同的功能，具有五种同工酶，其作用是催化乳酸和丙酮酸 的可逆转化，l l 酸脱氢酶可逆催化氧化l 哥l 酸为丙酮酸 5 ”。反应中乳酸脱氢酶 分子的每一个亚基都结合一个底物分子和一个辅酶分子( 烟碱胺腺嘌呤二核苷酸 n a d + n a d h ) ，独立的发生反应。在氧化l 乳酸的逆反应中，乳酸脱氢酶在n a d h 的辅助下，可逆催化还原去质子化丙酮酸盐，生成去质子化l 乳酸盐。 我国淮海工学院江龙法f 53 j 对米根霉乳酸发酵的不同阶段乳酸脱氢酶的比活力 进行了研究，发现碳源消耗和产酸的增长期均出现在发酵的2 0 4 8 h ；乳酸脱氢酶的 比活力高峰出现在发酵的2 6 4 0 h ，l 一乳酸的增长期和乳酸脱氢酶比活力的增长期基 本上是同步的；同时l 一乳酸的发酵受菌体生长状态的影响等。但是，在其实验中 采取了一次性加入c a c 0 3 的方法，因而过程p h 值变化对乳酸脱氢酶比活力所产生 的影响是不可忽视的。本课题组从米根霉a s 3 8 1 9 中初步分离出乳酸脱氢酶，对其 酶学特性、发酵体系l d h 活力及代谢调控进行了研究【5 4 , 5 5 1 。获得了该乳酸脱氢酶 的最适反应p h 为7 4 ，最适催化温度为3 0 5 0 。m 9 2 + 、c a 2 + 对该酶有激活作 用，k | + 、z n ”对该酶有抑制作用。以n a d h 和丙酮酸为底物的米氏常数分别为 7 2 2 x 1 0 4 m o l l 和1 2 4 1 0 。m o l l 。 o b a y a s h i 在1 9 6 6 年首次报道了在米根霉中存在n a d + 依赖型的乳酸脱氢酶【5 “。 k a t s u i c h is a i t o 以及a k m l es a i t o l 57 j 等人在二十七种能够突出积累乳酸的米根霉中发 现了两种l d h 基因，分别为l d h a 与l d h b ，编码n a d 依赖型乳酸脱氢酶。经过研究， 发现乳