（发酵工程专业论文）l赖氨酸产生菌选育及其发酵条件的调控.pdf

摘要 摘要 本论文应用代谢控制发酵原理，系统地研究了l 赖氨酸产生菌l x q 8 9 的选育、代 谢流量分析以及摇瓶发酵条件等，主要研究内容和结果如下： 以黄色短杆菌( b r e b v i b a c t e r i u m f l a v u m ) x q 8 为出发菌株，经化学和物理诱变处理， 以高浓度葡萄糖、磺胺胍( s g ) 、高浓度赖氨酸乙酯盐酸盐( l y s o e t ) 抗性平板以及缬氨酸 扪缺陷平板定向筛选，成功选育出一株l 赖氨酸产生菌l x q 8 9 ( m e t t h r s u c g a e c s g r v a l 。l y s o e n 。在以葡萄糖为碳源、硫酸铵为氮源的培养基中发酵7 2h ，产酸可达7 7g l 。 建立并完善了l x q 8 及其2 个逐步叠加不同遗传标记的突变株l x q 8 1 和l x q - 8 9 合成l 赖氨酸的中心代谢网络。分别测定了它们在特定培养时段( 4 2 4 6h ) l - 赖氨酸等代 谢物的胞外浓度，由此计算这一时段这些代谢物在发酵液中积累( 或消耗) 的速率，分别 作出这3 株菌在拟稳态下的代谢流量分布图，进而研究育种过程中不同遗传标记的叠加 对代谢网络中l 赖氨酸合成流量分布的影响。结果表明遗传标记的引入使流量分配发生 了重大变化，节点处的流量分配朝着有利于l 赖氨酸合成的方向改变。从代谢流量分析 角度上，证明结构类似物抗性和缺陷型突变是代谢流导向和设计育种的有效手段，代谢 流量分析为设计育种提供新思路。 对菌株l x q 8 9 进行了培养基和发酵条件的优化，研究了在发酵培养基中添加乙酸 和乙醇、在发酵过程中添加吐温8 0 和二甲基亚砜对赖氨酸发酵的影响。得到最佳的种 子培养基( g l ) ：葡萄糖2 5 、( n h 4 ) 2 s 0 45 、玉米浆3 5 、k h 2 p 0 41 0 、m g s 0 4 7 h 2 00 5 、 c a c 0 31 5 。种子最佳培养条件：p h 7 0 ，装液量2 5m l 2 5 0m l 三角瓶。最佳发酵培养基 ) ：葡萄糖1 7 0 、( n h 4 ) 2 s 0 45 5 、玉米浆1 8 6 、k h 2 p 0 41 2 、m g s 0 4 7 i - 2 00 6 、f e 什2 m g ：l 、m n 2 + 2m g l 、m e t0 4 、t h r0 4 、v a l0 2 、乙酸6 3m l l 、v h1 0 0p g l 、v b i2 0 0 腭l 、c a c 0 34 5 ，在发酵2 0h 时添加3 2g l 的吐温8 0 。摇瓶发酵最佳培养条件：选择 种龄为1 lh 的菌体，初始p h 为7 0 ，以1 0 接种量接入装液量2 5m l 5 0 0m l 三角瓶， 往复式摇床3 0 ，转速1 0 0r r n i n ，发酵周期7 2h ，优化后产酸可达9 5g l 。 结合菌株l x q 8 9 发酵过程曲线，对发酵过程中补加葡萄糖进行了初步的研究，结 果表明：总糖为1 7 0g l ，确定初糖为8 0g l ，在发酵2 8h 补加4 5g 糖( 对于1 l 的发酵 液而言) ，在4 4h 再补加剩下的4 5g 糖( 对于1 l 的发酵液而言) ，7 2h 产量达到最大值 1 0 0g l ，对赖氨酸的产量有一定的提高。 关键词：l 赖氨酸；育种；黄色短杆菌；代谢；调控 a b s t r a c t a b s t r a c t a c c o r d i n gt ot h et h e o r yo fm e t a b o l i cc o n t r o lf e r m e n t a t i o n ，t h ep a p e rf o c u s e do nt h e b r e e d i n go fl l y s i n eh y p e r - p r o d u c e rl x q - 8 9 ，t h em e t a b o l i cf l u x so ft h eo r i g i n a ls t r a i n l x q 一8a n di t sm u t a n tl x q 一8 1a n dl x q - 8 9 ，t h es u i t a b l ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o no fs h a k i n g f l a s ka n ds oo n t h em a i nr e s e a r c hc o n t e n t sa n dr e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： t h el 1 y s i n ep r o d u c e rw a sd e r i v e df r o mt h eo r i g i n a ls t r a i nb r e b v i b a c t e r i u mf l a v u m l x q 一8b yc h e m i c a la n dp h y r s i c a lm u t a t i o nm e t h o d s ，t h ep l a t es c r e e n i n gw i t hh i g h c o n c e n t r a t i o n so fg l u c o s e ，s u l f ag u a n i d i n e ( s g ) ，l l y s i n ee t h y le s t e rd i h y d r o c h l o r i d e ( k s - o e t ) r e s i s t a n c e ，a n dv a l i n e ( v a l ) d e f e c t s as t r a i nl x q - 8 9 ( m e t t h r s u c g a e c s g r v a l l y s o e t r ) w a so b t a i n e da n d7 7g ll 1 y s i n ew a sa c c u m u l a t e d t h em e t a b o l i cn e t w o r k so ft h eb r e b v i b a c t e r i u mf l a v u ml x o 8 ，a n dt h et w od e r i v a t i v e s c a r r ya d d i t i o n a lm u t a t i o n sl x q 81a n dl x q 8 9w e r ee s t a b l i s h e da n dm o d i f i e d 1 1 1 e c o n c e n t r a t i o n so fe x t r a - c e l l u l a rm e t a b o l i t e sw e r ed e t e r m i n e du n d e rs u b s t e a d y - s t a t e ( 4 2 - 4 6m o ft h eb a t c hc u l t u r e 硼1 em e t a b o l i cf l u xd i s t r i b u t i o nm a p so ft h et h r e es t r a i n sw e r eo b t a i n e d c o m p a r e da n da n a l y z e d n l e s er e s u l t si n d i c a t et h a tt h ei n t r o d u c t i o no fa n a l o gs u p e r s e n s i t i v e m a r k e ro rd e f i c i e n tm u t a n tm a r k e rs k e wt h em e t a b o l i cf l u xt o w a r d st h ef o r m a t i o no fl 1 y s i n e m e t a b o l i cf l u xa n a l y s i sp r o v i d e dan e wi d e af o rd e s i g nb r e e d i n gr a t i o n a l l y t h eo p t i m i z a t i o no fm e d i u mc o n t e n t sa n df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sf o rl x q 8 9w a s c o n d u c t e d ，a c e t i ca c i da n de t h a n o lw e r ea d d e di n t ot h ef e r m e n t a t i o nm e d i u m ，t w e e n - 8 0a n d d i m e t h y ls u l f o x i d ew e r ea d d e di nt h ef e r m e n t a t i o np r o c e s s t h eo p t i m u ms e e dm e d i u m c o n t a i n e dg l u c o s e2 5g l ，f n h 4 ) 2 s 0 45e e l ，c o r ns t e e pl i q u o r3 5g l ，k h 2 p 0 41 0g l ， m g s 0 4 7 h 2 0o 5g l ，c a c 0 315e e l t h eo p t i m u ms e e dc o n d i t i o n sw e r ep h7 0 ，a n dt h e o p t i m u mm e d i u mv o l u m ew a s2 5m l 2 5 0m l t h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o nm e d i u mc o n t a i n e d g l u c o s e 1 7 0g l ，( n h 4 ) 2 s 0 45 5g l ，c o r ns t e e pl i q u o r18 6 g l ，k h 2 p 0 4 1 2 g l ， m g s 0 4 7 h 2 00 6g l ，f e 计2m l ，m 一+ 2m g l ，m e t0 4g l ，t h r0 4g l ，v 甜0 2g l ，a c e t i c a c i d6 3m l l ，b i o t i n10 0 肛g l ，v m2 0 0 肛g l ，c a c 0 34 5g l ，a d d i n gt w e e n - 8 03 2g la t2 0 h t h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r ei n o c u l a t e dt i m e1 1h ，o r i g i n a lp h7 0 ，s e e d v o l u m e1 0 5 0 0m lc o n t a i n s2 5m lb r o t h c u l t u r i n ga t3 0 。co nr e c i p r o c a t i n gs h a k e r , s h a k i n gs p e e d10 0r r a i n , f e r m e n t a t i o nt i m e7 2ha f t e ro p t i m i z a t i o n t h ep r o d u c t i o no f l l y s i n ew a s9 5g e l t h ef e d b a t c hf e r m e n t a t i o nw a ss t u d i e d ，c o m b i n i n gw i t ht h ef e r m e n t a t i o np r o c e s so f s t a i nl x q 一8 9 i tw a sd e t e r m i n e dm a tt h et o t a lg l u c o s ew a s17 0g l ，t h ei n i t i a lg l u c o s ew a s8 0 l ，4 5g ( f o r1lb r o t h ) g l u c o s ew a sa d d e da t2 8l l ，t h er e m a i n i n gg l u c o s ew a sa d d e da t4 4h ， a n dl 1 y s i n er e a c h e d10 0g la t7 2h k e y w o r d s ：l - l y s i n e ，b r e e d i n g , b r e b v i b a c t e r i u m f l a v u m ，m e t a b o l i s m ，r e g u l a t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是拳人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 期： 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并耳本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名：导师签名： 日 期： 第一章引言 第一章引言 1 1 前言 l 赖氨酸是人体和动物所不能合成的八种必需氨基酸中最重要的一种。l 赖氨酸是 国际市场上发展前景良好的产品【1 。2 】，消费需求每年以7 1 0 的速度递增，国内年产量则 以每年2 0 3 0 以上的速度递增【3 】。研究l 赖氨酸的生产对我国有重大而深远的影响，对 提高国际竞争力具有十分重要的意义。 1 2l 赖氨酸的理化性质 l 赖氨酸又名a ，二氨基己酸或2 , 6 二氨基己酸，分子式为c 6 h 1 4 n 2 0 2 ，分子量为 1 4 6 1 9 。结构式如下： o h n h 2 l - 赖氨酸在水溶液中的解离常数p k l = 2 2 0 ( 一c o o t - t ) ，p k 2 = 8 9 0 ( a n i - - 1 2 ) ， p k 3 = 1 0 2 8 ( e - n h 3 + ) ，等电点p i = 9 5 9 。在4 8 酒精溶液中的解离常数p k l = 2 7 5 ，p k 2 = 8 9 5 ， p k 3 = 1 0 5 3 。在8 4 溶液中的解离常数p k l - - 3 5 5 ，p k 2 = 8 9 5 ，p k 3 = 1 0 4 9 。比旋光度 c 【】d 2 0 = + 2 1 0 ( c = 8g 1 0 0m l ，6 m o l lh c l ) ，熔点2 6 3 c ，单斜晶系，稍有甜味，易溶于水， 难溶于甲醇、乙醇、乙醚、苯、丙酮、醋酸乙酯和氯仿等有机溶剂。赖氨酸结晶在6 0 以下及相对湿度6 0 以下稳定，在相对湿度6 0 以上，容易吸水生成c 6 h 1 4 n 2 0 2 2 h 2 0 。 1 3l 赖氨酸的功能及应用 l 赖氨酸为碱性必需氨基酸。由于食物中赖氨酸含量甚低，加工过程中易被破坏， 引起赖氨酸缺乏，故常称为第一限制性氨基酸。广泛应用于食品、饲料和医药工业，在 平衡氨基酸组成方面起着十分重要的作用。全球约9 0 的赖氨酸用作饲料添加剂，约 5 用作食品添加剂，其余5 用作医药中间体。 1 3 1l 赖氨酸在食品工业中的应用 ( 1 ) 食品强化 l 赖氨酸具有增强胃液分泌，提高蛋白利用率，增强造血机能，使白细胞、血色素 和丙种球蛋白增加，保持代谢平衡增加抗病能力。有利于促进儿童体格与智力发育。在 谷类为主的食品中添加一定量的l 。赖氨酸，可提高其蛋白质的吸收率和营养价值 4 1 。 根据食品营养强化剂使用卫生标准( 试行) ，l 一赖氨酸可添加于面包、饼干、面条、 馒头中【】，添加量为1 2g k g ，也可加入面粉或大米中，添加量约为2g k g ( 以干粉计) 。 ( 2 ) 食品除臭剂 利用l 赖氨酸位氨基的活泼性，也可消除食品加工中产生的异臭味。如大米存放 时间过长后，由于米粒含有的脂肪酸氧化，在煮饭时产生陈米臭，影响食欲，在煮饭时 江南大学硕士学位论文 加入o 5 l 赖氨酸，挥发性直链脂肪酸及挥发性直链酮类与赖氨酸的氨基反应生成 不挥发性物质，陈米臭可完全消除【7 | 。 1 3 2l 赖氨酸在饲料工业中的应用 ( 1 ) 促进动物生长发育 动物在生长期，细胞增殖旺盛，特别需要蛋白质作为机体发育的原料。实验证明， 在饲料中添加适量l 赖氨酸、d l 蛋氨酸，就能增加动物机体内蛋白质的合成，从而促 进动物的生长发育。 ( 2 ) 改善肉质，提高产奶、产蛋量 饲料中添加l 赖氨酸，可使猪的外观好，肉质味道鲜，皮变薄( 由0 5c m 减少到0 4 c m ) ，瘦肉率高( 由4 6 2 则提高到4 8 2 ) 【8 1 。 ( 3 ) 节省蛋白质饲料，使饲料得到充分利用【9 】 饲料中含的蛋白质中由于氨基酸组成不合理，因而造成蛋白质浪费和氨基酸失衡。 如在饲料中添加适量的蛋氨酸和赖氦酸，可校正氨基酸的平衡，提高蛋白质的利用率， 并有节省高价蛋白质的作用。实验证明：1t 蛋氨酸可节省1 0 0t 饲料，相当于3 0 0 0 0i l l 2 饲料地的经济效益。1tl 赖氨酸可节省1 2 5t 饲料，可多生产1 0 1 6t 猪肉或8t 鸡肉， 或者2 5 万个鸡蛋。 1 3 3l 一赖氨酸在医药工业中的应用 ( 1 ) 营养剂 生物体中，蛋白质的合成及分解；是处于动态平衡状态，为了维持体内的氯平衡， 必须由外界供给蛋白质或氨基酸。如果遇到消化道功能严重障碍者，或在创伤、手术后 不能由口摄取食物时，就必须不经口腔，设法供给足量的氨基酸才行。国外很多医院曾 有统计，单纯靠传统的葡萄糖输液，约有1 0 3 0 的住院病人，实际上并非死于原发 疾病，而是死于营养枯渴，这在婴儿期的胃肠道疾病中尤为突出。临床上常通过直接输 入氨基酸制剂改善患者营养状况，增加治疗机会，促进康复。以复合氨基酸为主的要素 膳制剂也成为防治疾病的重要手段【1 0 1 。 ( 2 ) 治疗药剂 l 赖氨酸可调节人体代谢平衡。食物中加进少量l 赖氨酸，可以显著增加食欲。显 著增加胃蛋白酶和盐酸的分泌，提高胃液分泌功效，促进幼儿的生长和智力发育【1 1 1 。防 止老年人记忆力衰退；赖氨酸还能提高钙的吸收及其在体内的积累加速骨骼的生长【1 2 】。 l 赖氨酸在医药上还可作为利尿药的辅助治疗剂，治疗因血中氯化物减少所致的铅 中毒，可与酸性药物( 如水杨酸等) 生成盐，以减轻不良反应，与蛋氨酸合用能抑制重症 高血压病，同时，赖氨酸也是优良的血栓预防剂。赖氨酸与亚铁化合物一起治疗贫血效 果显著1 1 3 j 。 1 4l 赖氨酸的制备方法 l 赖氨酸的生产方法有化学合成法和酶法、抽提法、发酵法。目前，赖氨酸工业生 2 第一章引言 产以发酵法为主，其次是酶法【1 4 6 - 1 。 化学合成法和酶法：先用化学方法由环己烯合成外消旋d l 氨基己内酰胺，再用微 生物产生的d 氨基己内酰胺外消旋酶使d 型氨基己内酰胺转化成l 型氨基己内酰胺， 再经l 氨基己内酰胺水解酶作用生成l 赖氨酸。 抽提法：将血干粉、脱脂大豆蛋白等进行水解，再用离子交换法或苦味酸沉淀法分 离提取赖氨酸。生产流程如下： 蛋白质兰! 水解! 竺真空浓缩一过滤一稀释一调p h l j 耋 蛋白质一水解一真空浓缩一过滤一稀；| 肇一嘲 l 赖氨酸盐酸盐一调p h 值一真空浓缩一离交吸附脱附一 发酵法：分为添加前体发酵法、直接发酵法两种。添加前体发酵法是以赖氨酸生物 学合成的前体物二氨基庚二酸( d a p ) 为原料，用微生物或酶转化为l 赖氨酸。直接发 酵法是采用具有特定的生理特征的赖氨酸产生菌在一定的条件下进行耗氧发酵，将糖等 基质转化为赖氨酸，借助微生物具有合成自身所需氨基酸的能力，通过对菌株的诱变等 处理，选育出各种营养缺陷型及氨基酸结构类似物抗性变异株，以解除代谢调节中的反 馈抑制与阻遏，达到过量合成某种氨基酸的目的。目前发酵法生产l 赖氨酸的关键是在 生产茵上，所以选育l 赖氨酸产生菌就显得尤为重要。 1 5 发酵法生产l 赖氨酸的研究进展 赖氨酸产生菌有：细菌中包括棒状杆菌、短杆菌、诺卡氏菌、念球菌、假单孢菌、 埃希氏菌、芽孢杆菌等；真菌中主要有酵母、加斯酵母、隐球酵母等【l7 。目前国内外用 于选育赖氨酸生产菌的出发菌株多为谷氨酸棒杆菌( c o r y n e b a c t e r i u mg l u t a m i c u m ) 、黄色 短杆菌( b r e v i b a c t e r i u mf a v u m ) 、乳酸发酵杆菌( b r e v i b a c t e r i u ml a c t o f e r m e n t u s ) 及大肠杆菌 但c o l i ) 等。 赖氨酸在国际上的开发研究始于6 0 年代，工业化生产始于7 0 年代。国外赖氨酸生产 厂家除韩国的m i w o n 公司采用自己的菌种和技术外，其余均为日本味之素集团和协和发 酵集团所垄断。味之素在美、法、意、泰均有生产基地，其赖氨酸的销售额约占世界市 场的4 0 左右。我国在6 0 年代就完成了赖氨酸发酵法生产工艺研究，7 0 年代末就建设了 一批生产厂，产量也有较大的增长。近几年我国赖氨酸产能高速增长，从2 0 0 1 年不足5 万t 年增长蛰j 2 0 0 5 年的5 7 万t 年( 有效生产能力达5 1 万t 年) ，成为世界最大的赖氨酸生 产国。目前国内主要赖氨酸生产企业有长春大成实业集团公司、聊城希杰、宁夏伊品、 正大菱花、川化味之素有限公司、泉州大泉赖氨酸有限公司、山东金玉米生化有限公司、 安徽丰原生物化学股份有限公司等1 4 家企业。 在引进国外先进赖氨酸生产技术的同时，国内也十分重视自行研究开发符合我国国 情的赖氨酸生产技术。目前国内有关单位已成功地开发出发酵法生产赖氨酸的新工艺， 该工艺利用玉米、甘薯、大米等淀粉水解糖；甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜等，用高产菌种和发 酵工艺生产赖氨酸，提取率达8 0 8 5 ，糖转化率达4 0 4 2 ，产品收率9 0 以上，生 产菌株的产酸能力，发酵和提取技术在总体上已达到国内先进水平。育种方法主要以诱 变育种为主，特别是在本世纪8 0 年代以前，许多优良的赖氨酸高产菌株均以诱变育种方 江南大学硕士学位论文 法获得。女 n c o s t a 等人【l8 】通过亚硝基胍诱变谷氨酸棒杆菌a t c c2 1 5 1 3 得到的突变株，其 赖氨酸的产量达5 ，比出发菌株提高l 倍多，s c h e n d e l 等【l9 】选育的高丝氨酸缺陷型和a e c 抗性的赖氨酸生产菌株，赖氨酸的产量达6 以上。 在本世纪8 0 年代后，随着细胞工程和遗传工程的发展，人们可通过基因重组技术将 诱变获得的不同赖氨酸生产菌的优良性状组合在一起选育出产酸更高的赖氨酸生产菌。 如j o n g 等人【2 0 】将ec o b 编码d d p 合成酶的基因通过质粒载体转到赖氨酸高产菌株( 谷氨 酸棒杆菌突变株) 体内，使赖氨酸的产量大幅度增加。h i r a o 等【2 1 1 培育的谷氨酸棒杆菌赖 氨酸高产菌株b 6 ，产酸量达1 0 以上。 t o s a k a 等由乳糖发酵短杆菌选育具有a e c 抗性、丙氨酸缺陷、a 氯己内酰胺抗性、 y 甲基l 赖氨酸抗性和b 。氟丙酮酸敏感突变株a j l1 2 1 4 ，可积累l 赖氨酸7 0 9 l ，对糖 转化率达5 0 。 2 0 0 0 年，k i y o s h it a d a 等以黄色短杆菌a j l1 8 4 3 为出发菌株，在发酵过程中添加苏 氨酸，使赖氨酸提高到7 0g l 。 2 0 0 1 年，张伟国，顾正华以黄色短杆菌a t c c l 4 0 6 7 力出发菌株，筛选出1 株l 赖氨酸高产菌x q 8 ( a e c 。s u c g t h r 。s g r ) ，摇瓶发酵转化率为4 8 0 o 5 1 2 2 1 。 2 0 0 4 年，齐秀兰、曾绍钧、周忠喜以钝齿棒杆菌( c o r y n e b a c t e r i u mc r e n a t u m ) d 6 0 9 5 为出发菌株【2 3 】，筛选出抗性突变株e 0 9 3 7 ，其发酵液中l 赖氨酸盐酸盐产量达1 1 0g l 。 2 0 0 5 年m k i l ai m e d z u n f x 等人 2 4 1 通过在e c o l i 中增加雉因的表达，衄f 基因编码核糖 体调节因子的蛋白质来提高赖氨酸的产量，赖氨酸产量达n 5 0g l 。 2 0 0 8 年m l a d e n v 等人【2 5 】以c o r y n e b a c t e r i u mg l u t a m i c u m a t c c2 1 2 5 3 为生产菌，使 肌醇六磷酸为唯一碳源来发酵生产赖氨酸。 近年来通过基因工程对赖氨酸产生菌进行改造很热，但是产量都不高，都还未达到 8 0g l 。m a t t h e o sk o f f a s 和g r e g o r ys t e p h a n o p o u l o s 2 6 提出通过代谢工程来改良菌种，首 先必须找出代谢的节点，然后精确在具体的基因上，而赖氨酸高产的两个基因是丙酮酸 羧化酶和天冬氨酸激酶，只有提高这两种酶的合成，赖氨酸的合成才会进一步的提高。 饶志明等利用基因工程技术把谷氨酸棒杆菌的高丝氨酸脱氢酶编码基因h o r n 敲除，发酵 6 0h 赖氨酸产量达到4 7g l ，是出发菌株谷氨酸棒杆菌a t c c1 3 0 3 2 的6 7 倍【2 。 1 6l 赖氨酸的代谢控制育种 1 6 1l 赖氨酸的生物合成调节机制 以黄色短杆菌为出发菌株，天冬氨酸激酶( a k ) 是变构酶，具有两个变构部位， 可以与终产物结合，受终产物影响，当只有一种终产物( 赖氨酸或苏氨酸) 与酶变构部 位结合时，酶活性不受影响，当两种终产物( 赖氨酸和苏氨酸) 同时过量存在，即两种 终产物同时与酶两个变构部位结合时，酶的活性受到抑制，这种终产物的反馈抑制称为 协同反馈抑制。 在图1 - 1 ，在代谢途径第一个分支点，由于高丝氨酸脱氢酶活性比d d p 合成酶约高 1 5 倍，所以代谢优先向合成高丝氨酸方向进行；在第二个分支点，由于琥珀酰高丝氨酸 4 第一章引言 合成酶活性比高丝氨酸激酶高，代谢优先向合成甲硫氨酸方向进行。当甲硫氨酸过剩时， 阻遏琥珀酰高丝氨酸合成酶的合成，代谢流转向合成苏氨酸方向进行。当异亮氨酸过剩 时，反馈抑制苏氨酸脱氢酶，就积累苏氨酸。由于苏氨酸过剩，反馈抑制高丝氨酸脱氢 酶，使代谢流转向合成赖氨酸。赖氨酸和苏氨酸同时过剩，协同反馈抑制天冬氨酸，使 整个途径停止进行。 天冬氧酸 广叫5 l 一甲硫氨酸j 0 。一异亮氨酸 雹豳2 2 2 珍 优先合成 一+反馈抑制阻遥 1 天冬氨酸激酶2 - = 氢吡啶2 ，6 - 二羧酸( d d p ) 合成酶 3 一高丝氨酸脱氢酶4 琥珀酰高丝氨酸合成酶5 苏氨酸脱氢酶 图i - i 黄色短杆菌赖氨酸生物合成调节机制 f i g 1 1t h eb i o s y n t h e t i cr e g u l a t o r ym e c h a n i s mo fl y s i n ei nb r e b v i b a c t e r i u m f l a v u m 。弋 l 畛，i 纩夕l 、 乙酰c o a ，7 天冬氨酸 柠檬酸 j 0 葡萄糖2 5 、玉米浆2 5 - 3 0 、( n h 4 ) 2 s 0 45 、k h 2 p 0 41 、m g s 0 4 7 1 4 2 0o 5 、c a c 0 310 。 ( 4 ) 摇瓶发酵培养基( g l ) 葡萄糖1 5 0 、玉米浆1 5 、( n h 4 ) 2 s 0 45 0 、k h 2 p 0 41 、m g s 0 4 7 h 2 00 5 、l t h r0 4 、 l m e t0 4 、l v a l0 2 ( l x q 一8 1 6 ，l x q 一8 1 6 9 ，l x q - 8 9 三株菌的发酵培养基加) 、f e 2 + 2 m g l 、m n 2 + 2m g l 、v h1 0 0 “l 、v m2 0 0p g l 、c a c 0 34 0 。 基本、完全和种子培养基均用2 0 n a o h 调p h 至7 o 7 2 ，1 2 1 灭菌2 0r a i n 。 发酵培养基用2 0 n a o h 调p n 至7 o 7 2 ，1 1 5 灭菌8m i n 。 ( 5 ) 筛选培养基 高浓度糖抗性突变株的筛选培养基：基本培养基中添加适量的葡萄糖。磺胺 胍( s g ) 抗性突变株筛选培养基：基本培养基中添加适量s g 。缬氨酸( v a l ) 缺陷型突变 株的筛选培养基：基本培养基和添加v a l 的基本培养基。耐高浓度赖氨酸乙酯盐酸 盐( l y s - o e t ) 抗性突变株的筛选培养基：基本培养基中添加适量的l y s - o e t 。 2 2 方法 2 2 1 培养方法 ( 1 ) 斜面、平板培养方法 恒温箱温度3 0 1 ，培养2 4h 。 ( 2 ) 摇瓶培养方法 摇床为往复摇床，振次1 0 0 2r r a i n ，温度3 0 1 ，种子装液量2 5 0m l 三角瓶 3 0m l ，种子培养1 2h ；发酵装液量5 0 0m l 三角瓶2 5m l ，发酵培养7 2h 。 2 2 2 诱变方法 ( 1 ) 紫# b ow ) 诱变 3 0 】 u v 诱变是一种使用最早、应用广泛、效果明显的物理诱变剂，主要是促使d n a 与蛋白质的交联、胞嘧啶与尿嘧啶之间水合、d n a 键的断裂和形成嘧啶二聚体等。 u v 诱变步骤【3 1 】：将细菌培养液以3 0 0 0r r a i n 离心5r a i n ，倾去上清液，将菌体打 散加入无菌生理盐水再离心洗涤。将菌悬液放入已灭菌的、装有玻璃珠的三角瓶内用 手摇动，以打散菌体。将菌液倒入有定性滤纸的漏斗内过滤，单细胞滤液装入试管内， 使细胞浓度达到1 0 8 个m l ，作为诱变用菌悬液。取4m l 制备的菌悬液加到直径9c m 培养皿中，放入一个无菌磁力搅拌子，然后置磁力搅拌器上、1 5w 紫外线下3 0c m 处。 在正式照射前，先开启紫外线1 5r a i n ，使得紫外灯预热，然后开启平皿盖，正式在搅拌 1 0 第二章实验材料与方法 状态下照射。整个操作在红光下进行，避免白炽灯。取未照射的制备菌液和照射液各 o 5m l 进行稀释涂布，计数活菌细胞数。取照射菌液o 1m l 于筛选平板涂布培养。 ( 2 ) 硫酸z 7 , 酯( d e s ) 诱交 3 2 1 d e s 是一种单功能基团烷化剂，主要是通过烷化基团使d n a 分子上的碱基及磷酸 部分烷化，d n a 复制时导致碱基配对错误而引起突变。碱基中容易发生烷化作用的是 嘌呤。d e s 在水溶液中半衰期很短，因此要现用现配。 所需试剂：p h7 0 的磷酸缓冲液，5 0g l 的硫代硫酸钠，9 5 的乙醇，d e s 原 液和8 5g l 的生理盐水。 d e s 诱变步骤 3 3 , 3 4 ：a 、制备细胞浓度为1 0 8 个m l 的菌悬液( 同u v 诱变步骤) 。 b 、取1m l d e s 原液，4m l9 5 的乙醇于带塞试管中混匀，制成d e s 稀释液。c 、取 1 0m l 菌悬液于诱变碘量瓶中，之后加入适当浓度的d e s ，振荡处理1 5 - 2 0m i l l 。d 、加 入5m ln a 2 8 2 0 3 振荡1 0 - 1 5m i n 终止反应。e 、吸取3m l 于离心管中5 0 0 0r m i n 离心 1 0m i n 后，再用3m l 磷酸缓冲液离心洗涤两次。f 、取诱变处理后的菌液o 1m l 于筛 选平板涂布培养。 ( 3 ) 亚硝基胍( n t g ) 诱变【3 5 3 7 】 亚硝基胍也是一种单功能基团烷化剂，其作用原理与硫酸二乙酯相同。它能使细胞 发生一次或多次突变，还能使多基因并发突变，诱变效果好，有超级诱变剂之称。 所需试剂：p h6 0 的磷酸缓冲液；8 5g l 的生理盐水；1g l 的n t g 母液( 称取 1 0 2 0m gn t g ，按照n t g ：丙酮：p h6 0 的磷酸缓冲液= 1 0m g ：1m l ：9m l 的比例配制) ； 1 5m o l l 的n a o h 溶液。 n t g 诱变步骤【3 5 , 3 6 ：a 、取1 5m l 细胞浓度为1 0 8 个m l 的菌悬液于诱变碘量瓶 中。b 、吸取3m l n t g 母液于诱变碘量瓶中，置摇床上摇1 0 3 0m i n 。c 、吸取3m l 反 应液于离心管中，5 0 0 0r m i n 离心5m i n ，倒掉上清液于处理液中，加入3m l 的生理盐 水，5 0 0 0r m i n 离心5m i n ，倒掉上清液于处理液中，重复操作一次，加3m l 完全培养 基振荡。d 、振荡均匀后，将其倒入已加入1 0m l 完全培养基的摇瓶中，振荡培养1 5 2 h 。o 、取o 5m l 茵悬液，梯度稀释，分别涂布筛选平板。f 、诱变结束后，将所有接触 n t g 的物品放入处理液浸泡过夜，可烧毁的一次性物品需焚烧填埋或放入回收处。 2 2 3 筛选方法 ( 1 ) 平板筛选 耐高浓度糖抗性突变株的筛选：把诱变的菌液涂布在含有适当浓度葡萄糖的基 本培养基上，3 1 培养培养3 4d ，挑出生长良好的菌落，即为耐高浓度糖抗性突变株。 磺胺胍( s g ) 抗性的筛选：把诱变的菌液涂布在含有s g 的基本培养基上，3 1 培 养培养3 - - 4d ，挑出生长的菌落，即为s g 的抗性菌。或将诱变处理过的一定浓度的菌 液涂布于基本培养基平板上，将抗性药物用无菌水配制成一定浓度的溶液，用无菌滤纸 片蘸取适量抗性药物溶液，放置于涂有菌液的基本培养基平板上。3 1 恒温培养3 4d ， 挑出在抑菌圈内长出的单菌落，即为结构类似物抗性突变株 缬氨酸( v a l ) 缺陷型的筛选：把诱变的菌液涂在基本培养基上，3 1 培养2 4d l l 江南大学硕士学位论文 标出生长的菌落，再倒上一层含v a l 的基本培养基，再次生长出来的菌落可能为v a l 缺 陷型，挑出后长出来的菌落，如果在基本培养基上不生长，而在含有v a l 的基本培养基 上能生长的为v a l 缺陷型。 耐高浓度赖氨酸乙酯盐酸盐( l y s o e t ) 菌株的筛选：把诱变的菌液涂布在含有适 当浓度的l y s o e t 的基本培养基上，3 l 培养2 4d ，挑出生长良好的菌落，即得到耐 高浓度的l y s o e t 抗性突变株。 ( 2 ) 摇瓶筛选 初筛：将平板筛选获得的变异株扩大培养后，接一环于装有2 5m l 发酵培养基的 5 0 0m l 三角瓶中，振荡培养7 2h ，测定发酵液中的l 赖氨酸，筛选出若干产l 赖氨酸较 高的菌株进行复筛。 复筛：先将初筛得到的菌株进行种子培养，然后每株菌分别接2 0m l 种子液于 装有2 5m l 发酵培养基的5 0 0m l = 角瓶中，做三个平行样，3 0 ，1 0 0r m i n 振荡培养7 2h ， 筛出产l 赖氨酸高的菌株。 2 2 4 分析方法 ( 1 ) p h 测定 国产精密p h 试纸( 6 0 8 o ) 和p h 计测定。 ( 2 ) 菌体生长测定 取0 2m l 待测液，加入5m lo 2 5m o l l 盐酸溶液中，摇匀，用7 2 1 型分光光度计， 1c m 光程5 6 2n l n 测o d 值。 ( 3 ) 发酵液中还原糖的测定 斐林试剂滴定法【3 8 1 。 ( 4 ) l 赖氨酸含量的测定 纸层析法定性测定( 诱变后用该测定方法进行初筛) 展开剂：正丁醇：乙酸：水= 4 ：1 ：2 显色剂：1 茚三酮 酸性茚三酮定量测定( 诱变后复筛用该测定方法，该方法测定的赖氨酸值偏大) 采用酸性茚三酮比色法测定【3 9 1 。发酵液经3 5 0 0r m i n 离心1 5m i n ，取上清液o 1m l 稀释至1 0m l 吸取1m l 稀释液加入4m l 茚三酮试剂于2 5m l 的刻度管中，沸水浴加 热2 0m i n ，快速冷却后用7 2 1 型分光光度计在4 7 8h i l l 处比色。根据标准曲线确定发酵 液中l 赖氨酸产量。 氨基酸自动分析仪( 代谢流量分析时用该测定方法测定赖氨酸) l 赖氨酸的标准曲线 取6 支2 5m l 的刻度管，依次标上0 5 。依次加入含有o ，o 1 2 ，o 2 4 ，o 3 6 ，0 4 8 ， o 6 0g l 的l - 赖氨酸样品1m l ，加入4m l 茚三酮溶液，按2 2 4 4 ( 2 ) 测定o d 4 7 8 值。得 到l 一赖氨酸的标准曲线见图2 1 。 1 2 第二章实验材料与方法 图2 1l - 赖氨酸的标准曲线 f i g 2 1t h es t a n d a r dc u r v eo f l - l y s i n em e a s u r e m e n t ( 5 ) 有机酸测定 发酵液离心取上清液，用3 的活性炭脱色，同时用终浓度7 0 的乙醇沉淀蛋白质， 再离心取上清液，进样测定有机酸含量，柱条件为：色谱仪：h p l l 0 0 ；色谱柱：z o r b a x s b a qc 1 84 6m r n x1 5 0n 吼；流动相：0 0 2m o l l 磷酸二氢钾缓冲液+ o 0 5 7 , 腈( 磷酸 调p h 至2 o ) ；流速：0 5m l m i n ；柱温：3 0 c ；进样：1 0 l x l ；检测器：紫外检测器； 检测波长：2 1 0n r f l 。 ( 6 ) 氨基酸测定 氨基酸柱前衍生法 色谱柱：( 2 5 0 4 6 ) 衄5l x mo d sh 帅e r s i l 柱温：4 0 。c 流动相：a 相：称取8 og 结晶乙酸钠于1 0 0 0m l 烧杯中，加入1 0 0 0m l 水搅拌 至所有结晶溶解，再加入2 2 5 此三乙胺，搅拌并滴加5 的醋酸，将p h 调到7 2 0 0 5 ； 加入5m l 四氢呋喃，混合后备用。 b 相：称取8 0g 结晶乙酸钠于8 0 0m l 烧杯中，加入4 0 0m l 水搅拌至所有结晶溶 解，滴加2 的醋酸，将p h 调到7 2 o 0 5 ；加入8 0 0m l 乙腈和8 0 0m l 甲醇，混合备 用。 流速：1 0m l m i n 紫外检测器：3 3 8n l t l ，2 6 2n m ( v r oh y p r o ) 梯度洗脱 t ( m i n ) a 09 2 2 7 54 0 3 1 5o 3 2 00 3 4 01 0 0 3 5 59 0 b 流速( m l m i n ) 8 1 0 6 01 o 1 0 01 5 1 0 01 5 o1 o 1 01 0 1矗)l罟is辛，i 江南大学硕士学位论文 第三章结果与讨论 3 1l 一赖氨酸产生茵的选育 赖氨酸是中间代谢产物，在正常的细胞中，由于细胞所具有的自我调节作用，不能 过量积累赖氨酸。要使细胞在发酵中过量积累赖氨酸，最有效的方法是根据菌种的代谢 特性，人为地改变菌种的代谢及代谢调节特性，使代谢流按照我们所需要的方向流动。 微生物发酵法生产氨基酸的首要任务是选育氨基酸产生菌，菌株是氨基酸产业的灵魂。 随着工业微生物育种技术的进步和氨基酸发酵工业的不断发展，氨基酸产生菌的选育， 由随机性、非定向性选育向有目的的定向选育发展，育种效率有了明显提高。如今，根 据氨基酸的生物合成与代谢调节机制进行的代谢控制育种，已在氨基酸产生菌选育上占 主导地位。要使微生物大量积累目的产物，就必须打破微生物原有的平衡状态，控制微 生物的代谢作用【4 们，对细胞的代谢途径进行修饰。在代谢控制发酵中，就要控制培养条 件和微生物的遗传型。内因是变化的根据，因此，改变微生物的遗传型，往往是控制代 谢最有效的途径，这可以通过选育具有遗传标记的突变株。要获得具有目的遗传标记的 突变株，常采用诱变或细胞内基因重组( 包括原生质体融合、转导、转化、杂交等) 等 育种技术【4 。 当然，应用基因克隆技术