（应用化学专业论文）舒巴坦钠的工艺优化研究.pdf

哈尔滨工程大学硕士学位论文 摘要 b 内酰胺类抗生素选择性好，是很重要的一类抗感染药物。但在此类抗 生素的主体结构中，均有一个具有一定外张力的b 内酰胺环，该环对外界环 境极为敏感，易水解开环，导致b 内酰胺类抗生素抗菌活性下降，甚至完全 丧失抗菌作用。因此，细菌的耐药性已成为临床治疗中的严重问题。在对待 耐药菌的感染时，使用1 3 - 内酰胺酶抑制剂，将其与b 内酰胺类抗生素结合， 保持甚至加强p 一内酰胺类抗生素的抗菌活性，不失为一种快捷、有效的方法。 舒巴坦是具有抑酶作用的典型的p 内酰胺酶抑制剂，与p 内酰胺环类抗生素 联合应用，通过对酶的抑制，保护抗生素免受破坏，提高抗菌活性。因而研 究和优化舒巴坦钠的工艺路线具有十分重要的现实意义。 舒巴坦钠的合成分重氮化、取代、氧化、还原、成盐共五步。其传统合 成路线大致分二种。第一种为：取代反应是在乙酸乙酯有机相中进行，用硫 酸保持酸性条件，高锰酸钾作为氧化反应的氧化剂，在高压釜中以镍催化还 原，总收率为6 6 5 。第二种为：取代反应是在二氯甲烷有机相中进行，用 硫酸保持酸性条件，高锰酸钾作为氧化反应的氧化剂，甲醇为溶剂以镁粉还 原。总收率为6 5 。 本论文在传统工艺基础上，主要研究了以6 氨基青霉烷酸( 6 - a p a ) 为 原科经由重氮化、双溴化、氧化、还原、成盐制得舒巴坦钠的工艺优化。其 中。取代反应的采用氢溴酸，氧化反应中氧化剂采用高锰酸钾与磷酸混合液， 还原反应中还原剂采用锌粉。在实验过程中考虑了温度、物料配比、反应时 间、反应液p h 值、氧化剂混合液的配比、还原剂的种类、萃取次数及催化 剂等因素的影响，进行大量实验，进而确定最佳合成工艺路线：取代反应中 6 - a p a ：n a n 0 2 ：h b r ：b r 2 的比例为1 ：l ：1 3 ：4 ( 物质的量比) ，在0 c 时。以十 六烷基三甲基溴化铵为催化剂，反应3 5 h ；氧化反应中，溴代青霉烷酸( i i ) ： 磷酸：高锰酸钾的比例为l ：1 5 ：1 5 ( 物质的量比) 在o 5 1 2 、p h 值为6 5 的条 件下反应l h ；还原反应中，采用锌粉作为还原剂，溴代青霉烷砜酸( i i i ) ：锌 哈尔滨丁稃大学硕十学f ) ! 论文 i i i 粉的比例为l ：6 ，p h 值为4 0 ，后处理过程用乙酸乙酯萃取三次；成盐反应 中，属巴坦( ) ：晃辛酸钠的比例为1 ：l ( 物质的量比) ，反应l h 。 反应的总收率可达6 9 6 7 ( 以( i ) 计) 。反应收率较传统工艺( 收率为 6 5 6 6 ) 提高了将近4 。优化后的工艺简便易行、成本低、收率高、适合 工业化生产。 最后用熔点仪、红外光谱仪、核磁共振氢谱、液相色谱及质谱对产物结 构进行分析和鉴定。 关键词：内酰胺酶；舒巴坦钠；t 艺优化； 收率；表征 哈尔滨工程大学硕士学位论文 a b s t r a c t w i t hf i n es e l e c t i v i 毋，1 3 - 1 a c t u ma n t i b i o t i c sa r ev e r yi m p o r t a n ta n t i - i n f e c t i v e d r u g s b u t , i nt h em a i ns 打u c 眦o fs u c ha n t i b i o t i c s , t h e r ei sa1 3 - l a c t a mr i n go fa c e r t a i nt e n s i o no u t s i d e t h eb 1 a c t i mi s e x t r e m e l ys e n s i t i v et ot h ee x t e r n a l e n v i r o n m e n t , a n di ti se a s yt oh y d r o l y s i sa n dp a r t , w h i c hm a yd e g r a d et h e a n t i b a c t e r i a la c t i v i t yo f1 3 - 1 a c t a ma n t i b i o t i c s , e v e nl e a dt ol o s so fa n t i b a c t e r i a l e f f e c tc o m p l e t e l y t h e r e f o r e ，c l i n i c a lt r e a t m e n to fb a c t e r i a lr e s i s t a n c eh a sb e c o m e as e r i o u sp r o b l e m c o m b i n i n g1 3 - 1 a e t a m a s ei n h i b i t o r sw i t h 陆c t u ma n t i b i o t i c si n t h et r e a t m e n to fr e s i s t a n tb a c t e r i a i n f e c t i o n s ，w h i c hm a i n t a i n i n go re v e n s t r e n g t h e n i n ga n t i b a c t e r i a la c t i v i t yo ft h e3 - l a c t a ma n t i b i o t i c s ，i s ar a p i da n d e f f e c t i v em e t h o d s u l b a c t a mw a sp r o v e dt ob et h ep e n i c i l l i ns u l f o x i d ep o s s e s s i n g i n l f i b i t i n ge f f e c t p e n i c i l l i ns u l f o x i d ei sat y p i c a lb e t a - l a c t a m a s ei n h i b i t o r i tw a s c o m b i n e dw i t hd l a e t a mr i n ga n t i b i o t i c st op r o t e c ta n t i b i o t i c sa g a i n s td a m a g i n g a n di m p r o v ei t sa n t i b a c t e r i a la c t i v i t yb yt h ew a yo f i a l f i b i t i o no f t h ee i i z y l n e t h u s ， t h ep l o c e s ss t u d yo f s u l b a c t a ms o d i u mh a sg r e a tp r a c t i c a ls i g n i f i c a n c e g e n e r a l l y , t h et r a d i t i o n a ls y n t h e s i sm u t e so fs u l b a e t a ms o d i u mh a v et w o t y p e s a tt h ef i r s tr o u t e ，s u b s t i t u t i o nr e a c t i o ni sc a r r i e do u ti nt h eo r g a n i cp h a s eo f e t h y la c e t a t e ，w i t hs u l f u r i ca c i da sm e d i u m ；o x i d a t i o nr e a c t i o n i sc a r r i e do u t p e r m a n g a n a t eo fp o t a s ha so x i d a n t ；u s i n gn i c k e la sc a t a l y s ta tt h er e d u c t i o ni n a u t o c l a v e n 圮t o t a ly i e l di s6 6 5 a tt h es e c o n dr o u t e , s u b s t i t u t i o nr e a c t i o ni s c a r r i e do u ti nt h eo r g a n i cp h a s eo fd i c h l o r o m e t h a n e , s u l f u r i ca c i da sm e d i u m ； o x i d a t i o nr e a c t i o ni sc a r r i e do u tu s i n gp e r m a n g a n a t eo fp o t a s ha so x i d a n t ；i nt h e r e d u c t i o n , m e t h a n o lw a su s e d 舾as o l v e n ta n dm a g n e s i u ma sr e d u c i n gm e d i u m t h et o t a ly i e l di s6 5 i nt h i sd i s s e r t a t i o n , t h ep r o c e s so fs u l b a c t a ms o d i u mb a s e do nt h et r a d i t i o n a l p r o c e s sw a sr e s e a r c h e d ，o p t i m i z i n gp r o d u c ep r o c e d u r eo f s u l b a e t a ms o d i u mu s i n g 哈尔滨丁程大学硕十学位论文 6 - a m i n o p e n i c i l l a n i ca c i d ( 6 一a p 蛐a s r a wm a t e r i a l s b yd i a z o t i z a t i o n , d i - b r o m i d a t i o n , o x i d a t i o na n dr e d u c t i o n s u b s t i t u t i o nr e a c t i o ni sc a r r i e do u ti n i n o r g a n i cp h a s e o f h y d r o b r o m i e a c i dm e d i u m m i x t u r eo f p o t a s s i u m p e r m a n g a n a t ew i t hp h o s p h o r i ca c i dw a su s e da so x i d a n ti no x i d a t i o nr e a c t i o n , a n d z i n cp o w d e ra sr e d u c t a n ti nr e d u c t i o nr e a c t i o n i nt h ec o u r s eo fe x p e r i m e n lc o n s i d e r a t i o nt h ei n f l u e n c eo ff a c t o r ss u c ha s t e m p e r a t u r e ，t h er a t i oo fr e a c t i v es u b s t a n c e s ，r e a c t i o nt i m e ，p hv a l u e ，t h er a t i oo f o x i d a n tm i x t u r e ，r e d u c t a n t ，t h et i m e so fe x t r a c t i o na n dc a t a l y s t t h r o u g hal o to f e x p e r i m e n t s ，t h eo p t i m u mr o u t eo f p r e p a r a t i o ns u l b a c t a ms o d i u mw a sd e t e r m i n e d ： s u b s t i t u t i o nr e a c t i o nl a s t e d3 5 hw i mc e t y l t r i m e t h y la m m o n i u mb r o m i d ea s c a t a l y s t a to c w h e n6 - a p a ：n a n 0 2 ：h b r ：b r 2w 孙1 ：l ：1 3 ：4 ( m o l er a t i o ) ， o x i d a t i o nr e a c t i o nl a s t e dl ha t0 5 c w h e n ( i i ) ：p e r m a n g a n a t e o f p o t a s h ：p h o s p h o r i ca c i dw a s1 ：1 5 ：1 5 ( m o l er a t i o ) a n dp hw a s6 5 ：r e d u c t i o n r e a c tw i t hz i n cp o w d e ra sr e d u c t a n tw h e n ( i i i ) ：z i n cw a sl ：6 ( m o l er a t i o ) 。a n d e x t r a c t e df o rt h r e et i m e sw i t he t h y la c e t a t e ；t h ef i n a lr e a c t i o nl a s t e df o rl h w h e n ( ) ：c h 3 ( c h 2 ) 4 c 8 ( c h 3 ) c o o n a w a s1 ：l ( m o l er a t i o ) t h et o t a ly i e l do f r e a c t i o ni so f 6 9 6 7 ( t o ( i ) s u b t o t a l ) 。w h i c hi n c r e a s e db y n e a r l yf o u rp e r c e n tt h a nc o n v e n t i o n a lp r o c e s s e s ( y i e l d6 5 - 6 6 ) 1 1 1 ep r o c e s si s s i m p l e ，l o wc o s t ，h i g hy i e l d ，a n ds u i t a b l ef o ri n d u s t r i a lp r o d u c t i o n f i n a l l y ，s t r u c t u r eo ft h ep r o d u c tw a sa n a l y z e da n di n v e s t i g a t e db ym e l t i n g p o i n te q u i p m e n t , i l l1 h n m r , h p l ca n dm s k e yw o r d s ：l a c t a m a s e ；s u l b a c t a ms o d i u m ；o p t i m i z a t i o np r o c e s s ；y i e l d ； c h a r a c t e r i z a t i o n 哈尔滨工程大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：本论文的所有工作，是在导师的指导 下，由作者本人独立完成的。有关观点、方法、数据和文 献的引用已在文中指出，并与参考文献相对应。除文中已 注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已 经公开发表的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个 人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到 本声明的法律结果由本人承担。 作者( 签字) ：i 墨垂堑 日期：少口7 年7 月7 口日 哈尔滨丁程大学硕十学位论文 第1 章绪论 1 1 抗生素药物简介 抗生素是在低浓度下对各种病原性微生物或肿瘤细胞有选择性杀灭抑制 作用的药物。 1 1 1 抗生素药物的发展简史 1 8 7 7 年p a s t e u r 和j o u b e r t f l ! 意到炭疽杆菌在无菌尿液中生长迅速，但如同 时存在某种常见菌，炭疽杆菌就不能繁殖并立即死亡。在动物实验中也有相 似的结果，并认为此现象有重要的应用价值。1 9 世纪后叶和2 0 世纪初，在细 菌培养中证明了几种抗生素，某些曾被用于临床，但因毒性太大而被淘汰。 1 9 2 8 年，f l e m i n g 在研究葡萄球菌变异时偶然发现，青霉菌污染能使培养 的细菌溶解，有青霉菌生长的肉汤能抑制许多微生物生长，他将青霉菌产生 的这种物质称为青霉素。但此发现被搁置多年。直到1 9 3 9 年f l o r e y 和c h a i n 在 研究抗生素的工作中，制备了青霉素，确定其无毒，并于1 9 4 1 年在伦敦成功 地治疗了第一例葡萄球菌和链球菌混合感染患者，由此开创了抗生素治疗的 新纪元。并且他们3 人共同获得1 9 4 5 年的诺贝尔医学奖。 1 9 3 5 年，由于d o m a g k 的系统工作，第一个磺胺药百浪多息( p r o n t o s i l ) 进 入临床试验，d o m a g k 获得1 9 3 9 年诺贝尔医学奖。之后开始了现代抗微生物的 药物治疗时代。 1 1 2 抗生素药物的作用机制 微生物维持其生长繁殖，有赖于结构完整和代谢功能正常。细菌借细胞 壁( 阴性茵为细胞外膜) 和胞浆膜维持其细胞内环境，即起着重要的屏障作 用，其完整与否影响着通透性。选择性的抑制细胞壁的合成或增加外膜的通 透性，均能破坏原有的屏障作用，产生抑菌和杀菌效果。 很多抗生素分别选择性地抑制微生物的蛋白质和核酸合成中的某个或某 哈尔滨1 = 程大学硕士学位论文 些环节，产生抗微生物作用。主要包括以下几种：( 1 ) 抑制细菌细胞壁合成； ( 2 ) 增加胞浆膜的通透性；( 3 ) 抑制细菌蛋白质的合成：( 4 ) 抑制核酸的转录与 复制；( 5 ) 影响叶酸代谢【。 1 1 3 抗生素药物的分类 抗生素按其化学结构可分为以下5 类。( 1 ) 1 3 - 内酰胺类抗生素：p 内酰胺 类抗生素是一类最常用的抗菌药物。它们的结构中均有b 内酰胺环。按化学 结构分为：青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类、和氧头孢烯类；( 2 ) 四环素 类：四环素类抗生素是一组带有共轭双键四元稠环结构的抗生素。它包括金 霉素、士霉素、四环素、地美环素等天然四环素和多西环素等半合成四环素 类；( 3 ) 氨基糖苷类：氨基糖苷类抗生素分子结构中都有一个氨基环、醇环和 一个或多个氨基糖分子，并由配糖键连接成苷而得名。包括两大类：一类为 来自链霉菌的链霉素、卡那霉素、妥布霉素、大观霉素、新霉素等和来自小 单孢菌的庆大霉素，西索米星、小诺霉素、阿司米星等天然氨基糖苷类；另 一类为阿米卡星、奈替米星等半合成氨基糖苷类；( 4 ) 大环内酯类：大环内酯 类抗生素是一组具有大脂肪族内酯环特征性结构且抗菌作用相近的抗生素。 红霉素为其代表药；( 5 ) 其他类：其他类的抗生素包括很多半合成的药物。 1 2 b 一内酰胺类抗生素 现代l 晦床上最常用的抗生素是b 内酰胺类抗生素，而青霉素和头孢菌素 类又是最为常用的b 内酰胺类抗生素中的两种。通过对它们的母核p 一氨基青 霉烷酸和7 一氨基头孢烷酸的侧链进行改造，获得了大量各具特点的抗生素。 b 内酰胺类抗生素抑菌和杀菌作用机制是抑制细菌粘肽的合成，通过共价键 与细胞壁合成有关的青霉素结合蛋白( p b p s ) 结合而抑制细菌细胞壁的合成 冈。 1 2 ，1 青霉素类抗生素 2 哈尔滨工程大学硕士学位论文 青霉素是青霉素g 的简称，又称为苄青霉素，在医药上主要用其钠盐。 主要优点是杀菌作用强、毒性低、价格便宜。主要缺点是不耐酸，故不能口 服；不耐青霉素酶，耐药现象极为普遍；抗菌谱窄，对肠道杆菌无效；可引 起过敏反应，严重者发生过敏性休克。 青霉素的抗菌作用机制包括：( 1 ) 抑制转肽酶活性，干扰细菌细胞壁合 成：青霉素的作用靶点被称为青霉素结合蛋白( p b p s ) ，作为主要靶蛋白的 几种p b p s 都具有转肽酶活性，参与细胞壁合成的关键步骤，抑制转肽酶使细 胞壁合成障碍，产生去细胞壁细菌细胞，其能很快裂解；( 2 ) 增加细菌细胞 壁自溶酶的活性：b 一内酰胺类抗生素使细菌裂解往往最终有赖于细胞壁自溶 酶的活性，产生自溶或细胞质水解。另外干扰肽聚糖的装配和启动自溶性更 有利于细胞裂解。 1 2 2 头孢菌素类抗生素 头孢菌素类抗生素是以头孢菌素的母核7 一氨基头孢烷酸接上不同的侧链 丽制成的半合成抗生素。头孢菌素类的特点表现在；对b 内酰胺酶的稳定性 比青霉素类高，抗菌谱比青霉素类广，抗菌作用比青霉素类强，过敏反应比 青霉素类少。 1 2 3 其他旷内酰胺类抗生素 其他的争内酰胺类还有头霉素类、碳青霉烯类、单环类和氧头孢烯类。 均是医药上常用的抗生素。 1 3 对p - 内酰胺酶的研究 1 3 1 细菌的耐药性 耐药性是自然界微生物闻普遍存在的抗生现象的特殊表现形式。各种微 生物在求生存的过程中，一方面产生相应的抗生物质，用以杀灭其他微生物； 另一方面要积极抵御其他微生物所产生的抗生物质侵入。当种类不断增加的 抗菌药物被用于防治感染性疾病时，各种微生物势必加强其防御能力，即形 3 哈尔滨工程大学硕士学位论文 成了抗菌药物参与的微生物抗生现象。再加上耐药基因的传代、转移、传播、 扩散，耐药微生物越来越多，耐药程度不断增加，形成高度和多重耐药性。 微生物可通过以下机制产生耐药性【3 】：( 1 ) 产生灭活酶：( 2 ) 改变靶 位结构，包括改变靶蛋白，使其与抗生素的亲和力降低；增加靶蛋白的数量， 在药物存在的同时仍由足够量的靶蛋白维持微生物的正常形态和功能；新合 成敏感菌所没有的、功能正常的、与抗生素亲和力低的靶蛋白；( 3 ) 降低外 膜的通透性，使药物不易进入靶部位；( 4 ) 加强主动流出系统。而通过产生 灭活酶将药物灭活是微生物产生耐药性的重要机制。 争内酰胺酶就是一类由细菌产生的能够降解1 3 内酰胺类抗生素、使细菌 产生耐药性、最终使1 3 内酰胺类抗生素的抗菌作用减弱或者最终丧失的一种 灭活酶。 1 3 2b 内酰胺酶的发现 青霉素和头孢菌素等1 3 内酰胺类抗生素的发现和使用为人类抵抗细菌感 染作出了巨大的贡献。但是，随着这些抗生素广泛、大量的使用，人们在临 床上分离出耐青霉素类、头孢菌素类及相关抗生素的许多菌株。p - 内酰胺酶 于1 9 4 0 年首次在大肠埃希氏菌中被确定。随后这种酶在其它许多细菌中被检 测到。1 9 4 4 年明确了金葡菌对青霉素耐药的机理是其产生1 3 内酰胺酶。当时 这种耐药菌的产酶水平较低，但随着6 内酰胺类抗生素的广泛使用刺激了细 菌产生b 内酰胺酶的能力。2 0 世纪6 0 年代第一代头孢菌素问世之后，发现了 头孢菌素酶，以后又发现了既能水解青霉素又能水解头孢菌素的广谱酶【4 】。 b 内酰胺酶是引起细菌对p 内酰胺类抗生素产生耐药性的主要原因，肛 内酰胺类药物在这类酶的作用下，使p - 内酰胺环水解开环，而p - 内酰胺环是 与青霉素结合蛋白( p e n i c i l l i n - b i n d i n g - p r o t e i n ，p b p s ) 结合的活性功能部位，因 而b 内酰胺环的破坏使其失去了干扰细菌细胞壁合成的功能。研究人员已对 2 0 0 种左右的b 内酰胺酶的结构和功能进行了研究。另外，也对7 0 多种p 内酰 胺酶、3 种单功能转葡基酶和7 0 多种p b p s 进行了序列测定，其具有多重序列 4 哈尔滨工程大学硕十学位论文 同源性。对b - 内酰胺酶和参与细菌细胞壁肽聚糖代谢的d 丙氨酸- d 丙氨酸肽 酶进行x 射线晶体学等研究后发现，虽然这两种酶的催化特征和总的氨基酸 序列不同，但它们的三维空间结构十分相似，在丝氨酸活性位点附近的氨基 酸序列也基本相同。进一步研究表明大多数p b p s 与大多数6 内酰胺酶一样， 为活性位点丝氨酸酶，且从进化的角度考虑b 内酰胺酶可能来源于p b p s 。 1 3 - 3p 内酰胺酶的分类 迄今为止报道的p 内酰胺酶已超过3 0 0 种，多数是由于应用不同的p 内酰 胺类抗生素产生的诱导作用及细菌迫于生存压力而产生的。它们在来源、底 物、抑制剂、结构等方面存在许多差异，从而给b 内酰胺酶的系统分类带来 困难。至今已有7 种酶分类法的报道。1 9 6 8 年s a w a i 以血清法区分青霉素酶和 头孢菌素酶。1 9 7 3 年r i c h m o n d 和s y k e s 主要根据酶的底物轮廓及质控和染色 体因子将革兰氏阴性菌来源的b 内酰胺酶分为5 类，1 9 7 6 年s y k e s 和m a t t h e w 按 质粒编码和染色体编码的酶对此分类作了修改。1 9 8 0 年a m b l e r 在氨基酸序列 分析的基础上将争内酰胺酶按分子结构分为4 类，a 类为青霉素酶，b 类为金 属b 内酰胺酶，c 类为头孢菌素酶，d 类为苯唑西林酶。1 9 8 1 年m i t s u h a s h i 和 i n o u e 根据底物轮廓和等电点将酶分为青霉素酶、头孢菌素酶光谱酶和超光谱 酶。1 9 8 9 年b u s h 按底物、抑制剂和分子结构对所有细菌来源的b 内酰胺酶进 行分类，1 9 9 4 年b u s h 。j a c o b y 和m e d e i r o 5 】在此基础上增加y 1 3 内酰胺酶抑制 剂亲和力降低的酶和能水解碳青霉烯、被克拉维酸微弱抑制的含丝氨酸的p - 内酰胺酶，形成了现在普遍接受的分类方法。 1 3 4b 内酰胺酶的构效关系 近2 0 年来超广谱新品种的大量应用，b 内酰胺酶的种类、底物谱和耐药 程度均以惊人的速度在发展，已经引起了人们的格外重视。其中对p 内酰胺 酶分子结构及其与底物之间相互作用的构效关系研究己成为揭示耐药机制的 重要环节。 哈尔滨工程大学硕十学位论文 细菌争内酰胺酶耐药性基因的两种突变可引起广泛耐药。但无论何种突 变其对耐药的贡献最终还需要通过p 内酰胺酶分子作为桥梁，因此对争内酰 胺酶与底物之间构效关系的研究是酶介导的耐药机制研究中的另一个重要方 面。随着研究技术和手段的不断进步，特别是x - 射线立体衍射分析技术的发 展，对物质空问三维结构的准确描述成为可能，在此背景下，精细的b 内酰 胺酶构效关系研究取得了很大的进步。其中最为系统的研究为t e m 和s h v 型争内酰胺酶，特别是近年来不断发现的t e m 和s h v 型超广谱酶，其活性 位点上残基的取代所造成的耐药日益严重，使得对该类b 内酰胺酶构效关系 的研究显得更为重要。现主要以t e m 型b 内酰胺酶为例叙述如下： 所有t e m 和s h v 型超广谱b 内酰胺酶与原型酶( t e m - 1 ，s h v - 1 ) 相比都 有l 5 个氨基酸残基的取代。a r 9 1 6 4 的取代是t e m 型酶中最常见的一种， a r g1 6 4 与a s p 9 之间通过静电引力和氢键作用共同维护着q 环的结构。若发 生a r g i “一s 盯，后者较弱的氢键作用和静电引力使得1 6 4 与1 7 9 位点之间的 结构松弛，从而增加了q 环的柔韧性，这样更利于具有较大空间位阻的底物 进入活性中心，同时，q 环的改变有可能使环上的g l u l 6 6 与水分子之间的连 接发生改变。通过点突变获得的a r 9 1 6 4s e r t e m - i 对头孢噻肟唾肪、头孢 他啶和氨曲南的k c a t k m 值有显著增加；理论上a 印 9 的取代也有类似于 a r 9 1 甜的结果，x 射线立体结构显示a s p l 7 9 j a 蚰p cl 突变酶具有更松弛的 。环，对头孢他啶的耐药性增强。 g l u l 舛的取代频率在t e m 型酶中仅次于a r 9 1 6 4 。g i u l 0 4 通过与a s n l 3 2 的 相互作用对s d n 结构域单元( 1 3 0 1 3 2 位点) 起稳定作用，从而保证s e r 的催化活性嘲，同时g 1 1 0 4 侧链本身也可能与b 内酰胺类抗生素侧链上的基团 连接。最近的研究表明，除与底物的直接连接外，g l u l 0 4 的取代对s d n 结构 的间接影响可能是更重要的耐药原斟”。 a l a 2 3 7 上的卟m 一和- c o 一可以与弘内酰胺环上的- c o - 和侧链上的酰胺键 连接。a l a p 7 一1 h 的取代见于t e m - 5 和t e m - 2 4 ，由于t h r 侧链含有一o h ， 6 哈尔滨工程大学硕十学位论文 被认为是比a l a 更好的h 受体，因此t h r 更易接受b 内酰胺侧链上卟m 一提 供的h ，从而造成t e m - 5 和t e m - 2 4 对肟类头孢菌素的高效水解衍生型普通 变形菌酶通过s e r 2 3 7 - a l a 点突变后对头孢噻肟的水解效率显著下降( s e t 侧 链含有- o h ) 证实了以上推断的合理性隅1 。 g l y 2 3 3 - , t s e r 取代见于部分t e m 型酶和几乎所有s h v 型酶中。一般认为 此位点的作用是维护b 链的构型，o l y 8 _ s e r 取代有利于空间位阻较大的 底物与2 3 7 位点的结合，增加酶与底物的亲和力，降低k m ；但g 1 y 2 3 3 _ s c r 也可能带来另一种结果，即随着b 一链位置的改变，o x y a n i o n 盒的位置也相应 改变，拉大与活性中心s e r 7 0 的距离，最终导致水解效率的降低。另外有报道 指出，g i y 2 3 8 上的一o h 可与头孢噻肟基上的n 形成氢键，提示2 3 8 位点可能 通过其他方式发挥作用。 g i u 2 4 0 位于c 链的转折处，它的取代一般不会引起构型的变化。研究表 明g l l | ：2 4 0 l y s 取代后，l y s 的侧链可通过静电引力与p 内酰胺肟基链上的 羧基结合，加速水解，含有以上结构的头孢他啶和氨曲南的水解性质证实了 这一点。而在1 0 4 和2 4 0 位点同时发生l y s 取代的t e m - 2 4 对头孢他啶显示 了极强的水解效率。 目前关于a 獬的作用有争议，但通过对克拉维酸的研究，人们对a 的作用有了更新的认识，发现a f g t m 通过与水分子的相互作用激活水分子， 使后者参与亲核水解反应，当带有较短侧链且不带电荷的s e t 或切l y s 取代 a r g 后，就无法激活水分予引发水解反应，因此，a 唱2 4 4 被看作是对克拉维酸 耐药的重要位点。发生a r 9 2 4 4 - - s e t 或c y s 取代的菌株均表现出对克拉维酸 耐药。 m e 尸是另一个与抑制剂耐药性有关的重要位点尽管它紧邻s e r 7 0 活性 位点，但这并不是其重要性的关键，关键在于它位于o x y a n i o n 盒区域，此位 点的突变可改变o x y a n i o n 盒的空间相对位置。目前发现的取代有m e 尸寸 i l e ，l y s 和c y s ，以m e t 船_ i l e 为例，n e 较m e t 有更强的疏水性，由于构象 ， 哈尔滨工程大学硕十学位论文 的关系，n e 侧链上的p 一甲基极易伸入o x y a n i o n 盒区，使o x y a i l i 伽盒的结构 改变，造成水解反应无法正常进行。b 一内酰胺酶抑制剂的分子一般都较小， 位于“键合腔”边缘的1 0 4 ，1 6 4 ，2 4 4 等位点由于距离的原因基本不与b 一内酞 胺酶抑制剂发生作用，因此使得6 9 ，2 4 4 位点的取代在b 一内酰胺酶抑制剂的 耐药中变得极其重要，事实也证明6 9 位点被取代的t e m 一3 3 3 6 对克拉维酸 高度耐药。 除以上取代位点外，许多学者对其它位点如3 9 ，4 3 ，1 8 ，2 0 5 ，2 6 5 等也进行 了不同的研究，但这些位点在水解反应中的作用还不清楚或其重要性较低。 旷内酰胺酶的种类和数量正以惊人的速度在发展着，新酶的不断出现和新b 一 内酰胺类抗生素的发展密不可分。在过去的2 0 年里，由于超广谱头孢菌素的 大量使用，造成了超广谱b 一内酰胺酶在世界范围的流行。尽管目前对旷内 酰胺酶的研究取得了长足的进步，但许多疑点和难点还待进一步研究，我们 相信随着技术进步和研究的深入，对p 一内酰胺酶的认识将更加精确和准确， 从而为临床治疗和新药开发提供有力的帮助。 1 4b 内酰胺酶抑制剂的研究概况 5 0 多年前青霉素的问世宣布了抗生素时代的开始f 9 】，b 一内酰胺环类抗生 素，通过共价键与细菌细胞壁合成有关的青霉素结合蛋白( p b p s ) 而抑制细菌 细胞壁的合成。有高效、低毒、广谱、选择性好的优点，是很重要的一类抗 感染药物。但近年来，耐药菌株的产生，特别是长期使用的环境使具很强致 病性的耐药菌获得选择性地发展，使其疗效大大下降，使该类抗生素的使用 受到威胁。而b 一内酰胺酶抑制剂与该类抗生素联合使用，具有明显的协同作 用，可增强抗菌作用、扩大抗菌谱。 1 4 1b 内酰胺酶抑制剂的发现 葡萄球菌的p 内酰胺酶以及其在临床上产生耐药性的发现，促使人们开 始对b 一内酰胺抑制剂的研究。早在2 0 世纪4 0 年代中期，已清楚地了解到抑 制b 一内酰胺酶能增强青霉素g 的效力。 盛 哈尔滨工程大学硕士学位论文 抑制b - 内酰胺酶的早期研究包括：( 1 ) 不同结构的合成化合物的检测； ( 2 ) 中和b 一内酰胺酶的抗血清；( 3 ) 合成新的p 一内酰胺类物质，目的是增加 它们对p 一内酰胺酶的稳定性；( 4 ) 从天然产物中筛选p 一内酰胺酶的抑制剂。 在这些化合物的筛选中，只有某些化合物显示了较弱的抑制活性，但没有一 个有希望可用于临床。2 0 世纪6 0 年代随着半合成青霉素的出现，发现某些 青霉素( 如甲氧西林、乙氧萘青霉素等) 有抑制旷内酰胺酶的作用，又重新唤 起了人们对b 一内酰胺酶抑制剂的兴趣，并开始研究结合其它青霉素使用时的 协同作用。但由于半合成青霉素作为p 一内酰胺酶抑制剂有着很大的局限性而 没能应用于临床。尽管如此，这些药物在临床上的潜在效果是清楚的。 2 0 世纪7 0 年代初，人们开始了从微生物中筛选b 一内酰胺酶抑制剂的研 究。第一个旷内酰胺酶的自杀性抑制剂是在1 9 7 6 年从橄榄链霉菌 ( s t r c p t o m y c e s - - o l i v a c e u s ) 中分离得到的，称为橄榄酸( o l i v a n i c a c i d s ) ，但由 于其穿透细菌细胞壁的能力较差且其在体内的代谢很快的缘故，使它在临床 上无应用价值。尽管如此研究人员对微生物的筛选工作仍在不断开展。不久 人们从橄榄链霉菌的培养液中分离得到棒酸( c l a v u l a n i c - a c i d ) ，棒酸是一种具 有强b 一内酰胺酶抑制作用的化合物，它没有橄榄酸在体内不稳定的缺点。棒 酸对不同类型的p 一内酰胺酶的敏感性不一样，金葡茵的p 一内酰胺酶和质粒 介导的酶都能被棒酸很快地抑制。另外，克雷伯氏菌、变形杆菌及脆弱拟杆 菌所产生的染色体介导的酶也能被很快地抑制，但某些i 型b 一内酰胺酶不能 被棒酸很快地抑制。 1 4 2b 内酰胺酶抑制剂的研究进展 棒酸是第一个被用于l f 缶床的p 一内酰胺酶抑制剂，国外自8 0 年代初开始 应用于临床。最常见的抗菌机制是细菌产生了旷内酰胺酶，p 内酰胺酶能够 裂解p 一内酰胺坏，使b 一内酰胺类抗生素失活。对p 一内酰胺类化合物的化学 修饰有助于提高这些化合物对b 一内酰胺酶的稳定性，进一步的研究导致许多 有用的b 一内酰胺酶抑制剂的发现。 9 哈尔滨丁程大学硕士学位论文 i 1 9 7 8 年e n g l i k h 等报道了青霉烷酸及其砜类的b 一内酰胺酶抑制剂，其中 青霉烷砜酸( s u l b a c t a m ) 就是一个很好的b 一内酰胺酶抑制剂。它本身不具有抗 菌活性，但它在较低的浓度时，对l i ，i i i ，和v 型酶都有很强的不可逆抑 制作用，它与多种旷内酰胺类抗生素联合使用能产生明显的协同作用，从而 对大部分耐药菌的最低抑菌浓度降至这些抗生素的敏感范围内。u n a s y n ( 优 立新) 是氨苄青霉素与青霉烷砜的复合剂【l o s u l p e r a z o n 是头孢哌酮与青霉烷 砜组成的复合剂。 青霉烷砜的缺点是吸收不良，美国的辉瑞公司合成了它的匹呋酯以改善 它在给药后的生物利用度。另外，为了克服青霉烷砜和b 一内酰胺类抗生素联 合使用时二者在吸收速率、体内分布和有效作用等方面的差异，丹麦l e o 公 司的b a l t z e r 等根据互为前体药物的原理，将青霉烷砜和氨苄青霉素缩合成双 酯化合物s u l t a m i c i l l i n ，以克服青霉烷砜和b 一内酰胺类抗生素口服吸收差的 缺点，并可以使青霉烷砜和b 一内酰胺类抗生素在相同的时间以相同的速率吸 收，且有相似的血药半衰期。这表明青霉烷砜和b 一内酰胺类抗生素始终同时 存在相同的比例，发挥其最佳的保护作用。国外该产品已经上市。 1 9 8 0 年s c h e n e i n 和p r a t t 报道了一种专一性的、不可逆的b 一内酰胺酶抑 制剂p h y l p r o p y n a l ，该物质不属于p 一内酰胺类化合物。1 9 8 8 年， c r o m p t o n 等报道了一组b o r o n i ca c i d 型的b - 内酰胺酶抑制剂。这些化合物主 要是丝氨酸型蛋白酶的抑制剂，它们能够抑制p 内酰胺酶，主要是因为这两 类酶在活性位点上具有相似性。1 9 9 9 年，k o u i c h i 等i l l j 发现一个新的p 一内酰 胺酶抑制剂s y n 2 1 9 0 ，它是单环内酰胺的衍生物。2 0 0 1 年t o n e y 等报道了 一系列的2 ，3 - ( s ，s ) 一二取代的琥珀酸可作为一种山质粒介导的i m p l 金属 - 1 3 - 畦j 酰胺酶( 属于b 类p 一内酰胺酶) 的有效抑制剂。该抑制剂可有效地抑制 i m p - 1 金属- 0 一内酰胺酶水解碳青霉烯类抗生素1 1 2 1 。 1 5 舒巴坦的研究现状 正如上文所说舒巴坦( 青霉烷砜酸) 作为一种竞争性的不可逆的争内酰 哈尔滨丁程大学硕士学位论文 胺酶抑制剂d 3 】，当它与青霉素联合使用时具有明显的协同作用，因而近年来 对舒巴坦的需求也日益增多。舒巴坦作为一种医药中问体，应用价值很高 【1 4 ，i s 1 5 i 舒巴坦的作用机理 影响母内酰胺酶抑制剂化合物活性的因素有：抑制剂化合物与p 内酰胺 酶的亲合程度；b 内酰胺酶的数量；理化条件如p h 值的影响等等。舒巴坦 是一个广谱酶抑制剂，只对e s b l s 及a m p c 酶作用较差，其抑酶作用受细菌 产生的p 内酰胺酶量的影响、抑制剂的通透性和p h 僮的影响。舒巴坦通过 首先与b 内酰胺酶作用形成酰化产物( 称为i ) ，然后i 噻唑环开环生成中间 体i i ，i i 重排后得到不易水解的b 氨丙烯酸类化合物i i i ，酰化产物l 及其开 环生成的中闻体i i 可水解得到活化酶和水解产物，h 和m 还可进一步转变 为不可逆失活产物，而使酶失活，舒巴坦的作用机理见下式。 成一乖一一。誊 可 e a o h + 水解产物水解产物 1 5 2 舒巴坦抗菌活性 舒巴坦是半合成的酶抑制剂，青霉素母核中的噻唑环硫原子氧化成砜。 对细菌的抗菌作用弱，除对淋球菌和脑膜炎双球菌抑菌浓度为0 1 3 2 g m l l；蚓十 e 哈尔滨工程大学硕士学位论文 外，对其余细菌的抑菌浓度均在2 5 2 0 0 p 咖l ，对肠球菌及绿脓杆菌耐药。 舒巴坦是广谱酶抑制剂，在较低浓度时，对i i ，i i i ，v 型b 内酰胺酶具 有很强的不可逆抑制作用，可抑制由质粒或染色体介导的产b 内酰胺酶的金 黄色葡萄球菌、大肠杆菌和某些分枝杆菌，但穿透革兰氏阴性菌外膜能力差， 不能抑制由大肠杆菌、枸橼酸杆菌所产生的i 型染色体介导的b 内酰胺酶， 其抑制作用和克拉维酸相似，与多种b - 内酰胺环类抗生素联合能产生明显的 协同作用。使大部分耐药菌的最低抑菌浓度值降至这些抗生素的敏感范围。 1 5 3 舒巴坦的临床应用 舒巴坦与不耐酶的抗生素联合应用治疗常见致病菌引起的呼吸道、泌尿 系统感染。与氨苄西林的复方制剂舒他西林s u l t a m i c i l l i n ( p a r e n t e r a l ) ，对氨苄 西林有耐药的菌株呈现良好的抗菌作用，主要用于内科感染。舒他西林( 口服 用) s u l t a m i c i l l i n ( o r a - 1 ) ，主要用于敏感菌引起的呼吸系统感染。临床上，舒巴 坦和头孢哌酮的复合制剂也常用于各系统的感染治疗【1 6 】。 1 6 舒巴坦与舒巴坦钠复合制剂 舒巴坦作为抗菌药物单独应用很少见效。但它是一种较强的内酰胺酶抑 制剂，对青霉素酶，头孢菌素酶具有较强的不可逆作用，因此与各种内酰胺