（发酵工程专业论文）青霉素印迹聚合物的制备及其应用研究.pdf

天津科技大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的 研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包括任何其他个人或 集体已经发表或撰写的成果内容。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均 已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名： 日期：年月日 专利权声明 本人郑重声明：所呈交的论文涉及的创造性发明的专利权及使用权完全归天 津科技大学所有。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名： 日期：年月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权天津科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口( 请在方框内打“) ，在年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密矾请在方框内打“ ) 。 作者签名：豫 导师签名： 同期：叶年l 月 同期：年月 摘要 本文利用分子印迹技术，以b 内酰胺类抗生素青霉素作为模板分子，通 过反复优化合成条件制备得到了对青霉素具有高特异性吸附能力的印迹聚合 物p e n g m i p 。利用s c a t c h a r d 模型对该印迹聚合物的吸附性能进行评价后，研 究了其在环境中青霉素残留的快速检测以及在牛乳中青霉素残留定量检测中 的实际应用。主要研究内容包括p e n g m i p 合成条件的选择和优化、洗提条件 的确定、p e n g m i p 印迹效率的评价、在不同介质中p e n g m i p 吸附平衡时间 的确定以及对不同底物的选择性、反复回收性能测定的研究等。 采用l 9 ( 3 4 ) 正交实验设计，以模板和单体的比例、致孔剂及预作用时间 为指标，筛选出合成对青霉素有特异性吸附能力的印迹聚合p e n g m i p s 的较 优条件为：模板和单体的比例为l ：3 ，预作用时间6 h ，致孔剂选用d m f 和氯 仿的混合溶剂。使用超声的方法进行颗粒的模板洗提，研究了溶剂种类、溶剂 用量、混合溶剂组成和提取时间对青霉素提取率的影响。经试验得到青霉素超 声洗提的最佳工艺条件为：提取溶剂为含10 乙酸的甲醇溶液，溶剂用量为 2 0 m l g 样品，洗提时间为4 次，每次2 0 m i n 。 利用s c a t c h a r d 模型评价了最优m i p 的吸附性能，确定在其中存在对青霉 素具有不同亲和力的两类作用位点：高亲和力结合位点的平衡解离常数k d l = 1 1 4 x1 0 一m o l l ，最大表观吸附量q m a x l = 4 6 0 l g m o l g ；低亲和力结合位点 的平衡解离常数k d 2 = 1 3 5 1 0 一m o l l ，最大表观吸附量q m a x 2 = 7 2 5 5 1 t m o l g 。吸附动力学实验结果表明颗粒在水中吸附平衡时间分别为10 m i n ，与本尼 迪特( b e n e d i c t ) 试剂结合分析确定了p e n g m i p 在牛乳中的吸附平衡时间为 6 h 。反复回收性能测定实验证明m i p 颗粒在第5 次回收后吸附能力仅下降 18 。 用一定量颗粒吸附处理含有青霉素的牛乳，再进行发酵活性实验，通过颗 粒的用量及发酵情况确定乳中青霉素的残留量，实现分子印迹技术用于乳中青 霉素残留的快速定量检测，检测下限为5 p p b ( g g l ) 或以下，结果准确度高， 操作简便，且p e n g m i p 颗粒可以反复使用，极大的降低了乳中青霉素残留的 检测成本。 关键词：分子印迹；青霉素；聚合物；残留检测；牛乳 a b s t r a ct i nt h i sp a p e r ，b - l a c t a ma n t i b i o t i c sp e n i c i l l i nw a su s e da sat e m p l a t e ，t h r o u g h o p t i m i z i n gt h ec o n d i t i o n so fs y n t h e s i sr e p e a t e d l y ，p e n g - m i pw h i c hh a sah i g h s p e c i f i ca d s o r p t i o na b i l i t y f o rp e n i c i l l i nw a sp r e p a r e db yu s i n gm o l e c u l a r i m p r i n t i n gt e c h n o l o g y b ys c a t c h a r da n a l y s i s ，t h ea d s o r p t i o nc h a r a c t e r i s t i co f p e n g m i pw a se v a l u a t e d t h e nt h ep r a c t i c a la p p l i c a t i o no fm i pf o rr a p i d d e t e c t i o no fp e n i c i l l i ni nt h ee n v i r o n m e n ta n dq u a n t i t a t i v ed e t e c t i o no fp e n i c i l l i n r e s i d u e si nm i l kw e r es t u d i e d t h er e s e a r c hc o n t e n t sm a i n l yc o n t a i n e dt h ec h o i c e a n do p t i m i z a t i o no fs y n t h e s i sc o n d i t i o n s ，t h ed e t e r m i n a t i o no fw a s h i n gc o n d i t i o n s ， p e n g - m i pe f f i c i e n c ye v a l u a t i o n ，t h ed e t e r m i n a t i o no fa d s o r p t i o ne q u i l i b r i u mt i m e i nd i f f e r e n tm e d i aa n dt h es e l e c t i v i t ya b i l i t yt o w a r d sd i f f e r e n ts u b s t r a t e s ，t h et e s t o fr e p e a t e dr e c o v e r yf e a t u r e sa n ds oo n b yl 9 ( 3 4 ) o r t h o g o n a le x p e r i m e n t a ld e s i g nt oo p t i m i z et h er a t i oo ft e m p l a t e a n dm o n o m e r ，p o r g e na n dt h ep r e - a c t i o nt i m e ，s y n t h e s i z e dp e n g - m i pw h i c hh a da h i g ha d s o r p t i o nc a p a c i t yt op e n i c i l l i n t h eb e t t e rc o n d i t i o n ：t h er a t i oo ft e m p l a t e a n dm o n o m e ri s1 ：3 ，t h em i x e ds o l v e n to fm e t h a n o la n da c e t i ca c i da sp o r o u s a g e n t ，p r e - a c t i o nt i m ew a s6 h u s e d u l t r a s o n i cm e t h o d sf o rp a r t i c l e sw a s h i n g o p e r a t i o na n ds t u d i e dt h ee f f e c to fm a i nt y p eo fs o l v e n t ，s o l v e n tc o n c e n t r a t i o n ，t h e c o m p o s i t i o no ft h em i x e ds o l v e n ta n de x t r a c t i o nt i m et ot h ep e n i c i l l i ne x t r a c t i o n r a t e b yr e p e a t i n gt h ee x p e r i m e n t ，o p t i m u mc o n d i t i o n so fp e n i c i l l i nu l t r a s o n i c w a s h i n gw e r e ：e x t r a c t i o ns o l v e n tw a st h em i x e ds o l u t i o no fm e t h a n o lc o n t a i n i n g 10 a c i d ；t h ea m o u n to fs o l v e n tw a s2 0 m ls o l v e n te v e r yg r a mo fp a r t i c l e s ；e l u a t e d f o r4 2 0m i n b ys c a t c h a r da n a l y s i ss h o w e dt h a tt h e r ew e r et w od if f e r e n ta f f i n i t ys i t e si n t h ep o l y m e r ，e q u i l i b r i u md i s s o c i a t i o nc o n s t a n to fh i g h a f f i n i t yb i n d i n gs i t e sk d l2 1 1 4 10 4 m o l l ，t h em o s ta p p a r e n ta d s o r p t i o nq m a x i = 4 6 0 1i t m o l g ； e q u i l i b r i u md i s s o c i a t i o nc o n s t a n to fl o w - a f f i n i t yb i n d i n gs i t e sk d 2 = 1 3 5 10 m o l l ，t h em o s ta p p a r e n ta d s o r p t i o nq m a x 2 = 7 2 5 5 i t m o l g a d s o r p t i o nk i n e t i c s r e s u l t ss h o w e dt h a ta d s o r p t i o ne q u i l i b r i u mt i m eo fp a r t i c l e si nw a t e rw a s10m i n c o m b i n e dw i t ht h eb e n e d i c t r e a g e n t sa n a l y s i s a s s u r e dt h a tt h eb a l a n c e d a d s o r p t i o nt i m eo fp e n g m i pi nm i l ki ss i xh o u r s s e l e c t i v eb i n d i n ga s s a ys h o w e d t h a t p a r t i c l e s e x h i b i t h i g hs p e c i f i c i t y t o p e n i c i l l i n r e p e a t e dt e s t i n g e x p e r i m e n t a t i o np r o v e dg r e a t e rs t a b i l i t yo fp a r t i c l e sa f t e ro p t i m a lc o n d i t i o n sf o r s y n t h e s i s ，a f t e rt h ef o u r t hr e c o v e r y , t h ea b s o r p t i o nc a p a c i t yr e d u c e do n l yb y18 a d d i n gac e r t a i na m o u n to fp a r t i c l e s t ot h eu n k n o w np e n i c i l l i ns o l u t i o n ， s e p a r a t e dt h es u p e r n a t a n tf o r t h ea b s o r b a n c ev a l u e st e s t i n g ，f r o mt h es t a n d a r d c u r v eg o tt h es o l u t i o nc o n c e n t r a t i o n ，a n dc o m p a r e dt h er e s u l t sw i t ht h a to fd i r e c t l y g o tf r o mt h es p e c t r o p h o t o m e t r i cm e t h o do fu n k n o w ns o l u t i o n ，r s dw a sw i t h i n 3 6 ，a c h i e v e dt h er a p i dd e t e c t i o no fp e n i c i l l i n i n a q u e o u ss o l u t i o n p r o p e r p a r t i c l e sa d d e di n t o ac e r t a i na m o u n to fm i l kc o n t a i n i n gp e n i c i l l i na n dt h e n s e p a r a t e dt ot a k ef e r m e n t a t i o na c t i v i t ye x p e r i m e n t ，a c c o r d i n gt ot h ea m o u n to f p a r t i c l e st od e t e r m i n et h ea m o u n to fp e n i c i l l i nr e s i d u e si nm i l k ，a c h i e v i n gg o a l so f c o m b i n i n gt h et w of o rr a p i dq u a n t i t a t i v ed e t e c t i o no fp e n i c i l l i nr e s i d u e si nm i l k w i t ht h er e s u l t so fh i g ha c c u r a c y , a n da tt h es a m et i m ep e n g - m i pp a r t i c l e sc a nb e u s e dr e p e a t e d l y , g r e a t l yr e d u c i n gt h ec o s to ft e s t i n g k e yw o r d ：m o l e c u l a ri m p r i n t i n g ；p e n i c i l l i n ；p o l y m e r ；r e s i d u ed e t e r m i n a t i o n ；m i l k 录 1 1 5 分子印迹法的工作步骤3 1 1 6 分子印迹技术的特点4 1 1 7 分子印迹高聚物的应用“5 1 1 8 分子印迹存在的问题与最新挑战”6 1 2m i p 作为分离介质应用于青霉素残留的检测7 1 2 1 青霉素简介7 1 2 2 牛乳中抗生素残留的现状分析8 1 2 3 牛乳中抗生素的来源及其危害9 1 2 4 牛乳中抗生素残留的检测方法及存在问题10 1 3 本课题的立题目的及主要研究内容1 3 1 3 1 本课题研究的目的及意义1 3 1 3 2 本课题研究的内容1 4 2 材料与方法1 5 2 1 材料l5 2 1 1 药品与耗材l5 2 1 2 主要试剂l5 2 1 3 主要仪器”1 5 2 1 4 试剂前处理及实验用溶剂的配制1 6 2 2 分析方法1 7 2 2 1m i p 洗脱液的b e n e d i c t 试剂检测l7 2 2 2 标准曲线法测定m i p 颗粒的结合量一l8 2 2 3 青霉素残留检测的发酵活性实验法1 9 2 2 4p h 法21 2 2 5t t c 法2 1 2 3 实验方法2 3 1 1 l 1 2 2 2 3 1p e n g m i p 的制备及颗粒模板洗脱”2 3 2 3 2u v 检测p e n g 和不同功能单体相互作用的研究”2 4 2 3 3 聚合物颗粒对模板分子青霉素的平衡结合实验2 4 2 3 4m i p 用于环境中青霉素残留的快速检测一2 5 2 3 5m i p 用于牛乳青霉素残留的定量检测2 5 3 结果与讨论2 7 3 1p e n g m i p 的合成2 7 3 1 1 功能单体的选择2 7 3 1 2 交联剂的选择及用量确定2 9 3 1 3 聚合过程引发方式的选择一3 1 3 1 4 引发剂种类的影响一3 2 3 1 5 合成条件的优化3 2 3 2p e n g m i p 洗提条件的确定3 4 3 2 1 溶剂种类3 5 3 2 2 溶剂用量3 5 3 2 3 混合溶剂组成及比例优化3 6 3 2 3 洗提时间一3 6 3 3p e n g m i p 印迹效率的评价3 8 3 3 1m i p 颗粒特性表征3 8 3 3 2m i p 颗粒吸附性能评价3 9 3 3 3m i p 在不同溶剂中的吸附性差异4 0 3 4p e n g m i p 用于环境中青霉素残留的快速检测4 l 3 4 1 吸附动力学曲线的绘制4 l 3 4 2 检测结果4 1 3 4 3m i p 对不同底物的选择性4 2 3 4 4 反复回收4 3 3 5p e n g m i p 用于乳中青霉素残留的定量检测4 4 3 5 1p e n g m i p 对乳中青霉素的平衡吸附时间4 4 3 5 2 乳中青霉素残留的检测4 6 3 5 3m i p 对乳中不同底物的选择性4 7 4 结论5 0 5 展望5l 6 参考文献5 2 7 论文发表情况5 8 8 致谢一5 9 天津科技大学硕l ：学位论文 1 前言 1 1 分子印迹学简介 在近代科学和技术中，人们对于“接受体 和“分子识别”概念的重要性 的认识，已有了很大程度的增长。这主要是因为在现代，人们已有能力将具有 不同特征功能的分子，作为功能单元去和其他的功能分子进行组织和结合，从 而得到具有高度复杂功能的集合体。为了能在这种条件下，发展一种高度复杂 而精巧的体系，就必须将不同分子以“预定 的方式进行组织排列，从而使每 种分子都能发挥出自己的作用或功能。 当我们设计一种新的、能为未来的工业生产应用的接受体时，需要考虑下 列这些因素： 在低成本下易于进行大规模的制备； 在较宽的操作条件下能保持良好的稳定性和活性； 对于大的客体分子能实现强而有选择的键合； 能在水中和客体分子相键合。 分子印迹的方法现已发展到可方便地提供价格低廉、行之有效的各种类型 的接收体。原则上，在高分子结构中，分子运动已被冻结，因此分子印迹可以 按人们期望的方式，固定于体系之中。这种方法是相当独特的，且具有挑战性。 1 1 1 分子印迹的定义 分子印迹( m o l e c u l a ri m p r i n t i n g ) 是一种利用对特定化合物具有的预定选择 性来制备合成识别位点的技术【2 1 。以此方法得到的高聚物即为分子印迹聚合物 ( m o l e c u l a ri m p r i n t i n gp o l y m e r s ) 简称m i p 【3 1 。分子印迹技术就是利用这种m i p 对模板分子的结构和相互作用进行识别。 1 1 2 分子印迹技术的起源与概况 分子印迹技术也叫分子模板技术【4 】，最初出现源于2 0 世纪4 0 年代的免疫 学，当时p a u l i n g 首次提出抗体形成学说【5 1 ，要点是抗体在形成时其三维结构 会尽可能地同抗原形成多重作用位点，抗原作为一种模板就会“铸造 在抗体 的结合部位。这种经后人证明是错误的理论却给化学家两点非常重要的启示： 生物体所释放的物质与外来物质有相应的结合位点；生物体所释放的物质 与外来物质在空间上相互匹配。后来“克隆选择”理论否定了这一学说。尽管 如此，它却为分子印迹理论的产生奠定了基础。从那时起，科学家对生物分子 天然识别的模拟研究产生了浓厚兴趣，并由此对分子印迹进行了各种尝试。 1 9 7 2 年w u l f fg 【6 j 研究小组首次成功制备出分子印迹聚合物，使这方面的研究 产生了突破性进展。但由于他的研究主要集中在共价型模板聚合物上，动力学 过程较慢，其应用仅限于催化领域，而在分子识别领域的应用没有展开。8 0 i 前言 年代后非共价型模板聚合物的出现，尤其是1 9 9 3 年m o s b a c h 等人【_ 7 】有关茶碱 分子印迹聚合物的研究报道，使这一技术在生物传感器【8 】、人工抗体模拟【9 j o 】 及色谱固相分离 i o q 2 1 等方面有了新的发展，并由此使其成为化学和生物学交叉 的新兴领域之一，得到世界注目并迅速发展【1 3 】。目前，全世界至少有包括瑞 典、日本、德国、美国、中国、澳大利亚、法国在内的1 0 多个国家、1 0 0 个 以上的学术机构和企事业团体在从事m i p 的研究和开发。 1 1 3 分子印迹的基本原理 将带有特殊官能团的单体与大量的印迹分子，进行模板聚合反应。由于印 迹分子的存在，在聚合过程中，单体分子本身所带的官能团会根据与印迹分子 相互作用的需要，调整并形成特定的空间构象得到高度交联的聚合物。聚合结 束后通过洗脱等方法除去聚合物上结合的印迹分子，聚合物主体上就形成了与 印迹分子空间匹配的、具有多重作用位点的空穴【l4 1 。空穴中包含了精确排列 的与模板分子官能团相互补的由功能单体提供的功能基团。此三维空穴可以选 择性地重新与模板分子结合，即对模板分子具有专一性识别作用。因而，得到 的印迹聚合物对印迹分子及其它与印迹分子结构相似的客体分子具有较高的 特异性结合能力，类似于酶一一底物的“钥匙一一锁”【l5 】相互作用。这便赋 予该聚合物特异的“记忆 功能，即类似生物自然的识别系统。 1 1 4 分子印迹学基础 依据模板分子和功能单体间形成的加成物性质，存在着两种形式的分子印 迹法，即共价印迹法和非共价印迹法【i6 1 。 1 1 4 1 共价印迹法( 预组装方式) 共价印迹法主要由w u l f fg 及其同事创立【1 7 l 。在进行聚合反应以前，功能 单体和模板分子通过共价结合而相互联结，这种联结在聚合反应中保持不变。 聚合后，通过分解反应使共价键打开去除模板，得到的印迹聚合物和客体分子 相遇时，则又可形成相同的共价结合。印迹分子与功能单体以可逆的共价键结 合，此方法所采用的单体通常是低分子的化合物，此单体与印迹分子形成的共 价键键能适当，在聚合时能牢固结合、聚合后又能完全脱除。目前，使用较多 的共价作用包括硼酸酯、亚胺、西佛碱、缩醛酮、酯的螯合作用【l 引。 1 1 4 2 非共价印迹法( 自组装方式) 非共价印迹法主要由m o s b a c h 及其同事创立【”】。印迹分子与功能单体之 自j 预先自组织排列，以非共价的相互作用( 如氢键作用、静电作用、一玎作 用、疏水作用、金属一配体作用等) 实现两者的结合，其加成物可以简单的通 过引入模板分子到反应混合物中而“就地 聚合，模板抽提后，通过相应的非 共价作用，就可使客体分子被制备的印迹高聚物所捕获。非共价键法是制备分 子印迹聚合物最有效且最常用的方法【2 0 1 。但在制备m i p 及其后续过程中，一 般来讲，使用单一的作用方式制得的m i p 的选择性较低，因此大多使用多种作 2 天津科技人学硕j ：学位论文 用相互结合来制备具有高选择性和分离能力的m i p 。由于非共价键法使用超分 子作用制备仿生模型，其分子识别机理类似于天然生物分子，因此是分子印迹 技术的研究热点，发展很快。 i 1 4 3 共价与非共价印迹的杂化体系法 聚合时功能单体和印迹分子通过共价键相互作用，这样就可以获得在空间 精确固定排列的结合基团。而在识别过程中，依靠的是非共价键作用，功能单 体和印迹分子的结合离解速度较快，操作简单，适于陕速识别，并且其识别 机理和生物比较接近。w h i t e c o m b e 等【2 i 】以4 一乙烯基苯基二乙酸为单体，通过 共价键作用与模板分子形成聚合物，聚合物后经碱水解除去c o 。，进一步打开 功能单体和模板分子间的共价键，在m i p 内就产生了能识别模板分子的非共价 型识别位点。制备的这种m i p 集共价键作用和非共价键作用的优点于一体，从 而使m i p 既有共价m i p 的亲和专一性，又有非共价m i p 操作条件温和等优点。 1 1 5 分子印迹法的工作步骤 分子印迹法实验步骤的主要内容包括【2 2 】：印迹实验中所需化学品的选 择；聚合反应最佳条件的确定；印迹效率影响因素的确定。 图i - 1 为m i p 制备的一般过程，其过程包括三个步骤【2 3 】：前聚合：在 一定溶剂( 也称致孑l 剂) 中，模板分子( t e m p l a t em o l e c u l e ，即印迹分子) 与 功能单体( f u n c t i o n a lm o n o m e r ，或称配体) 依靠官能团之间的共价或非共价 作用形成模板一配体复合物；共聚合：加入交联剂，通过引发剂引发进行光 或热聚合，使主客体配合物与交联剂通过自由基共聚合在模板分子周围形成高 交联的刚性聚合物。聚合方式有封管聚合、悬浮聚合、乳液聚合、表面印迹等 1 2 4 1 。为维持良好的特定空间构型，一般需要控制较高的交联度( 通常高达8 0 ) 。洗脱去除印迹分子：采用尽可能温和的物理或化学方法，将聚合物中 占据在识别位点上的绝大部分印迹分子洗脱或解离出来，洗脱去除聚合物中的 模板分子，这样在聚合物中便留下了与模板分子大小和形状相匹配的立体孔 穴，留下印迹聚合物。 模板分子模板一配体复合物 0 一 - 配体 一 聚合物 分子印迹聚台物 图1 1m i p 制备的一般步骤 魂嵌谯 弋- f i g 1 - lt h eg e n e r a lp r o c e s so fm i pp r e p a r a t i o n i 前言 1 1 5 1 功能单体 根据单体与印迹分子作用力的大小预测，合理的选取或人为合成具有特殊 官能团的单体和基质单体，所选择的官能团单体应该能和印迹分子存在较强的 相互作用。制备共价键型印迹聚合物通常使用的功能单体是含有乙烯基的硼 酸、醛、胺、酚和二醇以及含有硼酸酯的硅烷化合物，主要有4 一乙烯苯硼酸、 4 一乙烯苯甲醛、4 一乙烯苯胺、4 一乙烯苯酚等【2 5 1 。制备非共价型印迹聚合物使 用的单体有甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯、亚甲基丁二酸、丙烯酰胺、4 一乙烯基 苯甲酸、卜乙烯基咪唑、4 一乙烯基吡啶、n 一丙烯酰胺基丙氨酸、1 3 一环糊精和 含乙烯基l 一缬氨酸的衍生物等【2 6 1 。 1 152 交联剂 交联剂的作用【2 7 】是使模板分子和功能单体形成高度交联、刚性的聚合物， “固化 单体的功能基团在模板分子周围的特定位置。提取模板分子后，形成 与模板分子在形状和功能基团定位完全吻合的“空穴 。目前应用较多的交联 剂有乙二醇二甲基丙烯酸酯( e d m a ) 、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯( t m p t m a ) 、 季戊四醇三丙烯酸酯等【28 1 。它们在有机溶剂和亲水溶剂中均可作为交联剂。 1 1 5 3 聚合溶剂( 致孔剂) 在聚合时溶剂可能影响模板分子与单体间作用的强度或者聚合反应的动 力学。目前，常用的致孔剂为乙腈、氯仿和吐温- 1 3 2 9 1 。最近，也有一些极性 溶剂如四氢呋喃、甲醇等作为致孔剂【3 0 1 。它们在分子印迹技术中的应用将极 大地扩展m i p 应用的范围。非共价型m i p 中，反应溶剂对分子间作用力和m i p 的 形态影响很大。溶剂还起着致孔剂的作用。所用溶剂对印迹分子不但应具有较 高的溶解度，最好还能够促进印迹分子与功能单体间的相互作用，至少不干扰 这种效应f 3 1 1 。所以必须根据印迹分子与功能单体间可能的作用力类型选择适 宜的溶剂。 一般地，极性强的溶剂会降低印迹分子与功能单体间的结合，特别是干扰 氢键的形成，生成的m i p 识别性能较差，故应尽可能采用介电常数低的溶剂【3 2 1 ， 如苯、甲苯、二甲苯、氯仿、二氯甲烷等。但是，也有研究采用乙腈、n ，n 一 二甲基甲酰胺、四氢呋喃、丙酮、乙酸乙酯甚至甲醇、乙醇及醇和水的混合液 做溶剂合成m i p ，此时印迹分子与功能单体主要依靠疏水作用结合【3 3 1 。受溶剂 影响，在分析中m i p 可能发生溶胀，致使结合位点的三维结构发生改变，对分析 物的识别作用减弱。为避免溶胀发生，吸附中所用的溶剂最好与聚合反应溶剂 一致【3 4 1 。 1 1 6 分子印迹技术的特点 由以上可见，m i p 具有的特点有【3 5 】：第一，预定性，即它可以根据不同的 目的制备不同的m ip ，以满足各种不同的需要；第二，识别性，即m i p 是按照 模板分子定做的，可专一地识别印迹分子；第三，实用性，即它可以与天然的 4 天津科技人学硕i ：学位论文 生物分子识别系统如：酶与底物、抗原与抗体、受体与激素相比拟。但由于它 是由化学合成的方法制备的，因此又有天然分子识别系统所不具备的抗恶劣环 境的能力，从而表现出高度的稳定性和长的使用寿命。 1 1 7 分子印迹高聚物的应用 1 1 7 1 分子印迹传感器 早期的生物传感器虽然具有灵敏度高、特异性强等特点，但其用于分子识 别元件的生物活性组分极易失活、变性，并且可供选择的生物活性组分有限， 故将其大规模地应用于生产中受到严重限制。近几年来，用印迹高聚物为分子 识别元件的传感器得到迅速发展，m i p 取代生物分子作为识别元素【3 6 。39 1 。其在 保持传感器较高的灵敏度和选择性同时，大大的提高了寿命，并且降低生产成 本，这使得在生产中大量应用成为可能。 将印迹聚合物m i p 与换能器偶合，形成m i p 传感器1 4 0 】，如图1 - 2 所示。 也可以在换能器表面直接进行聚合反应，制备m i p 传感器。分析物经扩散进入 敏感层，与m i p 特异性结合，发生物理或化学变化，经过换能器转换成可检测 的信号，完成传感器全过程。 信号 图1 - 2m i p 传感器结构原理 f i g 1 - 2t h es t r u c t u r ep r i n c i p l eo fm i ps e n s o r 1 1 7 2 分子印迹吸收剂分析法 分子印迹吸收剂分析，在许多生物模拟的应用中，代表了一种最为典型的 应用【4 。它将印迹高聚物作为天然抗体的替代物，用于免疫分析。这种实验 通常涉及分析物和一定数量标记间的竞争键合，实验中未键合的标记配体通常 正比于所加入的分析物的数量。这一技术可作为抗体一基分析的一种补充，因 为印迹高聚物在很苛刻条件下，仍相当稳定。而天然分子，如在有机溶剂或酸、 碱溶液内，或在高温条件下往往不能存活。 1 1 7 3 亲和力为基的固相萃取 分子印迹聚合物具有特效的选择性和亲和性，用作固相萃取剂，可克服生 物或环境样品体系复杂、预处理手续繁杂等不利因素，为样品的采集、富集和 分析提供了极大的方便，可用于医药、食品和环境分析样品的制备，对于痕量 5 蛰蛰 l 前言 分析有重要作用 4 2 - 4 4 】。印迹聚合物既可以在有机溶剂中使用，优化条件下又可 在水溶液中使用，与其它萃取过程相比，具有独特的优点。 1 1 7 4 分子印迹催化剂 因为分子印迹聚合物内的孔穴类似于酶活性中心，因此m i p 具有模拟酶的 催化作用【4 5 1 。通过选用适当的模板和功能单体在孔穴内可以定制出与底物结 合的结合位点和起催化作用的活性基团，这些基团以最佳取向在空间进行确定 排列。模板聚合物作催化剂时，许多情况下与用酶作催化剂相似，并且符合米 氏方程动力学。 1 1 7 5 药物手性分离与控制释放 随着药物研究的不断深入，人们逐渐认识到药物的有效成分往往具有不同 的手性性质，尽管分子式相同，但其药效不同，甚至相反。因此有必要采取适 当方法对其对映体或异构体进行拆分【4 岳4 8 1 。目前，m i p 作为吸附剂应用于药物 分子的纯手性化已经得到了比较广泛的认同，已有几个制药公司小规模地将 m i p 用于药物的分离和纯化上【4 9 5 0 1 。 印迹高聚物可以吸收大量与印迹分子结构相似的物质，可以被用来作为一 种反应性控制释放载体。通过实验，初步提出了药物控制释放机理，以某种印迹 分子为模板制得的印迹高聚物载着一定量的与该种印迹分子结构相似的药物 分子，这种聚合物在该印迹分子存在的溶液中可以加速药物分子的释放。可以 想象，这种吸附有药物分子的高聚物进入人体后，如果人体内存有该种印迹分 子，则其会同药物分子对高聚物产生竞争性吸附，从而导致药物分子的逐步释 放。当然，该高聚物是可体内降解的。 1 1 7 6 用于色谱固定相 m i p 最广泛的研究领域之一是利用它的特异识别性去分离混合物。其使用 的印迹分子范围广阔，无论是小分子( 氨基酸、药品和碳氢化合物) ，还是大 分子( 如蛋白质) ，都已经被用于各种印迹技术中，并用于h p l c 、t l c 和c e 分离中。分子印迹聚合物作为色谱固定相广泛应用于拆分外消旋体【5 。 1 1 7 7 农残分析 b j a r n ib j a r m a s o n 等【5 2 】合成了以阿特拉津为模板的分子印迹聚合物，对 氯代三嗪类除草剂进行富集提取，取得较好的效果( 提取效率7 4 - - 7 7 ) 。 1 1 8 分子印迹存在的问题与最新挑战 由于“分子印迹”是一个综合性的概念，并易于操作，虽说这一概念已经 实现，同时一些高聚物也取得了实际应用，但这一技术仍处于发展之中并存在 一些问题。 首先，分子印迹过程和分子识别过程的机理和表征问题、结合位点的作用 机理、聚合物的形态和传质机理仍然是研究者们所关注的问题。如何从分子水 平上更好地理解分子印迹过程和识别过程，仍需努力。 6 天津科技人学硕 ：学位论文 其次，目前使用的功能单体、交联剂和聚合方法都有较大的局限性。尤其 是功能单体的种类太少，以至于不能满足某些分子识别的要求，同时可以将两 种或多种功能单体放置于与模板分子相互补的位置，原则上，当有多种功能单 体同时键合一个目标分子时，则对客体的选择性有所加强【5 3 1 5 4 1 。然而迄今为止， 所使用过的印迹高聚物主要是由一种功能单体组成，这就使得分子印迹技术远 远不能满足实际应用的需要。 第三，目前分子印迹聚合物大多只能在有机相中进行聚合和应用，而天然 的分子识别系统大多是在水溶液中进行的，如何能在水溶液或极性溶剂中进行 分子印迹和识别仍是一大难题【5 孓5 6 l 。今年来化学家已将注意力指向非有机的即 水基的体系，然而在水相体系中的印迹高聚物仍很有限，其主要困难是在水中 时，溶剂会妨碍印迹的实现：在大量的水中时，模板和功能单体预组织中最 受偏爱的双键，就会因溶剂的竞争而破坏；用于水中的通用水溶性交联剂( 如 n ，n 一亚甲基双丙烯酰胺) 不能充分的增强高聚物，因此所得的高聚物在用 作固定相时，就会出现刚性不足的问题。 第四，目前能用于分子印迹的大多是像药物、氨基酸和农药这样的小分子， 而像多肽、酶