（水产品加工及贮藏工程专业论文）壳聚糖快速制备技术及降血脂、免疫增强活性研究.pdf

壳聚糖快速制备技术及降血脂、免疫增强活性研究 学位论文完成日期： 指导教师签字： 答辩委员会成员签字： o r 6 6 o 篷婆 扣侈 枷。黄 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得一 或 其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的 任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：字日期：。年6 月c 。日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，并同意以下 事项： 1 、学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许 论文被查阅和借阅。 2 、学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权清华大学、中 国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社”用于出版和编入c n k i 中国知识资源总库， 授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 导师签字： 签字日期：z p y 年。月，日 签字日期：d ，- 4 z6 月- ，1 5 1 i v 壳聚糖快速制备技术及其降血脂、免疫增强活性研究 摘要 甲壳质是自然界中含量仅将于纤维素的第二大糖类化合物，广泛存在于真 菌、酵母细胞壁及虾、蟹等甲壳类动物壳中。甲壳素的组成单糖包括2 乙酰氨基 葡萄糖和2 氨基葡萄糖，并通过d 1 ，4 糖苷键连接而成。由于天然存在的甲壳 素只溶于n n 二甲基乙酰胺l i c i 、六氟丙酮及六氟异丙醇等特殊溶剂中，极大 限制了其应用范围。通过脱乙酰化，提高其脱乙酰度，可以使之转化为在常规溶 剂，如稀醋酸中可溶的壳聚糖。壳聚糖在农业、医药、环境及食品领域有着广泛 的应用。本论文针对壳聚糖快速制备技术、不同分子量壳聚糖的功能特性及其含 量的测定方法，开展了以下工作： l 、研究了甲壳素碱熔法脱乙酰过程中单因素对壳聚糖脱乙酰化过程的影响， 结果表明，甲壳素脱乙酰化过程中投料比 m ( c h i t i n ) ：m ( n a o h ) 、反应体系 的水分含量、加热温度及加热时间对壳聚糖脱乙酰度有显著影响。通过中心组合 设计优化了甲壳素碱熔法脱乙酰化的最佳工艺条件：投料比为1 1 ，时间为2 8 m i n ， 温度为1 7 7 ，在最佳工艺条件下制备的壳聚糖的脱乙酰度达n 9 0 9 ，特性粘度 2 7 6 5m l f 1 。在此基础上，初步探讨了双螺杆连续挤压过程中挤压机的工作参 数对甲壳质脱乙酰化过程的影响。研究结果表明，双螺杆挤压机的加热温度、转 速及反应物料中碱料比对壳聚糖的脱乙酰度有显著影响，利用双螺杆挤压技术可 实现壳聚糖的连续化快速制备。 2 、利用壳聚糖非专一性水解酶制备了相同脱乙酰度、不同分子量的壳聚糖 ( 脱乙酰度度9 3 5 3 ，分子量分别为2 4 5 0 0 ，8 4 5 0 ，1 5 0 0 及6 0 0 ) ，探讨了不同分 子量壳聚糖对小鼠免疫机能的调节作用。给小鼠连续皮下注射氢化可的松建立免 疫机能低下模型，用不同分子量的壳聚糖样品灌胃模型小鼠2 8 天，分别测定小鼠 的免疫器官重量、迟发性变态反应( d t h ) 、血清溶血素水平、抗体细胞生成数、 巨噬细胞吞噬能力和碳廓清指数。结果表明，水解2 4 h ( c t 2 4 ) 的壳聚糖( 壳寡 糖) 能显著提高小鼠免疫器官的重量，不同分子量的壳聚糖均能显著提高小鼠血 清溶血素含量( 尸 0 0 1 ) ，提高迟发型变态反应水平( 砌0 1 ) ，促进巨噬细胞 吞噬能力( 氏0 0 5 ，p 0 0 1 ) ，提高碳廓清指数( p o 0 5 ，p 0 0 1 ) 。不同分子量 的壳聚糖对免疫功能低下小鼠的增强功能优于目前市场上一种存在的壳聚糖功 能食品。壳聚糖水解物与其复配后，其免疫增强功能有一定程度的提高。 3 、利用灌胃高脂乳剂的方法建立了小鼠高胆固醇血症模型，通过测定正常 小鼠、模型小鼠和灌胃不同剂量壳聚糖小鼠血清、肝脏和粪便中的甘油三酯( t c ) 和总胆固醇( t g ) 含量变化，比较了不同分子量壳聚糖对高胆固醇血症小鼠脂 质代谢的调节作用。研究结果表明，除未水解的壳聚糖组( m w 2 4 5 0 0 ) 外，其 余各组均能显著降低小鼠血清中的t c 含量( 尸 0 0 1 ) ，提高t g 含量( 火o 0 1 ) 。 各受试样品组均能极显著降低小鼠肝脏中的t c 和t g 含量( p 0 0 1 ) 。未经水解 的壳聚糖组小鼠粪便中的t c 较模型组显著升高，其余各组与模型组相比均无显 著差异。 4 、利用化学发光法测定相同脱乙酰度、不同分子量壳聚糖的体外清除活性 氧自由基的能力。结果表明，不同分子量壳聚糖均对p y r o g a l l 0 1 l u r n i n o l 体系产 生的超氧阴离子自由基( 0 2 一) 及v e c u s 0 4 酵母悬浮液h 2 0 2 体系产生的羟基 自由基( o h ) 有较强的清除作用，抑制作用随样品( 多糖) 浓度的增大而增强， 并且相对低分子量的产物比相对高分子量的产物的抑制作用有所增强。低分子量 壳聚糖降低肝脏中t g 、t c 的作用及体外抗氧化作用明显，壳聚糖及其水解产 物可以作为辅助降脂药物进行开发利用。 5 、建立了利用p m p 柱前衍生法快速测定含壳聚糖功能食品中壳聚糖含量的 方法。氨基葡萄糖的线性范围4 6 p g l 一5 0 0 9 9 l ，检出限2 2 p g l ，定量限5 0 p g l ； 标准壳聚糖的线性范围6 0p g 几6 0 0 p g l ，检出限3 0 9 9 l ，定量限6 5 p g l 。精 密度r s d = 3 0 8 3 8 0 ，回收率在9 8 2 3 - 1 0 3 0 1 之间。研究了盐酸浓度、水解温 度及水解时间对壳聚糖水解的影响，利用正交试验优化了壳聚糖的水解工艺：盐 酸浓度6 m o l l 、水解温度11 0 、水解时间1 2 h 。在最佳水解条件下，壳聚糖中 氨基葡萄糖的水解回收率为8 5 7 ；利用柱前p m p 衍生高效液相色谱测定了市 场上几种常见壳聚糖与功能食品中壳聚糖的含量。 关键词：甲壳素，壳聚糖，快速制备，免疫功能低下，高胆固醇血症，测定 s t u d i e so nt h er a p i dp r e p a r a t i o no fc h i t o s a nf r o mc h t i na n di t s i o i dr e z u l a t i o na n di m m u n o m o d u l a t o r ye f f e c t sperimentallold a t l o ndl m m u n o m o a u l a t o r ye t i e c t so ne x p e r i m e n t a l l m 1 c e a b s t r a c t c h i t i ni st h es e c o n dm o s ta b u n d a n tn a t u r a lp o l y s a c c h a r i d en e x tt oc e l l u l o s e ，a n d i so b t a i n e df r o mt h ec e l lw a l l so ff u n g ia n dy e a s ta n df r o mt h es h e l l so fc r u s t a c e a n s ， s u c ha sc r a b sa n ds h r i m p s ，a n dh a sm a n ya p p l i c a t i o n si na g r i c u l t u r e ，m e d i c i n e ， e n v i r o n m e n ta n df o o d i n g e n e r a l ，c h i t i nc o n s i s t so fc o p o l y m e rr e p e a tu n i t so f p 一( 14 ) 一l i n k e d2 - a c e t a m i d o - 2 一d e o x y 一1 3 - d - g l u c o s e a n d i s - 0 - 4 ) - l i n k e d 2 - a m i n o - 2 - d e o x y p d - g l u c o s e a sc h i t i nd i s s o l v e so n l yi ns p e c i f i cs o l v e n t s ，s u c ha sn ，n d i m e t h y l a c e t a m i d e l i c i ，h e x a f l u o r o a e e t o n e , a n dh e x a f l u o r o - 2 - p r o p a n o l ， i t s p r a c t i c a lu s e sa r el i m i t e d d e a c e t y l a t i n gc 1 1 i t i l lt oc h i t o s a n , w h i c hi n c r e a s e st h eu n i t s o fp - ( 1 - 4 ) - l i n k e d2 - a m i n o - 2 - d e o x y p d g l u c o s e ，i so n ew a yt oi n c r e a s eo fi t s s o l u b i l i t yi nn o r m a ls o l v e n ts u c ha s d e l u t eh a g t h or e s e a r c hw a sd o n ef o r e s t a b l i s h i n gaf a s td e a c e t y l a f i o nm e t h o df o rt h ep r e p a r a t i o no fc h i t o s a nf r o mc h i t i n , a n dt h el i p i dr e g u l a t i o na n di m m u n o m o d u l a t o r ye f f e c t so ne x p e r i m e n t a lm i c eo f c h i t o s a nw i t hd i f f e r e n tm o l e c u l a rw e i g h tw a ss d u i e d ，a n dt h ef a s td e c t i o nm e t h o do f c h i t i n c h i t o s a ni nf u n e t i o n a lf o o dw a se s t a b l i s h e d 1 t h es o l i d p h a s er a p i dp r e p a r a t i o nt e c h n o l o g yo fc h i t o s a nf r o mc h i t i no nh i g h t e m p e r a t u r ew a si n v e s t i g a t e d u s i n gs o d i u mh y d r o x i d ea st h ep r o n u c l e a ra g e n t ，t h e e f f e c t so f m ( n a o h ) ：m ( c h i t i n ) ，r e a c t i o nt e m p e r a t u r e ，a n dt h e r e a c t i o nt i m e o nt h ed d a n di n t r i n s i cv i s e o s i t y r do fc h i t o s a nw a ss t u d i e d t h er e s u l t so fs i n g l ef a c t o r e x p e r i m e n ts u g g e s t e d t h a tw i t ht h ei n c r e a s i n go fm f n a o h ) ：m ( c h i t i n ) ，t h er e a c t i o n t e m p e r a t u r e ，a n dt h er e a c t i o nt i m e ，t h ed do fc h i t o s a nw a sq u i c k l yd e c r e a s e d t h e o p t i m u mc o n d i t i o n sf o rt h ef a s td e a c e t y l a t i o no fc h i t i nw a ss t u d i e dt h r o u g hac c d e x p e r i m e n t a ld e s i g n ，w h e r et e m p e r a t u r e ，t i m ea n dm ( n a o h ) ：m ( c h i t i n ) r a t i o w e r e v a r i e d t h e n r e s p o n s e s u r f a c ea n a l y s i s ( r s m ) w a s a p p l i e d t o o p t i m i z e t h e d e a c e t y l a t i o nc o n d i t i o no fc h i n t i n ，a n dt h eo p t i m u mc o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w s ： i r e a c t i o nt e m p e r a t u r e ( 17 7 0 c ) ，m a s sr a t i o 1 ：1 【( m ( n a o h ) ：m ( c h i t i n ) ，r e a c t i ot i m e ( 2 8 r a i n ) u n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n ，t h ed d o ft h ep r e p a r e dc h i t o s a nw a sa b o u t 9 0 o ，a n dt h ei n t r i s i cv i s c o s i t yw a sa b o u t2 7 6 5m l 矿1 b a s e do na b o v es d u d i e s ，t h e p r o p e r t i e sc h i t o s a np r e p a r e db ys r e s s i n gm e t h o d su s i n gat w i n - s c r e we x t r u d e rw a s s d u d i e d ，a n dt h ew o r k i n gp a r a m e t e ro f t w i n s c r e we x t r u d eo nt h ed d ，v i s c o s i t ya n d i ro fc h i t o s a np r e p a r e db yt h es r e s s i n gm o t h o df r o mc h i t i nw a ss u d i e d t h er e s u l t s h o w e dt h a tt h ep a r t i c a ls i z eo fc h i t i n , t h e h e a t i n gt e m p r a t u r e ，t h em a s sr a t i o ( m ( n a o h ) ：m ( c h i t i n ) ，a n d t h er o t a t i o n ls p e e dh a ds i g n i f i c a n ti n f l u e n c eo l lt h e p r o p e r t i e so fc h i t o s a np r a p a r e df r o mc h i t i n 1 1 1 es r e s s i n gm e t h o d su s i n gat w i n - s o e w e x t r u d e rw a sa b l et or e a l i z et h er a p i da n dc o n t i n u o u sp r e p a r a t i o no fc h i t o s a nf r o m c h i t i n 2 t h ec h i t o s a n 、析ld i f f e r e n tm o l e c u l a rw e i g h tw a sp r e p a r e dw i t hn o n - s p e c i f i c a l z y m eh y d r o l y s i s ，a n di t si m m u n o m o d u l a t o r ye f f e c t so nh y p o i m m u n em i c ew a s i n v e s t i g a t e d c h i t o s a n 、丽t hd i f f e r e n tm o l e c u l a rw e i g h tw a sg i v e nt on o r m a lm i c ea n d h y p o i m m u n em o d e lm i c ei n d u c e db yh y d r o c o r t i s o n e ，r e s p e c t i v e l y t i l es p l e e na n d t h y m u si n d e x ，d t h ，h e m o l y s i nc o n t e n t ，a n t i b o d yf o r m a i n g c e l l sn u m b e r , p h a g o c y t o s i sa b i l i t yo fp e r i t o n e a lm a c r o p h a g ea n dc a r b o np a r t i c l e c l e a r a n c ei n d e x w e r em e a s u r e dr e s p e c t i v e l y c h i t o s a nw i 也d i f f e r e n tm o l e c u l a r w e i g h tc o u l d s i g n i f i c a n t l yi n c r e a s et h es p l e e na n dt h y m u si n d e x ，h e m o l y s i nc o n t e n to b v i o u s l l y ( 尸0 0 1 ) ；h e i g h t e nd e l a y e da l l e r g i cl e v e l ( p _ 0 0 1 ) ；p r o m o t et h ep h a g o c y t o s i sa b i l i t y o fp e r i t o n e a l m a c r o p h a g e ( 尸0 0 5 ， 0 0 1 ) t h er e s u l t s h o w e dt h a tc h i t o s a n h y d r o l y s a t e sc a l ls t i m u l a t eb o ls p e c i f i ca n dn o n s p e c i f i ci m m u n ef u n c t i o ni nm i c e 3 t h ee f f e c to fc h i t o s a n 、 ，i t l ld i f f e r e n tm o l e c u l a rw e i g h to nb l o o dl i p i dr e g u l a t i o n i ne x p e r i m e n t a lh y p e f l i p i d e m i am i c ew a ss t u d i e d h y p e r l i p e m i am o d e lm i c ew e r e e s t a b l i s h e db yf e e d i n gt h em i c e 诵t 1 1l l i g l lf a te m u l s i o n m e a n w h i l et h e yw e r eg i v e n t h es a m p l e s 晰吐ld i f f e r e n td o s a g e sf o r3 0d a y s t h ec o n t e n t so ft ca n dt gi ns e r u m ， l i v e ra n df e c e sw e r ee x a m i n e d r e s u l t s ：t h ec o n t e n to fs e r u mt ci nm o d e lg r o u p w a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a to fc o n t r o lg r o u p ( p o 0 1 ) ，w h i l et h em o d e lt g c o n t e n to ft h ec o n t r o lg r o u pw a ss i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nt h ec o n t r o lg r o u p ( p i v 0 o1 ) e v e r yg r o u pc o u l dd e c r e a s et h es e r u mt c ( p 0 01 ) s i g n i f i c a n t l y , e x c e p tf o r t h eg r o u po fc h i t o s a n l i v e rt ca n dt go fm o d e lg r o u pw e r es i g n i f i c a n t l yh i g h e r + t h a nt h o s eo fn o r m a lc o n t r o lg r o u p ( p 0 0 1 ) ，a l ls a m p l eg r o u p sc a ns i g n i f i c a n t l y r e d u c et h el i v e rt ca n dt g ( p o 9 9 7 ) o v e rt h es e l e c t e dc o n c e n t r a t i o nr a n g ef r o m4 6 1 上g l 一5 0 0 r t g l t h e l i m i to fd e t c t i o na n dt h el i m i to fq u a n t i t a t i o nw e r e2 2 p g la n d5 0 i _ t g l ，r e s p e c t i v e l y t h ep r e c i s i o n ( r s d ) w a s3 0 8 ，a n dt h er e c o v e r yw a sb e t w e e n9 8 2 3 10 3 0 1 t h e s a m p l ew a sh y d r o l y z e du n d e r t h eo p t i m u mc o n d i t i o no f2 m o l lh c la t110 cf o r12 h ， u s i n gh p l c 、i t l l1 - p h e n y l 一3 - m e t h y l - 5 - p y r a z o l o n e ( p m p ) d e r i v a t i z a t i o na n dv a r i a b l e w a v e l e n g t hd e t e c t i o n ( v w d ) k e yw o r d s ：c h i t i n ；c h i t o s a n ；f a s tp r e p a r a t i o n ；h y p o i m m t m e ；b l o o dl i p i dr e g u l a t i o n ； d e t e r m i n a t i o n v v i 目录 第一章文献综述l 1 壳聚糖的结构与性质1 1 1 壳聚糖结构l 1 2 甲壳素的性质一”一“一”一一2 2 壳聚糖的制备方法3 2 1 甲壳素的提取技术3 2 2 甲壳素的脱乙酰化技术0 00 000 00 0 0 0000000000 0 一3 2 3 水溶性壳聚糖制备技术”7 3 壳聚糖的检测方法7 3 1 壳聚糖分子量测定7 3 2 脱乙酰度测定o oo oooboo 7 3 3 壳聚糖含量有检测技术9 4 壳聚糖的生物活性o ooq o o 1 1 4 1 壳聚糖的降血脂作用1 1 4 2 壳聚糖免疫增强活性一一1 1 5 、论文的主要研究内容及意义1 2 5 1 论文主要研究内容1 2 5 2 论文的研究意义d ooooo iooooo 1 3 参考文献 l3 第二章壳聚糖快速制备技术研究与工艺优化1 9 v o 引言19 1 甲壳素碱熔法脱乙酰化工艺优化研究1 9 1 1 实验材料19 1 2 实验方法_ 19 。1 3 结果与讨论2 5 1 3 1 甲壳素碱液法脱乙酰化的单因素试验结果2 5 1 3 2 甲壳素碱熔法脱乙酰化的单因素试验结果2 9 1 3 3 甲壳质碱熔法脱乙酰化工艺优化结果3 1 1 4 结论3 7 2 甲壳素双螺杆挤压法连续脱乙酰工艺的初步探讨3 8 2 1 实验材料38 2 2 实验方法38 2 3 实验结果39 2 3 1 碱料比对壳聚糖双螺杆挤压法连续脱乙酰化过程的影响o eoooooo0 3 9 2 3 2 加热温度对壳聚糖双螺杆挤压法连续脱乙酰化过程的影响4 0 2 3 3 加热时间对壳聚糖双螺杆挤压法连续脱乙酰化过程的影响o oooo0 4 1 2 3 4 双螺杆挤压法连线脱乙酰化过程中壳聚糖的溶解度变化4 2 2 3 5 双螺杆挤压连续制备壳聚的傅立叶变换红外光谱( f t i r ) 分析4 2 2 3 讨论- 42 2 5 小结一- 43 参考文献4 3 第三章不同分子量壳聚糖对免疫功能低下小鼠的免疫调节作用h 4 6 v i l 引言46 2 材料与方法4 7 2 1 实验材料4 7 2 2 实验方法“：4 8 2 2 1 不同分子量壳聚糖样品的制备及其表征4 8 2 2 2 动物分组及模型建立49 2 2 - 3 对免疫机能低下模型小鼠免疫器官重量的影响”一“4 9 2 2 4 对免疫机能低下模型小鼠血清溶血素含量的影响4 9 2 2 5 对免疫机能低下模型小鼠抗体生成细胞数的影响“4 9 2 2 6 对免疫机能低下模型小鼠迟发型变态反应的影响( 足跖增厚法5 0 2 2 7 对免疫机能低下模型小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响5 0 2 2 8 免疫机能低下模型小鼠碳廓清测定5o 2 3 实验数据的统计学处理5o 3 实验结果5 1 3 1 不同分子量壳聚糖样品的制备”51 3 1 1 不同酶对壳聚糖的水解效果5 1 3 1 2 不同水解时间壳聚糖的峰值分子量q ooooo ooooooooo ”5 2 3 2 对免疫机能低下模型小鼠体重和免疫器官重量的影响5 3 3 3 对免疫机能低下模型小鼠血清溶血素水平和抗体生成细胞数的影响”5 4 3 4 对免疫机能低下模型小鼠迟发型变态反应的影响一55 3 5 对免疫机能低下模型小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响”。5 6 3 6 对免疫机能低下模型小鼠碳廓清能力的影咐一一一5 7 l x 4 讨论一一58 5 本章小结6 o 参考文献- 6 o 第四章不同分子量壳聚糖对高胆固醇血症小鼠的降脂作用6 3 1引言一一一一63 2 实验材料与方法6 4 2 1 实验材料6 4 2 1 1 实验动物6 4 2 1 2 药品与试剂6 4 2 1 3 实验仪器6 5 2 2 实验方法6 5 2 2 1 高脂乳剂的制备6 5 2 2 2 动物的分组和实验6 5 2 2 3 血清中t c 、t g 测定一6 5 2 2 4 肝脏中t c 、t g 测定6 5 2 2 5 粪便中胆固醇和总脂质的测定6 5 2 2 6 不同分子量壳聚糖的体外抗氧化实验6 6 2 3 实验数据统计学处理o oo oo ooioooo 6 6 3 实验结果6 6 3 1 不同分子量壳聚糖对高胆固醇血症小鼠血清中脂质水平的影响6 6 3 1 1 对血清t g 水平的影响6 6 3 1 2 对血清t c 水平的影响。6 7 x 3 2 不同分子量壳聚糖对高胆固醇血症小鼠肝脏中脂质含量的影响6 8 3 2 1 对肝脏t g 水平的影响”6 8 3 2 2 对肝脏t c 水平的影响o ooo oo ”一6 9 3 3 不同分子量壳聚糖对高胆固醇血症小鼠对粪便中脂质含量的影响7 0 3 4 不同分子量壳聚糖体外清除活性氧自由基效果的比较”一”一7 2 3 4 1 对超氧阴离子自由基( 0 2 ) 的清除效果一7 2 3 4 2 对超氧阴离子自由基( 0 h ) 的清除效果“7 2 4 讨论73 5 本章小结7 5 参考文献76 第五章含壳聚糖保健食品中壳聚糖含量的测定研究o o ooooooa oooooo oo0 8 0 1 引言一一”一一80 2 材料与方法8 1 2 1 实验试剂和材料8 1 2 2 主要实验仪器设备82 2 3 实验方法8 2 2 3 1 壳聚糖的纯化m 一。82 2 3 2 壳聚糖最佳水解条件的优化8 2 2 3 3p m p 柱前衍生法测定样品中壳聚糖含量8 3 3 实验结果85 3 1 壳聚糖水解条件优化结果85 3 1 1 壳聚糖水解的初步结果8 5 x i 3 1 2h c l 水解壳聚糖的单因素试验结果8 6 3 1 3 壳聚糖水解正交实验结果8 9 3 2p 柱前衍生化测定样品中壳聚糖含量9 2 3 2 1 氨基葡萄糖标准曲线与回归方程9 2 3 2 2 精密度9 3 3 2 3 回收率9 3 3 2 4 含壳聚糖功能食品中壳聚糖含量的测定9 3 4 讨论”94 5 本章小结96 参考文献“98 主要结论99 主要科技创新1o o 第一章文献综述 甲壳素( c h i t i n ) 是自然界中储量仅次于纤维素的含氮多糖类化合物，广泛 存在于节肢动物、软体动物、环节动物、原生动物、腔肠动物、海藻、真菌及动 物关节等部位，年合成量在1 0 0 亿吨左右l l 】。壳聚糖( c h i t o s a n ) 是甲壳质的脱 乙酰化产物，学名为( 1 ，4 ) 一2 一氨基- 2 - 脱氧一d 葡聚糖。壳聚糖是自然界中存在的 唯一的一种带阳离子的可生物降解的高分子聚合物，是迄今为止发现的唯一天然 碱性多糖。它能溶于醋酸等有机酸，具有无毒性、可生物降解性、良好的生物相 容性等，因此，世界各国都非常重视对壳聚糖的研究和开发，甲壳质壳聚糖已 经成为当今研究最热门的糖类化合物，并且在轻工、医药、食品业中得到了广泛 的应用。 1 壳聚糖的结构与性质 1 1 甲壳素壳聚糖的结构 甲壳素和壳聚糖的分子结构与纤维素很相近，仅是c - 2 位的取代基团有所不 同，它们的结构式如图卜1 图所示。壳聚糖是甲壳素的脱乙酰化产物，一般脱乙 酰度为5 5 以上的，可溶于1 稀醋酸的甲壳素称为壳聚糖。 f o 竺纠f 渊9 hf o h o h 斑啭雠带蝉跑希一 硼鲫 b h b h o 佣 a ：纤维素 b ：甲壳囊 l 惑妈乎惑岛乎惑岛轳旷 呐。伽k 删毗 c ：壳聚糖 图1 1 甲壳素与壳聚糖的结构 f i g 1 - 1 s t r u c t u r eo fc h i t i na n dc h i t o s a n 甲壳素在体内的生物合成，与其他多糖一样，是一个想到相当复杂的生物化 学过程。生物在合成甲壳素的过程中虽然是以n 一乙酰氨基葡萄糖单位合成的， 但在合成的同时，也发生着甲壳素的脱乙酰化，因此生物体内天然存在的甲壳素 都是部分脱乙酰化的，但脱乙酰度通常小于1 5 9 6 。只有极个别的生物中以能溶于 i h a c 的壳聚糖的形式存在。 1 2 甲壳素壳聚糖的性质 天然存在的甲壳素由于分子内及分子间强大氢键的存在( 图1 - 2 ) ，不仅使甲 壳素大分子链间存在着有序结构，导致甲壳素不能熔化，而且不溶于水和稀酸、 稀碱等常规溶剂；壳聚糖大分子链中尽管有c 2 _ n h ：的存在，但也有较强的分子内 氢键作用，仅能溶于酸性环境。尽管甲壳素和壳聚糖的应用研究不断拓展，应用 领域不断扩大，但是其较差的溶解性制约了其进一步应用1 2 1 。因此目前国内外的 研究重点已转向了溶解性强的甲壳低聚糖或其衍生物。 图1 2 甲壳录分子内的氢键 f i g 1 2h y d r o g e nb o n di nc h i t i nm o l e c u l a r 1 9 6 3 年，r u d a l l 根据x 射线衍射光谱得到的结果，提出了天然存在的甲壳 素存在着0 【、p 和仨种晶型。旷甲壳素具有紧密的组成，大多数结晶的多晶区是 逆平行链状排列，d 一甲壳素的多晶型则是平行链状排列，而丫_ 甲壳素是两条链之 问上下排列。通过i r 或x 一射线衍射等方法，可以确定甲壳素结晶类型1 3 5 1 。 2 壳聚糖的制备方法 2 2 1 甲壳素的提取 r ，仁膦 匆冷 图1 3 甲壳素在浓碱的作用下脱乙酰化反应示意图 f i g 1 - 3t h ed e a c e t y l a t i o no fc h i t i ni nc o n c e n t r a t e da l k a l is o l u t i o n 壳聚糖的脱乙酰化方法主要包括碱液法、碱熔法及酶法。碱液法是目前壳聚 3 糖生产工厂中使用的主要方法。大量的研究表明，当碱的浓度低于3 0 时，即使 增加反应温度和延长反应时间，甲壳素的脱乙酰度仅达到3 5 6 左右，产品不能 溶于h a c 等有机弱酸溶液中。在工业化生产过程中一般用4 5 5 0 的n a o h 溶液， 按液料比1 ：4 0 的比例投料，并在8 0 - 9 0 c 条件下长时间反应。因此，壳聚糖的 生产过程会产生大量的废碱液，具初步测算，每生产1 吨壳聚糖就会产生2 0 0 5 0 0 吨的碱性废水。目前，我国的壳聚糖年生产量在4 万吨左右。每年产生的废水超 过1 0 0 万吨，给我国环境污染带来了严重的压力，在提倡低能耗、环境友好型生 产的当今社会，需要创新甲壳素的工业化脱乙酰技术。 为了降低甲过素脱乙酰化反应的活化能，减少甲壳素生产过程中碱的作用 量，改善壳聚糖产品的质量，对甲壳素的碱液法脱乙酰化工艺进行了大量研究。 r f w e s k a 等人【6 】在1 3 0 的条件下，反应9 0 m i n ，用虾废料制得分子量为1 5 0 k d a ， 脱乙酰度为9 0 的壳聚糖。h o n gk y o o nn o 等人川在加压条件下，对不同时间、 不同温度、不同投料比情况下制得的壳聚糖的脱乙酰度、黏度、分子量进行了研 究，结果表明，在投料比为1 ：1 5 ，时间3 0 r a i n ，碱浓度为4 0 时可制得脱乙酰度 为7 0 。以上两种方法虽然极大缩短了甲壳素脱乙酰化反应的时间，但碱的用量 并没有减少。 为了进一步减少碱的用量，欧阳明等人【8 1 以甲壳素为原料，以异丁醇为溶 剂，氢氧化钠为亲核试剂，研究了一种制备高脱乙酰度壳聚糖的新方法。并研 究了投料比、反应温度、反应时间、反应方法等对脱乙酰度的影响。结果表明， 在反应温度为li o c ，反应时间2 5 h ，壳聚糖：n a o h ：醇= 1 ：5 ：1 2 ( 质量比) 条件下制得脱乙酰度为9 3 2 的壳聚糖。另外实验结果表明间歇法处理样品可 以在较短的时间里制备出脱乙酰度较高、相对分子质量较大的壳聚糖。曹健等人 【9 】采用微波技术制备了壳聚糖，并通过单因素试验和正交试验分析了微波反应时 间、碱液浓度、乙醇浸泡时间、乙醇浓度、微波功率对壳聚糖脱乙酰度和粘均分 了量的影响，提出了制备高脱乙酰度、高粘均分予量壳聚糖的最优条件为( 微波 功率4 6 2 w ) ：微波反应时间2 0 m i n ，n a o h 浓度5 0 ，乙醇浸泡时间2 5 h ，乙醇浓度 8 0 。在该条件下制得的