（化学工艺专业论文）从菠萝废弃物分离提取菠萝蛋白酶的研究.pdf

从菠萝废弃物分离提取菠萝蛋白酶的研究 摘要 本文主要研究了以菠萝加工废弃物菠萝皮为主要原料，分离提取菠萝 蛋白酶的工艺。 采用f i p 法检测浸提液中菠萝蛋白酶活性，实验结果表明f i p 法检测浸 提液中菠萝蛋白酶酶活是可行的，加标回收率在9 5 9 8 之间。 为了防止菠萝蛋白酶生产过程中失活，以菠萝皮和茎的提取液为对象， 研究了温度及停留时间、p h 值、金属离子种类和浓度、多元醇和糖等因素 对浸提液中菠萝蛋白酶活性的影响。在实验范围内，温度超过5 0 时菠萝 皮和茎的浸取液中菠萝蛋白酶将明显失活，在浸提液原始( 生理) p h 条件 下，浸提液中菠萝蛋白酶稳定性最好；f e 3 + 、f e 2 + 、c u 2 + 等金属离子都使菠 萝皮浸提液中菠萝蛋白酶稳定性下降，f e 3 + 的影响最大；c a 2 + 含量在2 0 m g l 一4 0m g l j 时，可提高菠萝皮浸提液中菠萝蛋白酶的稳定性，甘油 和葡萄糖可明显提高菠萝皮浸提液中菠萝蛋白酶的稳定性。 研究了用硫酸铵从菠萝皮浸提液中析出菠萝蛋白酶的影响因素。不同 p h 值下，盐浓度对菠萝皮浸提液中菠萝蛋白酶酶活沉降率的影响的研究得 出，酶活沉降率在p h3 8 7 ，盐浓度为0 3g o m l 1 时达到最大值。对不同盐浓 度下菠萝蛋白酶单位酶活变化对酶活沉降率的影响的研究表明，随菠萝蛋 白酶单位酶活的增加，酶活沉降率先增大后减小，在单位酶活达n 5 2 9 5 f - i p u m l d 大时酶活沉降率达到最大值；在单位酶活较小时，盐浓度为0 3 g m l 。的酶活沉降率大于盐浓度为o 2 5g m l j 时的酶活沉降率；在单位酶活 大于或等于5 2 9 5e i p u m l 。时，盐浓度为o 2 5g m l 。的酶活沉降率大于 o 3g m l 1 时的酶活沉降率。盐浓度对纯化倍数影响的研究得出，随盐浓度 的增大，纯化倍数呈下降趋势，在盐浓度为0 2g m l 。1 时纯化倍数为1 5 1 ， 在0 2 5 至1 j 0 3 5g m l j 趋于稳定，为1 2 8 1 左右，以后趋于递减。 研究了操作条件对菠萝皮浸提液中菠萝蛋白酶超滤过程中酶活截留 率、渗透通量和浓缩倍数的影响，不同膜切割分子量下压力对渗透通量影 响不同。膜切割分子量1 0k d ，3 0k d 在压力0 3 8m p a 时渗透通量达到最大 值，分别为4 4l m - 2 0 h 。和7 7l m - o h 一；1 0 0k d 时在压力0 2 6m p a 时渗透 通量达到最大值为8 4l m - 2 h 。p h 值对菠萝蛋白酶酶活截留率及渗透通量 有影响，在p h3 8 7 时渗透通量最高且为7 9l m - 2 0 h 。用1 0 0k d 的膜超滤1 0 2 m i n 后，酶活截留率呈一定速率下降，超滤浓缩倍数在2 0 7 至i j 2 5 3 之间较好。 从菠萝皮浸提液中超滤浓缩菠萝蛋白酶的最佳工艺操作条件为：膜切割分 子量1 0 0k d ，p h3 8 7 ，压力为0 2 6 m p a ，浓缩倍数在2 0 7 至1 j 2 5 3 之间。 由整个工艺流程提取出酶活性达3 6 2 1f i p u g 。1 的菠萝蛋白酶，酶的提 取回收率达n o 2 1 5 ( 以湿皮重计) 。超滤盐析法具有操作简单，对环境 污染小，酶活较高，酶的提取沉降率高。 关键词：菠萝蛋白酶稳定性超滤提取菠萝皮 r e s e a c hf o re x t r a c t l 0 na n dp u r i f i c a t i o no f b r o m e l a i nf r o mp n 町e a p p l ew a s t e s a bs t r a c t t h i sp a p e rd e a l e dw i t ht h et e c h n o l o g yo fb r o m e l a i ne x t r a c t i o na n d p u r i f i c a t i o nf r o mp i n e a p p l ew a s t e s ( r a wm a t e r i a l ：p i n e a p p l ep e e l ) f i pm e t h o dw a su s e dt od e t e c tt h eb r o m e l a i na c t i v i t yo fp i n e a p p l e e x t r a c t i o ns o l u t i o n ，a n dt h er e c o v e r yr a t ew a sb e t w e e n9 5 a n d9 8 b ya d d i n g t h ep u r i f i e de n z y m ei ns a m p l e s i no r d e rt op r e v e n tt h el o s so ft h eb r o m e l a i na c t i v i t yd u r i n gt h ep r o d u c t i o n p r o c e s s ，t h ee f f e c to ft e m p e r a t u r e ，t i m e ，p hv a l u e ，m e t a li o n s ，p o l y h y d r i c a l c o h o la n ds u g a r so ns t a b i l i t yo fb r o m e l a i na c t i v i t yi np i n e a p p l ep e e la n ds t e m e x t r a c t i o ns o l u t i o nw a se v a l u e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eb r o m e l a i na c t i v i t y o ft h ee x t r a c t i o ns o l u t i o nw a so b v i o u s l yd e c l i n e dw h e nt h et e m p e r a t u r e e x c e e d e d5 0 t h eb r o m e l a i na c t i v i t yw a ss t a b l ea tt h eo r i g i n a l ( p h y s i o l o g i c a l ) p hv a l u e t h es t a b i l i t yo fb r o m e l a i nw a sd e c r e a s e df o rt h ee x i s t a n c eo ff e ”， f e 2 + a n dc u 2 + ，a n di tw a se n h a n c e db ya d d i n gc a 2 + w i t hc o n c e n t r a t i o nf r o m2 0 m g l 。1t o4 0m g l g l y c e r o la n dg l u c o s es i g n i f i c a n t l ys t r e n g t h e n e dt h e s t a b i l i t yo fb r o m e l a i ni nt h ep i n e a p p l ep e e le x t r a c t i o ns o l u t i o n t h ee f f e c tf a c t o ra b o u tt h es e d i m e n t a t i o nr a t eo fb r o m e l a i ni nt h ee x t r a c t i o n p r o c e s su s i n ga m m o n i u ms u l f a t ep r e c i p i t a t i o nw a si n v e s t i g a t e d t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h es e d i m e n t a t i o nr a t eo fb r o m e l a i nr e a c ht h em a x i m u mi nt h e i i i c o n d i t i o no ft h es a l tc o n c e n t r a t i o n0 3g m l a n dp h3 8 7 t h ee f f e c to ft h e s p e c i f i c a c t i v i t y o fb r o m e l a i no ns e d i m e n t a t i o nr a t eo fb r o m e l a i nw a s i n v e s t i g a t e d t h es e d i m e n t a t i o nr a t eo fb r o m e l a i na c t i v i t yc l i m b e du p f i r s ta n d t h e nd e c l i n e dw i t ht h e s p e c i f i ca c t i v i t y o fb r o m e l a i n i n c r e a s i n g t h e s e d i m e n t a t i o nr a t eo fb r o m e l a i na c t i v i t yr e a c h e dt h em a x i m u mv a l u ew h e nt h e s p e c i f i ca c t i v i t ya t t a i n e d5 2 9 5f i p u m l t h es e d i m e n t a t i o n r a t ew a sh i g h e r w i t hs a l tc o n c e n t r a t i o na s0 3g m l 。1c o m p a r e dw i t ht h es a l tc o n c e n t r a t i o no f 0 2 5 9 m l i nt h el o wb r o m e l a i ns p e c i f i ca c t i v i t yc o n d i t i o n h o w e v e r , t h e o p p o s i t er e s u l tw a sa c h i e v e dw h e nt h eb r o m e l a i ns p e c i f i ca c t i v i t yw a se q u a lt o o r h i g h e r t h a n5 2 9 5f i p u m l t h ee f f e c to fs a l tc o n c e n t r a t i o no n p u r i f i c a t i o np r o p o r t i o nw a sa l s oi n v e s t i g a t e d t h ep u r i f i c a t i o np r o p o r t i o nw a s d e c l i n e dw i t ht h es a l tc o n c e n t r a t i o ni n c r e a s i n g ，a n dt h ev a l u ew a s15 1w i t ht h e s a l tc o n c e n t r a t i o na s0 2g m l t h ep u r i f i c a t i o np r o p o r t i o nw a sa b o u t1 2 81 w i t ht h es a l tc o n c e n t r a t i o nf r o m0 2 5t o0 35g m l ，a n dt h ev a l u eo ft h e p r o p o r t i o nt h e nd e c r e a s e dw i t ht h es a l tc o n c e n t r a t i o ni n c r e a s i n g t h ee f f e c to ft h eo p e r a t i n gc o n d i t i o n so nt h et r a p p e de n z y m a t i cr a t e ， p e r m e a t i o nf l u xa n dc o n c e n t r a t e dp r o p o r t i o no f t h eb r o m e l a i np u r i f i e dw i t ht h e t e c h n o l o g yo fu l t r a f i l t r a t i o nf r o mt h ep i n e a p p l ep e e le x t r a c t i o ns o l u t i o nw a s i n v e s t i g a t e d t h ee f f e c to fp r e s s u r eo np e r m e a t i o nf l u xw a sv a r i a n tw i t hu s i n g d i f f e r e n tm o l e c u l a rw e i g h tm e m b r a n e s w h e nt h em o l e c u l a rw e i g h tc u t t i n go f f o ft h em e m b r a n ew a s10k do r3 0k d ，a n dt h ep r e s s u r ew a so 3 8m p a ，t h e m a x i m u mo ft h ep e r m e a t i o nf l u xw a s4 4l m 。2 h 1o r7 7l m 。2 h 1 ， i v r e s p e c t i v e l y t h ep e r m e a t i o nf l u xr e a c h e dt h em a x i m u m 8 4l m - 2 h 。u s i n g10 0 k dm e m b r a n ei nt h ec o n d i t i o nt h a tt h ep r e s s u r ew a so 2 61 v i p a t h ee f f e c t so f p h v a l u eo nt r a p p e de n z y m a t i cr a t ea n dp e r m e a t i o nf l u xw e r ei n v e s t i g a t e d ，a n d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ep e r m e a t i o nf l u xr e a c h e dt h em a x i m u m7 9l m - 2 h 1 a tp h3 8 7 i ts e e m e dt h a tt h e10 0k dm e m b r a n e sw a st h eo p t i m u ms e l e c t i o n f o ri n c r e a s i n gt h ep e r m e a t i o nf l u xa n dm a i n t a i n i n gt h et r a p p e de n z y m a t i cr a t e t h et r a p p e de n z y m a t i cr a t ew a sd e c l i n e dw i t h10 2m i nu l t r a f i l t r a t i o nu s i n g10 0 k dm e m b r a n e sa n dt h ea p p r o p r i a t ec o n c e n t r a t i o np r o p o r t i o nw a sb e t w e e n2 0 7 a n d2 5 3 t h eo p t i m u mc o n d i t i o n sf o rt h ee x t r a c t i o no ft h eb r o m e l a i nf r o m p i n e a p p l ep e e le x t r a c t i o ns o l u t i o nw e r ea sf o l l o w s ：t h e10 0 k dm e m b r a n e sw e r e u s e d ，t h ep r e s s u r ew a so 2 6m p a ，t h ep hw a s3 8 7 ，a n dt h ec o n c e n t r a t i o n p r o p o r t i o nw a sb e t w e e n2 0 7a n d2 5 3 t h eb r o m e l a i na c t i v i t yw a s3 6 21 f i p u g 一1 a n dt h er e c o v e r yr a t eo ft h e e n z y m e ( w e tp e e lw e i g h tm e a s u r e ) w a s0 215 u s i n gt h eo p t i m u mt e c h n o l o g y o fu l t r a f i l t r a t i o nc o m b i n e dw i t hs a l t i n go u t t h i sm e t h o dw a se a s yt oo p e r a t e ， a p p r o p r i a t e f o rs m a l le n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o n ，b e t t e rf o rb r o m e l a i na c t i v i t y m a i n t a i n a n c ea n de n z y m ee x t r a c t i o n k e y w o r d s ：b r o m e l a i n ；s t a b i l i t y ；u l t r a f d t r a t i o n ；e x t r a c t i o n ； p i n e a p p l ep e e l v 符号说明 意义 f i p 法测定的酶试样单位酶活 每2 5m l 所用酶试液中含酶试样的质量 2 7 5r i m 处酶试样的的吸光度 酶活回收率 沉析后固体粗酶总质量 菠萝蛋白酶皮汁初始总体积 原液的单位酶活e o 盐析后固体粗酶中单位酶活 酶活截留率 截留液中菠萝蛋白酶总酶活 原料液中菠萝蛋白酶总酶活 截留液中单位酶活 截留液体积 原料液体积 渗透液体积 渗透时间 超滤有效面积 体积浓缩倍数 渗透液体积 浓缩倍数 渗透通量 膜切割分子量 i x 单位或量纲 f i p - u g 一1 g g m l f i p u m l 一1 f i p u g 一1 f i p u f i p - u f i p u m l l m l m l m l m i n m 2 m 3 l 。m - 2 0 h 一1 d 口丐 x 褂 胁 蛳 锄 y m 矿 易 乓艿 坼 日 场 所f s 巧r 以舭 广西大学学位论文原创性声明和学位论文使用授权说明 学位论文原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和相 关知识产权属广西大学所有。除已注明部分外，论文中不包含其它人已经发表过的研究 成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮 助的个人和集体，均已在论文中明确说明并致谢。 论文作者签名： 学位论文使用授权说明 力9 辟 | 多月步日 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文的研究内容； 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本； 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： 图实时发布f - 1 解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 论文作者签名：髟 新獬栌1 嘶拍 广西大学硕士学位论文 从萝菠萝废弃物分离提取菠萝蛋白酶的研究 1 1 课题背景 第一章绪论 菠萝( a n a n a sc o m o s u s ) ，又名风梨，属草本植物，是热带著名的水果。在我国主要 分布于广东、广西、福建、台湾等地。菠萝是我国南方栽培面积最广，产量较大的大众 水果之一。菠萝营养丰富，富含糖类( 果糖、葡萄糖等) 、蛋白质、氨基酸、有机酸、维 生素c 、矿物质等。其蛋白质中含有分解蛋白质的酶，称为菠萝蛋白酶。菠萝蛋白酶 ( b r o m e l a i n ) 是从凤梨科植物组织中制取分离出的蛋白水解酶组合物的总称，根据分离 提取部位的不同，分为果菠萝蛋白酶( f r u i t b r o m e l a i n ，e c 3 4 2 2 5 ) 和茎菠萝蛋白酶( s t e m b r o m e l a i n ，e c 3 4 2 2 4 ) 。18 91 年，c h i t t e n d e n 等首先用硫酸铵沉淀法从菠萝果实中分 离出了果菠萝蛋白酶。1 9 5 7 年，h e i n e c h e 等人从菠萝茎中制取蛋白水解酶，从此菠萝蛋 白酶实现了商品化生产。菠萝蛋白酶存在于菠萝植株茎、叶、果实、果柄、果皮、果芯 等部位中；菠萝植物中的茎、果实、果皮的菠萝蛋白酶含量相对较高，而果柄、果芯和 叶中的菠萝蛋白酶含量相对较少【1 】。菠萝蛋白酶富有菠萝香气，浅黄色至棕黄色粉末， 含有丰富的半胱氨酸。 菠萝是世界水果中的第六大品种，世界上最重要的菠萝产地在泰国、中国、菲律宾、 印度尼西亚、墨西哥、夏威夷、巴西和南非等国家和地区，据不完全统计，菠萝的世界 总产量早在8 0 年代就超过千万吨，在近千万吨菠萝中，以鲜果供应市场的约占六成，加 工产品约占四成。我国菠萝资源丰富，年产菠萝1 0 0 万吨以上，约有2 0 万吨菠萝皮和1 0 0 万吨菠萝茎被费弃，造成了浪费和环境污染。进入9 0 年代以来，随着国内果汁工业的兴 起和发展，在5 、6 年间，南方菠萝产区已耗资数亿元，引进了浓缩菠萝汁生产线近1 0 条， 加工菠萝能力在2 5 - 4 0 万吨年之间。水果加工过程中大量废弃的菠萝皮等下脚料，一般 要占投料的4 0 5 0 2 1 ，以往均作为废弃物丢掉，只有少部分用作饲料。从菠萝植株中提 取菠萝蛋白酶的原料有两类：一是菠萝茎、果实；二是菠萝加工的废弃物果皮和果芯。 两者都可以用于生产菠萝蛋白酶，酶产品的组成稍有不同，其功能相似。茎中的酶含量 和活力较高，最有开发利用价值，但原料的获取受到限制。菠萝加工的废弃物果皮和果 芯中的菠萝蛋白酶含量也较高，也是一种较理想的生产菠萝蛋白酶的原料。因而，利用 菠萝加工下脚料提取菠萝蛋白酶，不仅可充分利用资源，还可减少菠萝加工企业废弃物 广西大学硕士学位论文从萝菠萝废弃物分离提取菠萝蛋白酶的研究 对环境的污染。 印度和泰国由于地理优势，盛产优质菠萝，他们的蛋白酶产量大、品质好，而且产 品开发的历史较长，具有品牌效应，是我国强劲的竞争对手。泰国的g r e a tf o o dg r o u po f c o m p a n i e s 年产菠萝蛋白酶2 0 0 吨左右，是世界上最大的生产厂，其产品据称在世界市 场份额占有率高达7 0 ，泰国产的菠萝酶多采用盐析法，产品含有硫酸铵成分。国内只 有几个小厂生产，广西区内还没有生产厂，加强对菠萝蛋白酶分离提取和菠萝蛋白酶开 发利用的研究，开辟菠萝深加工增值和废弃物综合利用的新途径，无论对于菠萝产业的 发展还是对于资源的再利用，都有很重要的意义，将产生广泛的经济与社会效益。 1 2 菠萝蛋白酶的性质 1 2 1 菠萝蛋白酶组成成分及理化性质研究 菠萝蛋白酶商品为浅棕黄粉末，有特定菠萝香味。人们对菠萝蛋白酶进行了一系列 研究，发现这些蛋白酶不是单一的成分，而是由多种不同分子量和分子结构的酶组成【3 】。 茎中至少存在三种蛋白水解酶：s t e mb r o m e l a i n ( e c 3 4 2 2 3 2 ) 【4 】，a n a n a i n ( e c 3 4 3 3 3 1 ) 【4 】和c o m o s a i n 5 1 。茎酶的分子量为2 3k d 。也含有非蛋白水解酶，包括一种酸 性磷酸酶及过氧化酶；也可能含有淀粉酶及纤维素酶活性，还存在其他成分。已知的菠 萝蛋白酶及木瓜酶的蛋白水解酶在活性中心区域的氨基酸序列有很高的同一性，此结果 表明菠萝蛋白酶和木瓜酶使用相同的催化机理。但是，菠萝蛋白酶与木瓜蛋白酶具有不 同的裂解特异性【7 1 。y a m a d a 等人【8 】从菠萝果中分离出主要的生物蛋白f a 2 ，分子量为3 l k d ，是一种酸性蛋白，等电点为4 6 。h a r r a c h 等人【l 】认为菠萝蛋白酶至少存在两个组分， 分别为s b a a 和s b a b ，都具有蛋白水解活性，s b a a 的分子量约为2 3 5 5k d ，s b a b 分子量 为2 3 5 6k d 。s b a a 的等电点在4 8 - - 与4 9 之间，s b a b 等电点为4 8 。s b a a 与s b a b 具有 同样的n - 末端氨基酸系列( ii 个残基) ，果菠萝蛋白酶、茎菠萝蛋白酶和菠萝果上的主 要酸性蛋白也具有同样的n 一末端氨基酸系列( i i 个残基) 。s b a a 与s b a b 都具有高的糖 基组分，s b a a 的蛋白水解活性是s b a b 的两倍。菠萝蛋白酶是一种糖蛋白，分子结构中 含有一个寡糖分子，由木糖( x y l o s e ，x y l ) 、岩藻糖( f u c o s e ，f u c ) 、甘露糖( m a n n o s e ，m a n ) 和n 一乙酰葡萄胺( n a c e l t y l g l u c o s a m i n e ，g i c n a c ) 组成，共价连接在肽链上，i s h i h a r a 和y a s u d a 等人【9 】分别推测出了糖分子的结构。s b a a 与s b a b 是两个单酶，两者的催化性 质无关。y a s u d a 等【l o 】研究表明，菠萝蛋白酶分子结构中糖分子不是催化必需的基团， 巯基基团是菠萝蛋白酶分子催化水解活性基团。m u r a c h i i l 】等菠萝蛋白酶进行研究表明， 2 广西大学硕士学位论文从萝菠萝废弃物分离提取菠萝蛋白酶的研究 菠萝蛋白酶相对分子量为3 3 2l 【d ，等电点为9 5 5 ，分子中有4 个n 一乙酰化的氨基己糖， 含糖2 1 ，分子中有2 8 5 个氨基酸残基，含氮量为1 5 8 8 。r i t o n j a 等【1 2 】排列出了菠萝 蛋白酶主要组分的氨基酸顺序，有2 0 种氨基酸，共2 1 2 个，c 端的氨基酸为谷氨酸( g l u ) ， n 端的氨基酸为丙氨酸( a l a ) ，相对分子质量为2 3 8 2 8k d 。陈清西等【1 3 】研究认为：羧基 和羟基与酶活性无关，而氨基、巯基、色氨酸残基和组氨酸残基是酶催化活性的必需基 团。菠萝蛋白酶成分的复杂性，限制了其在生产中的应用，特别是医药领域对功能成分 的要求上，因此对菠萝蛋白酶的成分和各成分的具体功能的分析研究具有重要意义。 1 2 2 菠萝蛋白酶酶学特征研究 菠萝蛋白酶是一种蛋白质水解酶。菠萝蛋白酶的催化活性具有高效性、专一性、温 和性及酶的活性可调节控制性。菠萝蛋白酶有显著的热稳定性，能在4 0 至6 0 保持蛋白 水解活性，而其它大部分酶被破坏变性。菠萝蛋白酶最佳的蛋白水解温度范围在5 5 至6 0 之间【1 4 1 ，温度越高，酶的热失活增强，反应速度下降。菠萝蛋白酶比其它大部分酶在 不同酸度条件下有更大的有效活性范围，其在在p h 5 o ! u l o o 之间能保持稳定【l5 1 。酸性 环境中，酶反应速度下降快，在碱性下有个较宽的应用范围，酶较稳定的p h 范围在 3 5 - 4 5 。菠萝蛋白酶水解活性在p h 7 1 附近达最大值。菠萝蛋白酶易受到铜、铁等金属 离子的影响，使活性降低，而n a c l 、k c l 对酶反应影响不大，m g c l ：、c a c l ：对酶有一定 程度的抑制作用。菠萝蛋白酶也是一类巯基蛋白酶，其活性中心为巯基( - s h ) 。它的 水解蛋白活性较木瓜酶高1 0 倍以上。酶液的最大吸收波长为2 8 0n m ，0 0 5 1 浓度的酶液 在2 8 0n m 的光吸收值达0 9 8 4 。l i 等人【16 】用共振光散射光谱仪研究菠萝蛋白酶和用硫基 和羧基修饰的c d t e 纳米粒子之间的相互作用，由于该纳米粒子是水溶性且具有生物兼容 性并在碱性溶液里稳定且带有负电，当溶液p h 值低于菠萝蛋白酶等电点时，氨基离子带 有正电，因此它们之间发生静电作用而能用该装置检测( 0 0 9 - 0 9 ) x1 0 o l l - 范围 里的菠萝蛋白酶浓度。 1 3 菠萝蛋白酶的应用 1 3 1 菠萝蛋白酶在药物、食品等方面应用 菠萝蛋白酶中含有多种不同蛋白水解酶组分，多种蛋白质及多肽具有催化水解活 性。医学上认为菠萝蛋白酶是一种具有消炎及抗水肿作用的疏基酶，临床上可用作抗水 肿和消炎药，口服后能加强体内纤维蛋白的水解作用，将阻塞于组织的纤维蛋白及血凝 3 广西大学硕士学位论文 从萝菠萝废弃物分离提取菠萝蛋白酶的研究 块溶解，改善体液的局部循环，从而消除炎症和水肿。菠萝蛋白酶与抗生素及化疗药物 并用，能促进药物对病灶的渗透和扩散，它的优点是能分解纤维蛋白的大分子，但不破 坏凝血所必需的纤维蛋白原，可用于缓解心绞痛和中风治疗，也可用于各种炎症、水肿、 血肿及血栓，如支气管哮喘、支气管炎、急性肺炎、产后乳房充血、乳腺炎及视网膜炎 等，与抗菌药物并用对治疗关节炎、关节周围炎及小腿溃疡等均有效，并能治疗腹泻。 菠萝蛋白酶用于烧伤脱痂，能选择性地除去死皮，对正常皮肤无不良影响，脱痂彻底， 对治疗烧伤有重要意义。菠萝蛋白酶能够抑制肿瘤细胞的生长，降低毒素结合活性，并 能抑制热不稳定毒素及霍乱毒素的分泌效应1 1 7 】。菠萝蛋白酶能增进药物的吸收，与各种 抗生素联用能提高其疗效，并能促进营养物质的吸收。菠萝蛋白酶具有免疫刺激作用， 体内外研究表明，通过对辅助细胞的刺激作用和对t 细胞的直接抑制反应，菠萝蛋白酶 可以增强和抑s o t 细胞的免疫反应【l8 1 。目前菠萝蛋白酶制品大多数是各种成分的混合 物，其组成因不同的品种、产地及提取方法等而产生一定的差异。因此，有必要进一步 确定真正起作用的具体成分，研究更适当的提取工艺，得到专一性更强的药物。 菠萝蛋白酶在食品工业中作为一种添加剂，能分解蛋白质、肽、酯和酰胺等，可使 肉质嫩化，啤酒澄清，提高啤酒的非生物稳定性及冷贮稳定性，添加l p p m 展f f 可有明显效 果，特别是在水解蛋白制备营养口服液上有着良好的应用前景【l9 1 。菠萝蛋白酶对含酪氨 酸较多的蛋白质有很强的水解能力，用于牛肉加工中的嫩化过程，可缩短时间、提高牛 肉的适口感。在生物化学工业生产上用于干酪、明胶、水解蛋白的生产。 1 3 2 菠萝酶市场现状和前景 随着从们对菠萝蛋白酶用途不断的开发，国内外对菠萝蛋白酶的需求量逐年增多， 特别是精制的菠萝蛋白酶【2 0 1 。在医药领域，对菠萝蛋白酶的纯度要求越来越高，甚至要 明确起功能作用的具体成分，精制菠萝蛋白酶目前的市场价约为8 0 0 0 0 元千克一。我 国菠萝蛋白酶的研究和生产起步较晚，国内年产量不足1 0 0t ，大多数产品是以粗酶形式 出售，产品的附加值低。据悉，我国年需菠萝蛋白酶千吨以上，而国内生产量不足1 0 ， 市场前景广阔1 2 。 1 4 菠萝蛋白酶分离提取及稳定性研究进展 1 4 1 菠萝蛋白酶分离提取研究 1 4 1 1 三种常用的菠萝蛋白酶提取工艺 酶的分离提取一直沿用离子交换吸附，冷丙酮，酒精，无机盐沉淀等方法。国内外 4 广西大学硕士学位论文从萝菠萝废弃物分离提取菠萝蛋白酶的研究 很早就对菠萝蛋白酶进行研究，从发展过程来看，菠萝蛋白酶的提取方法有高岭土吸附 法、单宁沉淀法【2 2 1 和超滤有机溶剂提取法，各种方法比较为【2 3 】： ( 1 ) 、高岭土吸附法 压榨 高岭土吸附 菠萝下脚科+ 汁液吸附物 洗脱液压滤盐析 离心 + 洗脱液盐析物湿粗酶饼 溶解过滤沉淀 干燥 澄清液+ 湿酶+ 精品 图卜1 高岭土吸附生产工艺流程图 f i g 1 - 1p r o d u c t i o ne n g i n e e r i n ga b o u ta d s o r p t i o no f k a o l i n e 高岭土吸附生产工艺流程图如图1 一l 所示。操作要点：压榨。将菠萝下脚料洗净， 用压榨机压出汁液，加入o 0 5 苯甲酸钠防腐，迅速过滤除杂质。吸附。将汁液移入 吸附槽中搅拌，同时加入4 的高岭土，搅拌约2 0m i n ，在1 0 吸附3 0 6 0m i n ，用虹吸 排掉上清液，收集高岭土吸附物。洗脱。用1 6 的n a o h 溶液调节吸附物的p h 值至 7 0 左右，再加入吸附质量为7 9 的工业食盐，搅拌3 0m i n 进行洗脱，然后迅速压滤， 收集滤液。盐析。将压滤液收集在盐析槽中，用1 ：3 的盐酸调节p h 值至5 o 左右， 搅拌加入压滤液质量2 5 的硫酸铵，待完全溶解后，4 过夜；然后离心，收集沉淀盐 析物，即粗酶。溶解。将粗酶放入溶解罐中，加入1 0 倍水，用n a o h 溶液调p h 值 至7 0 7 5 ，搅拌使其溶解，过滤除杂，收集滤液。沉淀、干燥。在搅拌下用l ：3 的 盐酸调节上述滤液的p h 值至4 o ，静置1h 使酶析出，用离心机分离出沉淀物，冷冻真空 干燥或减压干燥即得菠萝蛋白酶精品。 高岭土吸附法生产工艺和操作都比较复杂，吸附剂用量较大( 约5 ) ，原料消耗多， 所需设备也多，酶活总回收率低( 小于5 0 ) ，但产品质量好，纯度高。由于使用高岭 土并使用盐析工艺，对环境造成污染，环保投资较大。 ( 2 ) 、单宁沉淀法 5 广西大学硕士学位论文从萝菠萝废弃物分离提取菠萝蛋白酶的研究 压榨去杂质 菠萝下脚科斗汁液澄清液 加稳定齐j加单宁洗脱 + 稳定液+ 单宁沉淀物+ 干燥 滤液酶制品 图卜2 单宁沉淀法生产工艺流程图 f i g 1 - 2p r o d u c t i o ne n g i n e e r i n ga b o u tp r e c i p i t a t i o no ft a n n i n 单宁沉淀法生产工艺流程图1 2 。操作要点：压榨。方法同前。去杂质。鲜菠 萝汁经过滤去杂。加稳定剂。将澄清液移入生产罐中，在搅拌条件下，加入澄清液体 积0 0 5 的e d t a 2 n a 、0 0 6 的二氧化硫、o 0 2 的维生素c 。加单宁。立l l ! i 入 0 1 的单宁，在4 下静置1h ，离心弃去上清液，收集沉淀物。洗脱、干燥。将沉 淀物放入溶解罐中，) b l a 2 n 2 3 倍p h 值为4 5 的抗坏血酸溶液( 或用l ：3 的盐酸，调p h 值到3 ，搅拌洗脱4 0m i n ，然后过滤，收集滤液，减压干燥或冷冻真空干燥即得菠萝蛋 白酶精品。 单宁沉淀法工艺各操作比高岭土工艺简单，原料消耗少，所需设备少，易于土法上 马。但酶回收率低，部分产品能达到食品级，由于生产中加入单宁，对环境污染大。 ( 3 ) 、超滤有机溶剂浓缩法。菠萝下脚料、汁液、澄清液、浓缩液、加有机沉淀剂、 沉淀出的粗酶减压干燥获得产品。此法利用膜分子截留原理，将小于蛋白酶分子的大部 分物质过滤除去，以达到浓缩酶液的目的。经超滤浓缩后的酶浓缩液，加入有机溶剂将 酶析出，低温干燥得到酶制品。这种方法较前两种方法操作步骤少，条件温和，降低了 酶活损失，生产和环保投入少，但所得酶制品中含有没有酶活性的杂蛋白较多，低温操 作。 6 广西大学硕士学位论文从萝菠萝废弃物分离提取菠萝蛋白酶的研究 压榨去杂质 菠萝下脚料汁液澄液液 超滤浓缩 + 浓缩液 降温 加有机溶剂 沉淀干燥 + 湿酶酶制品 图卜3 超滤法浓缩提取工艺流程图 f i g 1 - 3c o n c e n t r a t i o na n de x t r a c t i o np r o c e s sa b o u tu l t r a f i l t r a t i o nt e c h n o l o g y 超滤法浓缩提取工艺流程图如图1 3 所示。操作要点：压榨。方法同前。去杂 质。可用压滤法或离心法去杂质。超滤浓缩。将澄清液在管式超滤设备中进行浓缩， 使体积浓缩至原体积的l 5 。有机溶剂沉淀。将浓缩液降温至o 4 ，边搅拌边加入2 0 的9 5 乙醇，直至混合液中乙醇浓度为5 0 ，静置，使酶沉淀，移出上清液，即得湿 酶。干燥。将湿酶在0 下减压干燥或冷冻真空干燥即得菠萝蛋白酶精品。 高岭土吸附法和单宁吸附法均为传统的菠萝蛋白酶提取方法，提取的过程中均需要 加入化学物质将酶与非酶物质分开，从而达到分离纯化酶的目的。由于提取过程中化学 物质的加入以后难以完全分离，会影响产品的质量，从而也限制了产品的应用范围。超 滤有机溶剂浓缩法工艺需要在低温条件下进行沉析，操作成本较高。 1 4 1 2 其它相关菠萝蛋白酶提取技术研究 中国专利菠萝蛋白酶的新提取方法【2 4 】提供了菠萝加工下脚料提取菠萝蛋白酶的新 方法，用一种高分子化合物聚丙烯酸作为沉淀剂将果汁中的菠萝蛋白酶沉淀，然后沉淀 用水悬浮，调节p h 值解析，用c a 2 + 将聚丙烯酸除去，盐析后得到酶成品，整个生产工艺 操作较为复杂，形成规模生产控制难度大。中国专利菠萝蛋白酶冷冻干燥粉的制备方法 2 5 1 提供了一种菠萝蛋白酶冷冻干燥分离的制备方法，菠萝茎压榨取汁后用氧化锌吸附， 解析后进行超滤浓缩，浓缩液冷冻干燥得成品，该方法在酶浓缩提取的过程中的温度均 高于3 0 ，根据工厂生产经验，菠萝酶料液易发酸变质，酶活力损失也很大，产品质量 难以保证。而且吸附与解析操作过程繁琐，无法形成连续操作，难以进行产业化提取生 产。中国专利一种菠萝蛋白酶的制造方法【2 6 】采有菠萝茎为原料采用冷却水循环降温，逐 级离心分离，超滤膜浓缩来分离提取菠萝蛋白酶，其设备投资大，能耗高，酶活较低且 不能对除菠萝茎以外的其它菠萝废弃物有效利用。 7 广西大学硕士学位论文从萝菠萝废弃物分离提取菠萝蛋白酶的研究 在寻求新型吸附剂吸附分离方面，美国专利4 3 1 8 9 9 0 号叙述了使用特制的多孔二氧 化钛微球吸附剂，用于菠萝果和茎的蛋白酶提取。d e v a k a t e 等人【2 7 】用离子交换色谱法分 离纯化菠萝蛋白酶纯度高，适于小批量作业，难以进行大规模生产。n i e 等人【2 8 ，2 9 ，3 0 1 用金 属螯合亲和膜提纯菠萝蛋白酶，用活化的尼龙膜经羟乙基纤维素键合改性，改性后的尼 龙膜与环氧氯丙烷、氢氧化钠和硼氢化钠的混合溶液反应，再将膜分别浸入碳酸钠、硼 氢化钠和偶联剂的混合溶液和硫酸锌溶液，得到螯合锌离子的金属亲和膜，将上述金属 亲和膜上叠成膜堆，放入膜桥，蠕动泵送入t r i s - h c l 缓冲液和洗脱液，接着送入菠萝蛋 白酶溶液，然后以洗脱剂进行洗脱，得到菠萝蛋白酶。u m e s h 等人【3 l 】使用反胶束萃取从 菠萝废弃物里分离纯化菠萝蛋白酶。 中国专利菠萝蛋白酶成分【3 2 】通过快速蛋白液相层析( f p l c n ) 使用装有诸如 s p - s e p h a r o s e 的物质的柱子用乙酸缓冲液中的( 0 - 0 8 ) m 氯化钠线性梯度进行层析可以 得到好的菠萝蛋白酶蛋白的分离。张桂香等【3 3 】用盐析法提取菠萝蛋白酶进行了研究。李 兴等【3 4 】将t i o ：、黏土、s i 0 2 、c a c o 。及活性炭混合，经高温烧结，制得可用于柱层析的t i o 。 多孔陶瓷，以陶瓷柱层析结合超滤法纯化果菠萝蛋白酶，得到酶制品比活力9 3 7u m g ， 酶活力回收率为4 8 ，纯化倍数为8 。这种吸附材料化学惰性好，适用的p h 范围宽，可用 于柱层析，实现连续吸附、洗脱、再生这一层析过程，为工业化生产提供了可能性。c h e n 掣3 5 】利用磁性氧化铁微球固定聚丙烯酸吸附菠萝蛋白酶。研究表明，室温下，p h 介于3 5 范围内，菠萝蛋白酶的吸附率接近1 0 0 。在p h 7 ，以o