（发酵工程专业论文）麦角甾醇产生菌的选育及其发酵条件研究.pdf

天津科技大学颂 一学位论文 摘要 本文首先对定量分极麦角缁簿含量戆寒效滚相色落法进行了吾舅究。在选 育麦角街醇高产菌方面，以啤酒酵母t k l 5 - 9 4 - 3 3 ( al y s + p h e ) 和克鲁弗酵母 1 k 6 3 4 1 7 2 ( aa d e l e u 。) 雩# 为亲株，运麓嚣生质融台技术，得到一拣麦角搿 醇含量和生物嶷都较高的菌株t k f 3 7 。并对其培养基及发酵条件进行优化。 确定h p l c 检测麦受髫醇含量麴各项参数；色遴毒圭n u c l e o s i lo d s ( 2 5 0 m m 4 6 r a mi d ，5 “m ) ，流动相( v v ) ，甲醇：承( 9 7 3 + ) ，流速1 5 m l m i n ， 紫外检测波长2 8 2 r m a 。该方法相对标准偏差r s d 。 t k l 5 - 9 4 3 3 原生质体形成疆佳条件，酶浓度0 ，l m g m l ，酶解时间5 0 r a i n ； t k 6 3 4 1 ，7 2 原生质蒋形成最佳条件，酶浓度0 1 2 m g m l ，酶解时闯6 0 m i n 。 在最佳的原生质体形成条件下，t k l 5 - 9 4 3 3 、t k 6 3 4 1 7 2 的原生质体彤成率 帮孬叟率为鳃+ 5 ，2 6 3 ；9 7 ，7 ，3 2 1 。 以t k l 5 - 9 4 3 3 、t k 6 3 4 1 ，7 2 为亲本，通过原生质体融合得到一株媳有两 亲株优良特性的莹株t k f 3 7 ，经遗传稳定性和形态鉴定恁，确定融合予t k f 3 7 性状稳定。t k f 3 7 的麦角甾醇含量为2 1 2 ，生物量为3 7 1 1 0 0 m l 。 运用正交实验法优化出最佳荦中子秘发酵培养基组成，著研究了最继发酵 条件。激佳发酵培养基组成为，葡萄糖4 ，胰蛋自胨 ，m g s 0 4 7 i t 2 00 i ， k h ，p 0 4 3 h 2 00 - 2 。最佳摇瓶发酵条件为，培养基初始p h 5 5 ：装液量为 5 0 m l 5 0 0 m l 三角瓶；培养湓度为3 0 ；摇床转速2 2 0 r r a i n ，培养对闻3 2 h 。 麦角蹦醇含量达到2 4 ，生物照达到4 3 9 1 0 0 m l 。 关键涸：轰建甾醇；酵霉；乐生溪融合；离效滚糖色谱 天津科鼓大学硕士学健论奠 a b s t r a c t t h ep a r a m e t e r so fh i g hp e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h ym e t h o dt o d e t e r m i n ee r g o s t e r o lc o n t e n tw e r es t u d i e d ，s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a et k l 5 - 9 4 3 3 ( al y s p h e + ) a n ds a c c h a r o m y c e sk t u y v e r it k 6 3 41 7 2 ( aa d e l e u - ) w e r es c r e e n e da s p a r e n ts t r a i n s u s i n gp r o t o p l a s t f u s i o nt e c h n i q u e ，af u s a n tt k f 3 7w i t h h i 醇 e r o g s t e r o l c o n t e n ta n db i o m a s sw a so b t a i n e d a tt h es a n l et i m e ，t h eo p t i m m n m e d i u ma n df e r m e n t a t i o n p r o c e s so f t k f 3 7 w e r es t u d i e d ， t h e p a r a m e t e r s o fh p l cw e r ed e t e r m i n e d t h e o p e r a t i n g c o n d i t i o n s i n c l u d e d c h r o m a t o g r a p h i c c o l u m nn u c l e o s i l o d s ( 2 5 0 m m 4 6 r a m i d 5i t m ) ，m e t h a n o l ：w a t e r ( 9 7 ：3 ，v v ) a sm o b i l ep h a s e 淅t h af l o wr a t eo f1 5 m l m i na n d u vd e t e c t i o na t2 8 2 n m t h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i m i o no f d e t e c t i o nr e s u l t sw a sn o m o r et h a n1 a n dt h er e c o v e r yr a t ew a so v e r9 8 t h ea c c u r a c ya n d p r e c i s i o no f t h em e t h o dw e r e g o o d t h ey e a s t e e r e v i s i a e ) w i t hh i g hb i o m a s sa n dt h ey e a s t 阻k t u y v e r ow i t h h i g he r g o s t e r o lc o n t e n ti nd r yc e l lw e r es c r e e n e df o r mt e nd i f f e r e n ts p e c i e sa n d g e n u s e si ny e a s t t w oh a p l o i d st k l 5 9 4a n dt k 6 3 4 1w e r es e p a r a t e df r o mt h e t w oy e a s t t h em u t a n t sw i t ht w og e n e t i cm a r k e r s t k l 5 - 9 4 3 3 ( al y s p h e 一) a n d t k 6 3 4 1 * 7 2 ( aa d e - t e u - ) ，w e r es e l e c t e da f t e rs t r a i n st k 】5 9 4a n d1 1 k 6 3 4 1w e r e t r e a t e db ye m s 。 t h eo p t i m u mc o n d i t i o n so fp r o t o p t a s tf o r m a t i o no nt h ey e a s tt k l 5 9 4a n d t k 6 3 4 1w e r es t u d i e d u s i n g0 ，l m g h n l z y m o l y a s e t ot r e a tc e l l so ft k i5 - 9 4f o r 5 0 m i n t h ep r o t o p l a s tf o r m a t i o nr a t ew a s9 85 a n dt h e r e g e n e r a t i o nr a t ew a s 2 63 u s i n go 1 2 m g m lz y m o l y a s et ot r e a tc e l l so ft k 6 3 - 4 1f o r6 0m i n t h e p r o t o p l a s tf o r m a t i o n r a t ew a s9 7 7 a n dt h er e g e n e r a t i o nr a t ew a s3 2 1 af u s a n tw i t h g o o d c h a r a c t e l so ft w o p a r e n t s t r a i n st k15 9 4 3 3a n d t k 6 3 4 1 7 2w a so b t a i n e db yp r o t o p t a s tf u s i o n b yi d e n t i f y i n gc e l l m o r p h aa n d g e n e t i c s t a b i l i z a t i o nt e s t ，t h es t r a i nt k f 3 7w a ss t a b l ef u s a n t 飘1 e e r g o s t e r o c o n t e n t o f t h e y e a s t t k f 3 7r e a c h e d 2 1 ，a n db i o m a s s w a s3 ；l 1 0 0 m l ， t h eo p t i m a ls e e da n df e r m e n t a t i o nm e d i u m sw e r eo b t a i n e db yo r t h o g o n a l d e s i g nt e s t ，a n d t h e o p t i m a l f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r ea l s os t u d i e d t h e o p t i m m n m e d i u mc o n s i s t e d o f ( ) ：g l u c o s e 4 ，t r y p t o n e l ，m g s 0 4 7 h 2 0 0 i ， k h 2 p 0 4 3 h 2 00 2 ，a5 0 0 m l f l a s kc o n t a i n i n g5 0 m lm e d i u mw r sc u l t i v a t e da t3 0 f o r3 2 hi np h 5 5m a dt h er o t a t i n gs p e e dw a s2 2 0 r r a i n t h ee r g o s t e r o lc o n t e n t r e a c h e d2 4 t h eb i o m a s sr e a c h e d4 3 9 1 0 0 m l k e y w o r d s ：e r g o s t e r o ly e a s t ；p r o t o p l a s tf u s i o n ；h p l c 天津科技大学倾= b 学位论文 1 前言 1 1 麦角甾醇的理化性质 麦角甾醇( e r g o s t e r o i ) 最早是从麦角中提取出来的，是简族( s t e r i 0 1 ) 4 抬物 中甾醇( s t e r 0 1 ) 中的种，甾醇是一类含环戊烷多氢菲核的饱和或不饱和高分 子一元醇，在生物体内可以以游离形式存在，也可以与脂肪酸结合形成甾醇 酯。麦角甾醇结构式如图1 1 所示。 图1 1 麦角甾醇的结构 麦角甾醇化学名称为：2 2 一麦角甾5 ，7 ，2 2 一三烯一3b 醇，分子式为： c 2 8 h 4 3 0 h ，分子量为3 9 6 6 6 。常温下为固体，熔点为15 6 1 5 8 。c ，麦角灞醇 不溶于水，易溶于乙醇、石油醚、正庚烷等有机溶剂。在乙醇中结晶得片状 水合晶体，在乙醇中的紫外最大吸收峰在2 8 2 n m 附近。 麦角甾醇主要存在于真菌细胞膜上。从酵母细胞中提取麦角甾醇，在紫 外光的照射下，麦角涵醇形成维生素d 2 ，见图l 一2 。 麦角甾醇 入f ， 维生素d z 图1 - 2 维生素d 2 的形成 1 2 麦角甾醇的应用 麦角甾醇是一种重要的医药化工原料，可用于“可的松激素黄体酮” 的生产，“黄体酮”是雌性激素之一，“可的松”具有抗炎症、抗过敏、抗病 毒、抗休克等药理作用，临床上多用以控制严重中毒性感染和风湿病等。麦 第一章籍喜 角甾醇逐是维生素d z 的煎体。维生素d 2 在调节生命代谢功能上有重要作用。 它可以撼高人体和动物钙磷的吸收，促进骨路的形成。若摄入量不足，会产 生严重的缺乏瘸，如婴儿的佝偻病、老年人的骨质疏松病等。 我鞫入口众多，j l 蠢佝偻瘸发病率很高，3 岁以下婴儿平均患病率为4 07 ，北方各省达5 0 以上，其中内蒙古离达8 7 。据美阑r d a ( r e c o m m e n d e d d a i l y a i l o w a n c e ) 推荐静标准，l 邀食用绥生素d 2 量4 0 0 i u 天( 约1 0 9 9 天) ， 若中国每年有1 0 0 万婴幼儿按上述标准服用维生素d 2 的话，中国国内仅婴幼 j l ，一年簸需婺维生素d 2 3 4 5 魄。 我国老年人口( 6 0 岁以上) 有一亿多人，据中国医学会1 9 9 5 年调查，老年 嚣倭蔬松病恚者有6 0 0 0 多万人。美警r d a 搀荐，若放每天每天掇人t o g g 豹 维生素d 2 ，可明显降低老年患骨质疏松病的危险。若按1 0 0 万老年人服用维 ，童素d 2 计算，簿年嚣缀生素d 2 4 0 0 穗。这撵，援，l 童帮老年入豹维雯索d 2 的年需求量就接近8 0 0 吨，而我国目前实际年产量只有5 0 7 0 吨，每年需进 强大量维生豢矜2 以用予药蜀蟊生产婴j l 保毽食晶。勇势，维生素d 2 还哥偿 饲判添加剂，提高家禽的孵化率和产蛋率。 因此，迸一步提毫我国麦霸籀酶穗维生素转2 装产羹兵毒萋黉戆享圭会效盏 和经济效益。 1 3 麦角甾醇戆生产 国内外生产囊角甾醇主要粟阁微生物发酵法，发酵所用的菌种主要有酵母 蘩、麴霉、毒霉藏等。w e n c k 】袋露麴霉蘩生产赛角掰醇，麦是泌酵含爨占缨 胞干重的2 ，2 3 ，s a v a r d 肚噪用青檬菌生产麦角甾醇，产缀达细胞干重1 8 我国在2 0 楚纪8 0 年代末出中科院微生物艇等单位开始硬究应用黪母莹 发酵法生产麦角甾醇，躲得成功，但是生产成本较高。目前国内生产凌角淄 醛鲍主要厂家见豪表l 。l ，生产攘标大致为，麦角 醇产量为细胞于重螅o + 8 1 2 ，酵母生物量( 干重) 为3 4 1 3 1 袭1 - 1 国内麦角甾醇生产厂家简介嘲 天津科技大学硕上学位论文 国内厂家生产规模均较小，这其中很重要的一个原因是技术陈旧，无法 规模生产，生产成本居高不下，赢利能力微弱。为了解决生产中的技术问题， 一是要选育高产麦角甾醇的优良菌株，二是要改进现有的提取工艺，使收率 上升，三是要综合利用废酵母、废菌丝体。 1 4 麦角甾醇的合成机理1 5 j 麦角甾醇的生物合成是一个多酶参与的复杂过程。麦角甾醇的合成过程是 以乙酰辅酶a 为起始物质，经鲨烯( s q u a l e n e ) ，到羊毛甾醇( 1 a n o s t e r 0 1 ) 最后形 成麦角甾醇，麦角甾醇合成的详细结构见图1 3 ，其生物合成可分为三个阶段， 其合成途径如下： 1 由乙酰辅酶a 合成二羟甲基戊酸( m e v a l o n a t e ，m v a ) 乙酰辅酶a ( c o a ) 。乙酰z l 酰辅酶a ( c o c o a ) 一羟甲基戍二酰辅傅 a ( h m g - c o a ) 呻二羟甲基戍酸( m v a ) 眦一c o a 还原酶 h m g c o a 还原酶有两个同工酶h m g l p 和h m 9 2 p 。研究表明，8 3 的 h m g c o a 还原酶的活性可以归因于h m g l p 。在只有h m 9 1 p 时，软脂酸( c 1 6 ：1 ， a 9 ) 是限速反应的正调节物，而麦角甾醇是负的调节物。在只有h m 9 2 p 时， 油酸( c 1 8 ：l ，a9 ) 是限速反应的正调节物，而麦角 _ = ；醇是负的调节物。h m g l p 合成的反馈调节受二羟甲基戊酸( m v a ) 水平的作用。 在简醇和血红素营养缺陷突变体中，添加6 一氨基乙酰丙酸，使细胞的血 红素重新恢复活性，会导致鲨烯一2 ，3 一氧化物和2 ，3 ，2 2 ，2 3 鲨烯氧化物的出现在 以葡萄糖存在下而无乙醇时，同时，h m g c o a 还原酶的活力上升5 倍，在乙 醇出现时，血红素刺激甾醇合成的能力消失。这可能是h m g c o a 还原酶对 乙醇敏感的原因。 2 由二羟甲基戊酸( m v a ) 转变成鲨烯 i v i v a p5 磷酸m v a 叶5 焦磷酸m v a 异戍烯( 醇) ，一 焦磷酸酣( i p p ) 二甲基烯丙基焦磷酸值( d p p ) 拨牛儿( 醇) 焦磷酸 酯法呢( 醇) 一枣磁酶i 妻暖酯一鲨烯鲨烯台成酶 有研究表明，用l o v a s t a i n 抗生素抑制h m g c o a 还原酶活性，结果导致 编码鲨烯合成酶的m r n a 水平上升，这可能是二羟甲基戊酸( m v a ) 调节鲨 烯合成水平。厌氧的条件下，过量的甾醇阻遏鲨烯合成酶和鲨烯环氧化酶的 合成。鲨烯合成酶受到甾醇的抑制，其中，麦角甾醇对鲨烯合成酶的抑制强 度是无烷基化的甾醇的4 倍怕】。 第一章蘸言 3 鲨烯环化成醚母固醇( 麦角掰醇的前体) ，进而转交成麦熊濒醇 糕褊卦氧化酗 4 娑瓣亩鼗糕- - 2 , 3 - - 氧纯翳i 磊i 尹零毛簦嚣面毒，4 二攀蒸- 篷警 一8 。1 4 ，j 4 兰烯醇_ n 4 ，4 ：甲基酵母督醇一酵母圈醇一粪甾醇 f_鼠g24熨l。2se r g s 1 画i 童t 位聋稗面i r 焘角- - 5 , 7 , 2 4 ( 2 8 ) 三烯醇1 i 西r 旋角一5 , 7 , 2 2 , 2 4 ( 2 8 ) 墨灏群二i 麦角搿臻 l i w q 鲨精强氧诧酪罐纯鲨臻生黢鲨爝2 ，3 一氧讫貔，需要氧分孑鹣参麓，这说 明氧气怒麦角甾醇合成的底物之。缺少不饱和脂肪酸，鲨烯坏氧化酶的活 性下降。不蠢缝橡静餐酵对酶谲节翡强浚不蠢，禽有e 2 2 不缝帮帮c 2 4 擎基恍 基团的筠醇能使鼬醇合成量降低5 0 。c 2 4 ，2 5 一环氧羊毛掰醇也能使细胞内生 黪淄醇合成量减少4 9 峰l 。 麦角掰醇合成途径中酶活性的调节，除了和囱身代谢终产物和中间产物有 关羚，还巍盘红素，鼹媵酸，磷建鲍我澈毒羞寮韬的联系，瞧是宅织之闻翡 调节机制还有待进一步的研究。 1 5 麦角； 醇生物合成途径畜关綦因熬磷宠 麦角甾醇合成途径怒真菌所特有的代谢途径，且和高等动物及人的胆固 黪合成途径有羞赢度楣似牲，在遗传学上，其瑷论侩臻缀突爨。在医学土， 人们常常利用真荫细胞缺少麦角甾醇无法生长的特性，寻找能抑制麦角甾醇 台成的药物。因此，在基因水平上，对合成麦熊描醇的备萃孛酶的进行磷究成 了众多科研者关注的热点，并己取得了很大的谶展。 e r g 9 编码魄蛋白为鲨烯合成酶，催化2 分子焦磷酸法昵酯形成麦角 ； 醇 生物合成途径中第一个圈醇分子，是麦角甾醇合成的直接前提。有两券实验 室克隆到了e r g 9 ，在辉家的研究当中e r g 9 的营养缺陷型需$ b 充麦角鲻醇 和有氧生长条件，用含e r g 9 的质粒转化大肠杆菌，导致大肠杆菌内麦角简 醇的合成，e r g 9 包含1 个开放阅读框，编码4 4 4 个氨基酸的蛋白质，蛋白分 子量为5 i7 0 0 ，该基因在入与酵母之间高度保守，位于第| 染色体上。 e r g i 编码产物为鲨烯环氧酶，浚酶为需氧酶，催化鲨烯转化为2 , 3 环氧 谶烯，利翊该酶对丙烯胺敏感的特性克隧到了e r g l 基因“，经分析发现， e r g l 基因包含1 个开放阅读框，编码1 个4 9 6 氮基酸的爱白质，位于第 天津科技人学硕士学位论文 z - 。一9 9 ”。 7 ，7 、。99 一。_ _ - _ 。f ：；7 v ，气旷卜9 ”9 一y 吖吖广 5 删 m叫l i m l 一 。= 噎一 i i m一。一c 第一章前言 e - - - - - - - - - - - - - 一 图1 3 麦角甾醇合成结构图 染色体上。 e r g 7 编码的蛋白产物为羊毛甾醇合成酶，先后在热带假丝酵母 ( c a l b i c a n s ) 平n 啤酒酵母( s c e m v i s m e ) 中克隆到该基因】，e r g 7 包含1 个 2 1 9 6 b p 的开放阅读框，编码7 3 2 个氨基酸的蛋白质。e r g 7 位于第染色体 上。 e r g i i 编码产物为羊毛甾醇1 4d 去甲基化酶即细胞色素p 4 5 0 ，催化羊毛 甾醇1 4d 氧化脱甲基作用。k a l b 等从酵母中克隆到该基因【l “，它含有单一的 丌放阅读框，编码5 3 0 个氨基酸的蛋白质，e r g l l 被破坏的菌株需补充麦角甾 醇及有氧生长条件。目前已经分别从高等植物、真菌、哺乳动物【l3 】体内克隆 出p 4 5 0 基因并测序分析，所有的p 4 5 0 都含有5 0 0 6 0 0 个氨基酸残基，多序 天津攀 拔大学磺士学位论文 列联配结果袁明高等植物、真菌、哺乳动物之间脊3 5 4 2 的序列同源性， p 4 5 0 还是许多抗嚣菌剂的作用靶位，对p 4 5 0 基因及其产物静研究将为抗真 菌新药的研发提供理论依据。 e r g 2 4 编鹃的蛋自产物是c 1 4 还原酶，催纯4 ，4 二甲基一艟甾 - - 8 ，1 4 ，2 怔三烯醇还原为4 ，4 一二甲基酵姆甾醇。e r g 2 4 包含1 个1 3 1 4 b p 的 开放游读柩，缡筠4 3 8 个氮基酸静蛋自质，蛋自蕊分子萋为5 06 1 2 秘j 。该基 因在染色体上的位鬣尚未确定。 e r g 2 5 编码的蛋叁产物为c 4 霾醇荦鏊氧化耱，m b a r d 等入蓄宠在簿灌 酵姆中克隆到了该基因l i “，e r g 2 5 突变体在菌体内积累4 ，4 - - 2 2 甲基酵母甾 酶，e r g 2 5 对予簿溪酵母生长是必霉静。e r g 2 5 包含蕈一开敦澜读框，缡鸦 3 0 9 个氨基酸的蛋臼质，存在于第染色体上。 e r g 6 缝鹳熬产物为c 一2 4 晕蒸伍酶，存在予檀物秘舞蓥中，继亿赘薄甾 醇c 2 4 位甲基化彤成2 8 碳的甾醇结构，c 2 4 位甲基化对形成正常细胞膜是 必霰的f l ”，e r g 6 突变俸怼放线蘩醺敏感，对割霉莹素獒获蛙，对e r g 6 突 变体必需补充色氨酸。e r g 6 具单一开放阅读框，编码3 8 3 个氨基酸的蛋白质， e r g 6 定位在第慰缭色体二。 e r g 2 编码的撩白为c - 8 固醇异构酶，催化粪淄醇转化为上位f = ；醇，该酶 是抗真菌蕊甥吗臻毂终罚款位【l ”。基困龟食单一玎藏阕读框，缡娼2 2 2 个氨 基酸的蛋白质。e r g 2 定位于第x h 染色体上。 e r g 3 镶妈懿蛋白产物为c 一5 聪筑酶，镁他上位滔醇还原为麦螽 - - 5 ，7 ，2 4 ( 2 8 ) - - - 烯醇。e r g 3 存在于动物、植物、真菌中，包含单一开放阅 读撰，编码3 6 5 个氮基酸的蛋白威。e r g 3 对s c e r e v i s i a e 蛇生长鼹非必嚣躲。 e r g 3 定位在第x 染色体上。 e r g 5 编码的碾自产物为c 一2 2 圆醇脱氯酶，催化麦角5 ，7 ，2 4 ( 2 8 ) - - 爝醇 还原为麦角一5 ，7 ，2 2 ，2 4 ( 2 8 ) 翻烯醇。该酶是麦角甾薄生物合成过程中第二个细 胞谯素p 4 5 0 超家族蛋白质成员，与哺乳动物细胞色素p 4 5 0 相似【l ”。e r g 5 包含单一开放阅读框，编码5 3 8 个氨基酸的蛋自腰，定位在第瑚染色体上。 e r g 4 编码的援白产物为c 2 4 固醇还原酶，是麦角淄醇生物台成过程中 最爝一个酶，催化簸终合成麦角简醇，序列分析袭明e r g 4 与e r g 2 4 十分相 似，有很高同源性l ，e r g 4 包含单一开放阅读撼，编码4 7 3 个氨基酸的蛋 白质，位予第染穗体上。 综上所述，麦角甾醇生物合成途径中相关结构基因的序列和存在位点已 基本弄清麓，这褥为通过纂因工程手段获得高产瀣角铺醇菌株和抗真菌蕊物 设计提供理论指导。 攀一章翦言 1 6 微生物麦角鬟醇菌株选育概狨 国外对麦角简醇产生菌的筛选主要集中在6 0 年代，主要为比较自然界中 不同种属真菌的麦角甾醇含量。研究发现，酵母和某些丝状真菌( 如青攥和曲 霉等) 中震角甾醇含量较高。p r u s s 等对五个酵母属的1 3 种菌麦角甾醇含量的 测定，发现啤酒酵母麦角甾醇含量较高，在2 4 左右，其他四个属的含量均 在0 2 o j 3 ，e u g e n e 等对5 5 8 株不同稀属辩母菌瓣研究 圭i 得到类似的结 果，以后酿酒酵母便成为主要的研究对象l ”j 。 謦内在麦煮甾醇产謦三菌静蠡然； 选上，氇开震了积极静研究。1 9 9 0 年， 奠湘筠等【2 i 】测定了3 3 株酵母菌的麦角甾醇含量，其中两株酿酒酵母的凌角甾 辩含量麓达4 3 3 秘3 + 3 。1 9 9 9 年，张薅斓等1 2 毯分孝厅了i 6 7 稼不丽耱、藩 酵母菌的麦角甾酾含量，发现不同种、属问差异很大，最高可达细胞干蘑的6 ，虽鬣豹其毒0 。3 。 研究中还发现，麦角潲醇含屋高的菌株往谯生物量偏低，生长周期长， 不吴有生产馀蹙。科硬王露者穆这类蘧椿露生长餐、，圭锈量嵩瓣萤拣滋行杂 交，以求得到两糟兼顾的生产菌株。张博润等口2 j 通过属j 旬原生质体融合构建 了薅个裹产麦受 ；= 醇魏黪母萤馋基晶系y e f 一2 1 、y e f 2 9 ，它织蒸奏嚣装拣熬 优良性状，其中y e f 一2 1 的麦角鲻醇综台值( 麦角f j 醇含嚣生物量) 分别是 疆愿始豢拣懿1 5 4 和l ，5 5 焙，麦受篷醇含量为3 。0 7 ( 麦受辎辩矮量7 细戆 煎量) ，生物量为2 4 9 1 0 0 m l ，熬有一定的实际应用价慎。 还鸯部分科磷人员尝试运躁多耪理化诱变手段来掇寒鹭生蓠熬麦热掰醇 含成能力。王纪等【2 3 1 通过1 0 k e v 低能氮离子注入酵母菌l 至筛选后获得高产菌 拣y a l 耱y a 2 ，麦角甾酶提毫蠛廑达6 0 ，在生物量为7 ；3 9 l 瓣情况下，麦 角 ；! 醇含奄在3 3 左右。张沧桑等1 2 4 j 通过h e n e 激光照射啤酒酵母菌，得到 一栋s 9 ，川麦角甾醇含量为细胞干重的2 2 6 ，生物量为1 6 9 1 0 0 m l 。 虽然从文献报道来肴，麦角锱醇高产菌的选育工作已经取得了较大的发 震。但是枣实上，几乎所有文献提到的筛选方法部是隧机筛选，在筛选方法 上没有突破。随机筛选怒指菌种经经诱炎处理艏，进行平板分离，随机挑取 单菌落，对所挑出的菌落逐个梭测，以确定产量变化的赢低，从中筛选赢产 菌株。麦角甾醇的测定方法一般为“皂化，萃取紫外分光光度法”整个过程需 爱4 h 左右时间。由于各种理化诱变方法所产生的突变是随机的，其突变频率 般为1 0 0 l o 一，且多数突变椿为负商突变，所以正向突交频率就更低了。 以麦角 醇的检测时间的冗长和正向突变率低的规律来看，凡欲邋过随 枫筛选栗得到高产菌，冀育种工作量，会大的惊人，这凡乎是不可麓实现的。 育种工作中另一种方法为理性化筛选，理性化筛选意指运用遗传学，生 天津瓣技大学锻：b 学位论文 物化学的原理，根据产物已知或可能的生物合成途径代谢调控机制和产物分 子结构来避行设计和采角一些筛选方法以打破微生物原有的代谢调控机制， 获得能大爨形成产物的高产突变株。 麦角甾醇韵肖种悉路可以鼠三个方瑟送行，一是增加前髂物的合成，麦 角甾醇合成的前体物是乙酰辅酶a ，为了得到较多的麦角甾醇，必须提高乙 酝辅酶a 豹量。柠檬酸合婊酶篷纯乙醚麓酶a 翻革酰乙酸缩合形成柠檬酸进 入三羧酸循环( t c a ) 。选育柠檬酸合成酶活力低的菌株可以减少乙酰辅酶a 遗入t c a 豹釜，爝热乙酸辅酶a 静稷熏。 二是解除菌体自身的反馈抑制。在费角甾醇合成途径中，如果能解除麦 旁瓣酶对强g c o a 还激酶、鲨游台戒懿懿季謇麓，爨绥麓膜中袭角漆簿静吉 量可获得较大提高。 三是运爱嚣生屡傣融合技术，穆蠢然爨中照已存在豹麦焦辫醇含鳖裹赘 菌株同生物量高的菌株细胞融合。构建这两种特性兼具的优良菌株。 l 。7 麦受警薅发酵壤莠基磷究援溅 1 7 1 碳源 e u g e n e 等瘸丸萋孛其它碳源代餐麓莓狳，发瑗纂糖可谈绸照予簇有鼹漤鸯鬟， 但嶷角甾醇含量基本不变。综合考虑细胞生长及凌角甾醇含量，麦芽糖怒较 好购碳源。建们避硬变了蘩莓糖浓度熬影嚷，没农发褒明显鲍住矮。两s t a r t 的研究表明，甾醇的生物合成与葡萄糖的浓度成爪比( 2 ”，王纪等f 2 3 】发现不同的 碳源褥到的葚俸量有缀大麓异，酵母在麦芽糖佟羰源的塔蓁基中生长最好， 但麦角简醇的积累较少：而蔗糖最有利于酵母生产麦角；_ 孚；醇，在不同蔗糖浓 度下，缨煦生物量及麦角掰醇含羹有一定菱异，随着糖浓度的提离，生物量 有所提高，但与糖的增加不成比例。而谭天伟等弘6 j 研究认为低浓度蔗糖可使 酵母生物鬟有所增加，但麦角甾醚含量基本不变，两高浓度蔗糖反面使麦角 甾醇古量下降。可见，对不同的菌种来说，都有獒最适的碳源及浓度。 1 7 2 氮源 氮源对菌体生物量及凌角甾醇含量的影响，因微生物种类而异。w e n c k 等的研究表明氮源对费希尔曲霉麦角甾醇的合成影响很大，丽e u g e n e 等分别 用( n h 4 ) 2 s 0 4 、n a n 0 3 、藤索及酪擞白求解物作为氮源，发现对酿酒酵母麦角 甾醇含量没有明显的影响。国内此方面的研究结果也不尽相同，有的认为氯 讫铵有利于奇异酵母麦角掰醇的合成；有的认为添加氮澈可提离红曲霉菌体 生物量，币i 单位细胞麦角甾醇含量则没有明显变化【2 7 ：| 。莫湘君等川研究发现， 酿酒酵母产麦角滏薛量随饕( n h 4 ) 2 s 0 4 添秘量的增加丽减少，而酵母生耪麓却 随潜增加。潭天伟等 2 6 i 发现，当氮源为n a n 0 3 或牛肉膏时，菌体中麦角酾醇 第一犟蘸言 含量较离，但生物量较低，而采用蛋白膝或( n h 4 ) 2 s 0 4 时生物量较大，但麦受 甾醇含量较低。刘海滨等口司在研究1 抹产麦角辆醇奇异酵母( s a c c h a r o m y c e s p a r a d o x u s ) 时发现n h 4 c i 有利于麦角甾醇的合成。张博润等【2 2 j 研究认为随着 ( n h 4 ) 2 s 0 4 和尿索的添加及浓度的提高，酿酒酵母细胞生物量和麦角弼簿含量 均明显降低，尤熊尿素的影响更加突出。因此，对不同的菌种而言，氮源的 影蛹氇楚不同静。 1 7 3 其它营养因子 钱寿裰【2 9 1 酪究了不瀚碳氮魄下，酵母生长中麦燕籀醇鲶含蕊差异。采用 的菌种为面包酵母，在所用的培养基中加入了簧芽汁，培养温度2 8 3 2 。c ， p h 4 0 7 。0 ，毽们懿磷嚣结栗曼示，最往磺氮魄为4 0 0 0 ：i ，就时，酵母中麦 角甾醇古量占细胞干重的3 0 5 。但文献没有提到发酵的生物燎。 c ，a r n e z e d e r 秘w a 。h a m p e l t 3 。1 3 h 分澍颐究了在碳瓣袋割、氮源袋翱裒磷 源限制的培养基中生长速率对酵母中麦角甾醇的积累的影响。所用的菌种为 酸灌酵母，发酵滋菠3 0 ，p 珏 纛4 5 ，避气量2 v v m 。魏靛憨磅究结鬃显示： 在碳源限制的培养基中，酵母中麦角甾醇的含量随着稀释率的增加而降低， 生甥量最大为1 4 3 9 l ，发热肇醇含量最大戈1 1 。e 趱g ；奁氮派艰铡懿壤姜基 中，麦角甾醇的含量随着稀释率的增加而增加，麦角甾醇的最大比合成速率 失2 m e d g 于缨鼹熊，生物量最大为6 。8 9 l ，麦负辎醇含量最大必1 5 。9 m g g 。在 磷源限制的培养簇中( 葡萄糖为碳源，c p = 4 5 4 ：1 ) ，在稀释率小于o 0 8 h 。时， 隧羞稀释搴载增攘，细臌内麦蹙缀醇含爨睫之减夺，藤撩释率大于戴整时， 燮角甾醇含量随之增加；麦角箔醇的最大比合成速率为2 4 m g g 干细胞，h ，生 物量最大为7 。o g l ，麦角甾醇食爨最大为1 2 。4 m g g 。 杨新华阎采用淀粉水解液作为碳源，玉米浆作为氮源对生产高麦缃甾醇 酵母工艺进 亍了研究。所用菌秘为酵母麓( y g 6 0 5 ) ，发醭温度2 8 3 9 。c ，p h 值5 6 5 8 。最终发酵水平：麦角伯醇含登2 o 以上。k t o d a p 埘和e j o h n i 3 4 】 研究了磷对酵母生长的影响，他们认为酿酒酵母生长所需的最少的磷为5 t 和2 0 m gp g 干细胞。 1 8 麦角掰醇发酵条件研究概况 1 8 1 培养时间 酵母细胞麦角甾醇的食量与培养时间的关系爱多种因素的影响。b r e j v i k 的研究认为酵母细胞麦角箱醇含麓与墙养时间硪正相关。然而e u g e n e 等的研 究则指出，酵母细胞麦角甾醇含照与发酵时间的关系受菌种、培养基成分的 彩确。陈裣生的磉究表鞠，不同麓抹产麦角甾醇蓬最商蜂对闻不同譬”。酵母 轰角甾酵含量与培养时间的关系受菌种、培养基成分等多种因紫的影响，不 天津科技大学硕士学位论文 同菌秽麦焦甾醇最寒峰时间不同。研究还发现，黪母缨黪中麦焦_ l ；醇翡含量 和菌体生物量有一定程度的负甥关，即麦熊甾酵含量惑的，毯体生物攫馕低； 丽生物曩赢的，麦角甾醇含量又较低。因蕊，最饿发酪条 牛的确定既要考虑 麦角甾醇含量又要考虑蕴体生物量。 1 8 。2 溶氧 m a g u i g a n 等【3 5 】在研究礅包酵母时得出结论：麦角甾醇的合成是有氧代谢， 酵母在通气良好的条件下生长，能合成大量的袁角甾醇。而在厌氡条件下， 细胞不能合成甾醇环。当将酵母细胞从厌氧条件转移至有氡生长条件，则促 进麦角甾醇的合成，同时伴随着其合成早期的h m g - - c o a 还原酶活性的提 高。l u s u k 等的研究也寝明氧有助于麦角蹒醇的合成f 3 。麦角甾醇的合成具 有需氧化谢的特征，酵母对溶氧的要求较高，通气艇增大可明履提高生物摄， 同时也有利于麦角弼醇的积累，而在厌氧条件下，细胞麦角甾醇合成受到抑 制，当将酵母细胞从厌氧条件转移，到有氧生长条件，则促进麦角甾醇的台 成。 1 8 3 温度 对予一般的酿酒酵母，5 0 ( 2 是死亡温度，而3 0 + c 是菌谇生长的最往温度， t 瓷是酵母缅胞内涵醇的最佳合成温度，在4 5 5 0 。c 培养酵母，酵母基本上 不生长1 3 8 1 。在低温下发簿，辞蹲菌体量将减少，而缅胞内铺醇和内脂的含量 却萋本不变。温度簧低，菌体登和缅稳内搿醇帮类脂酌含餐都将下降，甚至 停盎生长。 1 8 4p i t 壹 酵母菌遴行繁蹙匏环境虚量微酸性，最适p 餐为4 。5 5 5 之阔。侄鄹使 在p h 2 ，5 时，酵母慧仍能繁蓬。逶常青铵梭离子静培养基中由于铵校离子镀 酵母吸收，发酵液的p 壬 篷褥睫之降低，p 鞋僮黔降低将减疆酵母落静生长速 度，骏性过大甚至镁蕊髂荐止生长。 1 9 本文疆究熬意义帮内容 维生素d 袭调节人体l 弋落过程中起着非掌蓬要数 乍用，然酵母缨脆中提 取麦角籀醇，经紫钋光照射转变为缨生素d 2 ，是工业上生产v 。的主要方法。 段翦，我国v d 行业主要困莹秘发酵水平低和提取工艺落压，使维生囊d 不褥 不依赖进口，v 。市场潜力巨大，选密毫产麦角辍醇菌株，对于提裹企业经济 效益，增强企业国际竞争力及发展民族v d 工业都燎有羹大意义。 因此，本课题的主要任务是选商优良高产麟张，并对其培菸条件进行优 化，为进一步的产业化开发打好基础。 第一章前言 本课题的主要研究内容包括： 1 】研究h p c c 法检测麦角甾醇的参数。 2 】从不同种属的酵母菌中筛选麦角甾醇含量高的亲株和生物量高的亲 株，将两亲株分离单倍体，进行原生质体融合，筛选出具有两亲本优 良性状的融合子，并对其进行鉴定。 【3 对选育获得的麦角甾醇高产菌，运用正交实验优化出最佳种子培养基 和发酵培养基组成，并研究摇瓶发酵培养条件。 天津科技大学预士学位论文 2 材料和方法 2 1 材料 2 1 1 菌种 供筛酵母 啤酒酵母、清酒酵母、奇异酵母、热带假丝酵母、产瓶假丝酵母、解旨假丝酵 母、红酵母、裟璃酵蹲、克鲁弗酵母、毕赤酵母 融合亲秣 t k 3 5 9 4 3 3 ( al y s 。p h e 。) ( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i x i a e ) t k 6 3 4 1 7 2 ( a a d e l e u ) ( s a c c h a r o m y c e sk l u y v e r i ) 标准亲株 酵母摹倍体y - 2 ( a ) 、y - 4 ( 8 ) 2 1 2 主要仪器设撂 5 舞是动发酵罐德赠b ，b r a u n u v 3 0 0 0 紫外分光光痰计 | 三| 本岛津( s h i m a d z u ) 公司 7 2 l 型分光光凄诗四川分板仪器厂 裹效渡媚色避仪 日本岛津( s h i m a d z u ) 公司 卜一2 l b 型高速冷冻离心机美国b e c k m a n 公司 p m - - 4 6 0 分撕天平瑞士m e t t l e r 仪器公司 m k 2 0 0 空压机 意大利t i g e r ( t a i w a n ) 公司 高压蒸汽灭菌锅上海医用核子仪器厂 h y g + 回转式恒温调速摇床上海医药技术研究所 电热恒温培养箱上海华联理化器材厂 超净工作台苏州净化设备公司 o l y m p u s 双目光学照微镜日本进口 s b a 生物传感分析仪山东省科学院研究所 p h 计 梅特勒。托狷多仪器公司 2 1 3 主要试剂 葡萄糖j 京亿工厂 蔗糖天津市亿学试麓一厂 可溶性淀粉浙江菱潮纯工试裁厂 酵母漫出粉上海酵母厂 胰蛋自繇上海东海制药厂 麦角灞醇缝晶出中科院徽生物骚提供 z y m o l y a s e 酶 日本邀口 第一章材料与方澶 k o h n a o h h c l 酒石酸钾钠 3 , 5 二硝基水杨酸 乙醇( 无水、9 5 ) 正庚烷 e d t a 一巯基乙醇 尿素 l h 巢醇 c a c 0 1 n a c i 挺c l h 3 p 0 4 k 2 h p 0 4 k h 2 p 0 4 ( n 如) 2 s 0 4 m g s 0 4 n a n 0 3 2 1 。4 楣关溶液 天津化学试剂三厂 北京化工厂 北京化工厂 北京化工厂 北京西中化工厂 j 2 京化工厂 北京化工厂 天津市化学试帮厂 上海试剂二厂 j t 京化工厂 主海试剂二厂 天津塘洁邓中化工厂 天津市耱沽化学试剂厂 天津甫塘法化学试剡厂 天津市双庆试刹厂 天津化学试荆六厂 天津化学试剂六厂 南开化工厂 天津化学试刹一厂 天津化学试剂六厂 1 ) s t 溶液：i m o l l l 山梨醇，o ，0 1 m o l l t r i s h c i ( p h 7 5 ) 2 ) s t c 溶液：s t 溶液中加入o o l m o l l c a c l 2 3 ) p t c 溶液：3 5 p e g 一4 0 0 0 ，o 0 1 m o l t r i s h c i ( p h 7 4 ) ，o 0 1 m o i l c a c l 2 4 ) 溶壁酶( z y m o l y a s e ) 混合液：s t 溶液1 0 m l ，o 0 5 m o l le d t a ( p h 7 5 ) 0 2 m l ， z y m o l y a s e1 m g ，过滤除菌，4 傈藏 2 i s 培养基 斜面傈藏培养基( g l ) 活纯斜西培养基( g l ) 初始种子培养基( l ) ： 钥浆发酵培养蓦( 彩乙) ： 最佳秽予培养基( g l ) 葡萄糖2 0 ，蛋自黥2 0 ，酵母粉1 0 ，琼脂2 0 ，p 自然 葡萄穗2 0 ，酵母粉lo ，硫酸镁l ，磷酸二氢镪2 ，尿 素4 ，硫酸铵4 ，琮黯2 0 ，硝自然 葡莓糖2 0 ，酵母粉i 0 ，蛋白黥2 0 ，p h 6 0 麓莓糖8 0 ，酵母粉1 0 ，硫酸镁l ，尿素2 ，蘸骏铵3 ， 磷酸二氢钾6 ，磷酸钠2 p h 6 。0 葡萄糖2 0 ，酵母粉1 0 ，蕊酸镁】，p h 5 5 天津科拄大学顺：卜学位论：曼 最佳发酵培养綦( g l ) ：葡萄糖2 0 ，蛋国胨1 0 ，硫酸镁l ，磷酸二氢钾2 ，p h 5 5 完全壤棼基( g i ，) ：羲萄塘2 0 ，蛋白胨2 0 ，酵母膏l o ，琼脂2 0 再生完全培养基( 昏，l ) ：葡萄糖2 0 ，蛋白胨2 0 ，酵母膏i o ，琼脂2 0 ，山梨醇】8 2 ， p h 5 5 再生完全培养基软琼脂( g l ) ：葡萄糖2 0 ，蛋白胨2 0 ，酵母膏l o ，