（食品科学专业论文）固定化酶的制备与酪蛋白合成类蛋白的研究.pdf

摘要 固定化酶可以提高酶的稳定性并增加酶的使用次数，以及容易与产物和底物分离等优点 而被广泛深入的研究。但目前常用的固定化方法在制各同定化酶时酶活损失较大，且载体常 常不可重复使用或载体的再生操作复杂，限制了同定化酶的产业化应_ f j 。本文针对目前固定 化酶方法的不足之处提出了相应对策并对新的酶同定化方法和l 载体进行了探索。 本文选用a l c a l e 碱性内切酶平胰蛋白酶作为固定化对象，它们是一种米源广泛的蛋白 酶，在食品、轻纺、医学等领域有着广泛的应用。 研究了磁性飓q 纳米粒子、活性炭及f e 3 0 d 活性炭复合粒子作为载体采用吸附法制 各固定化酶。三种载体吸附酶活力比较：o f e 3 0 d c f e ，0 4 。沉降速度恰好相反。 以纳米f e 3 0 4 纳米粒子和活性炭粒子为原料，用化学表面修饰技术使f e ，0 4 粒子和炭粒 子表面功能化，将乙二氨基以共价键方式偶联在阳0 4 粒子币i 炭粒子的表面。制备出纳米高 分子络合剂。以此络合剂作为载体制备同定化酶。试验确定这两种载体固定化a l c a l a s e 碱性 内切酶和胰蛋白酶的同定化条件和固定化酶的性质。 采用液相沉淀法在磁性f e 3 0 4 纳米粒子的表面包覆了一层s i 0 2 膜制备磁性较强的纳米 f e 3 0 d s i 0 2 复合粒子，作用此载体制备固定化酶。通过试验确定这两种载体同定化a l c a l a s e 碱性内切酶和胰蛋白酶的固定化条件。 采用正硅酸乙酯与n - ( ，一氨乙基) 氨丙基三乙氧基硅烷在油包水形成的微胶囊中同步 水解的方法，一步法制备了氨基化的二氧化硅颗粒，这种颗粒大小均匀氨基含量和颗粒大 小可控。此颗粒经戊二醛处理后，采用共价法固定a l e a l a s e 碱性内切酶和胰蛋白酶。固定化 酶热稳定性，p h 耐受性，贮存稳定性都明显高于游离酶表明此颗粒可作为一种优良的酶 固定化载体。但是重复使用性不高，而且不易分离。 研究了a l c a l a s e 碱性内切酶和胰蛋白酶对酪蛋白的水解效果。采用三因素二次正交回归 设计。对水解反应中p h 、温度( t ) 、酶底物浓度比( 【e 】【s 】) 、三个因素对水解度的影响建 立了回归模型。通过f 检验，t 检验和应用验证，说明通过二次旋转正交回归设计建立的模 型不仅较好地反映了蛋白水解反应体系运行的真实规律。而且与实际情况吻合较好。a l c a l a s e 碱性内切酶水解酪蛋白时，三个因素对水解度的因子贡献率是：1 p h 【e m s 】，其是优水解 条件为： e ，【s 】= 2 5 ，p h 毋5 、t = 5 0 。胰蛋白酶水解酪蛋白时，三个因素对水解度的因 子贡献率是：t p h e 】【s 】，其最优水解条件为： e l s = o 4 、p h - - - 8 3 、t - = 4 5 c 。 研究了类蛋白反应中p h 、温度( t ) 、酶- 底物浓度比( e m s ) 、底物浓度四个因素对合成 率的影响，通过正交试验和级差分析可知：影响a l e a l a s e 内切酶催化合成类蛋白的产率的主 次关系为：p h 给酶量( 酶与底物比) 温度 底物浓度。确定类蛋白合成的最佳工艺条件为： p h = 5 、旧 s - - 2 、温度为4 0 、底物浓度为4 0 * , 4 ，类蛋白合成率为7 1 4 。影响胰蛋白酶 催化合成类蛋白的产率的主次关系为：p h 给酶量( 酶与底物比) 温度 底物浓度。确定类 蛋白合成的最佳工艺条件为：浓度4 0 * 4 、温度4 0 、p h 值= 5 ，l e s = o 5 ，类蛋白合成 捅螫 率为6 4 3 7 。 对类蛋白的起泡性与泡沫稳定性，乳化性与乳化稳定性进行了研究，并就几种冈素对类 蛋白物质的功能特性的影响进行了讨论，从结果可以看出，类蛋白物质的功能特性都有了一 定程度的改善。 关键词：固定化酶；酶水解；酪蛋白；类蛋白 s t u d i e so np r e p a r a t i o no fi m m o b i l i z e de n z y m e a n dp l a s t e i np o l y m e r i z a t i o nb yc a s e i n a b s t r a c t t h ei m m o b i l i z e de n z y l l l e sh a v em o r es l a b i l i t y , m o r eu s et i m e sa n de a s i e rs e p a r a t i o nf r o m s u b s t t a t ea n dv r o d u e tt h 8 1 1e n z y m e sj nb u l ks o l u t i o n b u tc u r r e n ti m m o b i l i z a t i o nm e t h o d sh a v e m a n yd i s a d v a n t a g e s , s u c h 够m u c he n z y m ea e t i v i l yl o s ea f t e ri m m o b i l i z a t i o na n dh i g hc o s t s o o n l yaf e wi m m o b i l i z e de n z y m e sh a v eb e e nu s e di ni n d u s t r yw i d e l yt h o u g he n z y m ei m m o b i l i z a t i o n h a sb e e ns t u d i e df o ra b o u tt h i r t yy e a r s i no r d e rt or e s o l v et h e s ed i s a d v a n t a g e s ，n e we n z y m e t i c r sa n di m m o b i l i z a t i o nm e t h o d 5n e e dt ob ee x p l o r e d i nt h i sp a p e rw ep u tf o r w a r df n l e s o l u t i o n sa n ds y n t h e s i z e d5 目e l b lk i n d so f n e w z y m ec a r r i e r s w ec h o o s ea l e a l a s ea n dt r y p s i na si m m o b i l i z e do b j e c t a l e a l e s ea n dt r y p s i na r ep r o t e a s e s w h i c hh a v eg r e a ti n d u s t r i a la n dm e d i c i n a lp o t e n t i a l f e r t i f e r o a so x i d en a n o - p a r t i c l e s ，n a n o m e t g l c a r b o nn a n o b e a d sa n df e ，0 以c o m p o s i t e p a r t i c l e sw c i eu s e dt om a k ep r e p a r a t i o nf o ri m m o b i l i z e de n z y m e a e t i v i t yo fa d s o r p t i o n ：c f e 3 0 4 c f e 3 0 4s p e e do f s e d i m e n t a t i o n ：f e 3 0 4 f e 3 0 c c e t h y l e n e d i a m i n ew a sr e a d i l yo b t a i n e db yn a n o m e t e ri m l b o nn a n o b e a d sa n df e r r i f e r o l l so x i d e n a n o - p a r t i c l e sm o d i f i e dw i t hs i l a n ec o u p l i n ga g e n t , a n dt h e nf u n e t i o n a l i z e d t h ec o m p l e z a t i o n a d s o r p t i o n sw e r eu s e dt om a k ep r e p a r a t i o nf o rj m m o b i l i z e de n z y m e t h ec o n d i t i o n sa n dc h a r a c t e r s o f i m m o b i l i z e da i c a l a s ea n di m m o b i l i z e dt r y p s i nw c i es t u d i e d as i l i c af i l mw 8 5c o a t e do n t ot h es u r f a c eo ff e r r i f e r o n so x i d en a n o - p a r t i c l e sw i t ht h em e t h o d o fc h e m i c a ld e p o s i t i o n c o m p o s i t ep a r t i c l e sw b 口 eu s e dt om a k ep r e p a r a t i o nf o ri m m o b i l i z e d e l l z y l l l e t h ec o n d i t i o n so f i m m o b i l i z e da l e a l a s ea n di m m o b i l i z e dt r y p s i nw e r es t u d i e d s i 0 2p a r t i c l e sc o n t a i n i n ga m i n eg r o u p sw e r es y n t h e s i z e db ys y n c h r o n o u sh y d r o l y s i so f t e t r a e t h y l o r t h o s i l i c a i ef f e o s ) a n d 州2 - a m i n o e t h y l ) - 3 a m i n o p r o p y l t r i m e t h o x y s i l a n e ( a e a p s ) i n w om i e r o e m u l s i o no ft f i t o n x - 1 0 0 c y c l o h e x a n e a m m o n i u mh y d r o x i d es y s t e m t h eo b t a i n e d p a r t i c l e sh a v ear l l a r r o wd i a m e t e rr a n g e a n di t s s i z ec a nb ec o n t r o l l e db ya d j u s t i n gw a t e rt o s u r f a c l a n tm o l a rr a t i oa n dw 衙t ot e o sa n dr e a p sm o l a rr a t i o a t t e rt r e a t e db yg l u t a r a l d e h y d e ， a l c a l a s ea n dt r y p s i nw e r ei m t n o b i l i z e do nt h ep a r t i c l e sb yc o v a l e n tm e t h o d a l la b o v ei n d i c a t et h i s k i n do f p a r t i c l ec a nb ea g o o de n z y m ei m m o b i l i z a t i o nc 口r i e r e f f e c to f a l c a l a s ea n dt r y p s i no nh y d r o l y s i so f c a s e i nw a ss t u d i e d t h er e g n e s s i o nr e v o l v i n g o r t h o g o n a la n dt r o p i c a ld e s i g nw a d o p t e dt os t u d yt h ee f f e c t so f a c t o r so nd e g r e e so f h y d r o l y s i s ( d h ) a n da m u t h m a t i c s m o d l e w a s b u i l t f - t e s t t - t e s t a n d a p p l i c a t i o n t e s t w j 口- e u s e d t o v e i l f y t h e n 】 m o d l e t h er e s u l t si n d i c a t e dt h et e s t i n gg o o d n e s so ff i t t h ec o n t r i b u t i o no ft h r o ef a c t o r st od ho f a l c a l a s ew i l l st e m p e m t o r e p h v a l u e 【e h s t h eo p t i m u mo fc o n d i t i o no fa l c a l a s ew a s b a t t e n e d ，t 5 0 ；【e l i s ，2 5 ：p h ，9 5 t h ec o n t r i b u t i o no f t h r e ef a c t o r st od ho f t r y p s i nw a s t e m p e r a t u r e p h - v a l u e e i s t h eo p t i m u mo fc o n d i t i o no ft r y p s i nw a sb a t t e n e d ，t 4 5 ；【e 】【s 】，o 4 ；p h ，8 3 1 1 1 ec a s e i nw a sh y d r o l y z e db yu s i n ge n z y m e s 。a l c a l a s ea n dt r y p s i n a f t e rt h ep l a s t e i n p r o d u c t i v i t yo fc a s e i nw a ss y s t e m a t i c a l l ys t u d i e dt h r o u g ho r t h o g o n a lt e s td e s i g n t h ee f f e c t t so f f o u rf a c t o r st op l a s t e i np r o d u c t i v i t ye f f i c i e n c y w a ss t u d i e d t h ef o u rf a c t o r sa r et e m p e r a t u r e ， p h - v a l u e ，【e s 】a n dc o n c e n t r a t i o no fs u b s t r a t e t h ec o n t r i b u t i o n o ff o u rf a c t o r st o p l a s t e i n p r o d u c t i v i t yo f a i c 2 l a s ew p h ) 【e 1 i s t e m p e r a t u r e c o n c e n t r a t i o no f s u b s t r a t e 1 1 他o p t i m u mo f c o n d i t i o nw a sb a t t e n e d ，p h ，5 0 ；【e 【s 】，2 t e m p e r a t u r e ，4 0 c ，c o n c e n t r a t i o no fs u b s a a t o ，4 0 a n dp l a s t e i np r o d u c t i v i t yi s7 1 4 t h ec o n t r i b u t i o no ff o u rf a c t o r st op l a s t e i np m d u o d v i t yo f t r y p s i nw a sp h ) 【e s ) t e m p e m t u r e ) c o n c e n t r a t i o no fs u b s i r a t e mo p t i m u mo fc o n d i t i o nw 鸥 b a h e n e d ，p h ，5 o ；【e 】【s 】，o 5 ，t e m p e r a t u r e ，4 0 ( 2 ，c o n c e n t r a t i o no fs u b s t r a t e ，4 0 0 4a n dp l a s t e i n p r o d u c t i v i t yi s6 4 3 7 s o m em a j o rf u n c t i o n a lp r o p e r t i e so fp l a s t e i nw e r es t u d i e d ，w h i e hi n c l u d e df o a m i n g , f o a m s t a b i l i t y , e m u l s i f i c a t i o na n de m u l s i f i c a t i o ns t a b i l i t y s o m ef a c t o r se f f e c t i n go np l a s t e i np r o p e r t i e s w e r ea l s od i s c u s s e d 1 1 1 ep l a s t e i nr e a c t i o na l s op r o v i d e sam e t h o dt oe x p l o i tu e wf o o dr e s o u r c e s a n dr e b u i l do t h e rp r o t e i n s x e yw o r d s ：i m m o b i l i z e de n z y m e ；e n z y m eh y d r o l y s i s ；c a s e i n ；p l a s t e i n i v c a n d i d a t e ：l ub o s p e c i a l i t y ：f o o ds c i e n c e s u p e r v b o r ：v i c e p r o f f e n gz h i b i a n 研究生学位论文独创声i w 和使用授权书 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。掘我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 l 蕉! 垒旦超直墓丝益要挂别直盟丝：奎拦亘窒2 或其他教育机构的学位或证 书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：屈彼嗍冲彳月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解 密后适用本授权书) 学位论文作者签名：力砭刀殳 导师签名：搋彪 日期：忍矽年彳月名日 日期：砷年月咖，。u 1 前言 1 1 固定化酶技术 酶是由生物体产生的具有催化能力的蛋白质。它能够催化构成细胞代谢的所有反应，生 物体内的各种化学反应均是在酶催化下进行的。同一般的催化剂相比，酶的催化效率一般是 无机催化剂的数百万倍以上，生物酶专一性很强，一种酶往往只对某一类物质具有催化作用 和产生一定产物。而且其催化作用的条件要求也非常温和，可以在常温、常压下进行，又有 可调控性。在人类历史上它的应用很早就已经开始，而且日益广泛，或者用于工农业加工 生产革新工艺，或者用于医药治疗，用于分析化验，同时它也是基础科学研究的一种重要 对象和有力武器。因此，在食品加工、饲料生产、医药和化工等领域有广泛的应用 f 力。虽 然酶在生物体内能够催化许多化学反应，但用作工业催化剂仍存在缺陷。由于酶是由蛋白质 组成，其高级结构对所处的环境十分敏感，所以它有一个突出的缺点就是稳定性较低，从而 给酶的分离、制备、应用以及回收带来了一定的困难，进而限制了酶在酶促反应中的广泛应 用。 2 0 世纪6 0 年代发展起来的酶固定化技术既克服了上述不足，又在一定程度上保持了酶 特有的催化活性，固定化酶的出现，为酶的应用开辟了新的前景。 日前固定化酶的研究己经涉及到生物学、生物化学、酶化学、发酵工程、生物化学工 程、有机化学、合成化学、催化化学、高分子化学、化学工程、医学及药物等各个学科领域。 我国在固定化酶的研究方面，也取得了不少成绩。特别是把染料工业中使用的双功能试剂对 b 硫酸酯乙砜基苯胺引入固定化领域，用于多种多糖载体与多种酶共价结合成为颇具我 国特色的固定化方法；另外，我国还成功研制出了用固定化大肠杆菌酰胺酶裂解青霉素生产 6 - a p a 的新方法，不仅大大简化了操作，而且使6 - a p a 的生产成本下降了三分之一以上( 千 烟一朗，1 9 8 1 ) 1 2 固定化酶技术的研究现状 1 2 1 固定化酶的定义及优点 酶在水溶液中，一般很不稳定，作为催化剂，酶液只能一次性地起作用若是用于医学 或化学分析领域，酶必须很纯，如此一次性使用，必然耗资很大。为了克服这种缺点，人们 开始探索将游离酶与不溶性载体联结起来，使之成为不溶于水的酶的衍生物同时又能保持 或大部分保持原酶固有的活性，在催化反应中不易随水流失。这样制备的酶，曾被称为水不 溶酶( w a t e r - i n s o l u b l ee n z y m e ) 、同相酶( s o l i dp h a s ee n z y m e ) 等。后来发现，一些包埋在凝 胶内或置于超滤装置中的酶本身仍是可溶的，只是被限定在有限空间不能自由流动而己。 因此在1 9 7 1 年第一届国际酶工程会议上，正式建议采州“州定化酶”( i m m o b i l i z e de n z y m e ) 这一名称。所以，固定化酶，是指经过物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失，而又 能发挥催化作用的酶制剂。 与游离酶相比，固定化酶具有下列优点( 禹邦超1 9 9 5 ) ：( 1 ) 固定化酶可以多次使用， 而且在多数情况下，酶的稳定性提高因而单位酶催化的底物鼙大增，用酶颦火减亦即单 位酶的生产力高。( 2 ) 同定化酶极易与底物、产物分开，因而产物溶液中没有酶的残留，简 化了提纯工艺，产率较高，产品质量较好。( 4 ) 固定化酶的反应条件易于控制。可以装柱( 塔) 连续反应宜于自动化生产，节约劳动力减少反应器，i 地面积。( 5 ) 比游离酶更适合于多 酶反应体系。( 6 ) 辅酶同定化和辅酶再生技术将使同定化酶和能量再生体系或氧化还原体 系合并使用从而扩大其应用范嗣。经过三十多年的研究和发展，固定化酶技术己取得了长 足的进步先后开发了多种性能多样的载体材料( 禹邦超等，1 9 9 5 ) ，取得了丰硕的成果。 酶的催化作用主要表现为酶蛋白质和底物的相互作用，即酶的催化作用是靠其活性中心 完成的，这个活性中心具有不同功能的两个位基组成，一个是参与酶催化反应的反应配基或 称催化配基；另一个是控制酶反应底物特异性的特异性配基，或称结合配基。这两个配基由 教个氨基酸基团构成，并保持酶所具有的高级结构。当酶的活性中心的氨基酸基团或其高级 结构发生变化时酶的催化作用便下降，底物的特异性等性状也会改变。冈此，为保持酶的 催化作用，并使酶的活性中心的氦基酸基团同有的高级结构不受剑损害，在制备制定化酶时t 需要在非常严密的条件下进行。同时还应该注意，酶蛋白质的功能团如游离的氨基、羧基、 半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酩氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基等参与反应的可 能性。当这些功能团处于酶的话性中心时，要求其不参与酶的同定化结合。此外，由于酶蛋 白质的结构是韶氢键、疏水键、离子键等弱键来支持的，所以在酶的同定化过程中，必须避 免州高温、强酸、强碱等处理而且有机溶媒、高浓度盐类也会使酶变形、失活。因此，操 作应尽量在非常温和的条件下进行。 1 2 2 酶的固定化方法 经过三十多年的研究和发展，固定化酶技术己取得了长足的进步，先后开发了多种同定 化方法和性能多样的载体材料( h u a n g 1 9 9 7 ，h u s s a i n ，2 0 0 1 ，邱广亮等1 9 9 9 ，卢冠忠等， 2 0 0 3 ) 取得了丰硕的成果，目前常用的酶固定化方法有以下几种： 1 载体结合法：将酶固定在非水溶性载体上。 2 交联法；酶与双官能团试剂或多官能团的试剂进行交联反应。 3 包埋法：将酶包裹于凝胶的微小格子或半透膜聚合物的超滤膜内。 2 1 2 2 1 载体结合法 载体结合法在同定化酶的制各中是一个最古老的方法。有关这个方法的报道也是多，选 择载体时应注意：载体粒子的大小；三维网状结构表面积的火小；亲水性基团的多少； 化学组成。 一般讲载体的亲水性基团越多，表面积越大，单位载体结合的酶量也越大，因而所制 备得到的高活力问定化酶也最多。载体结合法，根据结合的形式不同，可分为共价结合法、 离子结合法及物理吸附法。 所谓共价结合法，就是将非水溶性载体表面上的反应基团和酶蛋白分子上的功能团以化 学共价键的形式连接，以固定酶的方法。由于酶与载体间近接牢同不易发生酶脱落，有良 好的稳定性及重复使用性，成为目前研究最为活跃的一类酶 i i i i 定化方法。这种方法在已报道 的载体结合法中展为多见。其常j j 载体包括天然高分子( 纤维素、琼脂搪、淀粉、葡萄糖凝 胶、胶原及衍生物等) 、合成高聚物( 尼龙、多聚氨基酸、乙烯顺丁烯二酸酐共聚物等) 和 无机支持物( 多孔玻璃、金属氧化物等) 。采用这种方法时，酶与被结合在载体上的官能团 是：a 一氨基或一氦基；a 一、b 一和y 羧基：巯基或羟基；咪唑基：酚基。这些 官能团和各种重氦盐类、酰胺叠氮，异氰酸盐或活性卤代烷等进行反应。因此，当给载体和 酶以适当的反应条件，这些富有活性官能团的载体便与酶结合而制备成固定化酶。根据其结 合形式，可把问定化酶的制备方法分为重氮法、肽法、烷化法三种类型。 共价结合法与离子结合法和物理吸附法相比。控制条件苛刻反应激烈操作复杂，常 常冈其酶蚩向质的高级结构发生变化，并导致活性中心受到破坏，从而难于保证每次都能制 得高活力的标准品，有时还会使酶所具有的底物特异性发生变化，但是共价结合法制备的同 定化酶酶和载体结合极其牢州即使用高浓度的底物溶液或盐类溶液也不会简单地使酶 脱掉。因此，人们常常将其与交联法联用。安小宁等( 2 0 0 1 ) 采用壳聚糖包j ；l f ! 磁粉，经戊二 醛修饰、环氧氯丙烷交联制得高磁敏性壳聚糖微粒。此微粒共价结合卵清粘蛋白得到磁敏性 亲和吸附剂，应用于胰蚩白酶的亲和纯化纯化倍数为1 5 6 ，活性回收率为4 1 2 。郑连英 ( 2 0 0 1 ) 采用天然高分子聚合物几丁质作载体，以戊二醛为交联剂通过化学交联反应将纤维 素酶固定在几丁质上，用于降解壳聚糖，效果明显。 所谓离子结合法，是通过离子效应，将酶同定到具有离子交换基团的非水溶性载体上的 一种方法。离子结合法与前述的共价结合法比较，操作更加简便，处理条件也比较温和，而 且酶的高级结构和活性中心的氨基很少发生改变，因而可以得到较高活性的同定化酶。但这 种方法与共价结合等化学方法比较。载体和酶的结合力不够牢固，易受缓冲液种类和p h 的 影响，在离子强度较大的状态下进行反应，有时会使酶从载体上脱落下来。 j a n g 等( 2 0 0 0 ) 将z y m o n o n a s 流动果聚糖蔗糖酶用离子结合法同定在羟( 基) 磷灰石表面， 固定晟适条件为p h6 0 ，时间4 h ，固载量2 0 u 幢基体。这种固定酶其生物活性近似于天然酶。 物理吸附法是将酶蛋白吸附到不溶于水的载体上而使酶同定的方法。这个方法与前述的 离子结合法比较，酶蛋白的活性中心不易被破坏，酶的高级结构变化也不明显，从载体对酶 的适应性来看，这个方法是好的。但其缺点是，酶与载体的相互作用较弱， 东北农业大学_ 学硕l 。学位论文 彭立风等( 2 0 0 1 ) 研究了以c a c 0 3 粉末为载体吸附法固定脂肪酶的方法。同定化酶很 容易从反应体系中回收，重复使用5 次，酶活力保留7 3 3 7 用其催化棕榈油嗣相甘油解反 应生成单甘酯，是一条“绿色”工艺，并减少了催化剂的消耗。岳振峰等( 2 0 0 1 ) 以粉末状 壳聚糖为载体，采用先吸附后交联的同定法闱定a 葡萄糖氧化酶酶活力同收率为5 9 6 ， 效果较好，其酸碱稳定性及热稳定性很好。曾鸣等( 2 0 0 0 ) 在进行州定菊粉酶水解菊芋提取 液制备果糖的研究中，将内切菊粉酶和外切菊粉酶，_ i 吸附和共价相结合进行，取得了较好 的效果，对果糖、葡萄糖分离。果糖浓度可达9 5 。 1 2 2 2 交联法 与上述的共价结合法一样，都是靠化学结合的方式使酶同定化，其区别仅仅在于交联法 所采用的载体是非水溶性的即交联法是用多功能试剂进行酶蛋白之间的交联是酶分子和 多功能试剂之间形成共价键得到三向的交联网架结构除了酶分子之间发生交联外，还存 在着一定的分子内交联。根据使刚条件和添加材料的不同，还能够产生不同物理性质的吲定 化酶。常用交联试剂有戊二醛、双重氮联苯胺2 ，2 一二磺酸、1 , 5 二氯2 ，4 二硝基苯、乙二酰 亚胺酸二甲酯等。 q u i n n 等( 2 0 0 1 ) 用戊二醛作交联剂，将由乳酸制得的b 乳糖苷酶同定在石墨表面，在 石墨特有活性区域1 7 1 0 0 和2 5 1 0 0 时，固载量分别为1 1 8 u c m 2 和1 1 1 u c m 2 时，活性随酶同 载域的增加而增加，同定酶的k m 值约为游离酶的5 倍。用此嗣定酶( 质量分数5 ) 水解 乳糖，在3 7 c ，3 5 h 以上乳糖水解接近7 0 0 4 。试验证明，该吲定酶有很好的贮存稳定性和可 操作性。 交联法与上述共价结合法一样，反应条件比较激烈固定化酶的活力，在多数情况下都 比较脆弱。 一般交联剂价格较昂贵，此法也很少单独使刚，科研工作者一般都将其作为其 他j 句定化方法的辅助手段。以达到更好的固定效果 1 2 2 3 包埋法 是一种不需要化学修饰酶蛋白的氨基酸残基，反应条件温和，很少改变酶结构的固定化 方法。其基本原理是单体和酶溶液混合，再借助引发剂进行聚合反应将酶喇定于载体材料 的网格中。固定化时保护剂和稳定剂的存在不影响酶的包埋产率。这种酶包埋在高聚物内的 方法对大多数酶、粗酶制剂甚至完整的微生物细胞都适用。包埋法又分为凝胶包埋法和微囊 化法。 这一方法与载体结合法和交联法有所不同。从原理上讲，采用这种方法，酶蛋白本身不 发生结合反应，如果包埋的好，可用来制各多种固定化酶。但是在发生化学聚合反应时，需 要在比较苛刻的条件下进行，从而容易导致酶失活，因此，包埋条件一定要设计好。 】凝胶包埋法( 又称格子型法) 是将个别酶分子包在高聚物格子中，可以将块状聚合 形成的凝胶切成小块，也可以直接包埋在珠状聚合物中，后者可以使固定化酶机械强度提高 4 前言 】o 倍并改进酶的脱落情况。 2 微囊化法是将酶溶液或悬浮液包裹在膜内膜既能使酶存在于类似细胞内的环境中， 又阻i i 二酶的脱落或直接与微囊外环境接触。小分子底物则能迅速通过膜与酶作用，产物也能 扩散出来。此法包埋的酶量很多，在医学上具有很大的应用可能性，因此越来越受到人们的 注意。 姜忠义等( 2 0 0 2 ) 选用正硅酸乙酯为前体，代替目前生物分子包埋中常用的正硅酸甲酯 ( 正硅酸乙酯价廉易得但反应活性低) ，通过改变反应物配比、催化剂用量及其他反应条 件，摸索出了最为适宜的凝胶化条件，制备了较好的包埋基质。包埋法与交联法联用，也是 科研人员目前研究的热点。钱军民( 2 0 0 2 ) 以羟乙基纤维素( h e c ) 和四甲氧基硅烷( t m o s ) 为原料，利_ i j 溶胶凝胶技术，通过t m o s 水解和缩聚反应制得了h e c s i 0 2 凝胶复合物，并 片寻此凝胶复合物对葡萄糖化酶( g o d ) 进行包埋同定化，嘲定化g o d 的活力约为游离g o d 活力的5 0 其反应稳定性、贮存稳定性均有提高，分离后重复使用1 2 次活力仅有稍许 下降。沈立新等( 2 0 0 2 ) 通过对比，选择忙拉胶为包埋载体，将其溶于去离子水，与苗体以 一定比例混匀铺成1 2 m m 厚的膜，凝同后切粒，并以戊二醛交联，制成载体包埋e c o l i b l 2 1 ( p t r c - g s h ) 细胞催化合成谷胱甘肽( g s h ) ，优化条件下罐式反应器中g s h 产量为o 8 4 9 l ， 操作稳定性较好。 1 2 3 固定化酶的应用 1 2 3 1 工业生产中的应用 固相酶在水中不溶解、机械性能较好、活力也稳定。这样，同相酶就可以采用和游离酶 很不同的工艺来促使物质转化。固相酶可在不同类型的反应器中催化反应。最简单的是将同 相酶悬浮于搅拌梢中进行反应。当反应结束时可以不必将酶蛋白变性后除去而只需过滤 或离心，便能将同相酶从反应系统中除去，得到无蛋白质混杂的反应产物。分离出来的同相 酶又可重新用于第二次的催化反应。粒状固相酶又可制作酶柱( t r a u b ，1 9 7 0 ) 。层析柱内或 只用固相酶装满，或用同相酶与适当惰性填充剂装满。当底物溶液流过酶柱后，流出液中就 包含了产物。片状的固相酶可装在滤器的支架上或装在管道系统( s c h w a b e ，1 9 6 9 ) 。 1 2 3 2 分析化学中的应用 酶作为分析工具逐渐增加特别是医学化验中应用更为突出。一般作为生化分析的酶都 要求比较纯，因而酶的价格也就较昂贵，而且用于常规分析中的酶消耗量往往很大。由于固 相酶的稳定性及反应过程中不会带进杂质，可以消除这些缺陷，而且固相酶的异相反应及反 应器的多样性还为酶在分析中的应用开辟了新的途径。 5 东北农业人学t 学硕i 。学位论文 1 2 3 3 医药中的应用 近年来，酶在医药中的使用正在不断增长，固相酶在医药中的应用则正处于开创阶段 然而由于其独到之处预期必有美好前途 1 2 3 4 酶和抑制剂的分离提纯亲和层析 酶和抑制剂抗原和抗体、辅酶和酶蛋白这些生物体内的生物大分子和小分子配基 之间都有一定的亲和力，而能形成络合物。这些络合物也能在一定条件下分离。当这些络合 物的某一方被同相化后，就可以从溶液中专一地分离纯化另一方。 1 2 3 5 免疫学中的应用 ( 1 ) 固相酶可以作为免疫化学的工具。( 2 ) 同相抗体( 抗酶) 作为酶的专一吸附剂纯 化酶。如：枯草杆菌蛋白酶吸附于纤维素再从抗血清中吸附枯草杆菌蛋白酶的抗体，这样的 一种制剂用来从商品制剂的羧肽酶中除去枯草杆菌蛋白酶( s t o n e ，1 9 5 7 ) 。( 3 ) 固相抗原与 同相抗体的应用如：人血清向蛋白等抗原物质偶联于聚苯乙烯和纤维素，能从抗血消中分 离专一的抗体。抗原和酶包埋在交联的聚丙烯酰胺内，可从复杂的混合液中除去部分或全部 的其它抗体。固相抗原和同相抗体作为专一的免疫吸附剂能高效率地分离抗体和抗原。( 4 ) 分离纯化激素 抗人的绒毛膜的激长催乳激素结合于s e p h a r o s e ，可以浓缩激素5 0 0 倍 ( w e i n t r a u b ，1 9 7 0 ) 。人胎盘催乳激素的抗体结合于s e p h a r o s e ，用以从猴子的生长激素中分 离出催乳激素( g u y d a 1 9 7 1 ) 。猪胰岛素共价偶联于s e p h a r o s e 作为免疫吸附剂可高效率地 纯化羊抗猪胰岛素的抗体。用此方法纯化得到的抗体在进一步同相化后，可用于分离和证明 生物组织中及血清中存在的微量胰岛素。 1 2 3 6 在手性拆分中的应用 由于酶具有高度的立体专一性，可对手性物质进行不对称拆分，因此可用固定化酶作 为手性拆分剂拆分手性物质。酶法拆解外消旋氨基酸等具有特别的重要性，因为化学合成 的氨基酸通常都是外消旋体，必须经过拆解才能得到旋光度的对映体。多数氨基酸不易用化 学方法拆解，而酶法拆解却非常有效。 1 2 4 当前酶固定化方法的不足之处及相应对策 经过多年的研究，固定化酶技术已取得了较大的发展，先后开发了多种固定化方法和性 能多样的载体材料，取得了丰硕的成果。但是真正投入工业化应用的固定化酶还不多，仅有 6 前言 青霉酰化酶，葡萄糖异构酶等少数几种同定化酶得到产业化应用。限制同定化酶产业化应用 的主要原因有：( i ) 酶经同定化后，酶活损失较大。( 2 ) 酶l i i i l 定化使_ 【 j 的试剂币l 载体成本高。 ( 3 ) 同定化效率低，稳定性差，连续操作使h j 的设备比较复杂。针对目前同定化酶的这些 不足，人们正进一步开发更简便、更适用的同定化方法以及性能更加优异的载体材料，仪器 有更多的同定化酶区的工业规模的应用。 1 2 5 磁性高分子复合微球的研究 1 2 5 1 磁性纳米粒子的研究现状 随着纳米技术的不断发展人们对材料的性能提出了越来越高的要求超微磁性粒子是 指粒径在5 - 1 0 0 n m 的粉末材料应属于准零维范畴( 尺寸介如原子、分子与宏观同体问) 。 磁性纳米粒子由于具有磁性与流动性两者合一的独特性质，因而在巨磁电阻，磁性液、磁记 录、软磁、永磁、磁致冷、巨磁阻抗材料以及磁光器件、磁探测器等方面具有广阔的应川前 景( j l d o r m a n nc t a l 1 9 9 1 ：张立德，2 0 0 1 ；l g u t h e r e l a l ) 。除此之外，在生物技术领域 用磁性纳米粒子制成的磁性液已经被广泛地应用于磁性免疫细胞分离( k k a t oe t a l ，1 9 9 3 ) 。 核磁共振的照影( m i p a p i s o v e t a l 。1 9 9 3 ) ，以及药物控释( e k r u u g ee t a l ，1 9 9 3 ) 等领域。 近年来有关磁性纳米粒子的制备及性质研究受到很大重视( r f z i o l oe t a l ，1 9 9 2 ) 。制备 磁性氧化铁纳米粒子及其复合材料的基本方法有溶胶一凝胶法( g m c o s t ac ta 1 ，1 9 9 4 ) ( s o l - g e l 法) ，强迫水解法( s h k a ne t a l 1 9 9 6 ) ，共沉淀法( y s k a n g e ta 1 ，1 9 9 6 ) 微乳液 法( a w o o d i n g n a l 。1 9 9 ”，水热合成法( y t q i a l le t a l ，1 9 9 4 ) ，汽化一冷凝法( a r o u a n e l 吐a 1 ，1 9 9 5 ) 以及气溶胶喷射热解法( m v c a b a n a se ta 1 ，1 9 9 3 ) 等。在己报道的各类磁性纳 米粒子中，有关磁性f e 3 0 , 纳米粒子的制各方法及应用研究尤其受到重视。在传统的制备方 法上加以改进，如调整反应物组成，结构等就可获得理想的效果。f e l o n 等( 1 9 9 7 ) _ 【i j 微乳 液法以f e c l 2 与表面活性剂十二烷基硫酸钠( s d s ) 反应，通过控制s d s 的浓度及反应温度 制得了粒径为3 7 j 1 6 n m 的球形f e 3 0 4 纳米粒子，与传统法相比，该方法在反应物浓度极低 及室温。f 就可获得稳定的纳米粒子；c a r u s o 等( 1 9 9 9 ) 在苯乙烯( p s ) 乳液微球上通过选择 性沉积制各了多层f e 3 0 ，聚电解质纳米复合材料，形成了以p s 为核，f e 3 0 4 聚合物为壳的复 合结构，这一发现为胶体技术的应用开拓了新的可能性：s h e n 等( 1 9 9 9 ) 首先应_