（食品科学专业论文）海洋细菌Pleiognathi的发光性能研究及其在食品安全检测中的应用探索.pdf

海洋细菌户l e i o g n a t h i 的发光性能研究及其在食品安全 检测中的应用探索 摘要 本文以筛选具有优良体外发光性能、并对化学污染物敏感的海洋发光细菌为 出发点，研究了发光细菌的菌体性质，分离纯化了催化菌体发光的荧光素酶和 f m n ：n a d h 氧化还原酶，构建了双酶体外发光的检测体系。在此基础上，利用菌 体和双酶进行了食品安全检测的探索研究。 1 、对海洋发光细菌的菌体性质进行研究。从青岛海域分离纯化了五株海洋 发光细菌。经1 6 s r d n a 、生理生化试验鉴定，它们分属鳆发光杆菌( p 1 e i o g n a t h i ) 、 哈维氏弧菌( v h a r v e y i ) 、明亮发光杆菌( p p h o s p h o r e u m ) 、灿烂弧菌( v s p l e n d i d u s ) 和费氏弧茵( v f i s c h e r i ) 。对五菌株进行发光特性研究和化学污染物敏感性的筛 选。结果显示，p 1 e i o g n a t h i 珏最大发射波长4 7 1 n m ，持续稳定发光1 6 h ，发光性 能稳定，且对抗生素和重金属最敏感。优化了p 1 e i o g n a t h iy l 的生长发光培养基： 5 蛋白胨；1 o 酵母浸膏；0 1 o f e p 0 4 ；2 - 4 n a c i ；0 4 甘油；陈海水。最佳发 光条件：初始p h7 5 ；温度2 5 3 0 ；转速1 5 0 r r a i n 。 2 、建立了双酶体外发光的检测体系。对五菌株进行跟踪酶活测定，筛选出 产酶起始时间早、产酶活力高且稳定的p 1 e i o g n a t h il z 作为双酶的制备菌株。优 化了p 1 e i o g n a t h i 儿的产酶培养基：5 0 蛋白胨；1 o 酵母浸膏；0 1 o f e p o , ； 2 - 4 n a c l ；0 4 甘油；陈海水。最佳产酶条件：初始p h7 0 ：温度2 5 3 0 ； 转速1 5 0 r r a i n 。建立了单、双酶体外发光检测体系，并对两个体系进行比较。 荧光素酶检测体系( 室温) ：i m l 酶液中，迅速加入底物十二烷醛i o o p l ( 2 7 m l i ) 、 f m n - n a 5 3 p l ( 1 0 m m ) 和n a 2 s 2 仉2 0 0 i l l ( 3 4 r a m ) ，测定酶活。双酶检测体系( 室温) ： 1 m l 酶液中，一次性快速加入底物十二烷醛i o o p l ( 2 7 l m ) 、f _ n a 5 3 虬( 1 0 m m ) 、 n a d h2 0 0 儿( o 1 4 r a m ) ，测定酶活。双酶体系比单酶体系发光稳定性好，更适合 用于检测操作。 3 、对双酶的酶学性质进行初步研究。超声破碎菌体细胞，通过硫酸铵盐析、 d e a e - s e p h a r o s ec l - 6 b 离子交换柱层析得到了电泳纯的f m n , * n a d h 氧化还原酶， 测定分子量为2 8 k d a 。通过硫酸铵盐析、d e a e - s e p h a r o s ec l - 6 b 离子交换柱层析 和d e a e - s e p h a d e x 凝胶柱层析得到了电泳纯的荧光素酶，并成功分离出了酶的两 个亚基，其分子量分别为4 1 k d a 和3 6 k d a 。对荧光素酶两个亚基的进行活性测定， 结果发现，两个亚基单独存在时无酶活，只有两个亚基同时存在，荧光素酶才有 活性。优化了双酶的最适反应条件：温度为3 5 ( 2 ，p h7 o ，最适n a c i 浓度1 5 2 。 矿、c a 2 + 、n a + 、m 9 2 + 离子对酶活有促进作用；f e 2 + 、z n 2 + 、s n 2 + 、h 9 2 + 、b a 2 + 等离 子对酶活有抑制作用。抗生素对双酶基本无影响。双酶的热稳定性较好。4 c 下 可长时间保持酶活。随着温度升高，双酶的耐热性变差，且酶失活的时间缩短。 4 、菌体在食品安全检测中的应用探索。建立了只l e i o g n a t h ly l 检测水产 品中氯霉素残留的方法体系。选取对数生长期的只l e i o g 刁a t h i y l ，控制菌数为 1 0 7 c f u m l ，乙酸乙酯提取氯霉素，5 m l 菌液中加入5 m l 氯霉素提取液，2 7 1 5 0 r m i n 培养3 0 m i n ，测定发光抑制率。检测线性范围0 1 4 1 o i j g l ，方法检 出限0 1 4 儿g k g 。建立了只l e i o g n a t h i y l 检测水产品中重金属的方法体系。重 金属敏感性筛选结果显示，只l e i o g n a t my l 对h 9 2 + 、c r 、c d 2 + 最敏感。选取对 数生长期的只l e i o g n a t h iy l ，控制菌数为1 0 7 c f u m l ，样品灰化处理后，5 m l 菌液中加入5 m 1 重金属提取液，2 7 1 5 0 r m i n 培养3 0 r a i n ，测定发光抑制率。 h 9 2 + 检测线性范围0 0 0 7 - 0 2 8 p g l ，方法检出限为0 0 0 7 9 9 k g ；c r “检测线性范 围o 9 3 0 o “g l ，方法检出限为0 9 1 t g k g ) c d 2 + 检测线性范围5 4 6 5 o p g l ， 方法检出限为5 4 p g k g 。 5 、双酶在食品安全检测中的应用探索。建立了双酶检测水产品中重金属残 留的方法体系。重金属敏感性筛选结果显示，双酶对h 9 2 + 、c r 6 + 最敏感。样品灰 化处理后，l m l 酶液中加入5 0 0 “l 样品溶液，4 c 放置反应1 5 m i n ，测定酶活抑 制率。h 9 2 + 检测线性范围0 0 0 0 7 - 0 0 3 0 p g l ，方法检出限0 0 0 0 7 p g k g ) c r 6 + 检测 线性范围0 0 5 - 5 o 肛g l ，方法检出限0 0 8 “g k g 。初步研究了大肠杆菌内n a d h 对双酶酶活的影响。测定了n a d h 含量对双酶酶活的影响曲线。在此基础上，对 不同茵量的大肠杆菌进行超声细胞破碎，释放n a d h ，进行双酶酶活检测，为今 后利用双酶检测大肠杆菌的菌数提供基础理论数据。 关键词：海洋发光细菌；荧光素酶；f m n ：n a d h 氧化还原酶；氯霉素检测 s t u d yo nt h eb i0iu min e s c e n ts y s t e mo fp 1 e i o g n a t h ia n d it sa p piic a tio ninf o o d p ol iu t a n t sd e t e c tio n a b s t r a c t f i v el u m i n o u sb a c t e r i a ls t r a i n sw e r ei s o l a t e df r o mq i n g d a oc o a s ta n d c h a r a c t e r i z e db yac o m b i n a t i o no f16 s r d n a s e q u e n c e s ，t h em o r p h o l o g yo b s e r v a t i o n , p h y s i o l o g i c a lt e s t ，m o l e c u l a ra n db i o c h e m i c a la n a l y s i s i nc o m p a r i s o nw i t ht h es i m i l a r s t r a i n s r e p o r t e d , t h ef i v es t r a i n sa r ei d e n t i f i e d 弱p 1 e i o g n a t h i , v h a r v e y i , p p h o s p h o r e u m ，i , f s p l e n d i d u s ，v f i s c h e r i s e n s i t i v i t ys c r e e n i n ge x a m i n a t i o ni n d i c a t e dt h a tp 1 e i o g n a t h iy lw a sm o s t s e n s i t i v et ot h ea n t i b i o t i c sa n dh e a v ym e t a l sa m o n gt h ef i v es t r a i n s y ls t r a i nh a sa m a x i u mw a v e l e n g t hf o re m i s s i o na t4 7 i n t oa n dt h es t r o n gl i g h tl a s t e df o r1 6 h t h e o p t i m u mg r o w t ha n dl u m i n e s c e n c ec o n d i t i o n so fy lw e r ed e t e r m i n e da s i n i t i a lp n 7 j 5 ；t e m p e r a t u r e2 5 - - 3 0 1 2 ；s h a k i n gs p e e d1 5 0 r m i n 。t h em e d i u mw a sc o m p o s e do f 5 0p e p t o n e ，19 6 , y e a s te x t r a c t i o n , o 1 of e p 0 4 ，2 - 4 n a c l ，0 4 g l y c e 血a n d s e a w a t e r p 1 e i o g n a t h i y lw a ss e l e c t e dt o p r o d u c e l u c i f e r a s ea n df m n ：n a d h o x i d o r e d u c t a s e ( t h ec o u p l ee n z y m e s ) f o ri t ss t a b l ep r o d u c ta b i l i t y t h eo p t i m u m e n z y m e - p r o d u c i n gc o n d i t i o mw g r ed e t e r m i n e d ：i n i t i a lp h7 5 ：t e m p e r a t u r e2 5 3 0 1 2 ；s h a k i n gs p e e d15 0 r m i n 。 l u c i f e r a s ew a sa s s a y e da tl o o mt e m p e r a t u r eb ym e a s u r i n gt h el i g h te m i s s i o n u p o nt h er a p i di n j e c t i o no f1 0 m ll u c i f e r a s em i x t u r e , 5 3 p lf m n - n a ( 10 m m ) ，lo o p l n a 2 s 2 0 4 ( 3 4 r a m ) ，10 0 i - t l d o d e c a n a l ( 2 7 m m ) f m n ：n a d ho x i d o r e d u c t a s ew a sa s s a y e d a tr o o mt e m p e r a t u r eb ym e a s u r i n gt h el i g h te m i s s i o nu p o nt h er a p i di n j e e t i o no f 1 0 m lo x i d o r e d u c t a s em i x t u r e ，5 3 i _ t lf m n - n a ( 1 0 m m ) ，2 0 0 b ln a d h ( 0 1 4 r a m ) ， 10 0 p ld o d e c a n a l ( 2 7 m m ) t h el u m i n e s c e n c eo fc o u p l e de n z y m es y s t e mw a sm o r e s t a b l et h a nl u c i f e r a s es y s t e m t h ec o u p l ee n z y m e s 、7 l 僦r e l e a s e df r o mt h ec e l l sb ys o n i c a t ea n dp u r i f i e d f o l l o w e dt h ep r o c e d u r e s ：p r e c i p i t a t e db ys o l i da m m o n i u ms u l f a t e ；e l u t i o no n d e a e - s e p h a r o s ec l - 6 ba n dd e a e s e p h a d e xc o l u m n s t h em o l e c u l a rw e i g h t so f o x i d o r e d u c t a i s2 8 k d a l u c i f e r a s eh a st w os u b u n i t sa n dt h e i rm o l e c u l a rw e i g h t sa r e 3 6 k d aa n d4 1 k d ar e s p e c t i v e l y n oa c t i v i t yw a sf o u n dw h e ne i t h e ro ft h ei s o l a t e d s u b u n i t si sa b s e n t t h eo p t i m u mr e a c t i o nc o n d i t i o n so ft h ec o u p l ee n z y m e sa r e ：i n i t i a l p h7 5 ；t e m p e r a t u r e2 5 3 0 c ；s h a k i n gs p e e d1 5 0 r r a i n c 、c a 2 + 、n a + 、m 矿 p r o m o t e dt h ea c t i v i t yo ft h ec o u p l ee n z y m e sw h i l ef e 2 + 、z n 2 + 、s n 2 + 、h 9 2 + 、b a 2 + i n h i b i t e dt h ea c t i v i t y a n t i b i o t i c sh a dn oe f f e c to nt h ea c t i v i t yo ft h ec o u p l ee n z y m e s t h ec o u p l ee n z y m e sh a dag o o da c t i v i t ya t4 ca n dt h ea c t i v i t yd e c r e a s e dw i t ht h e t e m p e r a t u r er a i s e do v e r4 0 t h ec o n c e n t r a t i o no fc h l o r a m p h e n i c o li ns h r i m pa n dt u r b o tt i s s u e sw a sd e t e c t e d w i t hp 1 e i o g n a t h i 耽t h ec h i o r a m p h e n i c o li nt h et i s s u e sw a se x t r a c t e db ye t h y l a c e t a t e t h eo p t i m a lt e s ti n o e u h mi s107 c e l l s m l 5 m lc h l o m m p h e n i c o ls o l u t i o nw a s a d d e di n t o5 m li n o c u l u m t h em i x t u r es o l u t i o nr e a c t e df o r3 0 m i na t2 7 w i t ht h e s h a k i n gs p e e d15 0 r m i r at h ec o n c e n t r a t i o no fc h l o r a m p h e n i c o lr a n g i n gf r o m0 1 4t o 1 0 嵋几w a sd e t e r m i n e db yt h el u m i n e s c e n c ei n h i b i t i o nr a t eo fr l e i o g n a t h i 皿t h e d e t e c t i o nl i m i ti s0 1 4 t t g k g t h ec o n c e n t r a t i o no fh e a v ym e t a l s ( h 9 2 + 、c ，、c d 2 + ) i n s h r i m pt i s s u e sw a sa l s od e t e c t e d 、析mp 1 e i o g n a t h iy l t h ei o n so fh e a v ym e t a li nt h e t i s s u e sw e r ee x t r a c t e db yc i n e r a t i o n t h ed e t e c t i o np r o c e d u r eo fh e a v y m e t a l s ( h 9 2 + 、 c ，、c d ：+ ) w a st h es a m e 嬲t h ec h l o r a m p h e n i c 0 1 t h ec o n c e n t r a t i o no fh 9 2 + r a n g i n g f r o m0 0 0 7 1 工g lt o0 2 8 p g lw a sd e t e c t e d , t h ed e t e c t i o nl i m i tw a s0 0 0 7 t g k g t h e d e t e c t i o nc o n c e n t r a t i o no fc r ei s0 9 3 0 0 p g la n dt h ed e t e c t i o nl i m i tw a s0 9 p g k g t h ed e t e c t i o nc o n c e n t r a t i o no fc d w a s5 4 6 5 0 i - t g la n dt h ed e t e c t i o nl i m i tw a s 5 4 p g k g s e n s i t i v i t ys c r e e n i n ge x a m i n a t i o ni n d i c a t e dt h a tt h ec o u p l ee n z y m e sw e r em o s t s e n s i t i v et oh 9 2 + a n dc ，t h ec o n c e n t r a t i o n so fr i g r 2 + a n dc ，i ns h r i m pt i s s u e sw e r e d e t e c t e dw i t ht h ec o u p l ee n z y m e sr e s p e c t i v e l y t h ei o n so f h e a v ym e t a li nt h et i s s u e s w e r ee x t r a c t e db yc i n e r a t i o n 5 0 0 “li o ns o l u t i o nw a sa d d e di n t ot h ee n z y m em i x t u r e t or e a c tf o r15 m i na t4 c ，a n dt h ea c t i v i t yo ft h ec o u p l ee n z y m e sw a sd e t e c t e d t h e d e t e c t i o nc o n c e n t r a t i o no fh 9 2 + w a s0 0 0 0 7 - 0 0 3 0 p e c la n dt h ed e t e c t i o nl i m i tw a s 0 0 0 0 7 i t g k g t h ed e t e c t i o nc o n c e n t r a t i o no fc d 2 + w a s0 0 5 - 5 0 p g la n dt h ed e t e c t i o n l i m i tw a so 0 8 p g k g n a d hi ne c o l ic e l l sw a sr e l e a s e db ys o n i c a t ea n dp r o m o t e dt h e l u m i n e s c e n c eo ft h ec o u p l ee n z y m e s t h er e s u l t sp r o v i d e dd a t at od e t e c tt h et o t a l n u m b e ro fe c o l iw i t ht h ec o u p l e e n z y m e s k e yw o r d s ：m a r i n el u m i n o u sb a c t e r i a ；i u c i f e r a s e ；f n n ：n a d ho x i d o r e d u c t a s e ； d e t e c t i o no fc h i o r a m p h e n i c o i 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 或 其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的 任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：爨兰兰签字日期：沁另年月i e t 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息 研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公 众提供信息服务。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：靛兰兰 签字日期：丸蕊年乡月f e t 导师签字： 签字日期：fe l 海洋细菌r t a o g , 蛐n t t 的发光性能研究及其在食品安全检测中的应用探索 0 绪论 0 1 发光细菌简介 晴朗的夜晚，人们经常能观赏到瑰丽的海光。它有时似星光万点，有时又似 乳光一片，更似绚丽多彩的礼花。这种迷人的海火现象，就是发光细菌的杰作。 0 1 1 发光细菌的分类 发光细菌是指在正常的生理条件下，在细菌生长过程中伴随有可见荧光发 射的一类细菌，这种可见荧光波长在4 5 0 4 9 0 n m 之间，在黑暗处肉眼可见【1 2 】。 目前已知的发光细菌有四属，分别是异短杆菌属( x e n o r h a b d u s ) , 弧菌属 ( v i b r i o ) , 发光杆菌属( p h o t o b a c t e r i t 衄) 及希瓦氏茵属( s h e w a n e l l a ) 1 - 2 。按 照存在区域划分，发光细菌又可分为陆地发光细菌和海洋发光细菌【3 以2 1 。陆地发 光细菌主要是x e n o r h a b d u s 的发光异短杆菌( zl u m i n e s c e n s ) 。此外，我国学者 在1 9 8 5 年分离出一株新的淡水发光细菌，命名为青海弧菌( ko i n g h a i e n s i s ) 【1 2 1 。海洋发光细菌主要有y i b r i o 的哈维氏弧菌( zh a r v e y i ) 、美丽( 灿烂) 弧 茵( ks p l e n d i d u ) 、费氏弧菌( k ，i s c h e r l d 、火神弧菌( zi o g e 力和东方弧菌 ( ko r i e n t a l i s ) ；p h o t o b a c t e r i u m 的明亮发光杆菌( p p h o s p h o r e u 动和鳆发光杆 菌i e i o g n a t h l ) ；s h e w a n e l l a 的羽田希瓦氏菌( sh a n e d a z d 网：霍乱弧菌 ( kc h o l e r a 甸和地中海弧菌( zm e d i t e 黝e l o 中某些菌株也有发光现象【3 1 2 1 。 0 1 2 海洋发光细菌 海洋发光细菌普遍地存在于海洋环境及海洋生物体上，但以温带和热带海洋 居多。海洋发光细菌一般的生活方式可分为四种【1 3 d 羽：( 1 ) 自由浮游生存在海水 中，密度不高，以海水中的有机物质维生；( 2 ) 附着生存在海洋生物体表，以海 洋生物分泌的有机物质维生，例如鱼类、软体动物、甲壳类生物体表均可分离出 这些发光细菌；( 3 ) 共生于海洋动物的消化道中如许多鱼类的消化道中常含有大 量的发光菌，这些发光菌可随着鱼类的排便而散布到广大的海洋中；( 4 ) 共生于 海洋动物的发光器内：许多深海鱼类或软体动物具有发光器用来诱捕或吸引异性 交配，这些生物的发光器内共生着大量的发光细菌，宿主提供了安定舒适的生长 环境与养分供发光菌维生，而宿主也可透过各种调节与控制的方式来调节光的开 启与强弱，二者之间建立了密切的共生关系，互蒙其利【l “s l 。 不同种的发光细菌形态生理特性非常相似【1 9 1 ：属革兰氏阴性、兼性厌氧菌， 海洋细菌卫如蛔 ，删埘的发光性能研究及其在食品安全检测中的应用探索 大小约o 4 一1 o x1 0 2 5ui l l ；无孢子、荚膜，有端生鞭毛一根或数根。均一般 好低温，一般对明胶不产生液化，分解蛋白质后不形成毒物，常寄生在各种动物 体上引起“发光病”，即寄生发光【4 】。这些细菌通常经由寄主的卵传递给后代寄 主。有些发光鱼类和乌贼是和发光细菌共生而利用了细菌的发光。细菌发光是不 参与细胞色素系统的呼吸形式，称为发光呼吸，此过程可以把细菌体内的化学反 应所产生的能量以光的形式释放出来，而且在发光的同时，没有辐射热能的消耗。 0 1 - 3 海洋发光细菌发光机理 发光细菌的发光机理的研究表明，不同种类的发光细菌的发光机理是相同的， 属酶促氧化反应【2 0 啦】。是由分子氧作用，胞内荧光酶( l e ) 催化，将还原态的黄 素单核苷酸( f m n h 。) 及八碳以上的长链脂肪醛( r c h o ) 氧化为f m n 及长链脂肪酸， 同时释放出最大发光强度在波长为4 5 0 4 9 0 衄的蓝绿光。发光细菌的发光原理 如下。 f m n h l 十r c h 0 + u 型鲨里f m n + r c o o h + h ：o + h v m 嚣“ 图0 _ 1 发光细菌发光原理图 魂0 - im e c h a n i s mo ft h el u m i n e s c e n c eo fb a c t e r i a h a s t i n g 等 2 0 - 2 3 1 提出发光细菌细胞内的发光反应模式如图3 所示。脂肪还原 酶在a t p 和n a d p h 的参与下，将脂肪酸还原成脂肪醛，为发光酶促反应提供底物 脂肪醛( 长链脂肪醛r c h o ) 。与此同时，f , ：n a d h 氧化还原酶对f m n 有特异性， 在n a d h 存在的条件下，将f ) l i n 还原为f m n h 。，也为发光酶促反应提供底物。正是 在脂肪还原酶和f m n ：n a d h 氧化还原酶两个辅酶的共同作用下，荧光素酶催化 f m n h 。和r c h o 发生氧化还原反应，同时发出蓝绿色荧光。 海洋细菌p 腻a g n a # d 的发光性能研究及其在食品安全检测中的应用探索 研究证实，发光细菌的发光与其细胞浓度密切相关。在海水中，发光细菌的 密度很低，约有0 0 1 - 4 0 c e l l s m l 海水，多数情况下不能发光。但当发光细菌寄 生在动物或鱼类身上时，数量可以达到1 0 c e l l s m l 共生组织，可以发出耀眼强 光，发光几率变高【2 4 1 0 这一现象是由发光细菌的发光调节机制一自诱导物决定 的。当发光细菌存在海水中时，由于密度低，菌体的自诱导物被海水稀释到肉眼 无法观察。但在生物发光器( 共生组织) 中，菌体自诱导物的浓度可以达到 5 - 1 0 h m 。当自诱导物达到5 - 1 0 n m 的临界浓度时，细菌才会大量转录产生荧光素 酶的发光基因【2 5 稠。 通过基因定位、基因分析、基因产物鉴定、缺失突变、基因转导等方面的研 究发现细菌发光现象是细胞内的发光基因( 1 u xg e n e ) 及其操纵子表达与调控的 结果 2 7 - 3 0 。已知的操纵子有2 个。即o p e r o nl 和o p e r o nr ，它们从中间调节区 开始向2 个方面转录。l 操纵子含l u xr 基因，编码一种调节蛋白。r 操纵子含 l u xi ，c ，d ，a ，b ，e 等基因，l u xi 编码合成自诱导物。l 操纵子在转录水平 受a m p 、c r p ( c a m p 受体蛋白) 的正反馈调节，在转录及翻译水平又受自诱导物、 l u xr 基因产物、l u xi 基因产物的负反馈调节。 0 2 海洋发光细菌研究进展 0 2 1 海洋发光细菌在环境检测中的应用 环境中的污染物种类和数量日益增多，传统的分析鉴定手段难以达到实时、 迅速、在线分析的要求。发光细菌由于其独特的生理特性、与现代光电检测手段 完美匹配的特点而备受关注，在环境监测中的应用也越来越广泛。 发光细菌在正常的生理条件下能发出波长在4 5 0 4 9 0 n t o 的蓝绿色可见光，在 一定的试验条件下发光强度是恒定的。与外来受试物接触后，由于毒物具有抑制 发光的作用，发光细菌的发光强度即有所改变，变化的程度与受试物的浓度在一 定范围内呈相关关系，同时与该物质的毒性大小有关。外来受试物主要通过两个 途径抑制细菌发光：( 1 ) 直接抑制参与发光反应的酶类活性( 2 ) 抑制细胞内与 发光反应有关的代谢过程。 利用发光细菌的发光强度作为指标来监测有毒物质，越来越受到重视。国外 利用kf i s c h e r i 进行单一重金属的毒性评价和复合重金属的评价 3 1 - 3 3 1 ；利用发 光细菌环境中有机化学物质、杀虫剂等毒性的评价 3 4 - 3 7 ；并用发光细菌进行废水 3 海洋细菌只肠d 譬舢晒i 的发光性能研究及其在食品安全检测中的应用探索 污染程度的评价等3 引。国内吴自荣等利用发光细菌快速分析大气污染【3 9 】；江敏 等利用p p h o s p h o r e u m 对6 种含氮杂环化合物的毒性研究 4 0 ；张秀君等利用发 光细菌监测废水的综合毒性【4 1 】；李彬等利用发光细菌诊断重金属污染土壤毒性 【4 2 】 o 利用发光细菌制作生物传感器，是人们研究的热点之一。因此，微生物细胞 作为制备识别元件的生物材料，具有一定的优势。研究表明，发光细菌的发光强 度与某些污染物的浓度呈良好的线性关系，能够稳定、灵敏、快速地反映环境中 污染物的浓度变化。2 0 世纪8 0 年代初美国b e c k m a n 公司推出生物毒性测试仪， 发光细菌毒性测试( l u m i n e s c e n tb a c t e r i at o x i c i t yt e s t ，l b t ) 技术在世界 范围内迅速推广。黄正等利用发光细菌作为生物敏感材料，研制了用于污染物毒 性监测的传感器，并且进行了环境中有毒污染物的快速检测【4 3 】。李百祥等将 r p h o s p h o r e u m 固定成膜作为敏感元件，研制急性毒性快速测定仪嗍。a l i s o nm h o r s b u r g h 等利用基于发光细菌的生物传感器对水环境中的工业污染物进行了 检测【4 5 】。随着科技的进步，l b t 技术与其他分析技术联合应用，扩大了应用范 围，取得了很多成果。黄正等将l b t 技术与a m e s 致突变试验、色谱、质谱分 析方法结合起来，分析了武汉市工业废水的急性毒性、遗传毒性和主要毒物阄。 利用发光细菌毒性试验检测环境污染物急性毒性备受重视，我国于1 9 9 5 年 将这一方法列为环境毒性检测的标准方法( g b t1 5 4 4 1 - 1 9 9 5 ) 。 o 2 2 海洋细菌在食品安全检测中的应用 有机磷农药具有药效高、品种多、防治对象多、在环境中易降解等优点，在 我国农业生产中大量使用。但大多数品种属于高毒性，人们在食用高残留的水果 蔬菜时会发生急性中毒或慢性中毒。对此，袁东星等探讨了采用发光细菌对甲胺 磷、水胺硫磷、氧化乐果、敌敌畏、辛硫磷、甲基异硫磷等6 种常用有机磷农药 的检测状况。发光细菌检测法的最小农药检出质量浓度为3 m g l 【4 刀。 、 食用色素是最常用的食品添加剂。1 9 世纪8 0 年代开始使用合成色素作为食 用色素，由于是合成色素，大部分含有偶氮双键结构，属于偶氮染料。目前国际 上已全而禁止其作为食品染料使用。但由于偶氮染料染色效果好、牢度强、食品 色泽鲜亮、富有新鲜感、能激起人们的食欲和购买欲，因此将其作为食品染料的 现象时有发生。党亚爱等根据1 9 9 5 年国家标准规定的发光细菌法测定化合物的 4 海洋细菌卫翻堙刖胁，的发光性能研究及其在食品安全检测中的应用探索 急性毒性标准，测定了碱性紫、活性黑、还原蓝等1 7 种染料对发光细菌的抑制 影响【4 剐。 天然毒素是一大类生物活性物质的总称，主要包括真菌毒素、海洋毒素、微 生物毒素等。由于其毒性对食品安全和人类健康已构成了严重的威胁，所以对其 进行检测也是食品安全的重要内容之一。y a t e s 等对黄曲霉素b 1 、桔霉素等8 种霉菌毒素进行了发光细菌分析，结果发现8 种毒素的毒性次序与哺乳动物细胞 毒性试验结果一致嗍。赵华清等采用p p h o s p h o r e u m t 3 小种的暗变种t 9 1 7 1 菌 株检测了黄曲霉素b 1 、苯酚、环磷酰胺、缩水甘油、硫酸二乙醋、溴化乙锭、 甲基磺酸乙醋、硫酸锌、重铬酸钾等9 种化合物和1 4 种环境样品的基因毒性【5 0 1 。 0 3 荧光素酶的荧光体系 生物发光( b i o l u m i n e s c e n c e ) 是在自然界广泛存在的、有生命的生物产生的 一种发光现象。发光的生物种类很多，包括发光细菌、发光萤火虫、发光鱼、发 光海星、发光甲虫等。而能催化荧光素或脂肪醛氧化产生生物发光的一类酶即为 荧光素酶。从2 0 世纪5 0 年代就己经开始了对荧光素酶的研究。1 9 5 4 年，m e c l r o y 等对从哈氏弧菌中提取并纯化出细菌荧光素酶。1 9 6 7 年，f r i e d l a n d 等对从费氏 弧菌中提取出的荧光素酶的结构和反应原理进行了分析。1 9 5 6 年，g r e e na 等提 取出萤火虫荧光素酶。在1 9 7 0 年，d e n b u r g 等第一次测定了萤火虫荧光素酶的 结构。而从1 9 8 6 年，m a r l e n e 等第一个成功地获得表达萤火虫荧光素酶基因( 1 u x 基因) 的转基因烟草以来，荧光素酶的应用和发展进入了一个崭新的时代。应用 荧光素酶大大增加了生物发光免疫分析技术( b i o l u m i n e s c c n ti m m u n o a s s a y , b l l a ) 的灵敏度和应用范围，由于具有敏感性高，特异性好，反应迅速，操作简单，应 用范围广等优点，己成为医学、生物学、环境科学等研究领域中一种新的手段 f f s - s o 荧光素酶是海洋发光细菌发光体系中最重要的酶。 研究表明，荧光素酶是杂二聚体，含d 、1 3 两个多肽亚基的加单氧酶。单独 a 、b 亚基均无发光活性，只有a 、b 共存时才有活性【”5 3 1 。从不同海洋细菌中 提取到的荧光素酶其分子量基本相同。其中q 亚基含3 5 4 个氨基酸，分子量约 4 0 k d ；b 亚基含3 2 5 个氨基酸，分子量约3 7 k d 。从陆生细菌中分离到的荧光素酶 的q 亚基含3 6 0 个氨基酸，分子量约4 1 k d ；8 亚基含3 2 7 个氨基酸，分子量约8 k d ， 海洋细菌足肠堙加t w 的发光性能研究及其在食品安全检测中的应用探索 其中陆生细菌的q2 亚基和b2 亚基氨基酸序列分别有8 5 和6 0 与海洋细菌同源。 有研究表明，b l 与黄素( f l a v i n ) 结合点在q2 亚基；通过基因重组及定位点诱变 发现q2 亚基控制酶的催化能力和结构特点，亦是评判酶的热稳定性的关键因 素；a21 1 3 位对酶与黄素的相互作用密切相关，a22 2 7 位在调整酶与底物醛的 作用中处于中心位置【5 1 巧3 1 。 和其它酶一样，b l 活性受许多因素的影响：0 2 和离子浓度均能影响发光， h 2 0 2 、乙醛及长链烷基化合物在反应中刺激发光。从发光致病杆菌 伍l u m i n e s c e n s ) 中提取的b l 发现，酶与f m n 和豆蔻酸( 十四烷酸) 形成三元络合 物，三元络合物的慢分解限制了酶的转换，脂肪酸能促进酶与f m n 的相互作用酬。 研究热稳定性发现，b l 的热稳定性与其所表达的有机体有关，但与有机体细胞的 抗热性无关，木糖醇、甘油加入培养基中保护酶的活性【5 5 1 。n 一乙基顺丁烯二酰 亚胺对b l 失活的影响与p h 有关，随缓冲溶液浓度的增大，失活率升高。 目前已从哈氏弧菌( f i b r i o 施册f 力、费氏弧菌( v i b r i of i s c h e r l ) 、明 亮发光杆菌( p b o t o b a o t e r i u mp h o s p h o r e u m ) 等多种发光菌中克隆到细菌荧光素 酶基因，所得到的l u x 基因主要由l u x a ，b ，c ，d ，e5 部分组成，在l u x 操纵 子中其排列顺序为l u x c ，d ，a ，b ，e ，其中1 u x a ，b 分别编码分子量为4 0 x1 0 和3 7 1 0 的两条多肤链，组成荧光素酶，l u x c ，d ，e 分别编码还原酶、转移 酶及合成酶，3 种酶聚合成脂肪酸还原酶复合物。此外还有l u x l 、r 作为调控基 因，l u x l 、g 等种属特异基因( 可能和细菌的生活环境有关) 5 6 - 5 5 。 l u x 基因在原核生物易于表达。l u x 基因可以以两种形式导入原核生物，一 是只导入编码荧光素酶的l u x a ，b 基因，另外一种是将整个l u x 操纵子导入。前 者的不足是需要向反应体系中添加足量的脂肪醛底物，后者的不足是由于导入基 因的分子量较大，导致重组体的稳定性、酶切位点的数量等受到影响【5 9 】。 在真核生物中高效表达l u x 基因不易，大多需要在l u x a 和l u x b 前各接上1 个启动子，实际操作比较困难，但是只要能将l u x a 和l u x b 分别独立地在植物中 表达，基因产物就可以正确地组装成有功能的酶。如果将l u x a ，b 基因融合后接 上一个启动子进行转录和表达就较为容易，而且表达产物具有较高的催化发光活 性嗍。 0 4 荧光体系的应用 6 海洋细菌卫肠嘲删的发光性能研究及其在食品安全检测中的应用探索 0 4 1 荧光素酶在基础研究中的应用 荧光素酶基因已被广泛应用于不同启动子、外源基因表达强度和转录调控的 研究的报告基因。该报告基因的灵敏度高，对于研究低水平表达如弱启动子的调 控方式有较大的意义。目前，利用l u x 基因作为报告基因研究了多种枯草杆菌启 动子、分支杆菌( s m e g m a t i s ) 乙酞胺酶基因启动子的诱导、链霉菌( c o e l i c o l o r ) s a p a 基因编码的孢子相关多肽的转录时间分布和空间定位。同时利用核酸酶保 护杂交技术及发光监测，确定荧光酶合成与气生菌菌丝发生及s p a 基因转录起始 一致【6 。 荧光素酶检测的最大优点是不损