双水相萃取α淀粉酶PPT课件.ppt

实验前预备工作,请各位同学按照学号顺序就做，每排坐四位同学，为一个小组请各小组同学将各自桌面上的所有玻璃仪器清洗干净，放入烘箱烘干备用,2019/12/16,1,双水相萃取-淀粉酶及其影响因素分析-生物分离工程综合平台实验,2019/12/16,2,实验背景介绍,2019/12/16,3,双水相萃取,概念：利用溶质在两个互不相溶的亲水相之间的分配系数不同而进行分离的萃取技术。问题双水相成相机理及条件影响蛋白质在双水相中分配的因素双水相的优势,2019/12/16,4,1双水相的类型与形成原因,双水相类型,*PEG：聚乙二醇；Dex：葡聚糖,2019/12/16,5,1双水相的类型与形成原因,双水相形成原因聚合物/聚合物聚合物的不相溶性：当两种高分子聚合物之间存在斥力作用时，由于相对分子质量较大，分子之间的相互排斥作用于混合过程中熵的增加相比占主导地位，一种聚合物分子的周围将聚集同种分子而排斥其他分子，当达到平衡时，形成分别富含不同聚合物的两相。聚合物/盐盐析作用,2.2%葡聚糖水溶液与等体积的0.72%甲基纤维素钠水溶液混合静置,2019/12/16,6,常用的双水相,PEG/DEX平衡后，上相富含PEG，下相富含DexPEG/无机盐平衡后，上相富含PEG，下相富含无机盐,2019/12/16,7,相图的组成及意义,双节线（曲线TKB）：上方为双水相，下方为均一相系线（直线TMB）：系线上各点处系统总浓度不同，但均分成组成相同（T,B）而体积不同的两相两相体积近似服从杠杆原则，即VT/VB=BM/MTK点：系线的长度是衡量两相之间差别的尺度，系线越长，两相间差别越大，反之则越小。在K点系线长度趋向为零，两相差别消失，任何溶质在两相间的分配系数均为1，此点称为临界点。,双水相,均一相,2019/12/16,8,影响双水相分配理论,2.1成相聚合物的相对分子质量2.2成相聚合物的浓度2.3盐的种类和浓度2.4pH的影响2.5温度的影响,2019/12/16,9,双水相的优势,含水量高，萃取条件温和，不会引起生物活性物质变性没有有机溶剂残留去细胞碎片的同时纯化蛋白，使分离过程更加经济容易实现反萃取,2019/12/16,10,2019/12/16,11,实验安排,星期六上午（8:00-11:40）：实验分组，试剂配置，实验一星期六下午（2:00-5:30）：实验二与实验三星期日上午（8:00-11:30）：实验四与实验五星期日下午（2:00-5:30）：实验二三四五的结果分析与讨论；完成实验报告；整理教室卫生,2019/12/16,12,实验一PEG/（NH4)2SO4双水相相图的制作,2019/12/16,13,一实验目的,掌握浊点法制作双水相相图（双节线）的方法分析比较PEG分子量对双水相成相的影响,2019/12/16,14,二实验原理,因层析作用，一定浓度的PEG与（NH4)2SO4混合溶液可形成双水相，相图即用于描述双水相的成相条件及定量关系。双节线是双水相与均一相的分界线，可用浊点法测定制作双水相图中的双节线。,双水相,均一相,2019/12/16,15,二实验材料,PEG：400，800，2000，见公共实验台43%的（NH4）SO4溶液：称取43g硫酸铵（见公共实验台）溶解于适量水中，定容至100mL，称重计算密度。蒸馏水（值日生从117打水，放在桶中备用）碱式滴定管试管：干燥无水,2019/12/16,16,三实验步骤,PEG800与2000为固体，可于60加热熔化后称取。,2019/12/16,17,三实验步骤,红笔标记的体积可机动,2019/12/16,18,四实验注意事项,使用干燥洁净的试管。称取PEG时，要滴加在试管底部，避免挂到试管壁上。滴定和加水过程，避免液体溅到试管壁上。初始几次滴定过程，必须要缓慢逐滴滴加(NH4)2SO4溶液。若滴下(NH4)2SO4后，溶液出现浑浊，但振荡后又恢复澄清，说明已接近浊点，之后要缓慢逐滴滴加(NH4)2SO4溶液。,2019/12/16,19,五实验结果与分析,(NH4)2SO4溶液累计加量V盐(ml)=滴定后读数-初始读数,(NH4)2SO4溶液累计加量m盐(g)=*V盐,纯(NH4)2SO4累计量m(g)=43%*V盐,溶液累计总量m总(g)=mPEG+m盐+m水,PEG400(%)=mPEG/m总,(NH4)2SO4(%)=m/m总,2019/12/16,20,五实验结果与分析,2019/12/16,21,六思考题,为什么随PEG分子量增大，双水相系统分相动力增强？,2019/12/16,22,实验分组安排,每四个人一大组，每两个人一小组，分别完成两种PEG的相图制作，交叉验证。实验完成后，及时清洗玻璃仪器，置于烘箱烘干备用。完成下午试剂的配置工作。,2019/12/16,23,实验二-三PEG分子量/PEG浓度对-淀粉酶在双水相中分配的影响,2019/12/16,24,一实验目的,掌握PEG浓度/分子量对-淀粉酶分配行为影响的研究方法分析比较PEG分子量/PEG浓度对-淀粉酶分配行为的影响,2019/12/16,25,二实验原理,PEG的分子量对-淀粉酶的分配具有重要影响。随PEG分子量的增大，双水相分相动力增强，两相间差异增大，选择性增强；但PEG的疏水性增强，不利于蛋白向上相的分配。,2019/12/16,26,二实验原理,在PEG分子量一定的条件下，PEG浓度以及硫酸铵的浓度的改变均会改变改变两相间的性质差异，从而影响-淀粉酶在两相间的分配。,2019/12/16,27,三实验材料（PEG分子量的影响）,0.02mol/LPB7.0的配置：取6.1ml0.2M的Na2HPO4溶液加3.9mL0.2M的NaH2PO4混匀，用时稀释至2000mL。（全班一起配置，每组分取400mL于三角烧瓶）1%的-淀粉酶酶液：称取2g-淀粉酶溶解于200mL0.02mol/LpH7.0的磷酸缓冲液中。（全班一起配置，过滤后于4摄氏度备用）PEG800：称取65gPEG800，于60摄氏度水浴加热熔化备用。PEG2000：称取25gPEG2000，于60摄氏度水浴加热熔化备用。（全班一起配置）40%的硫酸铵溶液：称取80g硫酸铵，加适量pB7.0溶解，定重至200g。带刻度的玻璃离心管4根/小组；塑料离心管4根/小组；16根干燥的玻璃试管；,2019/12/16,28,四实验步骤（PEG分子量的影响）,PEG400为液体，直接添加1.6g，条件：PEG16%，硫酸铵20%，pH7.0,加完原料与蛋白后必须将离心试管沿轴向充分振摇，使固体充分溶解,2019/12/16,29,四实验步骤,1.上下相体积的读取：根据刻度读数直接读取,2.上下相蛋白含量的测定：上相稀释两倍，下相不稀释，测定OD280与OD260，通过公式1.45*OD280-0.74*OD260,2019/12/16,30,二实验材料(PEG浓度),PEG800溶液：同前0.02mol/LPB7.0的配置：同前1%的-淀粉酶酶液：同前40%的硫酸铵溶液：同前带刻度的玻璃离心管4根/小组；塑料离心管4根/小组；16根干燥的玻璃试管；,2019/12/16,31,三实验步骤（PEG浓度的影响）,总重量为10g，硫酸铵浓度固定为20%，PEG分子量选择800,称取的PEG800，对应的PEG浓度分别为多少？,2019/12/16,32,四实验步骤,1.上下相体积的读取：根据刻度读数直接读取,2.上下相蛋白含量的测定：上相稀释两倍，下相不稀释，测定OD280与OD260，通过公式1.45*OD280-0.74*OD260,2019/12/16,33,五实验注意事项,实验中各组添加量总重量为10g加完原料与蛋白后必须将离心试管沿轴向充分振摇，使固体充分溶解上下相分离时注意吸管小心吸出上相，将多余上相和少量下相弃去，换吸管，吸出下相。每个样品组均需设置空白对照，用于调零,2019/12/16,34,六实验数据处理分析,R=VT/VB-VT为上相体积；VB为下相体积。,K=CT/CB-CT为上相浓度；CB为下相浓度。,2019/12/16,35,六实验数据处理分析,分析分配系数是大于1还是小于1，以确定蛋白的分配选择性分析分配系数随PEG分子量的增大，其趋势是趋向等于1还是趋向远离1，显示两相性质差异以及蛋白分配差异分析回收率，确定蛋白质在选择性分配某相时，在该相的回收效率,2019/12/16,36,六实验数据处理分析（案例）,2019/12/16,37,六实验数据处理分析（案例）,2019/12/16,38,实验三五硫酸铵浓度、pH值对-淀粉酶在双水相中分配的影响,2019/12/16,39,一实验目的,硫酸铵浓度、pH值对-淀粉酶分配行为影响的研究方法分析比较硫酸铵浓度、pH值对-淀粉酶分配行为的影响,2019/12/16,40,二实验原理,在PEG分子量一定的条件下，PEG浓度以及硫酸铵的浓度的改变均会改变改变两相间的性质差异，从而影响-淀粉酶在两相间的分配。pH值会影响蛋白质及溶液的解离状态，从而影响蛋白质在两相中的分配。,2019/12/16,41,二实验材料(硫酸铵浓度),PEG800溶液：同前0.02mol/LPB7.0的配置：同前1%的-淀粉酶酶液：同前40%的硫酸铵溶液：同前带刻度的玻璃离心管4根/小组；塑料离心管4根/小组；16根干燥的玻璃试管；,2019/12/16,42,三实验步骤（硫酸铵浓度的影响）,对应的硫酸铵浓度分别为多少？,固定条件：PEG-800，PEG浓度20%，pH值7.0,2019/12/16,43,三实验步骤,1.上下相体积的读取：根据刻度读数直接读取,2.上下相蛋白含量的测定：上相稀释两倍，下相不稀释，测定OD280与OD260，通过公式1.45*OD280-0.74*OD260,2019/12/16,44,二实验材料（pH值）,0.02mol/LpH6.4的磷酸缓冲液的配置：取2.65mL0.2M的Na2HPO4溶液加7.35mL0.2M的NaH2PO4混匀，稀释至100mL，每组分25mL。0.02mol/LpH5.8的磷酸缓冲液的配置：取0.8ml0.2M的Na2HPO4溶液加9.2mL0.2M的NaH2PO4混匀，稀释至100mL。0.02mol/LpH8.0的磷酸缓冲液的配置：取9.47ml0.2M的Na2HPO4溶液加0.53mL0.2M的NaH2PO4混匀，稀释至100mL，每组分25mL。,2019/12/16,45,三实验步骤（pH值的影响）,固定条件：PEG-800，PEG浓度16%，硫酸铵浓度20%,2019/12/16,46,四实验数据处理,R=VT/VB-VT为上相体积；VB为下相体积。,K=CT/CB-CT为上相浓度；CB为下相浓度。,2019/12/16,47,四实验注意事项,实验中各组添加量总重量为10g加完原料与蛋白后必须将离心试管沿轴向充分振摇，使固体充分溶解上下相分离时注意吸管小心吸出上相，将多余上相和少量下相弃去，换吸管，吸出下相。每个样品组均需设置空白对照，用于调零,2019/12/16,48,六实验数据处理分析,分析分配系数是大于1还是小于1，以确