（食品科学专业论文）共轭亚油酸的分离纯化及检测.pdf

摘要 摘要 共轭亚油酸( c l a ) 是一种具有多种生理活性的天然脂肪酸，具有抗癌、减肥、抗粥 状动脉硬化、提高机体免疫力等作用。在理论上共轭亚油酸的异构体有5 6 种，近年来 研究比较多的是c - 9 ，t - i i c l a 和i ：- 1 0 ，c - 1 2 c l a ，前者具有抗癌的功效，后者有显著的减 肥作用。目前对于c l a 的研究集中在生理功能、微生物合成、来源等方面。 本文分别对共轭亚油酸气相色谱分析方法、共轭亚油酸的衍生化方法、共轭亚油酸 的分离纯化方法三个方面进行了研究。 采用a g i l e n t6 8 9 0 n 气相色谱仪，3 0 米长的毛细管柱可以将共轭亚油酸两种异构体 分离开。分离共轭亚油酸异构体相对理想的气相色谱条件为：进样口温度2 0 0 ；压强 5 0 k p a ；检测器温度2 6 0 ；程序升温条件：1 4 0 保持1 5 m i n ，以2 0 m i n 的速度升至 2 0 0 ，保持2 0 m i n ，以2 m i n 的速度升至2 4 0 保持1 0 m i n 。 选择化学合成的c l a ( 主要成分c 一9 ，t ii c l a 、t 1 0 ，c 一1 2 c l a ，理论上前者含量低于 后者含量) 作为研究对象，分别对三氟化硼一甲醇和硫酸一甲醇两种酯化方法进行了研究， 对酯化试剂的浓度，酯化时间，酯化温度进行了优化。得出b f 3 - m e 0 h 溶液酯化的最适 条件为b f 3 ：m e o h 质量比为1 0 ：1 0 0 ，酯化温度为4 5 ，时间为3 0 m i n 。h 2 s 0 4 一m e 0 h 溶液 酯化的最适条件为h 2 s 0 4 ：m e o h 质量比为1 0 ：i 0 0 ，酯化温度为3 5 。c ，时间为2 0 m i n 。比 较两种酯化方法，得到如下结论：三氟化硼一甲醇和硫酸一甲醇两种酯化方法均适合c l a 的衍生化，但是硫酸一甲醇衍生化试剂更适合c l a 异构体的分析。 用尿素包合法对化学合成的共轭亚油酸进行纯化，共轭亚油酸粗品尿素甲醇 = 1 ：2 5 ：8 ，包合温度为- 1 5 ，包合时间为6 h ，得到的共轭亚油酸纯度由7 0 提高到9 3 以上。纯化后的共轭亚油酸中t - 1 0 ，c 一1 2 c l a 的含量明显优于c 一9 ，t i i c l a 的含量，其 中c - 9 ，t - i i c l a 的含量由原来的3 5 增加到3 6 ，t 1 0 ，c - 1 2 c l a 的含量由原来的3 6 增 加到5 7 。 关键词：共轭亚油酸( c l a ) ，气相色谱，衍生化，纯化 a b s t r a c t a b s t r a c t c o j u g a t e dl i n o l e i ca c i d ( e t a ) i sa k i n do fs p e c i a lf a t t ya c i d i th a sm u c hp h y s i o l o g i c a l f u n c t i o ns u c ha s a n t i c a n c e r , w e i g h tr e d u c t i o n ，a n t i a t h e r o s c l e r o s i s ，i m p r o v i n go r g a n i s m i m m u n i t ya b i l i t ya n ds 0o n i nt h e o r y , c l ah a s5 6k i n d so fi s o m e r s t h ec - 9 ，t - 1 1c l a h a s t h ef u n c t i o no na n t i c a n c e ra n dt h et - 1 0 ，c - 1 2c l ah a st h ef u n c t i o no nw e i g h tr e d u c t i o n m a n y t r a i l sw e r ec o n d u c t e dt os t u d yt h ec l a p h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n ，m i c r o b i o l o g ys y n t h e s i s ，s o u r c e a n ds oo n 弧em e t h o do fg c a n a l y s i s ，d e f i v a t i z a t i o na n dp u r i f i c a t i o nw e r es t u d i e di np r e s e n t d i s s e r t a t i o n i s o m e ro fc l aw a si s o l a t e du s i n gc a p i l l a r yc o l u m no f3 0m e t e r sb ya g i l e n t6 8 9 0 ng c n eo p t i m a lc o n d i t i o nf o rg cw a so b t a i n e da sf o l l o w s ：t e m p e r a t u r ew a s2 0 0 c ；p r e s s u r ew a s 5 0 k p a ；d e t e c t i o nt e m p e r a t u r ew a s2 6 0 c n ec o n d i t i o nf o rt e m p e r a t u r ep r o g r a m m i n gw a s o b t a i n e da sf o l l o w s ：k e e p1 5 r a i na t1 4 0 c ；h e a t i n g u pt o2 0 0 。ca tt h es p e e do f2 0 。cp e rm i n a n dk e e p2 0 m i n ；h e a t i n g - u pt o2 4 0 。ca tt h es p e e do f2 0 cp e rr a i na n dk e e p1 0 m i n s t u d yw a sf o c u s e do nt h ee s t e r i f i c a t i o nm e t h o d so fb o r o nt r i f l u o r i d e - m e t h a n o la n d s u l f a t e m e t h a n o l ，c o n c e n t r a t i o no fe s t e f i f i c a t i o na g e n t ，e s t e r i f i c a t i o nt i m ea n dt e m p e r a t u r e 1 1 1 eo p t i m a lc o n d i t i o nf o rb f 3e s t e r i f i c a t i o nm e t h o dw a so b t a i n e da sf o l l o w s ：r a t i oo fb f 3t o m e o hw a s1 0 ：1 0 0 ，e s t e r i f i c a t i o nt e m p e r a t u r ew a s4 5 ，e s t e r i f i c a t i o nt i m ew a s3 0 m i n n e o p t i m a lm a s sf o rh 2 5 0 4t om e o hw a s1 0 ：1 0 0 ，t h ee s t e r i f i c a t i o nt e m p e r a t u r ew a s3 5 ，t h e e s t e r i f i c a t i o nt i m ew a s2 0 m i n t h r o u g hc o m p a r i n gt w om e t h o d sf o re s t e r i f i c a t i o n ，t h em e t h o d w i t hb o r o nt r i f l u o r i d e m e t h a n o la n ds u l f a t e m e t h a n o lw e r ea l lf i tt od e r i v a t i z a t i o nf o rc l b u ts u l f a t e m e t h a n o ls o l u t i o nw a sf i tt oa n a l y z ec l ai s o m e rm o r e n ec r u d ec l aw a sp u r i f i e du s i n gt h em e t h o do fu r e ai n c l u s i o n t h ep u r i f i c a t i o n c o n d i t i o nw a so b t a i n e da sf o l l o w s ：r a t i oo fc r u d ec l a ：u r e a ：m e t h a n o lw a s1 ：2 5 ：8 i n c l u s i o n t e m p e r a t u r ew a s - 1 5 ，i n c l u s i o nt i m ew a s6h o u r s n ep u r i t yo fc l a w a si n c r e a s e df r o m 7 0 t o9 3 i np r e s e n te x p e r i m e n t t h ec o n t e n to fc - 9 ，t 1 1c l ai n c r e a s e df r o m3 5 t o3 6 ， t h ec o n t e n to ft 1 0 c 0 1 2c l ai n c r e a s e df r o m3 6 t o5 7 i l a b s t r a c t k e yw o r d s ：c o n j u g a t e dl i l l 0 i e i ca c i d ( c l a ) ：g a sc h r o m a t o g r a m ( g c ) ：d e r i v a t i z a t i o n ： p u r i f i c a t i o n i i i 关于硕士学位论文使用授权的说明 论文题目：基堑亚澶酸数佥富纯丝丞捡冽 本学位论文作者完全了解大连轻工业学院有关保留、使用学位论文的规定，大连轻 工业学院有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅 和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内 容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 是否保密( 是) ，保密期至。切年争月口日为止。 学生签名：剑自导师签名：型鲢塑 妒 年竹月r 工日 第一章文献综述 1 1 共轭亚油酸概述 第一章文献综述 共轭亚油酸( c o n j u g a t e dl i n o l e i ca c i d ，c l a ) 是十八碳二烯酸，是亚油酸的立体和位 置异构体混合物的总称【啦】。对于具有共轭双键的十八碳二烯酸而言，如果条件允许，从 2 ，4 碳原子到1 5 ，1 7 碳原子有1 4 种可能的位置异构体。每一种位置异构体又有4 种几 何异构体( c i s ，c i s ；c i s ，t r a n s ；t r a n s ，c i s ；t r a n s ，t r a n s ) ，所以可能有5 6 种异构体。目前大约有1 7 种c l a 的异构体已得到证实，但是只有c i s 9 ，t r a n s 1 1 异构体是主要的存在形态1 3 一。近 年来研究者比较关注的两种异构体是c 9 ，t 1 1 和t 1 0 ，c 1 2 异构体，前者具有抗癌的作用， 后者有减肥的功效【5 , 6 1 。 其结构如下图： 图1 1 亚油酸和两种主要共轭亚油酸图 f i g 1 1c h e m i c a ls t r u e t r r eo fl aa n dc l a 1 2 共轭亚油酸的生理功能 共轭亚油酸是一种非常令人感兴趣的营养添加剂，已大量用于农业和食品工业。共 轭亚油酸能参与脂肪的分解和新陈代谢【5 1 ，诱导能量利用，导致体重下降且不储存脂肪， 第一章文献综述 缓和免疫反应的副作用的某些生理状态同，如提高维生素a 的水平。不管是在消化道中 合成或是从食物中摄取，共轭亚油酸都是在肠道中被吸收而分布全身，而后结合到血脂、 细胞膜及脂肪组织中。在肠粘液、肝和脂肪组织中可以检测到共轭亚油酸，哺乳动物还 能把比较多的共轭亚油酸分泌到乳中。另外，各种各样的研究表明了共轭亚油酸参与了 细胞内的化学过程【踟。 1 2 1 抗癌作用及机理 共轭亚油酸具有抗癌作用【9 1 。p a r i z a 及其同事在研究牛肉烧烤过程中诱变剂形成时发 现牛肉中含有能抑制诱变的成分，后来证实正是这些诱变剂具有抗癌特性。i p 等人进行 如下实验，在给老鼠喂食致癌剂d b i b a ( 7 ，1 2 一二甲基苯并蒽) 前的两个星期开始用含共轭 亚油酸的食物喂养出生3 7 天的老鼠。在基本饮食中共轭亚油酸的添加量分别是o 5 、 1 o 或1 5 ，结果老鼠癌症的发病率分别下降了1 7 、4 2 和5 0 ，乳腺肿瘤的数目分别 减少了3 2 、5 6 和6 0 。当老鼠用低剂量( 5 r a g ) d m b a 处理后，再用添) j n o 0 5 - , 0 5 共 轭亚油酸量的食物长期喂养，结果表明乳腺肿瘤发病率的下降与添加量相关。在致癌剂 处理前的五个星期内，用含共轭亚油酸的食物喂养出生5 0 天的老鼠也能很好地预防肿瘤 的生成，在以甲基亚硝基脲作为致癌剂的动物实验中也能观察到这种抑制作用。此外， 抑制癌症发生所需共轭亚油酸的含量与人类消费的食物中的水平相接近。共轭噩油酸所 有的异构体都能结合进入各组织的甘三酯分子中，但只有c 9 ，t 1 1 一共轭亚油酸能进入细 胞膜的磷脂中，因而此异构体被认为是具有生物活性的异构体。 对实验老鼠进行研究发现，共轭亚油酸能减少致癌物引起的皮肤癌、胃癌、乳腺癌、 结肠癌和胸腺癌等【1 0 l 。生理浓度的共轭亚油酸可以杀死或抑制用人类恶性黑素瘤、结肠 癌和胸腺癌培养的细胞。另外，共轭亚油酸还能调节细胞色素p 4 5 0 的活性，抑制癌过程 涉及到的鸟氨酸脱羧酶、蛋白激酶c 等酶的活性；抑制癌细胞中蛋白质和核酸的合成i l 。 癌症抑制机理【1 2 】：到目前为止已有好几个假设来解释共轭亚油酸作用的多向性，但 仍未能完全理解共轭亚油酸的作用机理。这些假设包括，抗氧化机理、促氧化剂的细胞 毒性、抑制核苷酸和蛋白质的合成、降低细胞增生活性以及抑制d n a 一加合物的形成和致 癌剂的激活。从某种角度来说，共轭亚油酸的抗癌作用可以归结为对生物体以花生四烯 酸为底物合成类二十烷的抑制作用。 2 第章文献综述 1 2 2 降低脂肪和增加肌肉 膳食c l a 可以降低各种动物，以及人体内的脂肪【1 引。有研究表明，在小鼠实验中， 喂食1 0 1 5 ( w w ) c i s - 9 ，t r a n s - 1 1 和t r a n s - l o ，c i s - 1 2 的c l a 天然混合物后，同对照 组相比，实验组小鼠具有较少的体脂肪和较多的肌肉。另外，用0 0 5 i 0 0 ( w , ) 的 c l a 混合物喂饲猪，可以增加饲养效率，即不影响体重，也可降低背部脂肪含量。用 0 0 7 0 5 ( w w ) 的共轭亚油酸混合物喂饲仔猪，5 6 d 后同对照组相比，不仅减少了脂 肪的沉积，而且喂养效率和瘦肉率都有提高。 研究表明，肥胖的成年男女摄入c l a l 8 0 d 后，c l a 处理组( 3 4 6 8 9 d ) 的体脂肪含 量下降。实验表明，中年人连续9 0 d 摄入添加有c l a 异构体混合物的食物后( 4 2 9 d ) ，同 对照组相比，体脂肪比例下降。经常进行身体锻炼的成年人，连续食用c l a 异构体 ( 1 8 9 d ) ，8 4 d 后同对照组相比，体脂肪含量下降。但也有研究表明( 2 0 0 0 年、2 0 0 1 年 z a m b e l l 等；2 0 0 0 年m e d i n a 等；2 0 0 0 年b e r v e n 等) ，连续6 0 9 0 d 摄入c l a 异构体的混合物 ( 3 0 3 4 9 d ) ，不会影响成人的脂肪含量、占肌体重的百分比、肌体重量和血脂含量。 研究结果的差异可能是由于摄入的c l a 异构体的种类和数量的不同造成的。 目前认为，c l a 抑制肥胖的主要机理是提高了代谢的速度1 9 , 1 4 ，所以增加了能量的消 耗。例如，用l ( w w ) 的c l a 异构体喂饲a k r j 鼠后，鼠的能量消耗增加，虽然在褐色脂 肪组织中，解偶联蛋白( u c p ) 基因的表达有些增加，但是在骨骼肌、白色脂肪组织和肾 中，解偶联蛋白( u c p ) 基因的表达没有上调。 1 2 3 抗粥状动脉硬化 共轭亚油酸能抗粥状动脉硬化。研究表明，饲喂含共轭亚油酸饲料的田鼠和兔子， 主动脉壁上的病灶逐渐变小变薄，血液中总胆固醇水平及坏胆固醇水平均较低，大动脉 中动脉硬化概率小f 埘。另有报道，共轭亚油酸能阻止脂肪和血小板在粥状病变的动脉壁 上沉积，这可能是共轭亚油酸抗粥状动脉硬化的重要原斟9 1 。 1 2 4 提高机体免疫力、促进生长 共轭亚油酸能提高机体免疫能力，促进生长f 1 6 】。研究表明，共轭亚油酸能促进细胞 分裂、阻止肌肉退化、延缓机体免疫力的衰退【1 7 1 。共轭亚油酸对免疫系统和发炎反应的 效果类似鱼油，二者可能以相似的机理发挥作用。在注入内毒素的老鼠中，共轭亚油酸 比鱼油能更好地防止内毒素产生的厌食和抑制生长等副作用。在对鸡的研究中发现了类 3 第一章文献综述 似的效果，在鸡的免疫系统受到内毒素等外界因素的攻击的情况下，共轭亚油酸能参与 能量分配并可促进生长。实验证明，当用添加共轭亚油酸的食物喂养怀孕期和哺乳期的 老鼠时，出生的小鼠比对照小鼠生长得更快。由于在奶中发现有共轭亚油酸，因此它可 能是重要的生长因子，在其它哺乳动物中同样也有类似的效果。共轭亚油酸提高免疫系 统的作用与其促进脾的白介素一2 细胞和t 细胞繁殖有关。 1 2 5 抗氧化性 共轭亚油酸具有抗氧化性1 1 8 l 。实验发现，共轭亚油酸的氧化速率与二十二碳六烯酸 类似，比亚油酸、亚麻酸要快，其共轭双健更易氧化，抗氧化性与花生四烯酸类似。 1 2 6 其它方面的作用 除上述功能以外，动物实验中还发现共轭亚油酸具有其它一些保健作用，如能改善 骨组织代谢，增大骨骼形成速率，对骨质疏松症，风湿性关节炎也有一定的缓解作用。 另外，共轭亚油酸还具有提高饲料效价、防霉变作用，共扼亚油酸的钠盐可以抑制霉菌 生长，无毒副作用，性质相对稳定。 1 3 共轭亚油酸的来源 1 3 1 自然来源 1 对亚油酸的瘤胃生物氢化作用 尽管c l a 已被认知多年，但共轭双烯结构在脂肪酸中不常见。在5 0 年代，研究人员 发现瘤胃微生物利用不饱和脂肪酸产生c l a 。c 9 ，t l 卜c l a 是亚油酸( c 9 ，c 1 2 - c 1 8 ：2 ) 被瘤 胃厌氧细菌( b u t y r i v i b r i o f i b r i s o l v e n s ) 生物氢化作用的第一个中间产品。而其下一步是共 轭双键氢化为t - l l 单键，最后的氢化过程便产生了硬脂酸( c 1 8 ：0 ) 。当生物氢化不完全， c 9 ，tl lc 1 8 ：2 逸出进入血液中，就可吸收进入乳腺并整合到乳脂中。故通过添加含高不 饱和脂肪酸的饲料，尤其是含亚油酸高的油脂类饲料，可强化乳脂中c l a 的浓度。 2 内源合成 k e l l ya n dk o l v e r 等( 1 9 9 8 ) 的研究显示，与对照组相比，虽然奶牛由混合日粮饲料转 换到青绿牧草饲养时生产性能显著下降，但饲养后期其乳脂中c l a 含量却提高了l 倍。 4 第一奄文献综述 d h i m a n ( 1 9 9 9 ) 的研究也表明，放牧且不补饲其他饲料的奶牛，其乳脂中c l a 含量比饲喂 典型日粮组奶牛高5 0 0 ，约为2 2 1 m g g 乳脂肪酸。 f r e n c h 等( 2 0 0 0 ) 的研究也表明，随着肉牛日粮中精料用量的减少及青绿牧草用量的 增加，肉牛肌问脂肪中c l a 的含量呈线性显著增加。b a e r 等( 2 0 0 1 ) 研究表明，与对照组 相比，对经产荷斯坦奶牛饲喂添加2 鱼油的日粮，可提高c l a 含量。c h o u i n a r d 等( 1 9 9 8 ) 也有类似报道。而t s u n e i s h i 等( 1 9 9 9 ) 在用日本黑色肥育肉牛进行的一项试验中表明，剁 碎稻草杆的摄入量与总饲粮消耗量的比率与肉牛皮下脂肪中c l a 浓度呈显著相关，说明 粗饲料消耗量与皮下脂肪中c l a 含量呈明显相关。这些研究表明日粮中即使包含低的亚 油酸，但若青粗饲料丰富或添加了鱼油，也可提高乳脂或肉脂c l a 含量。因此应该存在 另一条合成c l a 的途径。 c o d 等( 1 9 9 8 ) 进行的项研究表明，真胃灌注t r a n s - 11 c 1 8 ：1 ( 1 2 5 9 d ) ，在3 天灌 注期末，乳脂中c l a 含量提高了4 0 。为检查去饱和酶的重要性与内源c l a 合成的程度， c o da n dl a c y 等( 1 9 9 9 ) 又进行了奶牛真胃灌注苹婆酸( 一种1 9 碳脂肪酸，能特定抑制9 去饱和酶的活性) 的研究，结果显示苹婆酸导致乳脂中c l a 含量降低4 0 9 6 。由此说明c l a 合 成是借助于t r a n s - 1 1 c 1 8 ：l 的弘去饱和作用而完成的。g r i i n a r i 等( 2 0 0 0 ) 通过奶牛真胃 灌注实验也指出，通过使用1 4 ：0 1 4 ：1 比率作为苹婆酸抑制去饱和酶的指标，奶牛乳脂 中约有6 4 的c l a 来源于内源合成。即通过源自t r a n s - 1 l c l 8 ：l 的9 去饱和酶作用的内 源合成是奶牛乳脂中c l a 的主要来源。 g l a s e r 等( 2 0 0 0 ) 研究指出，饲喂富含c 1 8 ：l 反式脂肪酸的氢化脂肪的猪，背脂c l a 含 量高，表明猪可能通过内源性弘去饱和作用将反式脂肪酸酸转变为c l a 。s a n t o r a 等( 2 0 0 0 ) 研究表明，给小鼠饲喂l t r a n s - 1 卜十八碳烯酸( t v a ) ，约有1 1 4 1 2 5 的t v a 转化成 c l a ( c 9 、t 1 1 - c l a ) ，且转化发生在小鼠的脂肪组织。c l a 主要存在于反刍动物牛和羊等 的肉和奶中【1 9 】。这是由于在反刍动物肠道中厌氧的溶纤维丁酸弧菌亚油酸异构酶能使亚 油酸转化成c l a ，主要是以c - 9 ，t 一1 1 异构体形式存在。故天然的c l a 主要以反刍动物消化 道的微生物代谢产物存在。c l a 也少量存在于其他动物的组织、血液和体液中，植物食 品也含有c l a ，但其异构体的分布状况与动物食品显著不同。特别是具有生物活性的 c - 9 ，t - 1 1 异构体在植物中的含量很少。如在一般植物油中每克仅含有0 1 m g - - 一0 7 m g c l a ， 且其中c 一9 ，t - l l 异构体的含量少于5 0 。海洋食品中的c l a 含量也很少1 2 0 - 2 2 1 。 5 第一章文献综述 表1 1c l a 在食品中的分布引白( c h i ne t a l 1 9 9 2 ) 棚 t a b l e l 1d i s t r i b u t i o no fc l ai nf o o d 6 第一章文献综述 总之，自然界中c l a 的含量并不是很高，要想使共轭亚油酸充分发挥其优异的生理 功能，就不得不大量生产这个化合物。 1 3 2 人工合成 人工合成c l a 的方法主要有1 2 4 ，2 5 1 ：油酸烯丙醇脱水、蓖麻油合成共轭亚油酸、催 化剂催化亚麻油异构化、酶催化亚油酸异构化和碱性异构化五种方法。以下主要介绍两 种常用的方法：酶催化亚油酸异构化、碱性异构化法。 1 酶催化亚油酸异构化 可利用如老鼠肠道中的微生物、反刍动物溶纤维丁酸弧菌等无毒的微生物中亚油酸 异构酶催化亚油酸转化。溶纤维丁酸弧菌的1 2 一顺一1 1 一反异构酶能够使亚油酸和亚麻 酸转化成c 9 ，t 1 1 一共轭亚油酸，c 9 ，t 1 1 ，c 1 5 - 共轭亚麻酸。然而目前这些方法由于其局限 性而无法用于生产：如亚油酸不仅仅转化成共轭亚油酸，还会发生进一步氧化：另外， 如溶纤维丁酸弧菌的培养需要非常严格的厌氧条件，它还具有能使共轭亚油酸还原称其 他化合物的还原酶：而其他反刍细菌还能使c 5 、c 8 ，c 8 、c l l ，c l l 、c 1 4 的亚油酸加氢变 成硬脂酸。 为了能够在工业上生产c l a ，微生物应该是便宜、容易培育和使用的，并且是可食用 的。在所研究的微生物中，乳酸菌微生物可在发酵过程中产生c l a 、两种丙酸菌适合转 换亚油酸成细胞外的c l a 。嗜酸乳酸菌能比较有效地使亚油酸或甘油亚油酸酯变成共轭 亚油酸。乳酸菌微生物中含有亚油酸异构酶，且其作用位点是在c 1 2 双键上而不是c 9 双键上，能把亚油酸转化成c 9 ，t 1 1 c l a ，而不是t l o ，c 1 2 异构体。空气对它没有影响，而 有双键在c 6 上的脂肪酸会抑制其活性，但有双键在c 9 位置上的脂肪酸可提高其活性。 得到的共轭亚油酸可直接从细胞培养液中提取。亚油酸异构酶是膜结合蛋白，可以以细 胞形式反应，也可以以分离出的膜形式反应。反应条件最好在4 c 1 2 ，p h 8 0 8 8 之间，3 h 反应就已结束，每克细胞可产生7 8 m g 共轭亚油酸。得到的c l a 中c 9 ，t 1 1 异 构体的含量在9 8 以上，有少量的c 9 ，c l l 及t 9 ，t l l 异构体存在。脂类自动氧化的二级 产物烯丙基，羟基一油酸用酸催化甲酯化的方法可以转化为c l a 和其他产物，用碱催化 法则不能将其转化为c l a 。例如，油酸在日光下变成过氧化物，还原即可得到油酸的二 级产物8 一或1 1 一羟基油酸烯丙醇，在酸( 如b f 。，h c i ) 催化下，油酸烯丙醇转化成c l a 。 该方法的缺陷是不能把c l a 异构体分开【删。 2 碱性异构化 7 第一章文献综述 【白两卜a l ；c h 嚣c h 。佣( 啦h 禧 【白两卜饿= 鼎罨。c h 。佣啦7 饵热； g 琏1 昌c i - i ：c l e l 蔬c i - i 。c h ，( 儡) ，一c i ：x ：) r 。、：- - - - g 琏l 强 2 w 。c h ( 儡 ，一 娲馒= 镪，堪扩鲁) ，一芦 g 强1 c 陡一c 箍= 锶一c h = c h ( c n o7 一c r 牛 碱性异构化是目前最经济的c l a 制取方法。其异构化机理如上图，由于c l l 亚甲基处 于两个碳碳双键之闯，具有一定酸性，在强碱的作用下易脱去质子生成式所示碳负离 子中间体，该碳负离子的负电荷实际扩展为两个碳碳双键间的离域，离域作用可以用， ，3 个共振结构式表示，离域增加了中间体的稳定性，使脱质子反应易于进行。在 下步质子结合过程中，由于c 9 和c 1 3 都带有部分负电荷，能够与h 结合，从而可生成9 ，n 和l o ，1 2 两种位置异构的c l a 。理论上讲，存在如下8 种几何异构体， 1 口c 9 ，c 1 1 ；c 9 ，t 1 1 ； t 9 ，c l l ；t 9 ，t l l ；c 1 0 ，t 1 2 ；c 1 0 ，c 1 2 ，t 1 0 ，c 1 2 和t 1 0 ，t 1 2c l a 。不同异构体的生理作用 不同，由于天然存在的c l a 成分为t 9 ，t 1 1 异构体，该异构体被认为是最具生理活性的成分， 此外t 1 0 ，c 1 2 异构体也被认为具有某种生理活性。两t ，t 异构体无益于健康，应在合成过 程中避免生成。在碱性异构化反应中，为了能使强碱与油脂均匀混合，需要使用溶剂。常 用溶剂分为水和有机溶剂两类。用水作溶剂时，由于沸点低于反应温度，为了防止水分 蒸发，需要在加压下反应，这样将使反应增加压力影响因素。使用有机溶剂时，为了避免 大量使用溶剂，选择时需考虑碱在其中的溶解性。使用甲醇、乙醇等低沸点溶剂，也应在 压力下反应。通常在碱性异构化反应过程中黏度会有所增加。溶剂的蒸发将加速黏度增 加，从而影响搅拌等操作。使用沸点较高的有机溶剂可以使反应在常压及较高温度下进 行，但产物残留的溶剂不易除去。常用有机溶剂有乙二醇、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜 及丙二醇等，前3 种溶剂具有毒性，所得c l a 只能用于橡胶添加剂等工业用途。1 w a t a 等 用无毒丙二醇代替乙二醇，在亚油酸转化率和产品色泽方面驭得良好效果。国内也有采 用丙三醇作为溶剂的报道。所用的碱可以是氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化铯等无机碱。 也可以是甲醇钠、乙醇钠等醇钠或四乙基氢氧化铵等有机碱。其中氢氧化钾较常用，不仅 价格较便宜，而且较易溶解在水或丙二醇筹有机溶剂中。温度、时间等反应条件将影响 亚油酸转化率和产物异构体组成比例。红花籽油在l1 0 c 发生碱性异构化反应时亚油酸 转化率为2 6 1 5 ，在1 3 0 为7 8 1 2 ，当加热至1 7 0 反应时，转化率可达9 9 。i2 。但是 客 第一章文献综述 反应温度并非越高越好，当转化率达到一定值时，升高温度对其影响并不明显，相反，反 应温度过高，时间过长，部分c 9 ，t 1 1 2 t l o ，c 1 2 异构体会进一步稳定化生成t ，t 异构体，同 对其他异构体和未知物也会增加。当采用不同油脂原料时，也应对反应温度和时间作相 应调整。碱性异构化的主要缺点是所得产品为几种异构体的混合物，产品中c 9 ，t l1 异构 体约占2 0 - 一4 0 ，c 9 ，t 1 1 与t 1 0 ，c 1 2 异构体的比例约为l ：1 9 2 7 】，由于两者生理作用不同， 不同应用时需要不同比例，但是两者难以分离，使其应用受到限制。 综上所述，各种合成方法存在各自特点，其中碱性异构化是目前生产商品c l a 最经 济的方法。随着c l a 生理功能的深入研究，其应用前景及市场潜力将更加诱入。对于c l a 合成方法的深入研究也更加重要。 1 4 共轭亚油酸的研究历史 早在5 0 年代，就已经知道了含共轭双键的脂肪酸的存在。1 9 5 1 年n i c h o l s 等人通过碱 性异构化的方法用亚油酸合成了共轭亚油酸混合物。1 9 6 6 年k e p l e r 等人发现c 9 ，t 1 1 一共轭 亚油酸是反刍动物瘤胃内厌氧细菌( b u t y r i v i b r i o f i b r i s o l v e n s ) 生物氢化亚油酸过程中的 中间体【2 8 】。1 9 7 8 年p a r i z a 等人在研究烤牛肉过程中诱变剂的形成时，发现在未加工的和 烧烤的牛肉中含有一些能抑制诱变的物质，并推测其抑制诱变的活性能抑制癌症的发 生，这在后来的动物实验中得到证实。经分离纯化后确定这些抗癌因子为共轭亚油酬删。 1 9 9 0 年i p c 等人研究了共轭亚油酸与兔子动脉粥状硬化之间的关系，发现共轭亚油酸能 抗粥状动脉硬化，降低血脂在动脉壁的沉积【3 0 j 。c h i n 等人在研究中发现共轭亚油酸是老 鼠的成长因子【3 1 1 。p a r k 等人研究了共轭亚油酸对老鼠淋巴细胞功能和乳房肿瘤生长的作 用，结果发现共轭亚油酸能促进老鼠脾脏淋巴细胞及白细胞介素2 的生成1 3 2 。1 9 9 8 年 h o u s e k n e c h t 等人的研究结果表明饮食中的共轭亚油酸能使患糖尿病老鼠受损的葡萄糖 忍量正常化。最新的研究表明共轭亚油酸是过氧化物酶体增生因子激活受体q ( p e r o x i s o m ep r o l i f e r a t o r a c t i v a t e dr e c e p t o r 仅p p a r a ) 的高亲和力的配体和活化因子，并诱 导老鼠肿瘤细胞系中p p a r 响应的m r n a s 的积累。其中c 9 ，t l 卜共轭亚油酸是最强的脂肪酸 类型的p p a rq 配体之一。 共轭亚油酸的生产加工：在1 9 9 7 年以前，共轭亚油酸的合成主要是在实验室中应用 亚油酸通过化学方法合成( i p 等，1 9 9 1 ) 但这种方法合成的数量和效率都很低印j ，限制了 共轭亚油酸在动物生产中的应用。2 0 世纪9 0 年代中期，欧洲家公司以葵花油为原料， 采用强碱异构化法开始大量合成c l a 。接着又发明了应用造纸工业的废弃物来提取油酸 9 第囊文献综述 和亚油酸，进而合成共轭亚油酸( m t o ) 。现在世界上已有很多大型的、专门化的公司能 够合成c l a ，但这种化工合成的c l a 或m t 0 都含有1 6 的未知不可皂化物，因而限制 了其在食品和饲料添加剂中的应用。国内国家海洋局青岛海洋第一研究所通过低沸点溶 剂萃取技术在碱蓬籽中提取油脂，再从油脂中提取c l a ，纯度约为7 0 ，并已开始批量 生产。 1 5 脂肪酸的衍生化 油脂中脂肪酸特别是长碳链脂肪酸( 1 2 碳以上) 一般不直接进行气相色谱分析，其原 因是油脂( 脂肪酸甘油酯) 及其脂肪酸极性很强，是一种热敏性物质，在高温下不稳定， 易发生聚合、脱酸、裂解等副反应，沸点高，分析中易造成损失。若直接进行分析，柱 温很高，高温固定相难以选择，色谱峰易拖尾，保留时间不重复，有时有假峰出现等。 因此，对脂肪酸的色谱分析，一般都要进行前处理脂肪酸衍生化。 油脂脂肪酸衍生化，就是脂肪酸甲酯化或乙酯化m j 。它是把高沸点不易挥发汽化的 脂肪酸酯先水解或皂化得到脂肪酸和甘油，再使脂肪酸与甲醇或乙醇反应生成相应的脂 肪酸甲酯( 甲酯化) 或脂肪酸乙酯( 乙酯化) ，使其变成低沸点易挥发汽化的物质，或由油 脂直接与甲醇发生醇解反应制取脂肪酸甲酯，从而降低汽化温度，提高分离效果，有利 于气相色谱法分离并逐一测定其组成和含量的方法。要准确地测定各脂肪酸的组成和含 量，甲酯化反应是否迅速、酯化反应是否完全等是至关重要的。不同的油脂应该怎样选 择甲酯化方法，制成怎样的衍生化产物更有利于脂肪酸的准确测定，是做好色谱检测的 关键。 一般来说，对c ；以下的脂肪酸可衍生化为乙酯，丙酯或苯甲酯，c 。以上的脂肪酸转 变为甲酯，这样除可降低脂肪酸的极性外，还有利于选择固定相和进行色谱分析操作。 在现有的报道中，除在测定海豹油脂肪酸组成中e p a 和d h a 的含量时用到乙酯化方法外， 其余的衍生化方法中，绝大多数都用的是甲酯化方法。甲酯化方法有多种，以处理方法 分有重氮甲烷法、三氟化硼甲醇溶液法、硫酸( 盐酸氯化铜) 甲醇溶液法、酯交换法、四 甲基氢氧化铵法等。反应原理如下： 1 0 第章文献综述 矿 c h 2 o c r l o 9 h 2 邗ho 肛以一+ 3 c h 3 0 h 旱 = h o h + 3 r 琏 l o i r 、r 、r 、r 为c ，c l ，的垸基或烯烃基 1 6 不饱和脂肪酸的纯化 目前已有的不饱和脂肪酸的富集方法有：脂肪酶催化水解法、低温结晶纯化法、尿 素包合法、超临界c 0 2 萃取法、分子蒸馏法、吸附分离法等。 1 6 1 利用脂肪酶的特异性进行纯化 利用脂肪酶特异性催化水解、转酯和酯化反应的特性，能把很难分离的共轭亚油酸 酯异构体( 如碱异构化法所得的各种共轭亚油酸酯异构体) 分开。例如，白地霉脂肪酶只 能催化含9 z 双键的脂肪酶水解及转酯，故可以选择性地水解j , 顷- 9 、反一1 1 异构体酯，区 域选择率为1 2 ，黑曲霉脂肪酶的区域选择率更高，可达2 5 。顺一9 、反一1 1 共轭亚油酸在 正丁醇和水溶液中及黑曲霉脂肪酶催化下酯化成顺一9 、反一1 1 亚油酸正丁酯，而反一1 0 、 顺- 1 2 亚油酸不发生酯化反应，达到纯化的目的1 3 5 3 6 j 。 1 6 2 低温结晶纯化 该方法利用低温下不同的脂肪酸或脂肪酸盐在有机溶剂中溶解度不同来进行分离 纯化。一般来说，脂肪酸在有机溶剂中的溶解度随碳链长度的增加而减小，随双键数的增 加而增加。这种溶解度差异随温度降低表现更为显著。在干冰浴( 一5 8 ) 条件下，丙酮 溶液中的1 0 t ，1 2 c - 共轭亚油酸甲酯会沉淀下来，而9 c ，1 1 t 一共轭亚油酸甲酯仍保留在丙 酮溶液中，借此可将两者分开。另外，由于还存在1 1 ，1 3 - 共轭亚油酸甲酯，可以再在一6 2 下冷却，使9 c ，1 i t - 共轭亚油酸甲酯和残留在丙酮溶液中的少量1 0 t ，1 2 c - 共轭亚油酸 甲酯沉淀下来，而1 1 ，1 3 c - 共轭亚油酸甲酯保留在溶液中，以得到纯度更高的产品。低 温结晶纯化的方法比较简单，但产品的纯度不是很高，每种产品除含有本身的几种几何 异构体外，还有其他的位置异构体。 第一章文献综述 1 6 3 尿素结晶纯化 由于尿素能与结构线性较好的脂肪酸加成而形成结晶，而线性较差的脂肪酸仍留在 溶液中，故可利用尿素分离脂肪酸混合物。在盐酸存在的条件下，尿素与脂肪酸加成物 分解，即得到不饱和脂肪酸。含有杂质的脂肪酸可通过尿素结晶法制取天然的c l a 3 7 1 。 1 尿素包合的定义 尿素包合法是一种较常用的多价不饱和脂肪酸分离方法，其基本特点是可以把脂肪 酸混合物按脂肪酸不饱和程度的差异进行分离。 2 尿包法的发现 当b e n g e n 3 8 j 从牛奶中分离脂肪时，将脲加到牛奶中，以便脂肪从水中分离。当时， 这是定量测定牛奶中脂肪含量的可靠方法。在一系列实验结束时，他将几滴正辛醇加到 试样中以便达到最佳的分离效果。在溶液静置一段时间后，结晶就在水和脂相之间形成 了。分析表明，晶体中只含有脲和一些有机化合物。进一步实验表明，在无牛奶存在的 情况下，尿素同样能和正辛醇生成同样的结晶。尽管脲能和包括正辛烷在内的各种直 链脂肪烃类形成结晶，但不能和异辛烷反应。b e n g e n 发现，脲只能和直链分子反应，而 不能和支链分子反应。比较碳氢、醇、醛、酮、酸和酯的脲包物后，得出脂肪旅化合物 与脲形成包合物的两个基本条件： ( 1 ) 碳链必须大于4 个碳原子。 ( 2 ) 碳链必须是直链。 3 尿素包合的原理 脲包物以一个直链脂肪旗化合物为轴心【3 9 l ，尿分子之间能通过强大的氢键力饶着这 根轴心以右手盘旋上升，将这根轴心直链脂肪酸族化台物紧紧包合住，从而形成正 六棱柱。六个尿分子形成一个单位，即完成一圈盘旋，高度为1 1 1 a ，见图1 2 。尿素 分子在结晶过程中能够与饱和脂肪酸或单不饱和脂肪酸形成较稳定的晶体包合物析出， 而多不饱和脂肪酸由于双键较多，碳链弯曲，具有一定的空间构型，不易被尿素包合， 采用过滤方法除去饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸与尿素形成的包合物，就可得较高纯度 的多不饱和脂肪酸。 通常我们把包合物中的脲成为“主 物或“主 分子，把被包合的物质称为“客 物或“客分子。根据研究，包合物的两端是敞开的。包合物中的客分子与主分子之间 只有较微弱的范德华力。而没有像络合物螯合物那样的化学键。因此把包合物称为络合 物、加合物或螯合物都是不准确的。根据计算范德华半径可知，直链碳氢化合物的直径 1 2 第一章文献综述 为4 5 a ，而脲所形成的棱柱空穴的内径为5 5 a 。所以，直径大于5 5 a 的分子不能与脲 形成包合物，如碘代支链化合物很难或不能与脲形成包合物。 图1 2 尿素包合的六棱柱结构 f i g 1 2h e x a g o n a ls t r u c t u r eo fu r e ai n c l u s i o n 包合物的形成是一个放热过程。放热量随碳链长度的增加而增加，随不饱和度的增 加而减少，同一脂肪酸的甲酯比其异丙脂的放热大。不饱和脂肪酸包合物的稳定性为什 么较低，目前仍未有合理的解释。可能是由于不饱和脂肪酸链使碳的排列不规则，阻碍 了最佳平衡排列的形成。另一方面，可能是饱和脂肪酸分子的直径是形成包合物的最佳 直径，而不饱和脂肪酸顺式双键所形成的梯形结构使分子的最大直径增加。另外双键也 相应地缩短了脂肪酸分子的长度。此三个因素综合的结果使其结合力不如相应的饱和脂 肪酸强，尤其是第二个因素的影响。 由于脲包物的主分子将客分子紧紧地包合在中间，因而给客分子提供了层保护 层，阻止了氧和脂肪酸的直接接触，几乎可以完全避免客分子的自动氧化。 当脲或脂肪酸含量增加时，脲包反应平衡向脲包物形成的方向进行。 m ( f a ) + n ( u r e a ) = = = = ( f a ) m ( u r e a ) n 温度降低时，反应向脲包合物形成的方向进行。高度不饱和脂肪酸只有在极低温度 下才能形成脲包合物。饱和酸的脲包物的分解温度随碳链的增长而升高，随不饱和度的 增加而降低。 1 3 第一章文献综述 1 7c l a 的分析和检测 1