（化学工艺专业论文）聚丙烯酰胺类共聚纳米粒子固定脂肪酶的研究.pdf

摘要 摘要 聚丙烯酰胺类纳米粒子载体具有生物相容性好、无毒无味、耐酸碱、强度好等特点， 可通过廉价易得的丙烯酰胺与其它单体共聚得到。其分子链中含有氨基等反应基团，具 有较高蛋白质亲和性，可被广泛地进行化学改性，因而以聚丙烯酰胺类高分子合成材料 开发研制脂肪酶固定化载体前景看好。 本论文探索性地以聚丙烯酰胺类纳米粒子为固定化载体，采用共价键合的方法对 l i p o l a s e 的固定化条件及有机相中固定化酶的催化性能进行了考察，取得了这方面结果， 首先探索性的制备了小粒径单分散性好的p ( a m c o s t ) 和p ( a m c o a a c ) 微球，并对各影 响条件进行了讨论。其次以p ( a m c o s t ) 为载体，固定化的最佳条件为在p i l l 0 0 的缓冲 液下，吸附时间为1 2 h ，温度为3 5 - 3 6 。得到的固定化酶催化合成月桂酸月桂醇酯， 月桂酸与十二醇的摩尔比1 ：2 ，5 5 的条件下酯化反应催化效果最好。再次通过无皂乳 液聚合法探索性地制备了磁性高分子纳米微球，并将脂肪酶共价连接在微球表面。初步 研究了微球直径、锰的质量分数等因素对固定化酶活力的影响。结果显示随着微球直径 减小，固定化酶的偶联率和活力回收率逐渐增加。锰离子对固定化酶有明显的激活作用。 最后通过分散聚合法制备了小粒径的p ( a m c o a a c ) 微凝胶载体，用红外光谱和扫描电 镜对其进行了初步的表征。考察温度、p h 、含水量、底物摩尔比、反应时间对酶活性的 影响。与游离的脂肪酶相比，得到的固定化酶能有效地催化合成月桂酸月桂酯。实验同 时考察了固定化酶的贮存稳定性，在4 。c 下放置2 个月，酶活几乎没有损失。 关键词：聚丙烯酰胺，纳米粒子，脂肪酶，固定，酯催化 a b s t r a c t p o l y a c r y l a m i d el l a n o p a r t i c l e s v e c t o rh a st h ec h a r a c t e r i s t i co fg o o d b i o l o g i c a l c o m p a t i b i l i t y , n o n t o x i ca n dt a s t e l e s s n e s sa n dh i g hb o n ds t r e n g t h ，w h i c hc a nb eo b t a i n e db y c o p o l y m e r i z a t i o no fc h e a pa n da v a i l a b l ea c r y l a m i d ea n do t h e rm o n o m e r s t h em o l e c u l a r c h a i nc o n t a i n i n gr e a c t i v eg r o u p so fa m i n oh a sh i g hp r o t e i nc o m p a t i b i l i t yw h i c hc a nb eu s e d a sc h e m i c a lm o d i f i c a t i o n t h e r e f o r e ，p o l y a c r y l a m i d es y n t h e t i cm a t e r i a l su s i n ga sd e v e l o p i n g i m m o b i l i z a t i o nv e c t o ro fl i p a s eh a v eg o o dp r o s p e c t i nt h i s p a p e r , p o l y a c r y l a m i d en a n o - p a r t i c l e s w e r eu s e da si m m o b i l i z e d c a r r i e r , i m m o b i l i z a t i o nc o n d i t i o n sa n dc a t a l y t i c p r o p e r t i e si no r g a n i cs o l v e n to fl i p o l a s e w e r e i n v e s t i g a t e db yc o v a l e n ti m m o b i l i z a t i o n s e v e r a la s p e c t so fr e s u l t sw e r eo b t a i n e da sf o l l o w s ： f i r s t l y , t h em o n o d i s p e r s en a n o p a r t i c l e so fp ( a m c o s t ) a n dp ( a m c o a a c ) w e r ep r e p a r e d e x p l o r a t l y , a n de v e r ye f f e c tc o n d i t i o nw a sd i s c u s s e di nt h i sp a p e r s e c o n d l y , t h eb e s t i m m o b i l i z e dc o n d i t i o n sw e r ea t3 5 3 6 。c ，1 2 ha d s o r p t i o nt i m ea n d p i l l 0 0w h i l ep ( a m c o - s t ) u e s e da si m m o b i l i z a t i o nv e c t o r t h eb e s tc a t a l y t i c e f f e c t so fe s t e r i f i c a t i o nr e a c t i o nc a t a l y s i s e d b yi m m o b i l i z e de n z y m ew e r ea t5 5 m o l a rr a t i oo fl a u r i ca c i da n dl a u r y la l c o h o lw a sl ：2 t h i r d l y , b a s e do nt h ep r e p a r a t i o n o fp ( a m - - c o - s t ) - m n ( i r ) m a g n e t i cn a n o p a r t i c l e s b y e m u l s i o n ，l i p a s ew a si m m o b i l i z e do nt h i sn a n o p a r t i c l e sw i t hc o v a l e n tl i n k a g e i tw a sf o u n d t h a tw h e nd i a m e t e ro fn a n o - p a r t i c l e sd e c r e a s e dt h et h ec o u p l e dy i e l da n da c t i v i t yo ft h e i m m o b i l i z e dl i p a s ew a si n c r e a s e dg r a d u a l l y m n ( i i ) h a so b v i o u sa c t i v a t i o ne f f e c to n i m m o b i l i z e de n z y m e l a s t ，b a s e do nt h e p r e p a r a t i o n o fp ( a m c o a a c ) m i c r o g e lb y d i s p e r s i o np r e c i p i t a t i o np o l y m e r i z a t i o n ，t h em i c r o g ew a sc h a r a c t e r i z e db yi n f r a r e ds p e c t r u m a n ds c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e t h ee f f e c to ft e m p e r a t u r e ，p h ，w a t e rc o n t e n t ，s u b s t r a t e m o l er a t i oa n dr e a c t i o nt i m eo ne n z y m ea c t i v i t yw a si n v e s t i g a t e d t h ei m m o b i l i z e de n z y m e c o u l dc a t a l y t i cs y n t h e s i sl a u r i ea c i dl a u r y la l c o h o lc o m p a r e dw i t ht h a to ft h ef r e ee n z y m e 1 1 1 e s t o r a g es t a b i l i t yo fi m m o b i l i z e de n z y m ew a si n v e s t i g a t e d ，t h ea c t i v i t yo ft h ei m m o b i l i z e d l i p a s eh a sn o tb e e nd e a c t i v a t e do nt h ec o n d i t i o no f4 d e p o s i t e df o r2m o n t h s k e y w o r d s ：p o l y a c r y l a m i d e ；n a n o p a r t i c l e s ；l i p a s e ；i m m o b i l i z a t i o n ；e s t e rc a t a l y s i s i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名：e l 期： 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：导师签名： e l 期： 第一章综述 1 1 脂肪酶的研究概况 第一章综述弟一早琢尬 酶作为生物催化剂，具有很高的催化功能、底物特异性和反应特异性。近十年来， 随着生物技术的发展，酶催化反应作为一种手段越来越多地被有机化学家用于有机合 成，并应用于医药、农药、日用化学品等部门。 目前，有2 0 0 0 种以上的酶已被人们认识，其中2 0 0 多种已有市售。用于有机合成 中的酶大多数是脂肪酶和蛋白酶，尤以脂肪酶的应用更引人注目。 脂肪酶是一类糖蛋白，其分子量在10 0 0 0 一- - 10 0 0 0 0 左右，糖基部分约占分子量的2 1 5 ，主要成分是甘露糖。一般认为，脂肪酶是两极性分子，这是脂肪酶区别于其 它酶的显著特点，该界面对脂肪酶具有界面活化作用( i n t e r f a c i a la c t i v a t i o n ) 。近些年，对 脂肪酶结构，特别是对脂肪酶三维结构的研究，使人们对脂肪酶作用的理解取得了很大 的进展。 脂肪酶是水解油脂的酶类。脂肪酶的水解底物一般是天然油脂，其水解部位是油脂 中脂肪酸和甘油相连接的酯键；脂肪酶的另一个重要特点是它在异相系统，即油一水界 面上作用。脂肪酶在动植物各种组织及多种微生物中普遍存在l 。人们对脂肪酶的研究 已有上百年的历史，是最早被研究的酶类之一。早在1 8 3 4 年首次报道了兔胰脂肪酶的 活性；1 8 5 8 年报道了胃脂肪酶的活性；1 8 7 1 年报道了种子脂肪酶；而微生物脂肪酶直 到本世纪初才发现。经过各国科学工作者的努力，微生物脂肪酶的研究与应用取得了相 当大的发展，已有多种微生物脂肪酶获得纯化。脂肪酶产生菌中得到较深入研究主要集 中在根霉、曲霉、假丝酵母、青霉、毛霉、须霉、假单孢菌、色杆菌等具有工业应用价 值菌种以及在医学上有关的金黄色葡萄球菌、钩端螺旋体、粉刺状杆菌等。然而研究表 明，脂肪酶除了能够催化甘油酯类化合物的水解和合成之外，还可以用于催化酯交换反 应、生物表面活性剂的合成、多肽合成、聚合物的合成和药物的合成等，尤其是利用某 些脂肪酶的立体专一性，催化旋光异构体的拆分1 2 j 和手性药物的合成1 3 1 成为酶工程领域 研究的新热点。因而脂肪酶及其改性制剂在食品与营养、油脂化学品工业、农业化学工 业、造纸工业、洗涤和生物表面活性剂的合成以及药物合成等许多领域得到广泛应用。 1 2 脂肪酶固定化研究的重要性 八十年代以来，脂肪酶在应用方面的研究开发步伐加快，除水解油脂已进入工业化 外，利用脂肪酶所具有的不需要辅酶就能催化正逆反应的优点，用各种微生物脂肪酶， 在有机溶剂中催化酯合成及酯交换等反应，在人工合成酯( 包括酚酯、脂肪、糖脂等) ， 改性油脂生产、有机化学合成、消旋化合物拆分等众多应用上显示开发前景。近三十年 来，微生物脂肪酶的应用开发，也已由食品( 乳制品增香、代可可脂) 、助消化剂、化妆 江南大学顸：i ：学位论文 品、皮革和毛皮加工、洗涤剂、污水处理等，扩伸到脂肪酸生产，油脂加工，有机合成 化工产品、香料、药物制备等规模更大或更精细的医药，化工领域1 4 西l 。然而在使用酶 的过程中，人们也注意到酶的一些不足之处【”。例如：酶的稳定性较差，在温度、p h 和无 机离子等外界因素的影响下，容易变性失活；酶与底物反应结束后，即使酶仍有较高的 活力，也难于回收利用。这样一次性使用酶的方式，不仅使成本较高，而且难于连续化 生产；酶反应后成为杂质与产物混在一起，无疑给进一步的分离纯化带来一定的困难。 目前脂肪酶在油脂化学品开发中应用的主要障碍之一是经济费用。为了降低酶催化法的 成本，许多国家如日本、美国、印度等竞相开展了固定化脂肪酶的研究。固定化脂肪酶 具有可以回收，重复使用，稳定性高，产品质量高等优点。脂肪酶的固定化技术不仅在 工业生产的连续化和自动化上有重要价值，而且在生物学的基本理论研究中，在临床医 学和促进其他生化技术的发展中，都有重大的意义i & 1 0 j 。 1 3 脂肪酶固定化载体材料 多年的研究表明脂肪酶固定化过程中普遍应用的一些不溶性载体材料是多孔玻璃 及其衍生物、硅藻土、活性炭、离子交换树脂、纤维素及其衍生物、硅胶及其衍生物、 粘土、高岭土、矾土、二氧化钛、不锈钢、尼龙、聚乙烯及其衍生物、聚丙烯及其衍生 物、聚苯乙烯、丙烯酸共聚物、聚丙烯酰胺、聚氨酯、琼脂糖及其衍生物、葡聚糖凝胶、 海藻胶质、胶原蛋白、微晶纤维素、聚乙二醇吸附到磁铁矿、真菌菌丝体碎片或细菌的 细胞壁。还有各种形式的人工合成载体。根据文献报道，对于大多数脂肪酶来说，其中 聚乙烯、聚丙烯、琼脂糖、聚丙烯酰胺和葡聚糖凝胶等是固定化脂肪酶的优良载体【1 1 1 。 1 3 1 壳聚糖 壳聚糖类载体是近年来国内外研究最热门固定化材料之一，利用壳聚糖作为载体以 戊二醛为交联剂固定化方法，兼有吸收和共价结合作用，具有堆积密度低、无毒、化学 性质稳定、耐热性好、易接枝改性等优点，这使其在固定化技术中倍受青喇1 2 i 。近年来， 许多学者以壳聚糖为载体对脂肪酶固定化进行探讨，如：吴茜茜等1 ”l 研究壳聚糖吸附和 戊二醛交联对脂肪酶进行固定化，酶活力回收率约为5 4 2 。固定化酶半失活温度由游 离酶4 7 提高到1 0 0 ，最适反应温度由4 0 上升到8 0 ，最适p h 由6 下降到5 5 ， 固定化酶k m 值由游离酶k m s 0 m g m l 增加到5 6 m g m l 。该固定化脂肪酶催化己酸、乙 醇合成己酸乙酯，转化率高达9 5 以上。同样，在适当条件下采用固定化脂肪酶催化合 成乙酸异戊酯、乙酸异丙酯，转化率均达9 0 以上。 1 3 2 纤维素 纤维素是最丰富天然有机物，用不同取代基取代羟基可制得多种改性纤维素，是固 定化良好载体。维素结构中存在大量羟基，可通过各种反应，如氧化、酯化、醚化、亲 核取代、接枝共聚和交联等制成多种纤维素衍生物而带有各种活泼基团，用于固定化研 究。彭立风1 1 4 1 等研究以纤维素滤纸膜为载体猪胰脂肪酶四种固定方法( 高碘酸钠氧化法、 2 第一章综述 对苯醌活化法、环氧氯丙烷活化法、壳聚糖涂层法) 优化固定化条件。 1 3 3 凝胶材料 凝胶具有良好生物相容性，与疏水聚合物相比，同被固定化酶之间只有弱得多的相 互作用，固定在凝胶中酶活性能保持较长时间，卡拉胶、海藻酸钠凝胶是应用较早凝胶 材料。b e t i g e r i l l 5 l 研究海藻酸钠固定化假丝酵母脂肪酶，并与其它固定化方法进行比较。 m a t s u m o t l l 6 1 等研究海藻酸钠固定化假丝酵母菌脂肪酶热稳定性。杨本宏等1 1 7 1 研究以海藻 酸钠为载体，用包埋法制备固定化德氏根霉脂肪酶条件，固定化酶在1 0 0 下保温m ， 仍可保持6 3 8 活力，将该固定化脂肪酶用于非水溶剂中正戊酸异戊酯合成，重复使用 6 次后，固定化酶仍保持9 5 酶活力。宋少芳等i l s l 以a 一单硬脂酸甘油酯水解反应为指示 反应，初步研究琥珀酸二辛酯磺酸钠( a o t ) 一正庚烷一明胶微乳液凝胶固定化脂肪酶在有 机相中水解催化活性。 1 3 4 磁性微粒 磁性物质作为一种绿色材料是近年来研究较多材料。1 9 7 3 年，r o b i n s o n 等l l9 l 第一 次将磁性物质作为酶固定化载体，此后，磁性载体越来越多应用于细胞和酶的固定化。 磁性微球应用于酶固定化方面具有以下4 大优点：( 1 ) 具有磁性，可方便简单进行分离和 磁性导向；( 2 ) 具有很好生物相容性；( 3 ) 其表面含有大量功能团；( 4 ) 分散性好。分散于 有机溶剂中磁性微粒吸附脂肪酶显示出较高酶活性，当把脂肪酶制成这种结合体时，它 能在有机溶剂中催化酯合成l 删，并易于用磁场从反应混合物中回收。磁性微粒除可利用 吸附法固定化酶外，还可利用共价交联法等其它方法。刘薇等| 2 1 】就采用共沉淀法制备 f e 3 0 4 纳米磁性粒子，经月桂酸处理后，获得平均粒径2 0 r i m 具有超顺磁性疏水性载体， 在有机介质中分散和再分散效果好。结果表明，经纳米磁性粒子固定化后，脂肪酶得到 活化，固定化酶比活为游离酶1 8 倍，固定化酶最适吸附时间为6 0 m i n ，酶用量：载体 量为l ：1 ，固定化酶酶活达到7 1 8 u g 。钱斯日古楞等1 2 2 l 以磁性淀粉微球为载体，采用戊 二醛交联法固定化脂肪酶，磁性淀粉微球主要组成是淀粉和磁粉。结果得到，磁性固定 化脂肪酶总活力、蛋白载量、比活、活性回收率、最适温度和最适p h 值分别为 4 8 9 7 1 5 u g 、5 0 5 9 m g g 、9 8 5 8 u m g 、7 2 7 3 、4 5 和8 0 。固定化脂肪酶和自由酶在4 下，p h 8 的p b s 和正己烷中保存3 4 d 后，其相对活力分别为7 8 3 和9 8 8 。 1 3 5 人工合成高分子材料 聚丙烯酰胺凝胶原先是作为区带电泳的载体而被应用的，但自从发现用它包埋的酶 仍具有活性以来，对以丙烯酰胺等单体为凝胶起始材料的包埋固定化方法已进行了各种 改性和应用。本法最初是b e m f e l d 和w 抽| 2 3 i 进行研究的，它是以丙烯酰胺( a m ) 为单体， n ，n 亚甲基双丙烯酰胺( b i s ) 为交联剂，n ，n ，n ，n 四甲基乙二胺( t e m e d ) 作为加速剂， 过硫酸钾( k p s ) 作为引发剂，经聚合反应而形成凝胶。p i z a r r oc 1 2 4 1 等人采用聚丙烯酰胺 为载体，对碱性磷酸酶进行了固定化，研究了不同单体交联剂配比对载体材料溶胀比和 江雨i 学坝：l 学位论义 固定化酶活的影响，并利用优化方法寻求了固定化酶保留酶活最高时对应的载体材料配 比。 1 3 6 其它天然物质 目前有许多学者也对天然载体材料很感兴趣，如：盛梅等1 2 5 1 研究蚕丝固定化脂肪酶 催化猪油水解性能，结果表明，在温度为5 5 。c 、p h 为8 2 条件下，固定化脂肪酶活性 最高。底物浓度高达5 5 ( w v ) 时，仍无底物抑制，在上述条件下，固定化脂肪酶间歇 水解猪油时操作半衰期约为2 6 0 h 。刘新喜等2 6 1 研究蛋壳作载体固定化脂肪酶催化棕搁 油甘油解合成单甘酯最佳工艺条件。曹飞等4 2 7 1 以硅烷化粉煤灰为载体，戊二醛为交联剂， 交联法固定化自制胰脂肪酶，考察固定化时间、给酶量、戊二醛浓度对固定化酶活力影 响，并着重研究固定化胰脂肪酶热稳定性，固定化酶在5 5 。c 仍可保持较高酶活。 1 3 7 复合材料 据大量研究发现，单一载体材料有一定局限性，因此，也有很多学者对复合材料进 行大量研究。如：邓彩等f 2 8 l 合成5 种新型酞胺一胺型树枝状分子复合二氧化硅载体，研 究它们对脂肪酶p p l 固定化效果。结果表明，载体上氨基含量、树枝链长度、表面基团 性质等因素对酶固定化效率和固定化酶相对活力都有较大影响，其中( 1 ) o 5 g ，型复合载 体上氨基含量最高1 6 4 6 m o l g ，对酶固定化效果最好；( 2 ) 树枝链增长，酶固定化效率和 固定化酶相对活力增大( 1 5 g 0 5 g ；2 0 g 1 0 g ) ；( 3 ) 表面含有羧基复合载体对酶固定化 效果明显大于表面含有酯基复合载体( 0 5 g 和1 5 g 经水解改性后，活力分别比水解前提 高3 5 4 和1 3 1 ) 。经测定，固定化酶最适温度为4 0 ，p h 7 5 ；最佳固定化条件：搅 拌时间为3 0 m i n ，加酶量为7 5 m g g ( 以载体计) 。 目前，国内外固定化载体研究取得很大进展，载体材料研究范围从传统以聚合物材 料为主发展到聚合物材料和无机材料共同发展局面；聚合物载体材料研究向功能化和精 细化方向发展；固定化材料朝高活力保持率、长使用寿命、易于分离和可再生等方向发 展。固定化新方法、新技术发展迅速。随着新技术、新材料在固定化中应用，及载体性 质和固定化方法与固定化酶与细胞性能之间关系研究更为深入，固定化技术研究一定会 取得更大成果，其应用范围会不断扩展。 1 4 脂肪酶固定化技术 目前，已成功地研究出许多种获得固定化脂肪酶的方法，可以分成两大类：1 化学 方法包括共价法和交联法；2 物理方法，包括凝胶包埋法、微胶囊法、物理吸附法、离子 交换吸附法以及酶结合到干的菌丝体或细菌的细胞碎片。 1 4 1 物理吸附法 物理吸附法也许是最直接的固定化方法。实验准备比较简单，所需的花费也少。 4 第一荦综述 1 4 1 1 载体为亲水载体 将脂肪酶固定到粉末状的亲水固体载体上的一般步骤是：首先把脂肪酶溶解于缓冲 液中，再将溶液和粉末混合均匀( 通过在烧杯中搅拌或在柱中渗透) ，移去上清液( 通过过 滤或简单的排水) ，最后将固定化酶干燥以便保存。用这种方法己被研究的载体有次乙 酰塑料、离子交换树脂、纤维素、乙基纤维素、硅胶、硅藻土、粘土、高岭土、矾土、 二氧化钛、尼龙、琼脂糖、葡聚糖凝胶、活性炭、微晶纤维素和多孔玻璃等。用亲水载 体固定脂肪酶时，具有一个普遍特征，就是脂肪酶的失活高。脂肪酶的失活由以下几个 因素决定：a 脂肪酶吸附到某一载体时，酶的结构发生了改变，降低了活性；b 只有少 量的酶被固定到载体上；c 疏水底物到达脂肪酶活性基团的能力下降；d 由载体造成的 空间位阻，约束了脂肪酶分子的灵活性。为了提高固定化酶的活力，避免活力丧失，在 固定化过程中加入一些添加剂来保护脂肪酶。蛋白质( 例如白蛋白、酪蛋白、明胶) 和聚 乙二醇是很有效的添加剂。 1 4 1 2 载体为疏水载体 一般认为，脂肪酶物理吸附到疏水载体上的操作与吸附到亲水载体上的操作相似。 疏水固体载体如聚丙烯粉末，在吸附酶前先用乙醇、异丙醇、甲醇、丙酮之类的极性溶 剂预先润湿。极性溶剂的应用可以减少吸附反应所需要的时间，而不采用预先润湿的操 作通常可以得到具有较高活性的固定化脂肪酶。预处理时采用非极性溶剂是不利的。疏 水载体有高密度聚乙烯、聚丙烯、苯乙烯、琼脂糖苯基衍生物等。研究表明：用具有疏 水特性的微孔性载体( 如高密度聚丙烯或高密度聚乙烯) 来固定脂肪酶，效果非常好。 1 4 2 凝胶包埋法 将酶包埋在各种凝胶内部的微孔中，制成一定形状的固定化酶。载体如：聚丙烯酰 胺凝胶和海藻酸钙凝胶| 2 纠。当树脂是疏水性载体时，通过包埋法制得的固定化脂肪酶显 示出较好的活力和稳定性。通过这一方法制备的固定化酶可以具有多种形状，如球形、 圆柱形或膜。由于聚合包埋过程可能对酶和酶所处的环境( ! z n p h 值、离子强度等) 产生一 定的影响，因此酶在固定化前后表现出来的性态有所不同：a 固定化增加酶的耐热性； b 固定化增加酶对变性剂、抑制剂的抵抗力；c 固定化会不同程度地改变酶的立体构象、 引入了载体的立体屏蔽和扩散阻力；d 周定化可以延长酶的操作和保存有效期。 1 4 3 微胶囊法( 半透膜包埋法) 将脂肪酶包埋于半穿透性聚合体膜内，形成微囊。这种固定化酶由以下方法制备： 将二氧化硅或粉末葡聚糖加到乙烯顺丁烯二酐共聚物或糊精的粘合剂溶液中，这些混和 物和在乙醇和丙酮混和液中的脂肪酶一起溶解，在热空气中雾化，得到直径为1 0 2 0pm 的胶囊。脂肪酶也可采用液体干燥法，包埋在聚苯乙烯，硅酮衍生物和乙基纤维素中， 在这种条件下制备的胶囊直径为1 0 2 1 0 3u n l 。微胶囊型的固定化酶在加速乳酪，凝乳的 成熟方面也有研究。现己成功地利用胶囊型的脂肪酶作为乳酪类的风味剂应用于生产。 5 江雨人学g f l ：l ：学位论文 1 4 4 离子交换吸附法 脂肪酶是蛋白质，它根据溶液的p h 值和组成蛋白质的氨基酸的种类携带电荷，因此 脂肪酶能够利用离子交换技术进行固定化。现有文献报道将脂肪酶固定到二乙基氨乙基 纤维素和阴离子交换载体女n d u o l i t e ( 离子交换树脂) 上。作为脂肪酶的载体，羧酸离子交 换树脂，大孔隙的离子交换树脂是固定脂肪酶的有效的载体。用离子交换吸附进行脂肪 酶固定化，条件温和，操作简便。只需在一定的p h 值，温度和离子强度等条件下，将酶 液与载体混合搅拌几小时，或者将酶液缓慢地流过处理好的离子交换柱，就可使酶结合 在离子交换剂上，制备得到固定化酶。用离子交换吸附法制备固定化脂肪酶，活力损失 较少。 1 4 5 交联法【3 0 3 1 1 交联法制备的固定化脂肪酶结合牢固，可以长时间使用。但由于交联反应条件较激 烈，酶分子的多个基团被交联，致使酶活力损失较大，而且制成的固定化酶的颗粒较小， 给使用带来不便，为此，可将交联法与吸附法或包埋法等方法联合使用，以取长补短， 这种方法称为双重固定化。现已获得固定在a m b e r l i t e 和d i a i o n ( 甲醛系树脂) 上的固定化 脂肪酶。脂肪酶也可以先用物理吸附法吸附到不锈钢珠上，再用戊二醛交联。脂肪酶还 可先吸附于p v ( 聚氯乙烯) 上，再用戊二醛交联。 1 4 6 共价法1 3 2 - 3 3 1 要使载体和脂肪酶形成共价键，必须首先使载体活化，使载体活化的方法很多，主 要有重氮法、迭氮法、溴化氰法和烷化法等。脂肪酶已成功地固定到溴化氰活化的琼脂 糖珠，纤维素和葡聚糖凝胶。用重氮法固定脂肪酶的载体有：聚丙烯酰胺、p 一氨基苄基 纤维素、聚丙烯酰胺衍生物、聚一p 氨基苯乙烯、硅藻土氨基丙烯衍生物和玻璃的芳基胺 衍生物等。用迭氮法固定化脂肪酶的载体有：c m 纤维素、c m 葡聚糖凝胶、聚丙烯酰 胺衍生物和w o f a t i t e ( 离子交换树脂) 。用共价法制备的固定化脂肪酶，结合很牢固，酶不 易脱落，可以连续使用较长时间，但载体活化的操作复杂，比较麻烦，同时由于共价结 合时可能影响酶的空间构象而影响酶的催化活性。 1 4 7 真菌菌丝法f 3 4 1 现己成功地用真菌或细菌产生的胞外脂肪酶固定到干细胞上。真菌菌丝体作为酶的 直接来源，因此省去了分离和外部固定化的步骤，脂肪酶固定到细胞壁上。 大多数酶在固定化以后，稳定性和使用有效寿命均有所提高，其原因可能是固定化 增加了酶构型的牢固程度，阻挡了不利因素对酶的侵袭，限制了酶分子间不利于稳定的 相互作用。但是如果固定化触及到酶的催化活性位点或是酶的活性敏感区，则会导致酶 的稳定性下降甚至酶失活由于包埋法具有吸附容量大、通用性强等诸多优点，而且适用 于这一方法的酶和聚合物载体也较多，所以目前针对包埋法的研究较多。 6 第一章综述 1 5 固定化酶的应用 1 5 1 医药领域 固定化脲酶是催化尿素分解的专一性水解酶应用于尿素生产控制和产品检验，广泛 用于临床医学、医学检验等，固定化脲酶在血液透析中有着极佳的应用前景p 川。 c e l l a p a n d i a n 等p 6 1 在壳聚糖上接枝甲基丙烯酸缩水甘油酯( g m a ) ，g m a 的环氧基团开环 与脲酶的氨基缩合制得固定化脲酶，其活性保留达8 6 1 5 ，4 。c 和2 5 保存6 0 d 后活性 仍保留7 3 o 和5 8 0 5 ，这种固定化酶用于血液中尿素的脱除和人工肾透析液的再生都 取得了很好的效果。固定化磷酸酯酶：人体中的低密度脂蛋白是主要的血浆胆固醇载体。 由于其在体内代谢缓慢，易形成高血浆胆固醇，以至引起心血管疾病。磷酸酯酶的作用 就是水解低密度脂蛋白上的磷脂，加速体内低密度脂蛋白的代谢。c h e n i 了7 1 等先用碳化二 亚胺对磷酸酯酶进行活化，再用壳聚糖进行固定，同时控制碳化二亚胺与酶的重量比不 大于1 0 磷酸酯酶与壳聚糖的重量比不小于1 0 。3 ，所得固定化酶能使血浆胆固醇降低 3 2 0 。固定化葡聚糖酶：葡聚糖酶常用于水解在血液替代品的制备过程中产生的右旋 糖酐。m o h a m e d 等【3 8 j 用物理吸附和共价交联2 种方法制备了壳聚糖固定化葡聚糖酶， 发现共价交联法获得的固定化酶的相对酶活性最高达6 3 o ，而且固定化酶的最适反应 温度也从游离酶的6 0 升高到8 0 其催化能力比游离酶提高3 倍。固定化脂肪酶：布 洛芬是一种常用的非甾体类抗炎药物，有解热、镇痛、消炎和抗风湿作用，它有s ( + ) 型和r ( 。) 型2 种对映体，但只有s ( + ) 型布洛芬有生理作用，r ( ) 型的布洛芬不但没有生 理活性，而且具有毒副作用。传统的化学方法很难对光学异构体进行拆分。赵国俊等p 引 用自制的高脱乙酰度，高分子量的壳聚糖，通过成囊装置包埋含有不对称水解布洛芬酯 的脂肪酶的丝孢酵母进行固定化，并且戊二醛交联，制得直径1 0 m m 左右的固定化酵 母细胞壳聚糖多孔微球，酶活性保持超过8 0 0 ，操作半衰期超过7 5 d ，而且固定化酶 的最适反应温度从未固定化时的3 5 提高到4 5 。 1 5 2 环保领域 固定化酶在环保领域和生命健康领域中有广泛的应用。d a n n i b a l e 等1 4 0 j 用壳聚糖吸 附漆酶后，再以1 0 的戊二醛进行交联固定，所得固定化漆酶的热稳定性得到了很大的 提高，在7 5 和8 0 固定化酶分别保持了6 5 o 和5 0 o 的相对活性，而游离酶仅有3 5 0 和1 2 o 的相对活性，多酚氧化酶也是一种将芳香类和酚类物质氧化为醌类化合物的酶。 e d w a r d s 等【4 1 1 用聚砜毛细管膜复合壳聚糖凝胶吸附多酚氧化酶制备固定化酶，其活性保 持了8 3 o ，与传统的聚砜毛细管固定的多酚氧化酶相比，8 h 内前者可清除1 2 2 4 m g 污染 物，而后者只能清除2 0 3 m g 污染物。张寒飞1 4 2 1 等用磁性固定化漆酶去除苹果汁中的酚类 物质发现，以磁性聚苯乙烯为载体，戊二醛为交联剂制得的磁性固定化漆酶与底物亲和 力显著提高，其热稳定性、贮存稳定性和p h 稳定性较游离漆酶均有所增强，苹果汁经固 定化漆酶在4 0 处理2 h 后，其多酚含量减少2 0 ，而酶活性没有变化。杨雪梅等【4 3 l 选用 硅胶、活性炭、大孔树脂3 种载体在一定条件下用物理吸附法固定蛋白酶，3 种载体固定 7 江雨人学坝：卜学位论文 的蛋白酶对含高浓度蛋白质的淀粉黄浆废水进行水解实验，发现大孔树脂对蛋白酶的固 定效果良好，并对含高浓度蛋白质的废水处理效果最好，其最佳反应的p h 值为5 5 ，反 应进行0 5 h ，酶的催化效果最好，氨基酸产生速度达3 0 8 2 m g m i n ，且在3 h 后该速度仅减 少3 7 4m g m i n ，6 h 对蛋白质的去除率达到3 9 9 3 ，臭氧在潮湿的空气中容易生成过氧化 氢。 1 5 3 食品工业 在饮料加工过程中利用漆酶可以氧化酚类物质，使其聚合，这既可使果汁在加工过 程中快速澄清，又解决了果汁长时间储存所产生的后浑浊问题。且不用聚乙烯吡咯烷酮、 活性炭及吸附剂处理，污染问题少。有报道显示可将固定化的漆酶用于苹果汁的澄清和 儿茶酸的去除| 4 引。淀粉酶及糖化酶是现在仍在研究的固定化生物催化剂，将糖化型淀粉 酶吸附在二乙氨乙基纤维素上，作为催化剂并悬浮在3 0 的淀粉溶液中，在5 5 搅拌水 解，几乎可定量连续地得到葡萄糖溶液。淀粉酶及糖化酶能催化淀粉转化为葡萄糖，是 较早研究并仍在研究的固定化生物催化剂，仅淀粉酶与糖化酶的共固定化实现了淀粉的 液化与糖化2 步反应的合二为一、淀粉一步水解为葡萄糖且操作半衰期可达9 2 0 h ，而当a 一 淀粉酶、糖化酶及葡萄糖异构酶共固定化时又可使淀粉转化果糖。不仅如此，酶尚可与 细胞等其他生物分子构成共固定系统，2 种或多种有联系的酶共固定化构成更为复杂的 生物转化系统，能将复杂的生物反应过程简单化，是颇具新意的研究思路。其次，淀粉 及纤维素是地球上贮量丰富的可再生资源，通过固定化酶催化水解实现其高附加值转 化，符合社会经济可持续发展的时代要求，如固定化蜗牛酶对纤维素的降解具有良好的 酶催化活性，固定化酶应用于食品检测! 固定化酶技术的发展使生物传感器应运而生， 它的问世不仅使食品成分的快速、低成本、高选择性分析测定成为可能，而且生物传感 器技术的持续发展将很快实现食品生产的在线质量控制，降低食品生产成本，并给人们 带来安全可靠及高质量的食品1 4 引。 1 6 立题依据 聚丙烯酰胺类纳米粒子无毒无味，耐酸碱，强度好，通过廉价易得的丙烯酰胺与其 它单体共聚得到，可得到颗粒状很细的聚丙烯酰胺类载体。聚合物分子链中氨基作为固 定化载体具有高蛋白质亲和性；分子中有许多反应基团，可被广泛地进行化学改性；生 物相容性好，安全无毒，廉价易得等，且由于酰胺键对金属离子的螯和作用制成的固定 化酶活性不会受到溶液中c u 2 + 、c d 2 + 、n i 2 + 等离子的干扰和抑制，是一种极具潜力的固 定化材料。由于聚酰胺类高分子材料具有良好的抗微生物性能，机械强度大，有再生能 力和价格优势。因而以聚酰胺类高分子合成材料开发研制酶固定化载体前景看好。脂肪 酶是文献报道用于有机相反应较多的一种酶。应用游离酶在有机溶剂中进行催化反应存 在着很多缺点，如在有机溶剂中易聚集成团，使用后不易分离等。本论文设想，结合聚 丙烯酰胺类共聚纳米粒子优异的性能，希望通过分子设计制备出一种能提高固定化酶活 性收率、延长半衰期、降低成本的生物相容性及亲水性的智能载体，将脂肪酶固定在载 8 笙二至叁垄 体上，制成固定化酶，考察酶的固定化效果。选择制备固定化酶的方法、载体、以及固 定化过程的条件，使其具有高的酶活。考查固定化酶催化转酯反应的条件，以及是否具 备实际应用中应具备的热稳定性、操作稳定性、贮存稳定性等等性质。 9 江南人学硕二i ：学位论文 第二章脂肪酶基本性质的测定 本章研究内容是以游离脂肪酶为对象，考察温度、p h 等关键因素对脂肪酶的影响。 本章实验作为后续实验的准备工作，明确了水解的检测条件和定量分析方法，各种因素 对脂肪酶的活性影响。酶蛋白所具有的特异活性构象是分子中许多基团相互作用的结 果，当环境改变或一些基团的相互作用被减弱( 或完全消失) 时，就会引起一大部分结构 的很快崩溃，从一种有秩序的构象过渡到一种杂乱构象，这一现象就称为酶变性。酶的 空间结构一旦遭到破坏，活性中心的构象也就随之发生改变，酶因之失活。因此，酶失 活的实质是酶蛋白分子空间结构的改变或破坏。引起酶失活的因素主要包括： a )蛋白水解酶：水解肽链。 b ) p h ：大部分酶的活力受其环境p h 的影响，在一定p h 下，酶反应具有最大速 度，高于或低于此值，其便催化蛋白必需基团电离，强酸强碱条件下出现肽键 水解、脱氨基作用，b 消除和外消旋化、氨基酸变化等。 c )多数酶最适p h 值在p h 6 8 之间，动物酶多在p h 6 5 - 8 0 2 _ 间，植物及微生物 酶大多在p h 4 5 - 6 5 2 间，l i p o l a s e 在碱性p h 范围内有很高的活力。 d )温度：温度对酶反应速度也有很大的影响，在达到最适温度之前提高温度， 可以增加酶促反应的速度。反应温度每增高1 0 c 。酶反应速度一般增加到原反 应速度的卜2 倍。但温度升高，也使酶逐步变性，导致h 键或疏水键破坏。酶反 应的最适温度就是这两种过程的平衡结果。 e )氧化作用：各种氧化剂可氧化芳香族氨基酸的侧链、蛋氨酸；半肌氨酸和 肌氨酸残基变性剂、去污剂、重金属离子、疏基试剂作用。 本章目的在于对脂肪酶的反应条件进行优化，通过不同影响因素的多水平实验找出 此酶在何种温度、p h 下可达到最佳的催化效果，为下一步工作提供可靠依据。 2 2 实验部分 2 2 1 主要试剂 液体脂肪酶l i p o l a s e1 0 0 l 1 0 万u m ln o v 0 公司馈赠 无水乙醇：分析纯，上海振兴化工一厂生产，使用前蒸馏纯化。 超纯水：中国华晶电子集团( 公司) 生产，直接使用或实验室自制。 氮气：中国华晶电子集团( 公司) 动力工厂生产，直接使用。 2 2 2 主要仪器 仪器和设备名称规格型号生产厂家 1 0 第二章脂肪酶基本性质的测定 电子天平 磁力搅拌器 旋转蒸发器 红外光谱仪 数字熔点仪 真空干燥箱 f a l 6 0 4 m l 。9 0 2 r 2 0 1 f t l a 2 0 0 0 w r s 1 a d z f 一6 0 30 a 2 3 脂肪酶活力测定 上海精科实业有限公司 上海浦江分析仪器厂 上海申顺科技有限公司 加拿大a b b 公司 上海精密科学仪器公司物理光学仪器厂 上海一恒科学仪器有限公司 2 3 1 测足原理 脂肪酶具有对油一水界面的亲和力，能在油一水界面以高催化速率水解这些不溶于水 的酯，如天然油脂等，反应产物为甘油二酯、甘油单酯、甘油和脂肪酸。水解生成的脂 肪酸，可以用标准的碱溶液滴定，以滴定值表示酶活力。 反应式为：r c o o h + n a o h = r c o o n a + h 2 0 该反应的重要特征是异相反应系统，即在油一水界面上发生作用；另外酶解反应通 常比较复杂，容易受到多种因素的影响，因此反应不十分稳定，这些都决定了脂肪酶活 力检测时误差比较大。 检测脂肪酶活力的方法有很多种，所使用的底物也很多，一般根据目的的不同选择 合适的底物和方法。三油酸甘油酯、三丁酸甘油酯和橄榄油是常用的检测脂肪酶活力的 底物，通过检测反应释放的脂肪酸多少来检测酶活力；也有人用乙酸对硝基苯酚酯和辛 酸对硝基苯酚酯作为测活底物，利用水解产生的具有颜色的对硝基苯酚酯检测酶活力。 为了使脂肪酶作用充分，要求有尽可能大的反应界面，用搅拌和振荡往往只生成暂时的 不稳定的乳化状态，油珠的表面积不够大，而且重复性很差。通过加乳化剂，并且用高 速搅拌的方式使油以微粒状态充分分散，制成稳定的乳化剂，这样可以尽可能减少试验 误差，提高脂肪酶活力检测数据的稳定性。我国科研人员利用橄榄油作为底物检测脂肪 酶活力时，测定结果十分不稳定，其中很大一部分是没有采用乳化方法或乳化处理不合 理造成的。 2 3 2l i p o l a s e 脂肪酶的提纯 从诺维信( 中国) 生物技术有限公司生产的l i p o l a s e 脂肪酶为液体酶，含有小分子稳 定剂、氨基酸等杂质。为得到纯酶，我们将液体酶置于透析袋中在去离子水中透析，早 晚各换一次水并磁力搅拌以加速透析。三天后冷冻干燥得到白色晶状固体酶。固体酶在 冰箱中储存备用。 2 3 3 脂肪酶的浓度与吸光值的线性关系 配制一系列浓度的脂肪酶溶液，采用考马斯亮蓝法测定其吸光值。以脂肪酶浓度为 横坐标，蛋白质的吸光值为纵坐标，再用最 b - - - 乘法进行回归，得标准曲线( 见图2 1 ) 。 江南火学硕：i j 学位论文 所得直线方程为y = 0 0 0 1 1 3 x ( 线性相关系数r = 0 9 9 9 2 5 ) 。 c o 甚 。0 直 02 0 0加o6 0 08 0 01 0 0 0 脂肪酶的浓度( u m 1 ) 图2 1 标准曲线 f i g2 1t h es t a n d a