（食品科学专业论文）赣南脐橙皮中橙皮苷的提取、纯化及其活性研究.pdf

摘要i i i irrlii llp i l l i ii1 i i iy 1 7 4 6 810摘要据目前研究，柑橘属类黄酮的单体种类约有6 0 余种，主要包括黄酮、黄酮醇、黄烷酮以及花青苷，以黄烷酮最为丰富，其中橙皮苷含量最多，而且表现出非常重要的生物活性价值。本课题选用具有江西地方特色的资源赣南脐橙皮为原料，提取、纯化脐橙皮中橙皮苷，并对其与d n a 、i g g 的相互作用进行了研究。结果如下：1 在紫外可见分光光度法( u 讥v i s ) 的基础上，通过比较直接测定法、n a n 0 2 p d ( n 0 3 ) 3 - n a o h 法、a i c l 3 法、醇碱法，确定醇碱法测定脐橙皮中黄酮类化合物。同时通过比较u v - v i s 和高效液相色谱法( h p l c ) 测定粗品中橙皮苷的纯度，得出u v - v i s ( 6 7 2 5 ) 较h p l c 法( 6 1 4 2 ) 测得的纯度高。为节约时间和成本，最终确定在提取及纯化的条件优化过程中用u v - v i s 法，h p l c的精确度更高，可用于样品最终纯度的测定。2 在单因素的基础上用响应曲面法对赣南脐橙皮中黄酮化合物的提取工艺进行了优化。结果表明：水浴提取赣南脐橙皮中黄酮化合物的最佳提取工艺为：提取温度6 9 9 6 ( 2 ，乙醇浓度( 体积分数) 5 0 4 6 ，液固比2 5 9 1 ：1 ，提取时间3 0 4 h ，提取一次，预测可获得黄酮化合物最大提取得率为2 9 7 ，经验证黄酮化合物平均得率与预测值较为接近。超声辅助提取赣南脐橙皮中黄酮类化合物的最佳提取工艺为：提取温度7 5、乙醇浓度5 8 9 1 、液固比3 0 6 8 ：1 、提取时间2 0 7 9m i n 、提取次数为2次，预测可获得最大黄酮类化合物得率为3 2 9 8 。对实验结果进行验证，在最佳实验条下做三次平行实验，平均得率为3 3 5 1 ，与理论值相差0 0 5 3 。通过比较水浴和超声辅助提取黄酮类化合物，可见超声辅助法优于水浴提取。本实验选用超声辅助提取。?3 通过d 1 0 1 、a b 8 、n k a i i 、n k a 9 四种大孔吸附树脂对橙皮苷静态吸附和解吸性能的比较，确定采用d 1 0 1 大孔吸附树脂纯化黄酮类化合物( 主要为橙皮苷) 。其最佳工艺条件是：上样浓度0 2 m g m l 左右：上样流速l m l m i n ；直接上样；洗脱液乙醇浓度为6 0 ：解吸流速为上样流速1 2 ，即0 5 m l m i m洗脱剂用量约为3 b v 。纯化后样品纯度最高达可达9 4 8 2 ，富集倍数最高可达摘要1 5 4 ，橙皮苷回收率为7 0 2 7 。d 1 0 1 可用于脐橙皮中橙皮苷的纯化。4 应用荧光光谱、紫外可见光谱技术研究了在生理酸度条件下( p h = 7 4 0 )橙皮苷与免疫球蛋白( i g g ) 相互作用。研究发现，橙皮苷对i g g 内源性荧光产生了猝灭作用，测定不同温度下橙皮昔对i g g 的猝灭常数，得出橙皮苷对i g g的荧光猝灭为复合式猝灭方式；热力学参数表明，二者结合的主要驱动力为疏水作用力；同步荧光和三维荧光图谱表明橙皮苷能够使i g g 的构象发生变化。5 采用紫外光谱法、荧光探针法、熔点实验及粘度实验，研究了在生理酸度条件下( p h = 7 4 0 ) 橙皮苷与d n a 的作用方式。结果表明橙皮苷与d n a 主要发生了嵌插作用。橙皮苷对d n a e b ，| 体系的荧光猝灭属于静态猝灭，求得2 9 8 k 、3 0 4 k 和3 1 0 k 温度下，橙皮苷与d n a e b 相互作用的结合常数分别为0 6 9x1 0 4 、1 2 9 1 0 珥和1 7 9 1 0 4 ，橙皮苷与d n a 有一个结合位点。关键词：橙皮苷；紫外可见光谱；荧光光谱；超声辅助；水浴法；脐橙皮；d n a ；免疫球蛋白。i la b s t r a c ta b s t r a c ta c c o r d i n gt or e c e n tr e s e a r c h ，t h e r ea r ea b o u t6 0d i f f e r e n tc i t r u sf l a v o n o i d sm o n o m e r s ，i n c l u d i n gf l a v o n e ，f l a v o n o l ，f l a v a n o n ea n dc y a n i n , e ta 1 t h em o s tr i c hf l a v o n o i d si nt h ec i t r u si sh e s p e r i d i n ，w h i c hd i s p l a y si m p o r t a n tb i o l o g i c a la c t i v i t y t h i sp a p a rs e l e c t e dt h ec h a r a c t e r i s t i cl o c a lr e s o u r c e si nj i a n g x ip r o v i n c e - - - g a n n a nn a v e lo r a n g ep e e l 嬲r a wm a t e r i a l ，t h ee x t r a c t i o na n dp u r i f i c a t i o no fh e s p e r i d i nw e r es t u d i e d ，t h e nt h ei n t e r a c i t o nf e a t u r eb e t w e e nh e s p e r i d i n 蜥t l ld n a ( i g g ) w a ss t u d i e dt o o 1 h er e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ：i o nt h eb a s i so fu v - v i s ，c o m p a r e dw i t hd i f f e r e n td e t e r m i n a t i o nm e t h o d s ( d i r e c td e t e r m i n a t i o nm e t h o d ，n a n 0 2 a i ( n 0 3 ) 3 - n a o hm e t h o d ，a 1 c 1 3m e t h o da n d7 5 e t h a n o lc o n t a i n i n go 1 n a o hm e t h o d ) ，s e l e c t e d7 5 e t h a n o lc o n t a i n i n g0 1 n a o hm e t h o da st h em e a s u r a t i o nm e t h o dt od e t e r m i n eh e s p e r i d i ni nn a v e lo r a n g ep e e l a tt h es a m et i m e ，t h ep u r i t yq u o t i e n to fh e s p e r i d i ni nt h ec r u d ep r o d u c tw a sd e t e r m i n e d ，w h i c ht h er e s u l to fu v - v i sm e t h o d ( 6 7 2 5 ) w a sh i g h e rt h a nh p l c ( 61 4 2 ) t os a v et i m ea n dc o s t ，u l t i m a t e l yd e t e r m i n e dt h a tu v - v i sm e t h o dw a su s e di nt h ep r o c e s so fe x t r a c t i o na n dp u r i f i c a t i o n ，a n dh p l cw a su s e dt od e t e r m i n et h ef i n a lp u r i t yo ft h es a m p l eb e c a u s eo fi t sh i g h e ra c c u r a c y 2 b a s i n go nt h ee x p e r i m e n to fs i n g l ef a c t o r ，t h eo p t i m u me x t r a c t i n gc o n d i t i o n so ff l a v o n o i d sf r o mn a v e lo r a n g ep e e lw e r eo b t a i n e db yt h er e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y ( r s m ) ，t h er e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ：t h eo p t i m u me x t r a c t i n gc o n d i t i o n so fw a t e rb a t hm e t h o d ：t e m p e r a t u r eo f6 9 9 6 ( 3 ，e t h a n o lc o n c e n t r a t i o no f5 0 4 6 ( v v ) ，t h er a t i oo fl i q u i dt os o l i do f2 5 9 1m l ga n de x t r a c t i n gt i m eo f3 0 4h w e r ef o u n dt ob et h eo p t i m a lc o n d i t i o n st oa c h i e v et h eh i g h e s ty i e l do ff l a v o n o i d s ( 2 9 7 ) t h eo p t i m u me x t r a c t i n gc o n d i t i o n so fu l t r a s o n i c a s s i s t e de x t r a c t i o n ：t h et e m p e r a t u r eo f7 5 ，e t h a n o lc o n c e n t r a t i o no f5 8 9 1 ，l i q u i d - t o s o l i do f3 0 6 8 m l g ，e x t r a c t i n gt i m eo f2 0 7 9m i nw e r ef o u n dt ob et h eo p t i m a lc o n d i t i o n st oa c h i e v et h eh i 曲e s tv a l u eo fd e g r e eo ff l a v o n o i d se x t r a c t i o n ( 3 2 9 8 ) t h ep r a c t i c a ly i e l dr a t eo fi i ia b s t r a c tf l a v o n o i d sw a s3 3 51 a sc a l lb es e e nb yc o m p a r i n g ，u l t r a s o n i c - a s s i s t e de x t r a c t i o nm e t h o dh a sm o r ca d v a n t a g e st h a nw a t e rb a t he x t r a c t i o nm e t h o d i nt h i se x p e r i m e n t , w eu s e du l t r a s o n i c - a s s i s t e de x t r a c t i o nm e t h o d 3 b yc o m p a r i n gs t a t i ca d s o r p t i o na n dd e s o r p t i o np r o p e r t i e so ft h ef o u rm a c r o p o r o u sr e s i n si n c l u d i n gd101 ，a b _ 8 ，n ka - ua n dn ka 9 ，t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h ed101t y p em a c r o p o r o u sr e s i ni st h e b e s t f o rs e p a r a t i n ga n dp u r i f y i n gh e s p e r i d i nf r o mn a v e lo r a n g ep e e l t h eo p t i m u mc o n d i t i o n sa r e ：i n j e c t i n gc o n c e n t r a t i o n0 2m g m l ，p h = 5 ，i n j e c t i n gv e l o c i t y1 0m l m i n , 6 0 a l c o h o la sd e s o r p t i o ns o l v e n t ，d e s o r p t i o nv e l o c i t yo f f l o w0 5m l m i na n de l u t i o nv o l u m e3b v t h ea n a l y t i c a lr e s u l ts h o wt h a tt h eh i g h e s tc o n t e n to fh e s p e r i d i na f t e rp u r i f i c a t i o n、析md101t y p er e s i ni s9 4 8 2 b yh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) 1 1 l ee n r i c h m e n tf a c t o ro fh e s p e r i d i ni s1 5 4w i t hr e c o v e r yr a t eo f7 0 2 7 t h u s ，i ti sf e a s i b l et os e p a r a t ea n dp u r i f yh e s p e r i d i nb ydio1t y p em a c r o p o r o u sr e s i n 4 t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nh e s p e r i d i na n di g gw a ss t u d i e db yf l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p ya n du v 二v i si np b y s i o l o g i c a lb u f f e rs o l u t i o n ( p h = 7 4 0 ) i tw a so b s e r v e dt h a t t h e r ew a sae n d o g e n o u sf l u o r e s c e n c eq u e n c h i n gr e a c t i o no fh e s p e r i d i nt oi g g n l eq u e n c h i n gc o n s t a n t so fh e s p e r i d i nw i mi g ow e r em e a s u r e da td i f f e r e n tt e m p e r a t u r e ，a n dt h eq u e n c h i n gm e c h a n i s mw a ss h o w e da sc o m b i n e dq u e n c h i n g ，n l et h e r m o d y n a m i cp a r a m e t e r si n d i c a t e dt h a tt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nh e s p e r i d i na n di g gw a sd r i v e nm a i n l yb yh y d r o p h o b i cf o r c e t h er e s u l t so fs y n c h r o n o u sa n d3 df l u o r e s c e n c es h o w e dt h a tb i n d i n go fh e s p e r i d i nt oi g gi n d u c e dc o n f o r m a t i o n a lc h a n g e so fi g g 5 mi n t e r a c t i o nb e t w e e nh e s p e r i d i na n de t - d n aw a si n v e s t i g a t e db yu v 二v i s ，f l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p y , v i s c o s i t ym e a s u r e m e n t sa n dd n am e l t i n gt e c h n i q u e si np h y s i o l o g i c a lb u f f e r ( p h = 7 4 0 ) t h er e s u l t ss u g g e s t e dt h a th e s p e r i d i nc a nb i n dt od n a ，a n dt h em a j o rb i n d i n gm o d ei si n t e r c a l a t i o nb i n d i n g t h eq u e n c h i n gm e c h a n i s mw a s s h o w e da ss t a t i cq u e n c h i n g t h eb i n d i n gc o n s t a n t so fh e p e r i d i n 、析t hd n a e ba t2 9 8 k 、3 0 4 ka n d3 1 0 kw e r ec a l c u l a t e da s0 6 9 x 1 0 4 、1 2 9 1 0 4a n d1 7 9 x10 4 ，a n dt h eb i n d i n gs i t e sw e r ea l la b o u t1 f va b s t r a c tk e yw o r d s ：h e s p e r i d i n ；u v - s p e c t r o p h o t o m e t r y ；f l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p y ；u l t r a s o n i c a s s i s t e de x t r a c t i o n ；w a t e rb a t h ；n a v e lo r a n g ep e e l ；c a l ft h y m u sd n a ；i m m u n o g l o b u l i n ( i g g ) jv目录目录摘要：。ia b s t r a c t i i i目勇乏v i缩写符号和代号x第1 章综述11 1 脐橙皮中黄酮类化合物简介。：11 2 黄酮类化合物提取方法研究进展21 2 1 水提法21 2 2 有机溶剂提取法21 2 3 碱溶酸沉法31 2 4 微波辅助法31 2 5 超临界流体萃取技术41 2 6 超声辅助法提取41 2 7 酶水解法51 2 8 双水相萃取法51 3 黄酮类化合物分离纯化研究进展51 3 1 重结晶法51 3 2 传统柱色谱法61 3 3 高速离心法61 3 4 膜分离法71 3 5 高速逆流法( h s c c c ) o 71 3 6 大孔吸附树脂法71 3 7 高效毛细管电泳法( h p c e ) 81 3 8 制备高效液相色谱法( p h p l c ) 81 4 检测方法的研究进展81 5 功能活性研究进展：1 0v 1目录1 5 1 抗菌消炎作用l o1 5 2 免疫调节作用1 01 5 3 抗氧化作用- 1 01 5 4 对心血管系统的作用1 01 5 5 抗癌作用1 l1 5 6 促进皮肤微循环1 11 5 7 其他作用1 l1 6 药物与生物大分子相互作用研究进展1 11 7 课题研究意义及主要内容：1 21 7 1 研究意义121 7 2 主要研究内容13第2 章橙皮苷含量测定方法的确定。1 42 1 实验仪器与试剂：- 1 42 1 1 实验仪器设备1 42 1 2 实验试剂1 42 2 实验方法l52 2 1 紫外分光光度法l52 2 2 高效液相色谱法1 52 3 结果与讨论1 62 3 1 紫外分光光度法162 3 2 高效液相色谱法1 72 4 ，j 、结1 9第3 章脐橙皮中黄酮类化合物的提取工艺研究2 03 1 实验仪器与试剂2 03 1 1 实验仪器设备2 03 1 2 实验试剂2 03 2 实验方法2 l3 2 1 样品中黄酮化合物提取流程图2 13 2 2 黄酮类化合物含量的测定2 lv i i目录3 2 3 溶剂法水浴提取2 13 2 4 超声辅助提取研究2 33 3 结果与讨论”2 43 3 1 溶剂法水浴提取2 43 3 2 超声辅助提取实验结果。2 93 4 小结3 3第4 章橙皮苷的纯化工艺研究3 54 1 实验仪器与试剂3 54 1 1 实验仪器设备3 54 1 2 实验试剂3 54 2 实验方法3 54 2 1 上样液的制备3 64 2 2 大孔吸附树脂的预处理3 64 2 3 大孔吸附树脂树脂含水率的测定3 64 2 4 大孔吸附树脂的筛选3 64 2 5d 1 0 1 大孔吸附树脂纯化橙皮苷的条件优化3 74 2 6 经d 1 0 1 大孔树脂纯化后的橙皮苷的分析方法3 84 3 结果与讨论3 84 3 1 大孔吸附树脂的含水率3 84 3 2 大孔吸附树脂的筛选3 84 3 3d 1 0 1 纯化橙皮昔条件优化4 04 4 小结4 2第5 章橙皮苷与人免疫球蛋白相互作用研究4 35 1 实验仪器与试剂4 35 1 1 实验仪器设备4 35 1 2 实验试剂4 45 2 实验方法4 45 3 结果与讨论4 55 3 1 橙皮苷对i g g 的荧光猝灭作用及机理4 5v l l i目录一5 3 2 橙皮苷与i g g 结合常数和结合位点，。4 65 3 3 橙皮苷与i g g 的作用力类型和结合距离4 75 3 4 免疫球蛋白构象的变化。4 85 4 小结：5 0第6 章橙皮苷与d n a 相互作用研究。5 l6 1 实验仪器与试剂516 1 1 实验仪器设备5 16 1 2 实验试剂5 26 2 实验方法5 26 2 1 橙皮苷与d n a 相互作用紫外光谱的研究5 26 2 2 橙皮苷对d n a - e b 荧光光谱的影响5 26 2 3 熔点实验5 36 2 4 粘度实验5 36 3 结果与讨论5 36 3 1 橙皮苷与d n a 相互作用的紫外光谱5 36 3 2 以e b 为探针研究橙皮苷与d n a 相互作用的荧光光谱5 46 3 3 熔点实验5 46 3 4 粘度测定5 56 3 5 荧光猝灭机理及结合常数的求取5 56 4 小结5 7至| 【谢5 8参考文献5 9攻读学位期间的研究成果6 7缩写符号和代号缩写代号h e sd n ase bfu v - v i sk s v足e胛r玎t m缩写符号和代号中文名称英文名称橙皮苷h e s p e r i d i n小牛胸腺脱氧核糖核酸c a l f t h y m u sd e o x y r i b o n u c l e i ea c i d三羟甲基氨基甲烷t r i s - ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e溴化乙锭e t h i d i u mb r o m i d e荧光强度f l u o r e s c e n c ei n t e n s i t y紫外一可见光谱u l t r a v i o l e t - v i s i b l es p e c t r o s c o p y动态猝灭常数d y n a m i cq u e n c h i n gc o n s t a n t结合常数b i n d i n gc o n s t a n t能量转移效率e n e r g yc o n v e ye f f i c i e n c y结合位点数b i n d i n gs i t e气体常数g a sc o n s t a n t粘度v i c o s i t y熔点m e l t i n gt e m p e r a t u r ex第1 章综述第1 章综述2 0 0 4 年，中国柑橘的生产面积为1 6 3 万h m 2 ，居世界第一位：产量为1 4 9 5 8万吨，仅次于巴西( 2 0 5 9 4 万吨) ，成为世界第二大柑橘生产国【l j 。2 0 0 6 年中国出口橘片罐头3 0 万吨以上，约占国际贸易量的7 0 ，成为世界第一大出口国。中国柑橘工业主要是柑橘罐头和柑橘果汁i q k 2 1 。自二十一世纪初以来，随着中国橙汁消费量的逐渐增长，中国开始重视汁用甜橙的发展。从国内橙汁消费发展趋势来看，预计中国橙汁的消费量2 0 1 5 年可达到3 0 0 万吨，2 0 2 0 年达到4 0 0 万吨【3 l 。但是这些产业利用的仅仅是柑橘果实，而柑橘皮的应用较少，大部分的橘皮资源都被废弃浪费掉。柑桔类水果无论是加工还是鲜食，桔皮是其主要的副产物，柑桔制罐头或榨汁后的皮渣相当于柑桔重量的2 0 4 0 。柑桔皮所含营养成分除氨基酸外，其余均高于果肉，尤其富含黄酮类、类胡萝b 素等物质 4 1 。近年来，欧美和日本等发达国家为了提高原料综合利用率，降低成本，提高附加值，相继从柑橘果品中分离提取出许多功能性成分，开发成系列高附加值产品，这些产品可用于食品、化工、保健品和化妆品等领域。目前国内在柑橘类果皮的生理活性成分方面的研究还处于起步阶段【2 】。因此，充分利用来源广泛、价格低廉的废弃橘皮资源，深度开发柑桔皮中丰富的黄酮资源，“变废为宝”，提高其经济附加值，研究其生理及药理学活性并应用于医药、食品领域等，具有重大的经济效益和社会效益 4 1 。1 1 脐橙皮中黄酮类化合物简介?黄酮类化合物是泛指两个苯环通过中央三碳链相互联结而成的化合物( c 6 c 3 c 6 ) ，由于这类化合物多数呈黄色或淡黄色，因此称之为黄酮。在植物组织中，此类黄酮大多与糖结合，以苷的形式存在，少部分以游离态存在。据统计目前已分离出的黄酮类化合物已有4 0 0 0 多种【5 1 。黄酮类化合物对光、热比较敏感【6 7 】。柑橘皮中含有多种化学成分，如香精油、天然色素、黄酮类化合物、果胶、香豆素类化合物、类柠檬苦素等【8 1 。据目前研究，柑橘属类黄酮的单体种类约第1 章综述有6 0 余种，主要包括黄酮、黄酮醇、黄烷酮以及主要存在于血橙中的花青苷，以黄烷酮最为丰富，而且表现出非常重要的生物活性【9 】。橙皮苷( h e s p e r i d i n )即柑桔素7 o 新橙皮糖苷，又称橘皮苷或橙皮甙，是桔皮的主要成分之一，为脐橙皮中含量最丰富的类黄酮化合物【1 0 1 ，并且大量存在于柑橘属类果皮中【i i l 。随果实的长大和成熟，橙皮甙的含量明显下降，直径为1 2 7 - - 2 5 4c m 的果实含橙皮苷占干重的1 0 ，当果实完全成熟后，橙皮苷含量就下降到0 5 以下 1 2 1 0 橙皮苷属于植物次生代谢产物中黄烷酮类化合物，纯橙皮苷针状晶体，里头发样，颜色为白色或苍白色，略有苦味，熔点范围为2 5 8 - - - - 2 6 2 ( 2 5 0 开始软化) 。分子式为c 2 f f l 3 4 0 1 5 ，分子量为6 1 0 5 道尔顿。橙皮苷在碱性溶液和嘧啶中易溶，得到澄清的黄色溶液，微溶于水( 2 5 下2 0 p p m ) ，乙醇( 7 8 下o 1 4 ) ，乙酸乙酯( 7 7 下1 5 0 p p m ) ，丙酮( 5 0 下3 0 0 p p m ) ，甲醇( 2 5 下0 2 8 p p m ) ，异丙醇( 8 2 下6 0 0 p p m ) ，几乎不溶于丙醇、苯和氯仿。在碱性溶液中打开环成查尔酮，为淡黄色的结晶。橙皮苷糖的连接部分为一个分子的芸香糖( 鼠李糖与葡萄糖以6 位数连接) 与橙皮素。它是构成维生素p 的成分，能防止动脉粥样硬化、心肌硬塞、流血不止、微血管脆弱，以及有许多其他的生理活性功能1 4 ，u j 。1 2 黄酮类化合物提取方法研究进展1 2 1 水提法水提法适用于水溶性黄酮类化合物的提取。该法成本低、设备简单、对环境及人类无毒害，适合工业化大生产，但提取率低，提取物中杂质较多( 如蛋白质、无机盐、糖类等) ，后续分离也比较麻烦，现在很少单一使用该法【1 4 1 。黎乃维等【1 5 j 采用水浸提法提取洋葱中的黄酮类化合物，用比色法测定洋葱中黄酮类化合物的含量，并对黄酮类化合物提取过程中各因素对提取率的影响情况作了研究，其影响的主次顺序为料液比 浸提温度 浸提时间。?1 2 2 有机溶剂提取法此法是根据黄酮类化合物与干扰物质的极性不同来选择合适的有机溶剂，2第1 章综述常用的有甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮及某些极性较大的混合溶剂进行提取。梁开玉【1 6 1 等以9 5 的甲醇作提取剂，从陈皮中提取橙皮苷。用正交实验法选择最佳工艺条件为：温度8 5 0 ，提取争h ，纯度为8 5 7 ，p h 值为4 。经两次重结晶，纯度可达9 4 7 。该工艺操作简单，稳定可行。所得橙皮苷样品的红外光谱图与橙皮苷的标准品红外光谱图相符。1 2 3 碱溶酸沉法碱溶酸沉法提取时，p h 调至1 2 提取效果较好，而结晶的p h 也应当在3 5 5 5 内【1 7 1 9 1 效果较好。黄酮苷类虽有一定极性，可溶于水，但却难溶于酸性水，易溶于碱性水，故可用碱性水提取，再将提取液调至酸性，黄酮苷类即可沉淀析出。此法简便易行，橙皮苷属于黄酮苷类物质，因此也可用此法提取。在用此法进行提取时，应当注意所用碱液的浓度不宜过高，以免在强碱性下，尤其加热时破坏黄酮的母核结构。在加酸酸化时，酸度也不宜过强，以免生成盐，导致析出的黄酮类化合物又重新溶解，降低目标物的提取率。当药材中含有大量果胶、粘液等水溶性杂质时，宜用石灰水或石灰乳代替其他碱性水溶液进行提取，以使上述含羧基的杂质生成钙盐而沉淀，不溶解于提取液中。这将有利于黄酮类化合物的后续纯化处理【z 0 。1 2 4 微波辅助法微波是频率介于o 3 3 0 0 g h z ，波长为0 0 0 1 l m 的电磁波，具有快速、高效、高选择性、对环境无危害等特点。微波辅助提取技术( m a e ) 是利用微波场的热效应、生物效应及“扰动”效应来加速物质的扩散溶解，提高化合物的提取率和含量。而微波场对黄酮类化合物的提取，主要是来源于微波对细胞膜的生物效应。当用微波处理时，原料细胞内的温度上升，压力增大，当超过细胞壁的承受力时，细胞发生破裂，细胞内的黄酮类化合物从细胞中释放出来，被溶剂溶解，又因为质量传递与热量传递的方向一致，这有助于黄酮类化合物的快速溶出【5 1 。现已广泛应用于天然产物活性成分的提取与分离。赵虹桥等 2 1 1 采用微波辅助法从槿柑果皮中提取橙皮苷，该法提取橙皮苷得率为2 0 2 ，具有高效快速的特点。白建华【冽等，采用正交法研究了微波辅助提取玉米须黄酮，并且与加热浸提法相比，提取时间缩短约9 1 0 ，提取率提高约1 1 。m i ng a o第l 章综述等 2 3 1 运用动态微波辅助法提取水母雪莲花中的黄酮类化合物，在提取条件为：功率1 2 0 0 w ，液固比5 0 1 ，提取时间6 0 m i n ，提取液流速5 0 m l s 时，提取率可达到4 9 7 。1 2 5 超临界流体萃取技术超l 晦界流体萃取法是利用超临界流体在临界温度和临界压力附近具有的特殊性能作为溶剂进行萃取的- f - j 科学，最常用的超临界流体为c 0 2 2 4 。超临界c 0 2 提取黄酮类化合物和传统的溶剂提取法相比具有以下优点：周期短，从提取到分离可一步完成；黄酮类化合物得率和含量高；提取条件温和( = 3 1 0 6 c ) ，保护了类黄酮的活性成分；无有机溶剂残留，具有环境友好的特点1 2 引。吕凛等酬研究了超临界c 0 2 萃取橘皮中黄酮类化合物的影响因素，在单因素的基础上，进行了l 9 ( 3 4 ) 正交优化。结果表明，对萃取率影响因素的主次顺序为：夹带剂用量 萃取压力 萃取温度 萃取时间。最佳工艺条件为：萃取压力2 0 0 b a r ( 1 b a r = 0 1 m v a ) 、夹带剂用量0 3 5 m l m i n 、萃取温度为5 5 、萃取时间为1 5 0 m i n ，黄酮类化合物的提取率为2 7 2 3 。m s l i z a 等【2 。7 】用超临界c 0 2萃取马兰属菹草中的黄酮类化合物，最优条件为：压力2 0 0 b a r ，温度5 0 ，动态提取时间6 0 m i n ，萃取率为3 9 8 。通过实验得出，各因素对萃取率的影响由高到低为：压力、温度和提取时间。1 2 6 超声辅助法提取超声辅助法作为一种新兴的提取方法，在植物有效成分的提取中已有较广泛的运用，此方法具有高效、省时节能等优点。超声辅助法的是利用超声的空化作用机理、热力学机理及机械作用机理来提取活性物质。其主要运用于苷类、生物碱、多糖、挥发油和有机酸的提取【z 引。超声法提取橙皮苷的报道也颇多。郝云彬等【2 9 】用甲醇从橘皮中提取橙皮苷，通过对提取时间、甲醇的浓度、料液比和橘皮粉碎的粒度等因素进行的研究，最佳的提取条件为液料比5 0 m l l g ，提取时间3 0 m i n ，橘皮的粒度为0 4 5 - - 0 0 8 m m 。y a q i nm a 等【l o 】比较了不同超声频率、提取时间、温度和溶剂下，超声辅助法提取桠柑中橙皮苷的效果，得出最佳条件是：以甲醇为溶剂，6 0 k h z ，4 0 0 c 下提取6 0 r a i n 。另外还得出超声功率在实验中对橙皮苷的提取影响很小。周冰p o j 采用正交实验考察了不同超声频4第l 章综述率( 2 5 k h z 和5 0 k h z ) 对从柑桔果皮中提取橙皮苷含量的影响，实验得出2 5 k h z提取效果较好。朱兆友等【3 l 】用超声辅助法和传统醇法提取鱼腥草中黄酮类化合物，并比较二者所提取黄酮的活性，结果表明超声辅助法提取对黄酮的活性无影响。?1 2 7 酶水解法对于一些黄酮类化合物被细胞壁包围不易提取的原料，传统的热水、碱、有机溶剂提取法，受细胞壁主要成分纤维素的阻碍，提取效率较低。恰当地利用酶处理这些植物材料，可改变细胞壁的通透性，提高有效成分的提取率p 2 1 。高荣海等【3 3 】通过正交试验，得到大豆异黄酮糖苷酶法水解为大豆异黄酮苷元的最佳工艺条件：在p h6 0 缓冲液体系中，酶解时间为9 0m i n ，酶解温度为3 8 ，加酶量为4 0m g ( 4 ) ，酶法水解率为8 2 5 5 。易建华和朱振宝【3 4 l 利用响应面，法优化了酶法提取芹菜黄酮的工艺，得到酶法提取的最佳工艺条件为t 酶解温度5 1 5 ，纤维素酶浓度2 3 u m l ，p h 4 7 ，酶解时间2 2 h ，在此条件下黄酮得率为0 8 8 。殷涌光等【3 5 】用b 葡萄糖苷酶对松针黄酮进行酶解修饰，使其抗氧蓝化性明显提高。1 2 8 双水相萃取法双水相萃取技术( a t p e ) 分离是依据原料在双水相体系中的选择性分配的原理。当物质进入双水相体系中，由于电荷作用和不同力( 如憎水键、离子键及氢键等) 的作用、表面性质的不同和溶液环境的影响，使其在两相中的溶解度不同，从而达到萃取的目的【3 6 1 。该法设备投资少，操作简单，无有机溶剂残留污染，具有较高的选择性和专一性，因此利用此法有希望为从天然植物中提取有效药用成分开辟一条新的思路【1 4 1 。目前该法已运用于黄酮类化合物的提取，例如，橙皮苷、山楂叶黄酮类物质、黄芩苷等的提取【3 阳引。5第1 章综述1 3 黄酮类化合物分离纯化研究进展1 3 1 重结晶法重结晶法是利用黄酮类化合物不溶于酸，易溶于热水、乙醇和丙酮的性质，将黄酮类化合物粗提取液先进行酸析，再用乙醇或者丙酮溶解提取，浓缩或氨化成盐析出，再用活性炭脱色，反复重结晶即可得到纯品f 4 0 】。1 3 2 传统柱色谱法【4 l 】硅胶柱层析法：主要用于分离极性较低的黄酮类化合物如黄烷类、二氢黄酮( 醇) 和高度甲基化或乙酰化的黄酮及黄酮醇、异黄酮。如用石油醚丙酮或氯仿丙酮系统分离桑叶中的黄酮类化合物【4 2 】。由于黄酮类化合物与硅胶有很强的吸附作用，而且易与硅胶中很多金属离子络合而不能被洗脱，所以在使用之前应用浓盐酸处理硅胶以除去金属离子，以免干扰分离效果。聚酰胺柱层析法样品容量大，分离效果好，适用于在制备分离工艺中应用。但洗脱速度慢，损失量大( 有时高达3 0 ) ，而且常有低分子量酰胺的低聚物杂质混入，装柱时需用1 0 盐酸或5 甲醇预洗除去低聚物。陶艳等【4 3 】研究了聚酰胺纯化独脚金总黄酮的工艺条件，表明该法简单易行，分离效果良好。葡聚糖凝胶( 3 z 要有s e p h a d e x l h 2 0 型和s e p h a d e x g 型) 是一种洗脱速度快、可重复使用、无损失的非常好的分离纯化黄酮类化合物的填充材料。其中s e p h a d e xl h - 2 0 的洗出液不含杂质，适用于从硅胶、聚酰胺柱色谱及纸色谱中分离之后的黄酮糖甙配基及糖甙的最终纯化。马俊利等m 】采用反复硅胶柱色谱法、s e p h a d e xl h - 2 0 柱色谱法对忍冬叶中黄酮化合物进行分离纯化，从忍冬叶7 5 7 , 醇提取中分离得到7 种黄酮类化合物。活性炭柱色谱法，活性碳易得到，价格低廉，在有机溶剂中吸附力小，在水中吸附力大；对小分子化合物的吸附力小于大分子化合物【5 1 。适用于纯化黄酮甙，尤其是初步纯化水或甲醇水溶液提取的植物粗提物中的黄酮甙【1 4 】。氧化铝柱色谱法，氧化铝的吸附作用很强。一般只用于无邻二羟基或3 位、5 位无羟基的黄酮化合物及甲基化黄酮的分离。6第l 章综述1 3 3 高速离心法高速离心分离法是通过离心机的高速运转，离心加速度超过重力加速度的上千倍，加速药液中的杂质沉淀并除去的一种方法。目前离心机有：沉降式离心机、过滤式离心机和碟片式离心机，其中沉降式离心机因具有操作简便、维修简单、不限沉淀量多少等优点而应用最为广泛。该技术用于类黄酮的分离纯化时，与传统的醇沉法相比，避免了沉淀过程有效的成分损失而保证了药物的药理活性，并具有工艺流程短、价格低廉、省时省力、容易实现工业化等特点，而且由于是物理分离纯化，不会引起提取液中黄酮类化合物的变化或损失【2 5 ，4 l 】。目前已有学者用此技术对苦养、藜蒿等所含黄酮进行纯化分离【4 5 嗣。1 3 4 膜分离法膜分离技术是借助于人工合成的、具有选择性透过的膜，利用温度差、电位差、压力差作为推力，基于物质能否透过膜及透过的速率不同，使流体中各组分得到分离或富集的方法【47 1 。超滤法( u f ) 是膜分离法的代表，通过控制超滤膜孔径大小，能有效除去提取液中大分子物质，故选用适宜孔径的超滤膜是提高产品收率和质量的关键【1 4 1 。陈玲等【4 8 】利用膜分离技术对紫花杜鹃粗提物进行纯化研究，实验结果表明，将粗提物依次用截留相对分子质量为1 0 5 、5 x 1 0 4 、1 0 4 的膜分离，其纯度可达4 6 0 7 。1 3 5 高速逆流法( h s c c c )此法是当前国际上较新的无固体载体的液液分配技术，最初由美国国立健康研究院i t o 教授研制开发。h s c c c 具有较强的适应性，可以从复杂的天然产物粗品中提取不同特性的有效成分【4 9 1 。袁嫒等【5 0 】，采用制备型高速逆流色谱技术对木蝴蝶甲醇提取物中的活性黄酮苷类化合物进行分离纯化，一步收集到五种高纯度黄酮苷类物质。t i m - y o uz h a n g 等利用h s c c c 从药材中分离出了黄酮类化合物和生物碱【5 。?1 3 6 大孔吸附树脂法大孔吸附树脂是一种人工合成的具有多孔立体结构的聚合物吸附剂，是在第l 章综述离子交换及其它吸附剂基础上发展起来的一类新型树脂【5 2 1 。其原理是依靠它和被吸附的分子( 吸附质) 之间的范德华引力及它巨大的比表面物理吸附而进行的。合成吸附剂具有较大的比表面积和类似活性炭颗粒的内细孔结构，这些多孔能从水溶液中有效的吸附小分子化合物。与其它溶剂萃取技术相比用合成吸附萃取剂能减少溶剂的使用量和增加操作的安全性【5 3 1 。按照单体的基本结构，吸附树脂大体可以分为非极性、中极性、极性及强极性四类树脂m 】。吸附树脂的吸附作用符合这样一个经验规律：非极性物质在极性介质( 水) 中易被非极性吸附剂吸附：极性物质在非极性介质中易被极性吸附剂吸附。另外，吸附树脂吸附物质的性能与孔结构性质有关，如孔径分布以及比表面积、孔径、孔容等【5 5 1 。大孔吸附树脂技术是近年来国内外新发展的技术，在医药领域特别是天然药物精制中应用广泛，是分离中草药有效成分的一种有效方法。该工艺操作简便，成本较低，树脂可反复使用，适合工业生产【5 3 1 。大孔吸附树脂法已应用于多种天然产物的精制纯化，如皂苷、黄酮、生物碱及其他【5 6 1 。马丽萍等【5 7 】比较了a b 8 、h p d l 0 0 、d a 2 0 1 b 和h p d 4 5 0 四种大孔树脂对粗橙皮苷的纯化效果。最终选用d a 2 0 1 b 作为纯化树脂；采用8 0 的乙醇溶液洗脱时，解吸率达到了将近9 0 ，并且洗脱峰对称性好、集中、无明显拖尾现象，精制后的橙皮苷纯度达到9 3 以上。裴咏萍等【5 8 】用大孔树脂对红风