（农产品加工及贮藏工程专业论文）PCR技术检测婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的研究.pdf

摘要 阪崎肠杆菌能引起严重的新生儿脑膜炎、菌血症、小肠结肠炎，并可能引起 神经功能紊乱，造成严重的后遗症，死亡率高达2 0 - - 5 0 以上，引起世界范围 内的广泛关注。通过研究发现婴儿配方奶粉是其主要的感染源。传统方法操作繁 琐，检测时间长，且灵敏度较低。本研究利用f t a 滤膜与p c r 技术相结合的方法 建立了一套从婴儿配方奶粉中快速检出阪崎肠杆菌的方法，缩短了阪崎肠杆菌的 检测时间，提高了灵敏度。 本研究以阪崎肠杆菌的1 6 sr r n a 基因为靶基因，选择特异性引物，进行p c r 扩增，检测婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌。对p c r 反应体系中镁离子浓度、引物 添加量及退火温度和循环数进行优化，以确定适宜的p c r 反应体系和扩增程序， 其适宜反应体系为：6 1 a l1 0 x p c rb u f f e r ，4g ld n t p s 混合物，2 5m 9 2 + 此( 2 5 m m ) ， 2 此1 0g m o l 正向引物，2 l1 0i x m o l 反向引物，0 2 5 此( 5u i x l ) t a q ，2 3 2 5i x l 水，总反应体系为5 0 江；其适宜的p c r 扩增程序为：p c r 反应采用冷启动，9 5 预变性5m i r a 变性9 5 1m i l l 退火6 l 0 5m i n 进行3 5 个循环。p c r 反应产 物在2 的琼脂糖凝胶中进行电泳，凝胶成像系统观察结果。对扩增产物进行了 测序，p c r 扩增产物序列与文献报道的靶基因序列的同源性达1 0 0 ，从而证实 p c r 扩增产物确为目的扩增产物。本研究共检测了1 6 株菌，以验证引物的特异 性，结果表明：4 株阪崎肠杆菌均为阳性结果；1 2 株其它菌株均为阴性结果。因 此该引物特异性强，可用于检测阪崎肠杆菌。 采用f t a 滤膜制备模板进行p c r 扩增，其方法的灵敏度为7 x 1 0 1c f u m l 。 采用f t a 滤膜制备模板，利用p c r 技术检测婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌， 以确定检出限。结果表明，经过4 h 增菌后婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的检出限 为7 1 0 0c f u 1 0 0 9 。可在6 h 内完成对婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的检测，比目i j i 普遍采用的传统检测的方法缩短了1 2 2 2 h 。 比较了检测婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的6 种模板制备方法，结果表明f t a 滤膜法可高效从样品中提取阪崎肠杆菌d n a ，可有效的消除p c r 反应的抑制因 子，灵敏度高、操作简便、耗时短，该方法明显优于其他方法。 对实际样品进行检测，将本方法与行业标准s n t1 6 3 2 1 2 0 0 5 方法进行比 较，确定本方法敏感性为1 0 0 ，特异性为9 8 2 符合率为9 8 2 。 本研究方法使用f t a 滤膜法制备模板d n a ，可高效的提取样品中的d n a ， 有效的消除p c r 反应抑制因子，操作简便，为p c r 快速检测食品中的致病菌构 建了一个技术平台。 关键词：p c r ；检测f t a 滤膜：阪崎肠杆菌：婴儿配方奶粉 s t u d yo np o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o na s s a yf o rd e t e c t i o no fe n t e r o b a c t e r s a k a z a k i ii np o w d e ri n f a n tf o r m u l am i l k a u t h o r ：c h e ns h a n s h a n m a j o r ：f o o dp r o c e s sa n dp r e s e r v i n ge n g i n e e r i n g s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rz h a n g w e i a b s t r a c t e n t e r o b a c t e rs a k a z a k i ii sc o n s i d e r e da no p p o r t u n i s t i cp a t h o g e na n dh a sb e e n i m p l i c a t e di nf o o dd i s e a s e sc a u s i n gm e n i n g i t i s 、b a c t e r e m i ao rn e c r o t i z i n ge n t e r o c o l i t i s s p e c i a l l y i nn e o n a t e sa n di n f a n t s 1 1 1 e f a t a l i t y r a t e sh a v er e a c h e da b o v e 2 0 - 5 0 o n l yp o w e r e di n f a n tf o r m u l ah a sb e e nl i n k e dt ot h ee n t e r o b a c t e rs a k a z a 肪f a n dt h es e n s i t i v i t yi sl o w e r i nt h i ss t u d y , t h eu s eo fp c ra m p l i f i c a t i o nw i t hf t a f i l t e r sw a sd e v e l o p e dt od e t e c te n t e r o b a c t e rs a k a z a k i if o r mi n f a n tf o r m u l aq u i c k l y a n dt h et i m eo fd e t e c t i o nw a ss h o r t e n e d i nt h i ss t u d y , t o o ku s eo fe s a k a z a 舡fo fs p e c i a ls e q u e n c e so fc o n s e r v a t i v e16 s r r n at od e s i g nas p e c i a lp r i m e r s i nt h ep c r p r o c e s s ，m ：g pc o n c e n t r a t i o n ，a n n e a l i n g t e m p e r a t u r ea n dp c rc i r c l e sa r eo p t i m i z e dt od e t e r m i n et h eo p t i m a lp c r t h e r e a c t i o nm i x t u r ec o n s i s t e do f5 0 9 l ：6 9 llox p c rb u f f e r , 4 b lm i x t u r eo fd n t p s 2 5 1 x lm g 肘( 2 5m m ) 2 p lo f10i t m o lf o r w a r dp r i m e r , 2 9 lo f101 t m o lr e v e r s ep r i m e r , 0 2 5 9 l ( 5 u l x l ) t a qe n z y m e ，d d h 2 02 3 2 5 i - t l t h er e a c t i o nw a sr u nu n d e rt h e f o l l o w i n gc o n d i t i o n s ：c o o ls t a r t ，d n ap r e - d e n a t u r a t i o na t9 5 f o r5r a i n d n a d e n a t u r a t i o na t9 5 f o r1m i n ，p r i m e ra n n e a l i n ga t61 ，r u n3 5c y c l e s t h ep c r p r o d u c t sw e r ee x a m i n e db y2 a g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s t h er e s u l to fs e q u e n c i n g 、c o m p a r e dw i t ht a r g e tg e n es e q u e n c es h o w e dt h eh o m o l o g yg o tt o 10 0 ，s op c r a m p l i f i e dp r o d u c t sw e r ec e r t i f i e d t h e r ew e r e16b a c t e r i a ls t r a i n st ob ed e t e c t e d i n c l u d i n gf o u rs t r a i n s o fe s a k a z a k i ia n d1 4o t h e rb a c t e r i a ls t r a i n se x c e p tf o r es a k a z a 舫fs t r a i ni no r d e rt od e t e r m i n es p e c i f i c i t yo fa m p l i f i c a t i o no fp r i m e r s t h e r e s u l t ss h o w e df o u rs t r a i n sb e l o n g i n gt op o s i t i v er e s u l t sa f t e rp r i m e r se x t e n d i n g ，t h e r e s u l t sw e r en e g a t i v ef o ro t h e rs t r a i n s i nt h i ss t u d yr e s u l tp r o v e dt h a tt h ep r i m e r su s e d i np c rw a ss p e c i f i ct od e t e c t i o nes a k a z a k i i t h es e n s i t i v i t yo fp c r - b a s e da s s a yw i t hf t af i l t e r sa st e m p l a t e sw a s7 1o 1 c f u m l t h ed e t e c t i o nl i m i to f es a k a z a k i fi nr e c o n s t i t u t e di n f a n tf o r m u l ab yu s i n gf t a f i l t e rf o rd n at e m p l a t ep r e p a r a t i o na f t e ra ne n r i c h m e n ts t e po f4hw a s7 10 u c f u 10 0 9 t h ew h o l ee x p e r i m e n t a lp r o c e d u r ec a nb ec o m p l e t e do n l y6h o u r s s h o r t e r12 2 2 ht h a nt h et r a d i t i o n a lb i o c h e m i s t r yd e t e c t i o n t h ee f f e c to fs i xm e t h o d so fe x t r a c t i n g d n af r o me n t e r o b a c t e rs a k a z a k i fi ni n f a n tf o r m u l aw e r ec o m p a r e d a ne m c i e n t e x t r a c t i o np r o c e d u r ew a sc o n f i r m e df o re x t r a c t i o no fe n t e r o b a c t e rs a k a z a k i id n a f r o mi n f a n tf o r m u l a e n t e r o b a c t e rs a k a z a k i fd n aw a se x t r a c t e du s i n gf t af i l t e r t h e d e t e c t i o nt i m eo fp c rm e t h o di ss i g n i f i c a n t l ys h o r t e rt h a nt h eo t h e rm e t h o d s i nt h i ss t u d y , r e a ld e t e c t i o nw a sm a d e n er e s u l ti n d i c a t e s ：t h es e n s i t i v i t yo ft h e m e t h o di s10 0 t h es p e c i f i c i t yi s9 8 2 ，a n dt h ec o i n c i d e n c er a t ei s9 8 2 p r e p a r a t i o no fp c rt e m p l a t e sw i t hu s i n g f t af i l t e r sm o r es e n s i t i v ea n dw a sa b l e t oe f f i c i e n t l yr e m o v ei n h i b i t o r st h a tc o u l da f f e c tt h ep c rr e a c t i o n t h er e s u l t so ft h i s s t u d yd e m o n s t r a t et h a t af i l t e r - b a s e dm e t h o dc a l l e f f i c i e n t l y b eu s e dt od e t e c t f o o d b o r n eb a c t e r i a lp a t h o g e n si nf o o d k e y w o r d s ：p c r , d e t e c t i o n ，f t af i l t e r , i n f a n tf o r m u l ap o w d e r ；e n t e r o b a c t e rs a k a z a k i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑皇垦盛些盘堂或其他教育机构的学 虚或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：储砷捌叶签字日期：砂口g 年多月夕日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解塑皇垦盔些盘堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权塑皇堡盔些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书 学位论文作者签名：鲐、耐知十乙：沤海 、( i 翱躲憾( j 移 签字日期： 渺髟年石月汐日签字日期：蹦年月p 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： p c r 技术检测婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的研究 1 1 立题背景及意义 1 引言 食品安全是一个重大的世界性公共卫生问题。2 0 0 0 年，世界卫生大会通过 了食品安全决议，制定了全球食品安全战略，将食品安全列为公共卫生的优 先领域。全球各地连续发生一系列的食源性疾病爆发事件：英国的疯牛病：日 本的出血性大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 和雪印牛奶的葡萄球菌肠毒素中毒事件；法国 的李斯特氏菌中毒；全球范围内的禽流感等引起全世界范围的震惊l l j ，食源性 疾病也已成为中国的头号食品安全问题。 1 9 6 1 年，英国两位科学家首次报道2 例由该菌引起的脑膜炎病例，1 9 7 9 年 m o n o r e 和t i f d 2 】首次报道了阪崎肠杆菌感染但无脑膜炎症状的新生儿菌血症， 以后在世界范围内由该菌引起新生儿脑膜炎，菌血症和坏死性小肠结肠炎的病 例相继被报道。美国2 0 0 2 年的监测表明，1 岁以下婴儿阪崎肠杆菌的感染率 为1 1 0 万，而出生体重偏低的新生儿感染率是8 7 1 0 万，感染死亡率高达 2 0 至5 0 以上【3 】。尽管阪崎肠杆菌可以从多种食品中检出，但在新生儿感 染该菌事件的调查中可以发现婴儿配方奶粉是主要的感染渠道。婴儿配方奶粉 中阪崎肠杆菌的污染问题引起了f a o w h o 及各国的高度重视。 据报道即使低浓度的污染也可在奶粉的冲调、放置过程中大量繁殖而成为 感染的危险因素。以下三种主要途径可以导致婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的污 染：通过生产婴儿配方奶粉的原料；在巴氏杀菌后，由配方奶粉污染或其 它添加剂干粉带入；婴儿食用前被污染。据f a o w h o ( 联合国粮农组织世 界卫生组织) 专家组的报告，目前缺乏发展中国家婴儿配方奶粉的污染资料， 缺乏因食用已污染的婴儿配方奶粉导致的疾病状况资料，但不能排除发展中国 家没有阪崎肠杆菌感染的事件蝴。 当前国外使用的阪崎肠杆菌检测方法仍是常规培养法，由于其检测周期长 ( 5 7 d ) 、程序复杂、所需试剂繁多等缺点已远远不能满足现代检测要求。 f a o w h o 在2 0 0 4 年f 5 】召开了两次国际相关会议，倡导采用国际通用的分子生 物学方法来检测阪崎肠杆菌，以弥补传统方法的局限性。随着分子技术的日益 发展，p c r 技术用于食品检测领域也日趋成熟。 我国是一个食品生产和消费大国，随着市场经济的快速发展和生活水平的 提高，特别是加入w t o 后，消费者对食品安全更加关注，食品安全与食品贸 易的关系更为密切，提高我国食品安全水平的要求越来越迫切。为确保食品安 全与食品贸易，需要大力加强食品检验的力度，传统的检验方法已不适应时代 发展的需要，迫切需要建立快速、灵敏的阪崎肠杆菌的检验方法。 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 1 2 阪崎肠杆菌简介 1 2 1 阪崎肠杆菌生物学性状 阪崎肠杆菌( e n t e r o b a c t e rs a k a z a k i i ) 作为肠杆菌科的一种一直被称为“黄 色阴沟肠杆菌”( e n t e r o b a c t e rc l o a c a e ) ，直到1 9 8 0 年才以日本细菌学家r i i c h i s a k a z a k i i 的名字命名，即“阪崎肠杆菌”，以表彰他在肠道细菌学研究方面的突 出贡献【6 j 。不像其它肠杆菌，阪崎肠杆菌d 山梨糖醇发酵阴性，产胞外d n a 酶，在t s a 、b h i 琼脂和血平板上培养4 8 7 2 h 后长出黄色菌落，在2 5 培养 比在3 6 培养黄色色素产生更显著，而且株与株之间黄色色素产生水平也存在 差异。阪崎肠杆菌a 葡萄糖苷酶活性均为阳性，其它肠杆菌均为阴性，而且只 有阪崎肠杆菌缺少内酰胺酶【6 。 阪崎肠杆菌的生化特性见表1 嗍 表1阪崎肠杆菌生理生化特性 t a b l elc h a r a c t e r i s t i co f e n t e r o b a c t e rs a k a z a k i i l 。2 2 阪崎肠杆菌毒力、耐热性和传播途径 到目前，还未知阪崎肠杆菌的致病机理或蛋白毒力因子【9 】，体外试验用中 国仓鼠卵巢( c h o ) 滤液、v e r o 、y - 1 细胞作为细菌培养物，结果显示细胞裂 解且v e r o 、v 1 细胞更易受阪崎肠杆菌侵害。分别给小鼠静脉注射和口服发现 每鼠静脉注射达到1 0 8 c f u 可致死，i z l 服两株菌可致死( 一株来自临床，另一株 由食品分离出来) 。p a g o t t o 于2 0 0 3 年进行动物试验证实所有低于1 07 c 如剂量都 会有剂量反应线性关系【l o j 。f a o w h o 对阪崎肠杆菌危险评估分析中指出一株 菌就能引发感染【5 j 。来自荷兰的成人感染报道低于1 0 4 c f u 剂量就可能存在线性 关系。n a z a r w e e w h i t e 1 1 j 和f a r b e r 1 2 】认为1 0 0 0 个阪崎肠杆菌细胞1 0 0g 为感染 2 p c r 技术检测婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的研究 限量标准比较合理。h a v e l a a r 和z w i e t e r i n g t l 3 l 认为含有低量阪崎肠杆菌的奶粉溶 液在3 7 ，大约只要2h 就能使超过1 1 0 0 0 的婴儿患病。作为革兰氏阴性杆菌， 肠杆菌拥有外毒素致病因子，所以阪崎肠杆菌被认为是条件性致病菌，口服低 致死量和静脉注射高致死量可解释为毒力因子需经胃或者肠壁吸收可易致死， 而静脉注射错过了胃和或小肠这些器官p j 。 阪崎肠杆菌感染最终的死亡率为6 0 ；随着采用第三代头孢菌素类抗生素， 阪崎肠杆菌感染的死亡率降低【l0 1 ，采用头孢素类抗生素和第二代氨基糖类抗生 素结合使用，效果显著。使用第三代抗生素后死亡率为1 4 ，但是婴儿感染( 小 于1 2 月) 的死亡率仍为3 3 ，早产儿或低重儿( 小于2 5 0 0g ) 的死亡率为4 5 ， 所有的病人康复后存在智力和身体发育迟缓的症状，有些病人还存在突发性心 脏病、大脑瘫痪等后遗症；由阪崎肠杆菌引起的坏死性小肠结肠炎死亡率为1 0 - 5 5 l 1 1 1 4 1 。阪崎肠杆菌能在很宽的温度范围内生长( 6 - - 4 7 ) 1 1 2 1 在1 0 ，1 8 ， 2 1 ，3 7 温度时的代时分别是1 3 6 ，2 9 ，1 3 ，0 5 h 。可见阪崎肠杆菌相对于其 他的肠杆菌科细菌生长范围更广，并且迟滞时间和时代更短。因此冲调好的奶 粉中如果含有少量的阪崎肠杆菌( 1c f u m l ) 在较短时间就能增殖到1 07 c f u m l 【l 驯 从而威胁健康。 早期研究认为婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的污染与该菌的高度耐热性有关 【1 2 】，然而抵抗力研究发现阪崎肠杆菌并非具有特殊的耐热性，标准的巴氏杀菌 即可将其杀死，但它能耐受一定程度的干燥和渗透压，而且比大肠埃希氏菌和 沙门氏菌要强【1 5 】。阪崎肠杆菌在环境中的分布情况也有报道【1 6 】，但在多起该菌 感染的调查研究中发现，婴儿配方奶粉是其最主要的传播途径，各国也加强了 婴儿配方奶粉和其它奶粉的检查力度【3 ，r 7 - 2 2 】。广州检验检疫局从两批邮寄进境 的婴幼儿奶粉中检出阪崎肠杆菌，从婴幼儿奶粉中检出阪崎肠杆菌，在广东尚 属首次。 1 2 3 阪崎肠杆菌的流行病学 阪崎肠杆菌的发病率虽然不高，但导致的疾病死亡率很高，从1 9 6 1 年至 2 0 0 5 年，在7 3 例阪崎肠杆菌感染婴儿的报道中，有1 9 例死亡幽j 。食用奶粉引 起阪崎肠杆菌感染主要是导致婴儿脑膜炎、坏死性小肠结肠炎和菌血症。婴儿 脑膜炎发病率为0 2 5 - 1 1 0 0 0 ，而由阪崎肠杆菌引起的脑膜炎占总发病量约为 4 ，是新生儿最常见的肠胃道疾病，肠杆菌科细菌引起的坏死性小肠结肠炎占 总发病量的2 9 t 2 1 1 ，而由阪崎肠杆菌引起的坏死性小肠结肠炎占总发病的比例 随着近年阪崎肠杆菌分离技术的发展变得越来越大 2 4 j 。l a i l 2 5 】回顾1 9 9 4 1 9 9 9 年的微生物学数据，发现3 6 的菌血症与肠杆菌科细菌有关，由于阪崎肠杆菌 只在1 9 9 6 年进行了统计，因此阪崎肠杆菌只占菌血症的0 。4 。可见，相对于 发达国家人群的食源性疾病发病率在3 0 左右，食用奶粉引起的阪崎肠杆菌感 染发生的比例不高，美国食源疾病实时监测网络( f o o dn e t ) 2 0 0 2 年调查了阪 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 崎肠杆菌在婴儿( 小于1 2 月) 中的发病率为1 1 0 0 0 0 0 1 4 】。我国还缺乏相应的 数据调查。 阪崎肠杆菌引起的所有年龄层人发病，f a o w h o 公布了阪崎肠杆菌对不 同年龄人群的影响，婴儿( 小于1 2 月) 属于对阪崎肠杆菌的高危人群，其中新 生儿为最危险人群，尤其是早产儿和低重儿或免疫力低下新生儿。阪崎肠杆菌 引起的脑膜炎中5 5 为低重新生儿( 小于2 5 0 0 9 ) ，5 0 小于1 周，几乎7 5 小于 1 月【1 4 】。f o o dn e t 1 4 2 0 0 2 年调查在低体重婴儿中的发病率为8 7 1 0 0 0 0 0 。儿童 和成年人很少感染阪崎肠杆菌，并且感染都与食品无关，病人通常患有严重的 免疫力低下疾病。 1 2 4 近年来由阪崎肠杆菌引起的中毒事件 1 9 6 1 2 0 0 5 年【2 锄8 1 报道了7 3 起婴儿阪崎肠杆菌感染事件，其中2 5 起发生 于新生儿感染，表2 是1 9 5 8 , - 一2 0 0 2 年已发生的新生儿和婴儿感染病例。 4 p c r 技术检测婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的研究 表2 新生儿和婴儿中阪崎肠杆菌的感染 t a b l e2i n f e c t i o no f e n t e r o b a c t e rs a k a z a k i ii ni p fa n di n f a n t 爆发感染年龄死亡症状 感染源文献 年号病例数目 1 9 5 8 25 & 1 0d2脑膜炎未知u r m e n y i & w h i t e - f r a n k i n ( 1 9 6 1 ) 1 9 5 8l4dl脑膜炎 未知 j s k e r , h o r h o l m & s i b o n i ( 1 9 6 5 ) 1 9 5 8 l7d0菌血症 未知 m o n r o e & t m ( 1 9 7 9 ) 1 9 5 826 & l ld2脑膜炎、脓血症 未知 a d a m s o n & r o g e r s ( 1 9 8 1 ) 1 9 5 8 1 5w0脑膜炎 未知 k l c i m a n ，a l l e n ，n e a l & r e y n o l d s ( 1 9 8 1 ) 1 9 7 7 8 lw6脑膜炎 i f m m u y t j e n se ta 1 ( 1 9 8 3 ) ，s m e e t se t 1 9 8 1 a 1 ( 1 9 9 8 ) a l d o v 6e ta 1 ( 1 9 8 3 ) p o s t u p a & a l d o v 6 ( 1 9 8 4 ) i i 2d - 2m5集群现象未知 1 9 8 41 1 9 8 42 1 9 8 6 3 1 9 8 7 1 9 8 6 4 1 9 8 7 1 9 8 1 2 1 9 8 8 1 9 8 8 4 1 9 8 8 1 9 8 8 1 9 8 9 1 9 9 4 1 8 8 9 1 9 9 5 1 9 9 6 1 9 9 7 1 9 9 8 1 9 9 9 2 0 0 0 l l w 2 ld 8 d - 4 w 5d w w 脑膜炎 脑膜炎 脑膜炎 未知 未知 l f m a r s e n i ，m a l a m o u - l a d a s ，k o u t s i a x a n t h o u & t r i k k a ( 1 9 8 7 ) n a q v i , m a x w e i l & d u n k l e ( 1 9 8 5 ) w i l l i s & r o b i n s o n ( 1 9 8 8 ) b i e r i n gc ta 1 ( 1 9 8 9 ) ；c l a r ke ta 1 ( 1 9 9 0 ) w伤1 3 潴留、阑尾 未知r e i n ap a r r a s ，gi l ，s a l v a & a l o m a r ( 1 9 8 9 ) 炎、集群现象 2脑膜炎 未知l c e o u r , s e a t a & c o r d e i m ( 1 9 8 9 ) 2 8 3 4 5 w0脓血症、带血性i f m 搅 s i m m o n sc ta 1 ( 1 9 8 9 ) ；c l a r kc ta 1 ( 1 9 9 0 ) 6 月 2 天 w w 2 0m l 6 d l 7 d 1 24d - 2m ww 腹泻 器 菌血症 i f m n o r i e g ae ta 1 ( 19 9 0 ) 脑膜炎wg a l l a g n e r & b a l l ( 1 9 9 1 ) 新生儿小肠结未知c h a n ，s a i n g , y u n g , y e u n g & t s o i ( 1 9 9 4 ) 肠炎 脑膜炎 未知r e i s ，n a r m s & s c h a r f ( 1 9 9 4 ) 伤1 2 1 感染 未知t e k k o l b a e e s a , h i g g i n s & v e n t u r e y r a ( 19 9 6 ) 脑膜炎wb u r d e t t e & s a n t o s ( 2 0 0 0 ) 脑膜炎未知w e e k l yr e p o r t ( 19 9 7 ) 结肠炎 i f m v a na v k e re ta 1 ( 2 0 0 1 ) wi f m 搅 b l o c kc ta 1 ( 2 0 0 2 ) 器 1 9 9 923d & 4d 0 菌血症、脑膜炎 i f m &b a r - o zc ta 1 ( 2 0 0 1 ) 搅器 2 0 0 0l3y0菌血症 w l a i ( 2 0 0 1 ) 2 0 0 1 l ll l 天l脑膜炎、结肠炎 i f mh i m e l r i g h te ta 1 ( 2 0 0 2 ) 2 0 0 2l4 天 l脑膜炎 未知 s a f e t y l i s t ( w e bs i t e ) 注：i f m = i n f a n t f o r m u l a m i l k p o w d e r ( 婴儿配方奶粉) ：w = 论文中未见详细报道：d - - - - 天- 、俨周m 2 月t y = 岁 5 o o w w o o o o w 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 1 3阪崎肠杆菌检测研究现状 1 3 1 传统分离鉴定方法 ( 1 ) b a m 培养法 美国f d a ( 2 0 0 2 ) 1 1 田推荐的方法需要7d 时间，以最大可能数法( m p n ) 为基 础，需要一共3 3 3g 样品( 3x1 0 0g ，3 1 0g ，3 l 曲，具体试验流程如图l 所示： 6 l o o g1 0glg 1 分别用无菌蒸馏水稀释1 0 倍， 塬动至充分溶解，3 6 ( 2 保温过夜 取混合液1 0m l ，分别接入到9 0m l 无菌e e 肉汤稀释液中，3 6 孵育过夜。 直接涂布法( v r b g a ) 直接划线法( v r b g a ) 挑取可疑菌落。划线接种至t s a 琼月旨平板 上 2 5 c 培养4 8 7 2h 上 按a p i2 0 e 进行生化鉴定 上 查m n p 条 图1f d a 方法 f i g 1f d a m e t h o d p c r 技术检测婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的研究 ( 2 ) d f i 方法 d f i 方法【2 9 】是在f d a 方法的基础上改进了显色培养基x a - g l c a ，l 光v r b g a 更加提高了检测的特异性。流程见图2 ： 上 与2 2 5 m l b p w i ：1 0 稀释 上 取1 0 m l 接种到9 0 m l e e 肉汤中 i 在d f i 琼脂平板上划线分离 上 挑取蓝绿色菌落 上 生化特征鉴定 图2d f i 方法 f i g 2d f im e t h o d ( 3 ) o k 方法 o k 方法口7 j 采用了产荧光因子4 甲基伞形酮a - d 葡萄糖苷作为阪崎肠杆菌 a - d - 葡萄糖苷酶产生的指示剂，3 号胆盐是肠杆菌的选择性培养基成份，柠檬酸 铁和硫代硫酸钠是肠杆菌科h 2 s 产生的指示剂，这种培养基的荧光指示是一种 有选择性的肠杆菌科鉴别培养基。具体方法步骤同d f i 方法。 ( 4 ) i d f 方法 2 0 0 6 年2 月i s o 和国际乳品联盟( i n t e r n a t i o n a ld a i r yf e d e r a t i o n ，i d f ) 联合公布了“乳和乳制品中阪崎肠杆菌的检测方法”，该方法分别选择m l s t - v m 和e s i a 作为阪崎肠杆菌选择性增菌肉汤和选择性分离培养基替代美国f d a 方 法中的e e 肉汤和v r b g a ，选择性培养温度均为4 4 。c ，整个试验需5 6d t 2 8 1 。 ( 5 ) 传统检测方法的比较 阪崎肠杆菌的显色培养基主要包括以下几种： 胰化蛋白胨大豆琼脂( t s a ) 结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂( v r b g a ) d f i 显色培养基琼脂( x a - g i c a ) 山梨醇麦康凯琼脂( s m a c ) 四甲基伞 形酮培养基( n a + a m u g ) 阪崎肠杆菌分离琼脂( e s n ) 。 将参考菌株的e e 肉汤培养物划线接种于t s a ，v r b g a ，x a g l c a ， n a + a m u g ，s m a c 和e s i a 培养基平板，t s a 平板2 5 培养7 2h ，其余平板 3 7 c 培养1 8 - - 2 4h ，观察菌落形态。结果显示见表3 ： 7 围围 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 表3 选择性培养基试验结果 t a b l e3t h ec o m p a r er e s u l to fs e l e c t i o nc u l t u r em e d i u m 注：af d a ( 2 0 0 2 年推荐) 【9 】：bd r u g g a n f o r s y t h e # i v e r s v n ( d h ) 培养基【2 9 】选择荧光素5 溴_ 4 - 氯一3 一吲哚- a - d 葡萄糖苷作为区 别试荆：c 山梨醇麦康凯琼脂【3 0 】。山梨醇不被分解菌落透明；d 胰蛋白胨大豆琼脂作为黄色素产生的阳性鉴别培养基【9 ，3 2 】； eo k k a n g ( o k ) j 害养基 2 7 , 3 1 ，3 2 】，利用了阪崎肠杆菌能产生a 葡萄糖酶分解葡萄糖的原理：f 原理同b 另外还有 h s i n g - c h e n & w u ( f c a ) ；l 砉养基利用了溴甲酚紫作为乳糖发酵p h 值变化的指示剂 传统检测方法的优点是：无特殊设备要求方法经典可靠可直观判断 细菌的活与死；局限性有：检测周期长，费时费力在结晶紫中性红琼脂培 养基平板上，阪崎肠杆菌与肠杆菌科其他某些菌菌落形态相似，可操作性差： 而一些改进的培养方法效率大大提高，时间缩短至4 6 d 。 ( 6 ) 全自动微生物鉴定系统 尽管2 0 0 2 年美国f d a 推荐的方法是以a p i2 0 e 试剂条做生化鉴定，后来 也有人用a p i3 2 e 进行阪崎肠杆菌检测，但目前国内还没有该菌的国家标准检 测方法。由生物梅里埃公司出品的全自动微生物鉴定分析系统t i t e k 3 3 】是目前 世界上最先进、自动化程度最高的细菌鉴定系统之一，v i t e k 已被许多国家定 为细菌最终鉴定设备，并获美国f d a 认可。该系统工作原理是以每种细菌的微 量生化反应为基础，不同类型v i t e k 鉴定卡有多达3 0 种的生化反应孔。将分 离出的待检菌落制成符合一定浊度要求的菌悬液注入鉴定卡内，封口后放入读 数器，根据鉴定卡各生化反应孔中的生长变化情况，由读数器按光学扫描原理 定时测定各种生化介质中指示剂的显色或浊度反应，然后把读出信息输入电脑 储存并进行分析，再和预订的阈值进行比较，判定反应，再通过数值编码技术 与数据库中反应文件进行比较得出鉴定结果。v i t e k 全自动微生物鉴定系统可 完全代替b a m 培养法中的a p i2 0 e 生化反应试剂条进行生化分析。 在国内外，一些相对快速的传统方法也相继被报道：o g u i l l a u m e g e n t i l 等 p 4 j 用十二烷基硫酸盐胰蛋白胨肉汤加o 5 m o l ln a c l 和1 0 m g l 万古霉素在 ( 4 5 + 0 5 ) 培养2 2 2 4 h 对阪崎肠杆菌进行选择性增菌，然后在加有胆盐的 t s a 平板划线，最后用a p l 2 0 e 试剂条鉴定。而s h a r o ng e d e l s o n m a m m e l 等1 3 5 j 采用热灭活的方法也可以较快速杀灭冲调好的婴儿配方奶粉中的阪崎肠杆菌。 s e w o o k 等【2 2 j 用荧光选择鉴别培养基对阪崎肠杆菌进行分离，效果也不错。李 洁莉等【3 6 】应用v i t e k 全自动微生物鉴定系统检测婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌。 韩伟等【37 】也建立一种快速检测阪歧肠杆菌的方法。c a r o li v e r s e n 等 3 s 】、李兆辉 等【3 9 1 、房玉国【4 0 】、赵贵明等【4 1 1 、李志勇等【4 2 】也都从不同的角度介绍了阪崎肠杆 菌的性状和检测方法，为阪崎肠杆菌的检测提供了值得借鉴的知识。 8 p c r 技术检测婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的研究 1 3 2 阪崎肠杆菌分子检测方法 从上面的介绍可以看出，阪崎肠杆菌传统检测方法耗时长，操作繁琐已经 不能满足社会的需要，分子生物学尤其是p c r 技术的发展给阪崎肠杆菌的分子 检测提供了广阔的舞台，各国的学者也从各个角度进行了探索j 。 ( 1 ) 普通p c r m a n o jk u m a rm o h a nn a i ra n dk u m a rs v e n k i t a i l 删a l l a l l m 等人通过鉴定和 分子克隆阪崎肠杆菌的外膜蛋白a ( o m p a ) 基因，建立了针对该基因的p c r 检测阪崎肠杆菌的方法。o m p a 基因和它侧面的y c b g 、s u l a 基因在大肠埃希氏 菌、沙门氏菌和志贺氏菌中都是高度保守的，在g e n b a n k 数据库中提供的e c o l i 序列信息的基础上设计一对引物，扩增出2 0 4 7 b p 的d n a 片段，p c r 产物经琼 脂糖凝胶电泳并进行胶回收以后，克隆到p g e m t 载体上进行序列分析证明为 o m p a 基因，然后通过比对在o m p a 基因上找到阪崎肠杆菌的特异性序列并设 计p c r 引物，扩增出长度为4 6 9 b p 的d n a 片段，通过1 5 琼脂糖凝胶电泳成 像观察无非特异带，特异性良好。为了检验其他细菌存在的情况下该p c r 方法 的特异性，他们还在试验中人工污染了不同水平的伤寒沙门氏菌 ( 1 0 1 1 0 8 c f u m l ) ，结果证明伤寒沙门氏菌的加入丝毫不影响该方法对阪崎肠 杆菌的特异性检出。该方法可以检测到1 0 3 c f u m l 婴儿配方奶粉，如果增加一 个8 h 的增菌步骤，检测限可以达到1 0 e f u m l 。 高旗利等【4 5 】建立和提出了奶粉中阪崎场杆菌p c r 检测方法，他们利用细菌 1 6 s - 2 3 sr d n a 间区序列设计了1 1 条阪崎场杆菌p c r 检测引物，组合成3 0 对 p c r 引物并筛选出一对特异性引物，建立了奶粉中阪崎场杆菌p c r 检测方法， 高虹等【4 6 j 选取了跟高旗利相同区域设计引物，不同的是她还建立了阪崎肠杆菌 的荧光定量p c r 检测方法。 r r n a 分子具有高度的保守性，在所有的细胞生物中都存在，其变异不受 环境的影响，这使它成为了一种很好的度量生物进化关系的分子钟。r r n a 的 功能、碱基组成、一级结构以及高级结构都很保守。已经有人建议，d n a 相关 性 1 7 0 ，1 6 s r r n a 序列差异l 1 5 的细菌菌株属于同一种，如果我们在保 守的1 6 s r r n a 序列中找到某菌的特异性序列，再借助p c r 等分子生物学试验 方法完全可以进行该菌的特异性检测。南非的m k e y s e r ，r c w i t t h u h n t 47 j 等就 用这种思路对葡萄酒厂下水道上游厌氧污泥里的阪崎肠杆菌进行了特异性检 测，他们先在1 6 s r r n a 基因上选择一段阪崎肠杆菌的特异性序列然后p c r 扩 增，扩增产物进行1 琼脂糖凝胶电泳检测，特异性良好。 ( 2 ) 定量p c r 1 6 s 2 3