（发酵工程专业论文）温度对乳酸通量的调节规律研究.pdf

摘要 代谢控制理论( m c t ) 认为，对代谢通量起控制作用的往往是多步反应，控制步骤不 一定发生在不可逆步骤，即所谓的“限速步骤”，可逆步骤也可能在通量控制中起重要作 用。但利用该理论进行分析时有一定的局限性，比如通量控制系数的计算比较困难，需要 对代谢途径中的酶进行基因操作来获得对酶活性的扰动，耗时费力。温度是多数生物体代 谢活动的重要环境因子。本课题首次提出选用温度作为对酶活性的扰动手段，运用相对简 单的分析方法，对嗜酸乳杆菌的乳酸发酵途径进行了研究。 考虑到温度对体内酶活性及酶浓度的影响，本课题通过不同温度( 1 5 到5 2 ) 下培 养乳酸菌，并以所研究的乳酸发酵途径的酶为例进行测定，建立了一种推测酶的在体活性 的方法，并分析了温度对酶在体内表达量的作用规律。根据对该途径的通量分析，绘制了 不同温度下生长的嗜酸乳杆菌的通量图谱，发现4 2 培养时乳酸通量最大，这对代谢工程 上提高乳酸产量具有一定的指导意义。最后利用主成分分析和相关分析相结合的方法，对 在体酶活性数据与乳酸通量进行分析，提出了形式上类似于通量控制系数的新指标，来评 价乳酸发酵途径中1 0 种酶对乳酸通量的控制作用。 一 结果表明，在嗜酸乳杆菌的乳酸发酵途径中，己糖激酶( 胍) 和磷酸丙糖异构酶( t p i ) 对乳酸通量具有相对较高的控制作用，均达到了2 3 7 ，丙酮酸激酶( p k ) 次之，占2 0 4 ， 而磷酸果糖激酶( p f k ) 对乳酸通量的控制作用很小，甚至有一定的负控制作用，该结果 与代谢控制理论的观点是一致的。同时利用代谢控制理论的方法进行分析，两种结果的相 关系数为0 8 5 1 ，经双尾检验，在0 0 1 水平上显著相关，说明采用本课题提出的方法，来确 定酶对代谢途径通量的调控作用是有效的，可行的。本研究方法避开了代谢控制理论的一 些难题，有望成为一种研究代谢通量控制更为简便的方法。 关键词：温度；乳酸通量；酶活性；主成分分析；相关分析；代谢控制分析( m c a ) a b s t r a c t m e t a b o l i cc o n t r o lt h e o r y ( m c t ) s u g g e s t st h a tm e t a b o l i cf l u xi so f t e nc o n t r o l l e db ys e v e r a l s t e p so fp a t h w a y , a n d c o n t r o ls t e po c c u r s u n n e c e s s a r i l yo ni r r e v e r s i b l es t e p ，s o - c a l l e d “r a t e l i m i t i n gs t e p ”，i t sp o s s i b l et h a tr e v e r s i b l es t e pa l s op l a y sa l li m p o r t a n tr o l ei nt h ec o n t r o lo f f l u x h o w e v e r ，t h et h e o r yh a sc e r t a i nl i m i t a t i o n s ，f o ri n s t a n c e ，i t sq u i t ed i f f i c u l tt oc a l c u l a t et h e f l u xc o n t r o lc o e f f i c i e n t ，a n do p e r a t i n go nt h ee n z y m e so fp a t h w a y sa tg e n el e v e li sn e e d e dt o o b t a i nad i s t u r b i n ge f f e c to ne n z y m ea c t i v i t y , w h i c hi s t i m e - c o n s u m i n g a n dl a b o r i o u s t e m p e r a t u r ei sa ni m p o r t a n te n v i r o n m e n tf a c t o rt ot h em e t a b o l i s mo fm o s to r g a n i s m s i nt h i s t o p i c ，t e m p e r a t u r ew a sc h o s e na sad i s t u r b i n gm e a n st oe n z y m ea c t i v i t yf o r t h ef i r s tt i m e ，a n dt h e l a c t i cf e r m e n t a t i o np a t h w a yw a sr e s e a r c h e d ，e m p l o y i n gar e l a t i v e l ys i m p l em e t h o d c o n s i d e r i n gt h ee f f e c to ft e m p e r a t u r eo ne n z y m ea c t i v i t ya n de n z y m el e v e li nv i v o ， l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u sw a sc u l t u r e da td i f f e r e n tt e m p e r a t u r e ( f r o m15 。ct o5 2 c ) i nt h i s s t u d y , a n dam e t h o do fe s t i m a t i o nt ot h ee n z y m ea c t i v i t yi nv i v ow a sp r o p o s e db yt a k i n gt h e e n z y m e so fl a c t i cf e r m e n t a t i o np a t h w a ya se x a m p l e ，m o r e o v e r , t h ee f f e c to ft e m p e r a t u r eo n e n z y m ee x p r e s s i o n nv i v ow a si n v e s t i g a t e d a c c o r d i n gt ot h ef l u xa n a l y s i si nt h i sp a t h w a y , t h e f l u xm a p so fl a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u su n d e rd i f f e r e n tt e m p e r a t u r eh a db e e nd r a w n ，a n dt h e h i g h e s tl a c t a t ef l u xw a sf o u n da t4 2 。c ，w h i c hm i g h th a v eag u i d a b l em e a n i n gf o rm e t a b o l i c e n g i n e e r i n gt oi m p r o v et h el a c t i ca c i dp r o d u c t i o n f i n a l l y , t h ee n z y m ea c t i v i t i e s nv i v oa n d l a c t a t ef l u xw e r ea n a l y z e d ，b yc o m b i n a t i o np r i n c i p a lc o m p o n e n ta n a l y s i s 、析t l lc o r r e l a t i o n a n a l y s i s ，a n dan e wi n d e x ，w h i c hi ss i m i l a rt ot h ef l u xc o n t r o lc o e f f i c i e n t ，w a sp u tf o r w a r dt o a p p r a i s et h ec o n t r o le f f e c to nl a c t a t ef l u xb yt e nk i n do fe n z y m e si nt h el a c t i cf e r m e n t a t i o n p a t h w a y t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a th e x o k i n a s e ( h k ) a n d t r i o s e p h o s p h a t ei s o m e r a s e ( t p i ) h a dr e l a t i v e l y h i g h e rc o n t r o le f f e c t so nl a c t a t ef l u xi nt h i sp a t h w a y , b o t ho ft h e mr e a c h e d2 3 7 ，a n dt h ee f f e c t o fp y r u v a t ek i n a s e ( p k ) w a s2 0 4 ，o p p o s i t e l y ，p h o s p h o f r u c t o k i n a s e ( p f k ) h a do n l yas m a l l v a l u e ，e v e na p p e a r e das l i g h t l yn e g a t i v ec o n t r o l ，w h i c hw a sa c c o r d a n tw i t ht h es t a n d p o i n to f m c t s i m u l t a n e o u s l y , m e t h o do fm c tw a sa l s ou s e d ，a n dt h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n to ft h et w o r e s u l t sw a s0 8 5 1 ，c o r r e l a t i o nw a ss i g n i f i c a n ta t0 0 1l e v e l ( 2 t a i l e d ) ，w h i c hi l l u m i n a t e dt h a ti t w a se f f e c t i v ea n df e a s i b l et od e t e r m i n et h ec o n t r o la n dr e g u l a t i o no fe n z y m eo nt h em e t a b o l i c p a t h w a yf l u x ，e m p l o y i n gt h em e t h o di nt h i sr e s e a r c h s o m ed i f f i c u l tp r o b l e m ss u f f e r e db ym c t h a db e e na v o i d e di nt h i sn e wm e t h o d ，w h i c hh o p e f u l l yb e c o m e sas i m p l e rw a yf o rr e s e a r c h i n g t h ec o n t r o lo fm e t a b o l i cf l u x k e y w o r d s ：t e m p e r a t u r e ；l a c t a t ef l u x ；e n z y m ea c t i v i t y ；p r i n c i p a lc o m p o n e n ta n a l y s i s ； c o r r e l a t i o na n a l y s i s ；m e t a b o l i cc o n t r o la n a l y s i s ( m c a ) 论文、参加科研情况说明以及学位论文使用授权声明 论文、参加科研情况说明以及学位论文使用授权声明 一、d 出z 表论文一、衣t 匕义 乳酸及其代谢工程生产食品科学，2 0 0 7 ，2 8 ( 9 ) ：6 2 1 6 2 6 二、参加科研情况 研究生期间参与天津市重大攻关项目( 编号：0 3 3 1 2 1 0 1 1 ) “优质原料乳的开发研究 ； 国家重大奶业专项课题( 编号：2 0 0 2 b a 5 1 8 a 0 6 ) “乳品质量安全检测关键技术研究与应用”。 三、学位论文使用授权声明 本人同意授权天津商业大学将论文的全部内容或部分内容提供给有关方面，编入 中国学位论文全文数据库、中国优秀博硕士学位论文全文数据库、天津商业大学博 硕士学位论文全文数据库等有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段 保存、汇编以供查阅或借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 第百 第一章前言 第一章前言 1 1 温度对生物的生理调节作用 温度是微生物乃至一切生物生命活动中重要的环境因子之一，它直接或间接影响这些 生物的生命活动。有些生物能够在极端温度下生长，如嗜冷菌能在0 c 甚至零度以下生活， 最适生长温度不超过1 5 c ，最高生长温度低于2 0 c 。这类微生物以其生理机制适应低温 环境。e m p 途径和t c a 循环维持微生物生命活动的基本碳转化和能量代谢途径，这些代 谢途径中的酶系统对于嗜冷菌适应低温具有重要意义。许多研究【1 。3 】表明，嗜冷菌的最高生 长温度取决于它们的一些酶类对热的敏感性。辛明秀等【4 】对嗜冷酵母y 1 8 和酿酒酵母细胞 中e m p 途径和t c a 循环中一些“关键酶 的温度特性进行了比较研究。y 1 8 细胞中，己 糖激酶、1 ，6 ，二磷酸果糖醛缩酶和琥珀酸脱氢酶对温度很敏感，符合f e l l e r 提出的“冷活性 的概念，属于冷活性酶类。柠檬酸合成酶的温度特性类似于中温酶，仅酮戊二酸脱氢酶存 在不同温度特性的同功酶。通过对嗜冷酵母和中温酵母细胞中琥珀酸脱氢酶的k m 值进行 比较，结果显示嗜冷酵母琥珀酸脱氢酶在2 0 具有较低的k 恤值。 温度变化可以促进有些植物更好地生长。孙存华等【5 】从酶学角度对昼夜变温促进小麦 生长进行了研究。发现昼夜变温条件下生长的小麦幼苗，其淀粉酶和葡萄糖6 一磷酸脱氢酶 的活性具有昼夜周期特性，白天活性较高、夜晚较低，而恒温条件下生长的小麦幼苗则无 此特性。另外测得淀粉酶的最适温度是3 5 ，而葡萄糖6 磷酸脱氢酶的为3 0 c 。分析可 知，小麦幼苗在昼夜变温条件下，通过体内不同酶活性的交替改变，可充分利用代谢反应 的中间产物，促进植物生长的终产物产量大于恒温条件下的终产物产量，从而使变温条件 生长的小麦生长速率大于恒温条件下生长的小麦。 温度也是影响果实代谢过程、品质与贮藏寿命的重要因子。王育林等【6 】综述了预冷处 理、冷冲击处理、贮前热处理、间歇升温处理和低温处理等变温处理技术，对果实采后贮 运过程中与果实衰老相关的酶活性、c 0 2 和乙烯释放等生理生化特征，以及对