线粒体遗传病及产前诊断的研究进展_陈敏玲.pdf

作者单位: 510080 广州, 中山大学附属第一医院胎儿医学中心 通讯作者: 陈敏玲( e -mail: chenminling hotmail. com) #综述# 线粒体遗传病及产前诊断的研究进展 陈敏玲 方群 陈宝江 摘要 线粒体在人类遗传中占有重要地位。近年来, 线粒体 DNA 突变与疾病的研究已成为分子遗 传学研究的热点, 但线粒体遗传病分子发病机制还有待研究, 线粒体 DNA 突变还有很多机制未阐明, 针 对线粒体遗传病的产前诊断处于摸索状态, 可信性和有效性尚不明确, 还需要长期深入的研究。 关键词 线粒体病; 遗传; 产前诊断 线粒体普遍存在于需氧呼吸的真核细胞的细胞 质中, 是生物氧化与能量转换的重要场所, 并且还是 唯一存在于细胞核外带有遗传物质的细胞器, 因此 线粒体在人类遗传中占有重要地位。线粒体疾病的 发生被认为与氧化磷酸化过程相关基因的突变有 关, 线粒体疾病主要分为两大类: 遗传性和获得性疾 病, 前者病因包括核 DNA 损害、 线粒体 DNA 损害和 基因组间的通讯障碍, 后者主要由毒素、 药物和衰老 引起。近年来, 线粒体 DNA( mtDNA) 突变与疾病的 研究已成为分子遗传学的热点, 目前发现的和 mtD - NA 突变有关的人类疾病共有 100 多种。线粒体遗 传病和线粒体突变的关系及产前诊断受到国内外学 者的关注, 本文对此领域的研究做一综述。 1 线粒体 DNA 的分子遗传学特征 mtDNA 是存在于线粒体内的闭环双链分子, 外 环为重链(H) , 内环为轻链( L) , 由 16 569bp 组成, 分 子编码共有 37 个基因, 包括 2 种 rRNA( 12s 和 16 - srRNA) 、 22种 tRNA 及 13 种与细胞氧化磷酸化( OX - PHOS) 有关的多肽链亚单位( ND1、 ND2、 CO 、 CO 、 ATPase8、 ATPase6、 CO 、 ND3、 ND4L、 ND4、 ND5、 ND6、 Cyt b) 1 。mtDNA 与核内 DNA( nDNA) 在遗传 机制上存在不同特征。 111 半自主性 线粒体在形态、 染色反应、 化学组成、 物理性质、 活动状态、 遗传体系等方面, 都很像细菌, 所以人们 推测线粒体起源于内共生。在进化过程中好氧细菌 逐步丧失了独立性, 并将大量遗传信息转移到了宿 主细胞中, 形成了线粒体的半自主性。mtDNA 基因 排列非常紧凑, 除与 mtDNA 复制及转录有关的一小 段区域外, 无内含子序列, mtDNA 上的基因相互连 接或仅间隔几个核苷酸序列, 一些多肽基因相互重 叠, 几乎所有阅读框都缺少非翻译区域。很多基因 没有完整的终止密码, 而仅以 T 或 TA 结尾, mRNA 的终止信号是在转录后加工时添加上去的, 编码的 蛋白质高度保守, 能够独立地复制、 转录和翻译, 但 缺乏完善的修复系统, 其表达和稳定性受线粒体外 核内 DNA 的调控, 同一细胞中的 mtDNA 易于相互 作用, 其突变率明显高于核 DNA。 112 遗传密码与通用遗传密码不同 遗传密码与通用遗传密码, 主要有以下几点不 同: UGA 不是终止信号, 而是色氨酸的密码; 多 肽内部的甲硫氨酸由 AUG 和 AUA 两个密码子编 码, 起始甲硫氨酸由 AUG、 AUA、 AUU 和 AUC 4 个密 码子编码; AGA、 AGG 不是精氨酸的密码子, 而是 终止密码子, 线粒体密码系统中有 4 个终止密码子 (UAA、 UAG、 AGA、 AGG) 。 113 母系遗传 线粒体病可以有多种遗传模式, 细胞核氧化磷 酸化相关基因所致的疾病表现为孟德尔方式遗传, 体细胞的 mtDNA 突变可导致散发疾病, 复杂的线粒 体疾病表型可以两者共有, 而母系遗传是 mtDNA 的 特点 2 , 一般认为精子中的 mtDNA 在受精过程中不 进入卵子里, 因此, 受累女性的所有子女都可能传到 异常 mtDNA, 而受累男性的子女均无风险。有文献 提出父系 mtDNA 可能对哺乳动物子代起作用 3 , 但 即使受精卵中存在少量的父系 mtDNA, 与母系 mtD - NA 相比, 几乎对基因型不产生影响。 114 遗传漂变现象 同一细胞中的 mtDNA 清一色正常或异常称为 均质性( homoplasmy) , 如果胞浆中既有正常的mtDNA 又有异常的 mtDNA, 而且两者比例在不同细胞中也 #266# 国外医学遗传学分册 2005 年 10 月15 日第 28 卷第 5 期 Section Genet Foreign Med Sci Oct.15, 2005,Vol.28, No.5 不一样, 称为异质性( heteroplasmy) 。当异质细胞分 裂时, 随机把mtDNA 分配到子细胞中常导致临床表 现不一致, 部分原因可能是因为细胞和组织中有突 变和正常染色体基因组( 突变型和野生型) 的不同程 度组合,mtDNA 基因型分别向纯合突变型和纯合野 生型漂变, 突变型 mtDNA 比野生型更具复制优势, 导致野生型与突变型 mtDNA 向全部为突变型的 mtDNA 方向发展, 即突变负荷( mutant load) 随时间而 增加。 115 阈值效应 mtDNA 突变型的表达与核基因表达不同, 由某 种组织突变 mtDNA 达到一定的比例时, 才表现疾 患。不同组织和器官对能量的依赖程度不同, 引起 细胞功能障碍所需的突变 mtDNA 的分子数量也就 不同, 突变负荷较高的组织更易发病, 肌肉、 心脏和 大脑等需要高能量的组织特别容易发生线粒体病, 但是听力系统、 胰腺和肝脏也有风险。另一方面, 同 一组织在不同时间由于功能不同, 对代谢受损害的 反应也不同。mtDNA 还表现多态现象, 不是所有的 突变都会导致病理性改变, 而不同的mtDNA 突变可 以产生相似的表型 1, 2 。 2 线粒体遗传病的发病机制 线粒体遗传病多数是由 mtDNA 突变所致, 一般 分为 4 类: 错义突变、 有关蛋白质生物合成的基因突 变、 插入缺失突变及拷贝数目突变。 错义突变导 致编码氨基酸顺序的改变, 多属母系遗传, 并且多数 表达出较轻的疾病表型; 有关蛋白质生物合成的 基因突变发生在编码 tRNA 的基因上, 表型呈异质 性, 若突变的mtDNA 数量小于 85%, 个体表型正常, 而且有关蛋白质生物合成的基因突变有时间阈值, 年轻时不表达, 随年龄增长逐渐加重; 插入缺失突 变通常属于个体发育早期的基因新突变, 细胞质中 的mtDNA 基因组成属异质性, 缺失至少包含一个 tRNA 基因, 同一患者体内所有细胞的缺失点相同, 但在不同的组织内缺失比例可以相差很大。最常见 从ATP ase8 到 ND5 之间的 5kb 缺失。拷贝数目 突变为mtDNA 拷贝数目大大低于正常, 较少见。导 致蛋白质合成质或量的改变, 影响细胞氧化磷酸化 的功能。 事实上, 线粒体遗传病的突变原因尚未完全阐 明, 一些基因单个突变即可引起疾病, 也有需多个基 因协调作用才致病。生殖细胞的 mtDNA 突变和体 细胞中的 mtDNA 突变有协同作用, 生殖细胞的突变 决定临床表型的性质和严重程度, 体细胞的突变可 能决定发病年龄和进展 3 。 3 常见线粒体遗传病的分子遗传学特征 311 Leigh 综合征和神经性肌无力阵挛及着色性视 网膜炎( NARP) Leigh 综合征和NARP 多由 mtDNA8993T 位点突 变引起ATP 合成酶 F0 因子的通道阻滞, T yC 突变 导致 Leigh 综合征, T y G 突变表型较轻, 表现为 NARP, 属于蛋白编码复合体V 基因突变。临床表现 为共济失调, 肌张力减退, 发育迟缓, 视神经萎缩, 眼 外展肌麻痹, 发育延缓或退化, 多数成年后发病, 幼 年发病可致死 4, 5 。 312 Leber. s遗传性视神经病( LHON) LHON 为蛋白编码复合体 I 基因突变, 多见 mtDNA11778 位点 G yA 突变, 少数为 3460GyA 和 14484T yC 位点的突变, 突变通常为均质性的, 外显 率不高, 即 LHON 突变携带者可以终生无视力障碍, 而后代可能会出现很严重的症状。临床表现急性或 亚急性发作的无痛性视神经坏死, 程度不一, 但常为 严重的双侧中心视力丧失, 保留周围视力, 多见于 12 30岁 6 。 313 Kearns -Sayre 综合征( KSS) 和慢性进行性外侧 眼肌麻痹( CPEO) KSS 多在 20 岁前发病, CPEO 多在 20 岁以后, 表型较轻。与 CPEO 和KSS 患者相关最常见的 mtD - NA 突变为mtDNA 8 470 13 447 和 8 673 16 073 之 间大片段缺失, 缺失的大小及缺失范围各不相同, 从 310 810kb 不等, 缺失型 mtDNA 占总 mtDNA 的比例 为 3716% 8710%, 缺失比例大小大致反映不同的 临床症状, 患者体内缺失的 mtDNA 随时间增加, 缺 失原因与垂直传播和自发突变有关。A3243G 点突 变也可在少数患者中检测出。临床表现多系统受 累, 出现心脏传导阻滞, 非典型色素性视网膜炎, 中 枢神经系统变性 7 。 314 Pearson 综合征 该综合征可能与mtDNA 6 097 9 541之间片段 缺失有关, 是由于 mtDNA 单一缺失引起的。患病婴 儿出生后几个月内开始发病, 进行性肝功能衰竭常 导致死亡, 出现含铁幼红细胞性贫血伴胰腺分泌功 能异常, 骨髓中有带空泡的早期细胞 8 。 315 肌阵挛性癫痫与破碎红肌纤维病(MERRF) MERRF 被认为是由于线粒体 DNA 的 tRNA Lys 基 因上第 8 344处 AyG 的点突变引起, 这个突变位于 #267#国外医学遗传学分册 2005 年 10 月15 日第 28 卷第 5 期 Section Genet Foreign Med Sci Oct.15, 2005,Vol.28, No.5 tRNA Lys 基因 TW C 环处, 使复合体 、 合成减少导 致呼吸链障碍 9 , 肌肉里的突变负荷与临床严重程 度相关。表现进行性加重的肌阵挛性癫痫, 粗糙肌 红纤维, 痴呆, 小脑共济失调性肌病, 多在儿童后期 至成年期发病。 316 线粒体性脑肌病伴乳酸( MELAS) 酸中毒及卒 中样发作和线粒体糖尿病伴耳聋( MIDD) MELAS 和 MIDD 属于tRNA Leu( UUR) 基因上的3 243 位点AyG 或11 084位点AyG 突变, 体内突变负荷 与表型的相关性不强, 血样本中的突变 mtDNA 比例 不稳定, 随时间而降低。MELAS 进行性加重的神经 退行性变, 脑室扩张, 脑组织机能障碍, 好发年龄为 5 15 岁 10 ; MIDD 大多表现为不典型 型糖尿病, 多在发病多年后出现神经性耳聋, 多有母系遗传的 糖尿病家族史, 患者还表现出神经肌肉等多系统受 累 11 。 4 线粒体遗传病的产前诊断 411 线粒体遗传病的产前诊断和遗传咨询 目前国内外对线粒体遗传病的产前诊断和咨询 尚处于相当困难的境界, 其原因与线粒体遗传病的 异质性、 高度的表型变异和阈值效应有关 12 。 mtDNA 突变遗传有所谓的/ 瓶颈( bottleneck)0现 象, 原始生殖细胞通过有丝分裂产生卵原细胞, 卵原 细胞的增殖发生于胚胎发育早期的卵巢中, 总数量 可达400 500 万个, 每个卵原细胞含有至少 100 000 个mtDNA, 而卵原细胞经过减数分裂最终形成受精 卵细胞的数量甚少, 只有大约 400 个初级卵母细胞 得到继续发育的机会, 故突变 mtDNA 经母体遗传给 子代存在极高度的变异性和选择性, 产生遗传的连 续变异现象 13 。 突变的 mtDNA 在减数分裂过程中呈不规则地 分离, 并随机进入子代细胞, 复制的高度随意性导致 各个细胞所含的突变 mtDNA 和正常的 mtDNA 比例 明显不同, 受精后的合子突变 mtDNA 比例高者表现 出较严重的表现型, 不同子代在多次由丝分裂后突 变负荷相差甚远; 突变mtDNA 还可以传递给子代的 不同类型的组织细胞, 不同组织的 mtDNA 表型不同 产生的器官病变也不同。 基因突变累积形成的阈值效应可导致病变发生 的时间变异, 即突变负荷随时间而改变, 并影响病变 严重程度, 因此子代中出现不同的表达时间和重复 突变, 增加诊断和咨询的难度。 mtDNA 突变度比核 DNA 高 10 20 倍, 任何两 人的 mtDNA, 平均每 1 000 个碱基对中就有 4 个不 同, 在人群中存在许多固定的突变, 因此线粒体遗传 病表现型尽管不常见, 但突变的基因型却很普遍。 因此, 线粒体遗传病的产前诊断和咨询出现了 以下困难: 同一系谱的不同患者往往存在发病程度 和时间的高度表现型差异; 同一患者不同组织检测 的突变mtDNA 存在差异, 比如血标本检测阴性可能 其他组织( 如肌肉等) 检测阳性; 携带突变 mtDNA 母 亲分娩的子代都有患病的风险, 但由于复制分离的 结果, 突变 mtDNA 在后代分布的比例可为 0% 95% 12, 13 ; 产前诊断胎儿组织取材( 绒毛、 羊水或脐 血细胞等) 检测出突变 mtDNA 不等于胎儿出生后患 病, 而且也不能预测患病的严重程度, 而检测阴性也 不能完全排除患病的可能 14 。 412 线粒体遗传病产前诊断的现状 尽管线粒体遗传病的产前诊断困难较大, 近年 来国外学者仍对诊断可行性进行了初步研究。2000 年第 74 届欧洲神经肌肉病中心(ENMC) 关于线粒体 病的专题讨论会就母系遗传的线粒体病达成共识, 对临床应用有一定的指导意义 15 。一般认为: 母方 的女性亲属存在较高的患病和携带突变基因风险, 若采取辅助生育胞浆置换技术时, 不应考虑为供卵 者; 线粒体遗传病种植前诊断虽然不能完全反映胚 胎的突变 mtDNA 情况, 但可以提供参考, 有研究认 为同时对极体和卵裂球进行种植前诊断, 可明显提 高诊断的可信度; 绒毛活检等宫内介入性诊断对以 下特征的线粒体遗传病( 如 Leigh 综合征) 是可行和 有效的: 突变 mtDNA 负荷量和病变程度密切关联, 各种组织中突变mtDNA 类似, 突变没有明显的时间 差异, 有资料显示突变发生在绒毛细胞 100% 的 mtDNA, 选择性流产后对不同组织诊断发现同样的 mtDNA 突变达 68% 98% 16 。对于产前诊断为阴 性结果的病例应追踪, 并要交待低水平 mtDNA 突变 的可能。早期行绒毛活检的病例在孕中晚期要复查 羊水细胞或胎儿其他组织细胞, 出生后的新生儿还 要检测可能受累器官组织( 如肌肉等) , 并加强随 访 12 。 目前文献中较成熟的产前诊断病种为与mtDNA 第 8 993 位点突变相关的 Leigh 综合征。Leshinsky - Silver 等成功完成 1 例 Leigh 综合征的产前诊断, 该 孕妇曾生育 1个 Leigh 综合征患儿和 2 个健康孩子, 孕 12周行经腹绒毛活检检测 mtDNA 第 8 993 位点 未发现GP C 突变, 孕 20 周复查羊水细胞结果一致, 胎儿出生后证实健康 5 。White 等亦对 2 例病例产 #268# 国外医学遗传学分册 2005 年 10 月15 日第 28 卷第 5 期 Section Genet Foreign Med Sci Oct.15, 2005,Vol.28, No.5 前诊断并随访 5 年证实健康, 并认为 8 993T yGP C 突变负荷和表型有很好的相关性, 血中突变负荷为 63% 时的重症风险为0125, 超出此值, 症状加重的危 险性相对增加, 组织和时间的变异性不大, 母血的突 变负荷代表其他组织水平, 母体负荷和胎儿负荷呈 正相关, 绒毛可以代表胎儿的其他组织的负荷水平。 因此对于高突变负荷的孕妇选择绒毛活检基因分析 诊断胎儿是否患病是可信的, 但对于孕妇负荷水平 不高时, 仍应谨慎进行产前咨 询 17 。Graff 对患 CPEO 的孕妇进行绒毛和脐血的缺失 mtDNA 片段检 测, 结果阴性, 婴儿出生时和生后 6个月复查外周血 亦未检出缺失 mtDNA 12 。近年有文献提出综合性 的诊断策略, 结合直接分离 mtDNA 进行OXPHOS 的 生化分析及突变基因的测序, 尤其对于部分呼吸链 功能障碍但未能找到突变基因的病例, 可以使用酶 学分析方法达到产前诊断的目的, 使用绒毛或羊水 细胞进行酶学分析的前提条件是先证者经培养的成 纤维细胞必须存在酶表达缺陷, 因为绒毛细胞、 羊水 细胞和成纤维细胞有共同的胚胎源性 18, 19 。还有学 者尝试对MELAS 的产前诊断 20 。对于突变负荷因 组织和时间差异较大、 表型和基因型相关性差和自 身突变连续差异的线粒体遗传病目前产前诊断和咨 询都处于摸索阶段, 困难较大。 5 线粒体遗传病的治疗 目前对于线粒体遗传病提出的治疗手段为: 代 谢治疗、 选择治疗、 成肌细胞互补和基因治疗。代谢 治疗包括: 补充氧化磷酸化辅助因子, 添加呼吸链所 需的辅酶, 防止氧自由基对线粒体内膜的损害。目 前运用较多的是辅酶 Q, 尤其对 KSS 等症可以缓解 代谢异常的症状; 选择治疗是选择一些能促使细胞 排斥突变线粒体的药物进行治疗, 增加细胞中正常 mtDNA 的比例, 提高细胞的氧化磷酸化水平升高至 阈值以上; 成肌细胞移植是将患病肌细胞与正常肌 细胞在体外融合, 然后回输到患者体内, 细胞生物学 研究表明成肌细胞相互融合成肌小管而发育成成熟 的肌纤维, 但目前尚未见成功的成肌细胞移植治疗 线粒体病的临床报道 21 ; 最有潜力的治疗是基因治 疗, Chrzanowska 提出了 3 种线粒体病的基因治疗途 径: 第一是将克隆有正常线粒体 DNA 的表达载体导 入到核染色体内, 在细胞质表达蛋白质产物, 然后定 向进入线粒体。第二是除去突变的线粒体 DNA。 在线粒体 DNA 复制时单链形成期, 将反义的序列特 异的寡核苷酸与之结合, 可抑制突变型的复制。应 用亲脂质阳离子、 构建靶向线粒体 PNA、 转线粒体移 植手段, 以及构建 mtDNA 样质粒, 都可能是今后的 研究方向。第三是转染野生型 DNA 或 RNA 进入线 粒体, 造成顺式或反式调控作用 22 。Seibel 等成功 地将一段与前导肽结合的寡核苷酸导入了鼠肝线粒 体, 初步证实了这种途径的可行性 23 。 尽管有多方面的尝试, 目前线粒体遗传病尚无 有效的治疗手段, 人们期待胚胎细胞核移植、 置换卵 胞浆等辅助生育技术可以为患有线粒体遗传病夫妇 最终解决子代遗传问题 24 , 此方法是很有前途的方 法, 但 mtDNA 是人类染色体外唯一存在的遗传物 质, 核移植或胞浆移植还需要伦理学的进一步考证。 6 小结 线粒体遗传病分子发病机制还有待研究, mtD - NA 突变还有很多机制未阐明, 而对该病的产前诊断 处于摸索状态, 关键问题是产前诊断的可信性和有 效性尚不明确, 还需要长期深入的研究。基因治疗 有很好的前景。随着辅助生育技术的快速发展, 可 能通过核移植和卵胞浆移植最终解决患线粒体遗传 病夫妇的生育问题。 参 考 文 献 1 DiMauro S, Schon EA. 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