医学细胞生物学实验课教学大纲.doc

医学细胞生物学实验课教学大纲(供临床医学专业五年制使用)汕头大学医学院细胞生物学与遗传学教研室2007年6月前 言细胞生物学是生命科学中最重要的基础学科和前沿学科，细胞生物学课程是培养医学生基础理论知识、实践能力、创新能力的关键环节。优秀的细胞生物学课程高等医学院校课程体系建设的重要内容。结合汕头大学医学院人才培养目标，我们将锻造理论与实践、临床与基础重组渗透，能力培养贯穿始终的、特色鲜明的医学细胞生物学课程体系作为本课程建设的目标，力争通过本课程的学习使临床医学专业学生掌握细胞生物学的基本原理、研究方法，掌握相关疾病的分子机制，提高科学素养，为其今后的终身学习、临床实践、科学研究奠定良好基础。实验课教学是理论教学的重要补充，是人才培养的关键环节。在实验教学上我们以科研与教学相结合、科研应用于教学为指导思想，坚持实验内容的先进性和综合性，创造条件改善和提高学生的动手能力，为培养学生基本科研技能奠定基础。力争通过实验课学习使学生掌握医学细胞生物学的基本理论和实验技能，提高学生独立分析问题和解决问题的能力，培养学生学习的主动性，使其具备一定的科研思维和科研能力，提高科学素养，为其今后的终身学习、临床实践和科学研究奠定良好基础。五年制细胞生物学实验课程包括基础性实验-综合设计性实验-科研活动三个层次的实验课课程体系。通过该课程体系对五年制学生实验能力进行全程培养。本教学大纲规定基础性实验和综合设计性性实验的内容，其中基础性实验为必做内容，综合设计性实验可选做2个。科研活动的内容和要求由学生和教师讨论后自行确定。汕头大学医学院细胞生物学与遗传学教研室2007年5月五年制医学细胞生物学实验课内容实验项目名称学时层 次教学手段实验一 数码互动系统使用及细胞基本形态观察4基础实验数码互动系统讲授示教讨论实验二 细胞生理活动观察4基础实验数码互动系统多媒体演示讲授、示教讨论实验三 细胞染色体标本制备与观察4基础实验数码互动系统讲授、示教讨论实验四 细胞的原代与传代培养6基础实验数码互动系统多媒体演示讲授、示教讨论实验五 细胞组分的分离与鉴定12综合实验讨论多媒体实验六 细胞骨架对细胞、细胞器的影响12综合实验讨论多媒体实验七 药物对细胞增殖与凋亡的影响12综合实验讨论多媒体实验八 定位信号与蛋白亚细胞定位12综合实验讨论多媒体大学生科研活动项目科研活动综合应用多种教学手段第一章 数码互动系统使用及细胞基本形态观察1. 实验目的(1) 掌握显微镜的结构和性能、使用方法和保护方法。(2) 掌握Motic数码互动系统的使用。(3) 观察、了解真核细胞的基本形态结构，了解细胞所处位置与形态，功能的关系。(4) 掌握蛙的解剖和血涂片制备方法。2. 实验用品(1) 材料和标本：雄蛙1只，人血液1滴。(2) 器材和仪器：载片10张、盖片3张、吸水纸、手术器材1套、解剖盘1个(3) 试剂：1甲苯胺兰、Ringers液(两栖类用)3. 实验内容(1) 制备雄蛙脊髓压片观察脊髓前角运动神经细胞。(2) 雄蛙骨骼肌细胞的剥离与观察(3) 雄蛙肝脏压片的制备与观察(4) 雄蛙血涂片的制备与观察(5) 人血涂片的制备与观察(6) 人口腔上皮细胞标本的制备与观察4. 思考总结总结动物细胞形态与其功能的关糸。第二章 细胞生理活动观察1. 实验目的(1) 通过制片与观察加深理解细胞的运动、吞噬等生理活动。(2) 掌握小白鼠的解剖方法2. 实验用品(1) 材料和标本：雄蛙、小白鼠、l鸡血悬液、6淀粉肉汤、草履虫。(2) 器材和仪器：光镜、2ml注射器、载玻片、盖玻片、解剖器材、滴管、试管、玻璃片、黑纸。(3) 试剂：0.3台盼兰、1刚果红。3. 实验内容(1) 小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬活动的观察(2) 蛙口腔口腔上颌粘膜上皮细胞纤毛和精子鞭毛运动观察(3) 草履虫纤毛运动及吞噬泡的观察4. 思考总结(1) 小鼠巨噬细胞吞噬实验如何解释细胞内台盼兰的着色。(2) 总结鞭毛与纤毛运动的异同。(3) 结合吞噬泡形成和消失的过程，说明溶酶体的形成过程。第三章 细胞染色体标本制备与观察1. 实验目的(1) 掌握小鼠骨髓细胞染色体制备方法。(2) 掌握细胞骨架的功能及影响因素。2. 实验用品(1) 材料：小白鼠(2) 器材：解剖扳、解剖剪、大小镊子、吸管、离心管、注射器、离心机、培养皿、恒温水浴锅、量筒、预冷载玻片、洒精灯、普通天平、香柏油、二甲苯、擦镜纸。(3) 试剂：200g/ml秋水仙素、0.075mol/L KCl低渗液、甲醇、冰乙酸，pH6.8磷酸缓冲液，Giemsa原液，生理盐水。3. 实验内容(1) 小鼠骨髓细胞有丝分裂抑制(2) 制备小鼠骨髓细胞染色体标本(3) 比较观察分析小鼠骨髓细胞和人正常细胞染色体的结构差异。4. 思考总结(1) 结合实验说明选择什么样的材料及如何制备染色体(2) 细胞骨架的功能第四章 细胞的原代与传代培养1. 实验目的(1) 掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程。(2) 掌握细胞培养的基本条件2. 实验用品(1) 材料和标本：新生大鼠、HeLa细胞(人宫颈癌细胞)(2) 器材和仪器：手术器械、平皿、培养瓶、吸管、离心管(灭菌后备用)、酒精灯、烧杯、超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜。(3) 试剂：含有5小牛血清的MEM培养液、0.01mol/L PBS，0.25胰蛋白酶-0.02EDTA混合消化液、75乙醇。3. 实验内容(1) 原代细胞培养(2) 传代细胞培养4. 思考总结(1) 器材及液体的准备和无菌操作的注意事项(2) 原代细胞和传代细胞培养有哪些区别?(3) 总结一下你自己的经验，怎样才能既迅速，又保证无菌操作。综合设计实验一 细胞组分的分离与鉴定1. 实验目标(1) 实现细胞内细胞核、胞质溶胶、线粒体、溶酶体等细胞器的分级分离。(2) 鉴定出不同细胞组分2. 实验要求(1) 根据细胞生物学理论课所学知识，就以上实验目的设计出实验方案(包括所选用材料、实验技术、方法)。(2) 实验方案须交指导教师修改后，然后开始实验。(3) 实验过程中要严格遵守操作规程，独立完成。(4) 以小组为单位整理实验数据，按研究论文写作要求撰写论文。3. 学习目标(1) 掌握通过分级分离细胞组分的方法。(2) 掌握细胞匀浆、差速离心、密度梯度离心、SDS-PAGE和Western印迹方法。(3) 掌握不同细胞组分的分子标记及鉴定方法4. 实验用品(1) 材料：小鼠肝脏，Hela细胞(2) 器材和仪器：组织匀浆器、超声细胞破碎仪、台式冷冻离心机、电泳槽、电泳仪、电转仪、天平、光学显微镜及其他耗材(3) 试剂：分级分离试剂：生理盐水、0.25mol/L蔗糖溶液、0.34mol/L蔗糖溶液、51g/L蔗糖溶液、51.5g/L蔗糖溶液。SDS-PAGE试剂：30% PAGE、1MTris-HCl (pH6.8)、l.5MTris-HCl (pH8.8)、10% SDS、10% 过硫酸铵、考马斯亮蓝R250、甲醇、冰醋酸、去离子水、TEMED、蛋白质分子量标准参照物。Western印迹试剂：actin、histone1、cytochrome C等抗体、转移缓冲液、HRP标记二抗、羊血清、0.5%丽春红S染料溶液、印迹缓冲液(TTBS)、封闭缓冲液、硝酸纤维薄膜、3M滤纸等。5. 实验内容(1) 胞质溶胶、细胞核、线粒体、溶酶体、过氧化物酶体的分级分离。(2) 胞质溶胶、细胞核、线粒体、溶酶体、过氧化物酶体鉴定及纯度分析。6. 思考总结(1) 如何保持分级分离产物的产量和纯度。(2) 细胞组分的鉴定可以采用哪些方法。(3) 细胞组分的分级分离实验可用于那些科研项目的研究。综合设计实验二 细胞骨架对细胞影响的观察1. 实验目标(1) 观察微丝、微管、中间纤维在细胞内的结构、分布(2) 鉴定药物对微丝、微管、中间纤维的作用性质(3) 鉴定微丝、微管、中间纤维对细胞形态、细胞核功能的影响(4) 鉴定细胞骨架对基因表达影响2. 实验要求(1) 根据细胞生物学理论课所学知识，就以上实验目的设计出实验方案(包括所选用材料、实验技术、方法)。(2) 实验方案须交指导教师修改后，然后开始实验。(3) 实验过程中要严格遵守操作规程，独立完成。(4) 以小组为单位整理实验数据，按研究论文写作要求撰写论文。2. 学习目标(1) 掌握微丝、微管、细胞核、线粒体、内质网的观察方法(2) 掌握细胞松弛素B、秋水仙素对细胞骨架的作用性质(3) 掌握免疫荧光显微镜技术3. 实验用品(1) 材料：小鼠成纤维细胞NIH3T3(2) 器材和设备：CO2培养箱、荧光显微镜、相差显微镜、超净工作台、恒温水浴箱、微量加样器、台式冷冻离心机、PCR仪、电泳槽、电泳仪、电转仪、天平、凝胶成像分析系统及其他耗材(3) 试剂：细胞骨架观察试剂：actin、tubulin、laminA抗体、Rhodamine123-二抗、FITC-二抗、线粒体内质网活体荧光染料、DAPI、细胞松弛素B、秋水仙素。SDS-PAGE试剂：30% PAGE、1MTris-HCl (pH6.8)、l.5MTris-HCl (pH8.8)、10% SDS、10% 过硫酸铵、考马斯亮蓝R250、甲醇、冰醋酸、去离子水、TEMED、蛋白质分子量标准参照物。Western印迹试剂：actin、histone1、cytochrome C等抗体、转移缓冲液、HRP标记二抗、羊血清、0.5%丽春红S染料溶液、印迹缓冲液(TTBS)、封闭缓冲液、硝酸纤维薄膜、3M滤纸等。RT-PCR试剂：Trizol、Qiagen逆转录试剂盒、PCR引物琼脂糖凝胶电泳试剂：琼脂糖、TAE、EB染料1g/l、加样缓冲液蛋白浓度测定试剂：BCA试剂4. 实验内容(1) 细胞松弛素B、秋水仙素小鼠成纤维细胞NIH3T3微丝、微管、细胞核、线粒体、内质网分布的影响。(2) 细胞松弛素B、秋水仙素小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞细胞骨架成分的作用性质：结合性质、是否导致细胞骨架成分降解。(3) 细胞骨架变化对基因表达的影响：mRNA水平、蛋白水平5. 思考总结(1) 如何获得清晰的荧光显微镜照片(2) 本实验项目可用于那些科研项目的研究综合设计实验三 药物对细胞增殖与凋亡的影响1. 实验目标(1) 证实放线菌素D对肿瘤细胞的凋亡诱导作用(2) 区分细胞群中正常细胞、凋亡细胞、坏死细胞2. 实验要求(1) 根据细胞生物学理论课所学知识，就以上实验目的设计出实验方案(包括所选用材料、实验技术、方法)。(2) 实验方案须交指导教师修改后，然后开始实验。(3) 实验过程中要严格遵守操作规程，独立完成。(4) 以小组为单位整理实验数据，按研究论文写作要求撰写论文。3. 学习目标(1) 掌握细胞凋亡的特征(2) 掌握DNA ladder、caspase活化、DNA缺口、细胞核形态变化、细胞膜变化等凋亡细胞的鉴定方法。4. 实验用品(1) 器材和设备：CO2培养箱、荧光显微镜、相差显微镜、超净工作台、恒温水浴箱、微量加样器、台式冷冻离心机、电泳槽、电泳仪、电转仪、天平及其他耗材(2) 试剂：细胞凋亡鉴定：DAPI、Hochest33258、PI、AnnexinV、caspase9抗体、HRP-二抗、酚氯仿、TUNEL试剂。SDS-PAGE试剂：30% PAGE、1MTris-HCl (pH6.8)、l.5MTris-HCl (pH8.8)、10% SDS、10% 过硫酸铵、考马斯亮蓝R250、甲醇、冰醋酸、去离子水、TEMED、蛋白质分子量标准参照物。Western印迹试剂：caspase等抗体、转移缓冲液、HRP标记二抗、羊血清、0.5%丽春红S染料溶液、印迹缓冲液(TTBS)、封闭缓冲液、硝酸纤维薄膜、3M滤纸等。琼脂糖凝胶电泳试剂：琼脂糖、TAE、EB染料1g/l、加样缓冲液蛋白浓度测定试剂：BCA试剂5. 实验内容(1) 放线菌素D对Hela细胞的凋亡诱导作用：浓度、时间(2) DNA ladder、TUNEL、细胞核、细胞膜变化、caspase活化等鉴定细胞凋亡状态。6. 思考总结本实验项目可用于那些科研项目的研究综合设计实验四 定位信号与NRDR蛋白亚细胞定位影响1. 实验目标(1) 将外源基因导入到细胞内(2) 鉴定外源基因在细胞内的表达(3) 鉴定定位信号对蛋白亚细胞定位的影响2. 实验要求(1) 根据细胞生物学理论课所学知识，就以上实验目的设计出实验方案(包括所选用材料、实验技术、方法)。(2) 实验方案须交指导教师修改后，然后开始实验。(3) 实验过程中要严格遵守操作规程，独立完成。(4) 以小组为单位整理实验数据，按研究论文写作要求撰写论文。3. 学习目标(1) 掌握质粒纯化方法(2) 掌握转染技术(3) 掌握免疫荧光双染技术(4) 熟悉载体构建方法4. 实验用品(1) 器材和设备：CO2培养箱、荧光显微镜、相差显微镜、超净工作台、恒温水浴箱、恒温摇床、微量加样器、台式冷冻离心机、电泳槽、电泳仪、电转仪、天平及其他耗材。(2) 试剂：载体：N端-融合GFP-NRDR质粒、删除C-端定位信号N-融合GFP-NRDR质粒、C端-融合GFP-NRDR质粒、删除N-端定位信号C端-融合GFP-NRDR质粒、NRDR真核表达载体亚细胞定位：线粒体、过氧化物酶体荧光染料、DAPI、COS-7细胞SDS-PAGE试剂：30% PAGE、1MTris-HCl (pH6.8)、l.5MTris-HCl (pH8.8)、10% SDS、10% 过硫酸铵、考马斯亮蓝R250、甲醇、冰醋酸、去离子水、TEME