（应用化学专业论文）含硫氨基酸寡肽自组装合成及其寡肽与DNA的相互作用研究初探.pdf

摘要 多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质，可以调节体内各个系统和细胞 的生理功能，激活体内有关酶系，促进中间代谢的通透性，或通过控制d n a 转录或影 响特异的蛋白合成，最终产生特定的生理效应，发挥其药理作用。因此，活性多肽的设 计及合成，提供高纯度的多肽样品，筛选具有生物活性的寡肽分子在医学、药学及生物 学等领域都具有十分重要的意义。 本文以电喷雾质谱为检测手段，较系统的研究了无机磷试剂p o c l 3 辅助下l 甲硫氨 酸、b 半胱氨酸、b 胱氨酸的自组装成肽反应。具体包括时间、温度、溶剂等反应条件 对三种含硫氨基酸的成肽反应的影响，三种含硫氨基酸混合成肽反应及三种含硫氨基酸 成肽活性对比分析。并借助电喷雾质谱和电喷雾多级质谱等现代分析手段，对单氨基酸 肽库及杂氨基酸肽库进行了结构鉴定，总结了三种含硫氨基酸多肽的电喷雾质谱裂解规 律。结果表明：一定温度和溶剂条件下，l 甲硫氨酸、l 半胱氨酸、l 胱氨酸均可与三 氯氧磷反应生成不同长度的寡肽；时间、温度、溶剂等反应条件对三种含硫氨基酸的成 肽反应影响较大；三种含硫氨基酸与三氯氧磷反应活性顺序为：半胱氨酸 甲硫氨酸 胱氨酸。甲硫氨酸和半胱氨酸与三氯氧磷反应活性较高，成肽效果较好，二者与三氯氧 磷在四氢呋喃中反应转化率较高，得到以二肽为主的寡肽混合物，胱氨酸与三氯氧磷反 应活性较低且在四氢呋喃中反应转化率很低，在寡肽的合成分离上意义不大；三种含硫 氨基酸多肽的m s 2 裂解规律非常相似，一般容易失去一分子水、一分子一氧化碳，然后 脱去一系列氨基酸残基，形成“b ”型离子h ( h n c h r c o ) , + 和“a ”型离子 h ( i - i n c h r c o n ) n l n = c i - i r 。+ ，符合多肽”型断裂的典型特征。 通过控制p o c l 3 与l 甲硫氨酸、l 半胱氨酸反应的条件，合成了以二肽为主的甲硫 氨酸和半胱氨酸寡肽库，利用反相高效液相色谱，以水乙腈为流动相，分别以c 1 8 和c 3 半制备柱作为甲硫氨酸和半胱氨酸寡肽库的分离和制备柱，对分离条件进行了优化，分 离和制备了甲硫二肽和半胱二肽。并借助e s i - m s 、i r 、1 h i 偶和1 3 cn m r 分析对甲硫 二肷和半胱二肽产品进行了结构表征。 利用紫外可见光谱法初步研究了甲硫二肽与小牛胸腺d n a 的相互作用，考察了甲硫 二肽浓度、时间、离子强度、磷酸根、p h 值对甲硫二肽与小牛胸腺d n a 的相互作用的 影响。研究发现：甲硫二肽与小牛胸腺瑚蛆之间相互作用静电作用为主，由紫外光谱实 验结果线性拟合求得甲硫二肽与小牛胸腺d n a 相互作用的表观结合常数为k = 1 3 9 x 1 0 2 l m o l 。 关键词；含硫氨基酸自组装寡肽d n a 相互作用 i nt h i st h e s i s ，t h er e a c t i o n 8o fs e l f - a s s o m b l yi n t oo l i g o p c p t i d e sf o rl m e t h i o n i n e ， l - c y s t e i n eo rl - c y s t i n em e d i a t e db yp o c l 3w e r es y s t e m i c a l l ys t u d i e db yu s i n ge l e c t r o s p m y i o n i z a t i o nm a s ss p e c t r o m e t e r ( e s i - m s ) 【0 r c 憎i n f l u e n c eo f t h er e a c t i o nc o n d i t i o n ss u c ha s r e a c t i o n t i m e , t e m p e r a t u r ea n ds o l v e n to ns e l f - a s s e m b l y i n t o o l i g o p e p t i d e s f o rt h r e e m d f - a m i n oa c i d sw 骶m o n i t o r e d ；1 1 r e a c t i o no fs e l f - a s s e m b l yi n t oo l i g o p e p t i d c sf o rt h r e e s u l f - a m i n oa c i d sm i x t u r ew e r ea l s o i n v e s t i g a t e d ；b e s i d e s ，t h es e l f - a s s e m b l y i n t o o l i g o p e p t i d e sa c t i v i t yo f t h r e es u l f - a m i n oa c i d sw e r ed i s c u s s e d ；e l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o nm a s s s p e c t r o m e t e r ( e s i - m s ) a n dm u l t i s t a g ee l e e t r o s p r a yi o n i z a t i o nm 硒ss p e c t r o m e t e r ( e s i - m s n ) o fh o m o - p e p t i d c sa n di n h o m o - p e p t i d e sw e r ea l s oa n a l y z e d t h e s er e s u l t ss h o wt h a t ：u n d e r s p o e i f i c a lr e a c t i o nc o n d i t i o n s ，e a c hs u l f - a m i n oa c i dc a nr e a c tw i t hp o c l 3 ，y i e l dt h e c o r r e s p o n d i n gp e p t i d e s ；t h er e a c t i o nt i m e ，t e m p e r a t u r ea n ds o l v e n tp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei n t h er e a c t i o n s ；t h er e a c t i o n so fs e l f - a s s e m b l ya c t i v i t yo r d e ro ft h r e es u l f o a m i n oa c i d sw e r e l - c y s t e i n e l - m e t h i o n i n e l - c y s f i n e ；t h er e a c t i o na c t i v i t ya n dp o l y m e r i z a t i o nk i n e t i c so f l - c y s t e i n ea n dl - m e t h i o n i n e 眦l l i 扣t h a nl c y s t i n e ，a n dp r o d u c e dt h eo l i g o p e p t i d e s m i x i u r e 抛p r i o r i t yt od i p e p t i d e ；mf r a g m e n t a t i o np a t h w a yf o rt h e s ep e p 咖鹧i np o s i t i v e e s i - m s m sa r et h a tf i r s tl o s ew a t e ra n dc a r b o nm o n o x i d e ，t h e nl o s ea m i n oa c i d sr e s i d u e ， y i e l d e dm a i n l y b ”t y p ei o n sh ( h n c h r c o ) n + a n d “a t y p ei o n sh ( h n c h r c o n h l n = c h i k , c o n s i s t e n tw i t ht h ec o n c l u s i o nt h a tt h ep r o d u c t sw e r et h eo l i g o p e p t i d a s m o l i g o p e p t i d e so fl - m e t h i o n i n ea n dl - c y s t e i n ew e r ep u r i f i e db y 啦i l l g r e v e r s e - p h a s oh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y 一a p l c ) t h el - m e t h i o n i u ea n d l - c y s t e i n eo l i g o p e p t i d e ss e p a r a t e d0 1 1c 1 8a n dc 8c o l u m n s 惦i n ga e e t o n i t r i l ea n dw a t e ra s m o b i l ep h a s e ，a n dc h l m a t o 毋 4 h i cc o n d i t i o mw c i eo p t i m i z e d w i t ht h i so p t i m i z e dc o n d i t i o n l _ m e t h i o n i n ea n dl c y s t e i n ed i p e p t i d ec o u l db es e p a r a t e da n dp e r e p a r e d d i p e p t i d ea n d t r i p e p t i d e o fd - m e t h i o n i n ea n dl - c y s t e i n e , w h i t ea n ds o l i dp r o d u c t i o n s , h a db e e n c h a r a c t e r i z e db ye s i m s m s ，i i l1 hn m ra n d1 3 cn m r t h eb a s i cc o n d i t i o mf o rt i mi n t e r a c t i o nb e t w e e nm e t - m e ta n dd n aw a i es t u d i e db y u v - v i ss p e c t r o p h o t o m c t r y i na d d i t i o n , t h ee f f e c t so fc o n c e n t r a t i o n , i n t e r a c t i o nt i m e i o n s 衄c n g t h , p h o s p h a t ei o na n dp hv a l u e so nt h ei n t e r a c t i no fm e t - m e ta n dd n aw e f e i n v e s t i g a t e d i tw a sf o u n dt h a tt h ei n t e r a e t i o no f m e t - m e t a n dd n ai si nt h es t a t i cm o d e 1 k b i n d i n g c o n s t a n t ( 1 0 0 f m e t - m e t w i t h d n a i s1 3 9 x 1 0 2 l t 0 0 1 k e yw o r d s ：s u l f - a m i n oa c i d s ，s e l f - a s s e m b l y , o l i g o p e p t i d e s ，d n a , i n t e r a c t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包括其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为 获得河南工业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示了谢意。 论文作者签名：壅趁日期：兰2 ：王型： 关于论文使用授权的说明 本人完全了解河南工业大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；本人授权 河南工业大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：盔邋日期： 导师签名：么：至日期 沪0 7 j - 琵 舍硫氨基酸寡肽的自组装合成及小分子寡肽与d n a 的相互作用研究韧探 第一章前言 蛋白质作为生命的物质基础之一，是生命功能的执行体，对生命活动起着至关重要 的作用。随着现代生命科学研究的深入，发现越来越多的多肽在生命活动中具有如分子 识别、信息传导、细胞分化和个体发育等生物功能，设计并合成这些活性多肽已成为生 命科学和药物研究的热点。 1 1 多肽的合成方法 应用现代有机合成方法，化学合成多肽已发展较为成熟，即通过将不参加反应的氨 基、羧基以及具有活性的侧链保护起来，进行缩合反应完成。常规的合成方法有液相合 成法、固相合成法和酶促合成法。 1 1 1 液相合成法 多肽的液相合成法最早是e f i s h e r 于2 0 世纪初设计的一种合成方法，其基本过程 是：先将一个氨基酸的羧基和另一个氨基酸的氨基用保护基团封闭起来，然后将参与生 成肽键的羧基激活，激活的羧基受到游离氨基的亲核进攻形成封闭的二肽，最后通过选 择性水解去除保护基团而得到一个完整的二肽。大体分为三个步骤：1 弘氨基和羧基以 及侧链基团的保护。2 羧基的活化和形成肽键。3 脱除保护基团和纯化。过程示意图 如图1 1 。 当时，e f i s h e r 【l j 最先提出用能抑制消旋的烷氧羰酰基类保护基来合成多肽，但是 此类基团不能在温和的条件下脱除。到1 9 3 2 年，m b 叫驴锄【2 】等人改用催化氢化等温 和的方法来脱除苄氧羰酰基。同时t c u r t i u s 3 1 创立了酰氯法、叠氮活化羧基的肽键生成 法。到5 0 年代初期，t h w i e l a n d 等人在t c u r t i u s 的古典方法的基础之上，发展了活 化酯法和混合酸酐法旧。 河南工业大学硕士学位论文 1 1 2 固相合成法 f 2 心 卜。卜c f 3 h 喇。卜 彳3彳2亍1 x n h c h n h c h 一c o n h c h - - c o o y 静糊麟 亍3彳2f 1 n h 2 一c h c o n h - c h c o n h _ c 卜 一c o o h ： ； j 多肚 图i - 1 液相合成多肽的示意图 液相合成法中，每次肽链的延长需要对产物进行分离纯化以去除未反应完的原料和 副产物，导致分离纯化步骤繁琐费时，损耗大，收率低。固相合成法是对液相合成法的 改进，1 9 6 3 年rb m e r r i f i e l d | 5 】建立了将氨基酸的c 端固定在不溶性树脂上，然后在此树 脂上依次缩合氨基酸，延长肽链的固相合成法。在固相法中，每一步反应之后，只需要 简单地洗脱树脂，便可到达纯化目的，克服了经典的液相合成法中每一步产物纯化的困 难，奠定了自动化肽合成的基础。由于他的贡献，1 9 8 4 被授予诺贝尔化学奖。在国外， 固相合成多肽己作为合成多肽的主要方法【曰应用于合成3 0 肽以下的小肽。其氨基保护策 略主要有f m o c 法阴和b o c 8 l 法两种。在国内，天津大学【9 ，1 0 1 ，中科院上海生命所【l l 】，南京 工业大学【1 2 】等相继开始从事固相多肽合成的研究。 ( 一) b o c ( 叔丁氧羰基) 固相合成法 在b o c 固相法中，氨基保护基采用t f a 可脱除的b o c 。侧链保护基采用苄醇类。 2 古硫氨基酸寡肽的自组装合成及小分子寡肽与d n a 的相互作用研究初操 常用树脂是氯甲基化或羟甲基化聚苯乙烯树脂，近来被更广泛采用的是比氯甲基树脂稳 定1 0 0 倍的对乙酰氨基苄酯( p a m ) 树脂。 ( 二) f m o c ( 芴甲氧羰基) 固相合成法【1 3 】 在b o c 固相法中反复使用酸处理使得肽键断裂和酸催化产生其它副反应等等，该法 尤其不适合合成含有色氨酸等对酸不稳定的肽类。1 9 7 8 年，c h a n g 、m e i e d l o f e r 和a t h c r t o n 等人采用c a r p i n o 报道的f m o c 基团作为氨基保护基，成功地进行了多肽合成。与b o c 法不同之处在于氨基保护基采用碱性可脱除的f m o c 基，侧链保护基采用t f a 可脱除的 叔丁基。树脂采用9 0 t f a 可切断的对烷氧苄醇型树脂和1 t f a 可切断的二烷氧基苄 醇型树脂，因此，最终脱保护避免了强酸处理。 帆一o o h + h o h 2 c q o c h 2 g 旧 f m n h c h c o o h + 氐沪气，( p ) l 结合树脂 艮丫 ，m 一一c r h - - c 一心c q 。c m i f m 基脱除( 2 0 哌啶) 毗r 1 c h c 0 0 - - h 2 c q o c h ：o 蛔 n h 2 一一氛矿2 氛庐弋眇 i 藕联 m 一卅r 2 c h - - c o n h - - r 1 c h 毒卜h 筘q o c h 2 0 书p f m o c n h 一 一c 0 9 一h 2 c 氐庐飞庐1) i 重复前两步 _ n h 一( 肚) - - c o o ( 肚) - - c o o h 2 c 叫o o c h ： f m o c n h 一 一龟庐2 飞j _ 弋p ) i 脱保护基 f m 。c n 0 一( 肽) 一c o o h 为不溶性基质 图1 - 2f m o c 固相合成法示意图 b o c 法氨基保护策略优势在每次耦合后用t f a 处理会解除肷类的b 折叠结构，可以 减弱二级结构对合成难度的负面影响，但缺点是合成过程中不能随时监测，而且需要使 用强酸哪脱除氨基酸的保护基，合成条件苛刻，不适宜于短肽的大规模自动合成。f m o c 法避免了肽链连接时反复使用强酸的弱点，并且每次去保护时能释放出可检测的化合物 以及没有腐蚀性试剂参与反应，其温和的反应条件使得其主要应用于敏感的氨基酸衍生 物。 3 河南工业大学硕士学位论文 1 1 3 酶促合成法 肽键的酶促合成是利用蛋白水解酶催化肽键的生成法，蛋白催化肽键水解的反应是 可逆的，酶促法的原理即是利用酶水解反应的逆反应来生成肽键14 堋。酶促合成法具有 专一高，反应条件温和，不消旋，不要求氨基酸侧链保护封闭，后处理也比较简单，但 是转化率较低和酶对底物的专一性限制了酶促合成法的应用。 1 2 氨基酸的自组装成肽反应 1 2 1 磷与肽的前生物合成 漫长的生命起源历程是一个由有机分子自组装成生物小分子，再由生物小分子自组 装成生物大分子的化学进化过程。在探究原始地球上生命大分子如肽，前人已做了很多 深入的研究。f o x 将聚磷酸引入到氨基酸的缩聚合反应中，把磷酸加热到2 0 0 0 、2 5 0 、3 0 0 c 、3 5 0 c 时所产生的聚磷酸用于氨基酸的缩合。在6 5 c 下也能发生氨基酸聚 缩合【1 6 1 ，此反应中的聚磷酸起到脱水和催化作用，但是同样的条件下，浓h 2 s 0 4 却不 能促进氨基酸的聚缩合，这显示在原始地球上聚磷酸可能作为一种脱水缩合试剂，促进 肽的形成。于1 9 6 9 年，f c l d m a n n 和r a b i n o w i t z 分别研究了在水溶液中聚磷酸对氨基酸 的缩合作用，发现用环三聚磷酸处理过的甘氨酸和丙氨酸生成的二肽产率比较理想， 并且r a b i n o w i t z 将这一反应扩展至合理的前生源条件下( 稍偏碱性、低温、低浓度) 同 样得到满意的结果，基于这一实验结果，他们提出了一个经由酰基磷酸酯( 氨基酸和磷 酸混酐) 中间体成肽的途径( 图l - 3 a ) ：氨基酸的羧基先与磷酸反应生成酰基磷酸酯， 然后氨基酸游离氨基亲核进攻氨基酸被活化的羧基生成酰肽键l l “。 但是c h u n g 等人通过深入研究发现：三聚磷酸与羧酸反应缓慢，而与氨或烷基胺 能很快反应生成开链的磷酸胺化合物1 2 0 1 ，并在甘氨酸和环三聚磷酸的反应中检测到了 磷酰甘氨酸、- 磷酰甘氨酸二肽和m 磷酰甘氨酸三肽口“。基于这一发现，他提出了 另一种成肽途径( 图1 3 b ) ：氨基酸氨基先亲核进攻磷原子形成- 磷酰化合物，然后形成 五元环混酐中间体，最后由氨基进攻环内羰基生成肽键。这一反应途径被t u h a k o 等人 的工作陋创证实，他成功地在环三磷酸和氨基酸的反应体系中检测到了m 磷酰氨基酸 和五元环混酐中间体。 含硫氨基酸寡肽的自组装合成及小分子寡肽与d n a 的相互作用研究初探 图l _ 3 氨基酸经环三聚磷酸催化缩合成肽的两种途径 1 2 2 有机磷试剂与氨基酸的自组成肽反应 e i g e n 【2 5 】认为自组装是从随机的事件开始的，并在特定的环境和化学反应条件下进 行的，自组装的单体是一种富能分予，例如a t p 及其衍生物、被活化的氨基酸等。 有机磷试剂是氨基酸的一种活化试剂，当弘氨基酸被磷酰化为肛磷酰弘氨基酸后， 具有很强的反应活性，能发生磷上酯交换、磷酸基n o 迁移、活化成肽和成酯反应 2 6 - 3 。赵玉芬课题组曾报道过，m d 二( 三甲基硅基) 弘氨基酸与0 ：d - 亚苯基磷酰氯 反应生成磷酰弘氨基酸后，可以发生自组成肽反应。这些磷试剂辅剂是二烷氧基膦 酸( 如二异丙氧基膦酸，d 踟) 或二烷( 芳) 氧基磷酰氯( 如口o - 亚苯基磷酰氯) 的有机磷试剂 3 2 , 3 3 】。其中， l 磷酰西氨基酸在没有任何催化剂、脱水剂和能量给体( 如 a t e ) 的情况下能够活化成肽【2 6 3 4 翊。基于这些结果，他们课题组提出了成肽的“1 + n ” 机理【3 5 】：_ 磷酰弘氨基酸的自组装成肽反应先经历氨基酸五配位磷化合物中间体，然 后该具有磷酸羧酸混酐结构的中间体中的被活化的羧基，受到氨基酸氨基的亲核进攻 而形成二肽，二肽进攻n - 磷酰氨基酸则形成三肽，依次进行组装生成三，四等多肽。 他们把氨基酸衍生成m d 二( 三甲基硅基) 氨基酸( b 1 m s a a ) 后，与0 ：d - 二芳基磷 河南工业大学硕士学位论文 酰氯( 如d j o - 亚苯基磷酰氯) 反应，成功地检测到了五配位磷中间体，证实了“l + n ” 机理。整个过程分为氨基酸活化、肽链延长和肽链反应终止三个阶段，反应机理如图 卜4 所示。 反应第一步氨基酸的活化，郎氨基酸五配位磷化合物4 的形成。在反应第二步肽链 延长阶段，首先，氨基酸三甲基硅基衍生物2 分子中的亚氨基对氨基酸五配位磷化合物 混酐的羰基发生亲核进攻，形成二肽的三甲基硅基衍生物，同时离去环磷酸酯6 ；然后， 所得到的二肽的三甲基硅基衍生物再对氨基酸五配位磷化合物混酐的羰基发生亲核进 攻，形成三肽的三甲基硅基衍生物同时离去环磷酸酯6 ；这种反应重复进行，即可产生 一系列的寡聚多肽。反应第三步是肽链反应终止，当反应体系中活性氨基酸4 耗尽后， 成肽反应便自动停止。在三步反应中，氨基酸的活化是最重要的一步。 步骤1 氨基酸的活化 s 赢i n h p c o o s + q 即峨3b t m s 从 堕 1234 活性氨基酸 步骤2 肽链的延长 洲? 鼍0 8 峨r2 o s i m e 3 一一 矗 矗 5 弋= 一脚栅下一f 一 d 如峋二o b 删劓脚陆“r 。b m 娜如 6 b t m s - ( n - 1 ) - p e p t i d e “弋+ 胁3 。帅c p t i d c 6 步骤3 肽链反应终止 6 含硫氨基酸寡肽的自组装合成及小分子寡肽与d n a 的相互作用研究初探 氨基酸4 消耗尽肽链反应终止 b t m s - ( d - n ) - p e p t i d e堡竺，( d i n ) - p e p t i d e - m e 3 s i o h 图1 4 三甲基硅基化氨基酸在有机磷辅助下的自组装成肽反应机理咿1 陈忠周等【3 6 】人在此基础上深入研究了舭磷酰化氨基酸与氨基酸在溶液中自组成肽 的定向效应，发现成肽反应具有方向性：成肽产物的n 端氨基酸来自i v - 磷酰化氨基酸， 成肽发生在其c 端，另外，对- 磷酰化天冬氨酸的成肽产物研究发现，只有毋羧基参 与成肽，显示出成肽反应过程具有显著的选择性。经过理论计算，提出了_ 磷酰骆氨 基酸先经一个含氢桥键结构的过渡态( 图1 5 ) 而转化成分子内磷酸羧酸混酐五配位磷 中间体的反应历程，如图1 5 所示。 oh 八矿 r o 一莨i i 啪。洲i c h - c o o 。h r 4 。迪 r 沪f 州h - 一呈曲 洲扣删阶剁亳h 2 c o o h a 。於, 、c h 2 c o o r a , v 6 p , - r n h c d 圈1 5n - 磷酰化氨基酸分子内磷酸_ 羧酸混酐五配位磷成肽机理 1 2 3 无机磷试剂与氨基酸的自组成肽反应 卢奎【3 7 - 3 9 研究发现当氨基酸与无机磷试剂( 五氯化磷、三氯氧磷、三氯化磷) 搅拌 反应的混合物经醇解或水解终止后，会生成一系列的肽酯或肽，示意图如图l - 6 。 一o h ! ! i ：i s o c l 3 p c b o r p a 3 i i ：琨o o f r o h 塔l r jn 图1 6 无机磷与氨基酸自组装成肽反应示意圉 同时对d 弘氨基酸、l 广西氨基酸和d l 弘氨基酸氨基酸成肽反应的进行了比较，发现 d - a - 氨基酸、o 弘氨基酸成肽几乎没有差别，而d l - 弘氨基酸却成肽困难，此外，当用 s o c l 2 来代替无机磷试剂与氨基酸进行反应时，未发现多肽生成。基于这些发现，深入 7 b洲。洲 o = 耋一 z _ 伽 曰r 盼 0 0 c c r n 心 河南工业大学硕士学位论文 研究了成肽反应过程，确立了可能的反应机理，如图1 7 所示。整个成肽反应过程经历 磷酰氨基酸五配位磷化合物中间体，以五氯化磷为例：五氯化磷首先与氨基酸反应形 成环状的或具有螺旋结构的氨基酸五配位磷化合物中间体，然后，羧基被活化的氨基酸 五配位磷受到一分子氨基酸羧基氧原予的亲核进攻，形成- 磷酰氨基酸- 氨基酸酸酐， 随后发生异构化生成磷酰二肽，- 磷酰二肽进攻氨基酸五配位磷化合物，则生成 磷酰三肽，依次反应下去即可得到- 磷酰多肽。 在前期研究结果基础上，周宁 4 0 - 4 5 分别以一些含羟基、氨基的小分子化合物如薄荷 醇、金鸡纳啶、苄胺等来终止反应，而得到含有这些生物活性配体的小型缀合物的肽库， 这些缀合物肽库对于研究生物活性小分子与蛋白、核酸以及细胞的识别作用提供了新的 模型。曹书霞同样利用这种氨基酸与无机磷试剂自组成肽的方法合成了并成功地分离环 肽嘲。 我们实验室深入研究了微波、温度、溶剂、时间等条件对在无机磷试剂辅助下氨基 酸自组成肽反应的影响，并发现了各氨基酸的成肽规律【4 7 】。通过控制反应，合成并成功 地分离出环脯二肽、色色二肽等小分子寡肽 4 5 4 2 】。 1 氨基酸活化 p c i 5 h 2 n 一千“。c o o h t 。 r 伊 判7 融 o h r 飘了长多_ 阻许 晶降f 。s 卜 3 肽链反应终止 + h c小 a r 一 长 ” 延链肽 夏 。寓ch 。- r 一 纣 一 曰ch c r hn 9 r 州 含硫氨基酸寡肽的自组装合成及小分子寡肽与d n a 的相互作用研究初探 降? 一峄一一h s ：r 图1 - 7 五氯化磷辅助下氨基酸自组装成肽反应的机理口7 】 1 3 常用的多肽的分离及分析方法 随着生命科学和多肽合成技术的不断发展，人工设计并合成所需的目标多肽变得相 对容易，但在合成的产物中往往伴随有与目标多肽结构类似的副产物，而目标多肽与其 结构类似物的分离及分析工作一直以来都是科研工作者面临的重要问题。目前，广泛应 用于多肽分离的方法有两大类：一是色谱法，二是毛细管电泳法。色谱法有凝胶色谱、 离子交换色谱、反相高效液相色谱法嘲；毛细管电泳法有毛细管区带电泳、毛细管等速 电泳、毛细管等电聚焦等冈。 1 3 1 色谱法分离多肽 1 3 1 1 凝胶色谱分离多肽 凝胶色谱法是按溶质分子大小进行分离的一种色谱技术，相当于一种分子筛的作 用。溶质流出凝胶的速率取决于其分子的大小和凝胶的阻滞作用的差异。比载体基质孔 径大的样品分子不能进入孔内而被排阻，很快从柱子空隙中被洗脱出来，但是比载体基 质孔径小的分子进入孔内，由于流程长。移动速度慢，因而保留时间较长。在正常情况 下，溶质按分子由大到小递减的次序被洗脱出来( 图1 8 ) 。当流动相为有机溶剂时称凝 胶渗透色谱( g p c ) ，当流动相为水溶液时称为凝胶过滤色谱( g f c ) 。它主要用于分离分 子大小不同的生物大分子及测定其分子量，是多肽分离中最常用的最简便方法【5 5 】。 溶质分子在柱中移动的速度( 即被凝胶颗粒阻滞的程度) 决定于该分子在两相间的 分配常数尉。孟，d 由下试计算： 纷一妇 k d = v i v e 某物质从柱内完全洗脱出来时洗脱液的体积 v o - 胶粒问空隙的总容积，外水体积 9 河南工业大学硕士学位论文 - 胶粒内部空隙的总体积，内水体积 肉 图1 - 8 凝胶色谱分离过程示意图 1 3 1 2 离子交换色谱分离多肽 离子交换色谱法( i o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h , i e c ) 的分离原理是基于溶质分子与 填料表面上解离基团的相互作用，样品离子和离子交换树脂上带固定电荷的活性交换基 团之间发生离子交换。由于不同样品离子对于离子交换树脂上的亲和力不同，即相互作 用强度不同，与树脂作用弱的溶质不易保留，首先从柱中被冲洗下来，而与树脂作用强 的溶质在柱内保留时间较长，当样品中不同结构的组分通过交换柱时可以得到分离。根据 离子交换树脂上的交换基团所带电荷可分为阳离子交换色谱和阴离子交换色谱。 该法主要依赖电荷问的相互作用，利用带电分子中电荷的微小差异进行分离，且有 较高的分离容量。几乎所有的生物大分子都是极性的，都可使其带电，所以离子交换法 已广泛用于生物大分子的分离纯化。由于离子交换色谱分辨率高、工作容量大且易于操 作，它已成为蛋白质、多肽、核酸及大部分发酵产物分离纯化的一种重要方法，在合成 多肽分离中约有7 5 的工艺采用离子交换色谱5 7 j 。 对多肽分子进行分离纯化可采用两种方式，一是将目的产物离子化，被交换到介质 上，杂质不被吸附，从柱流出，称为“正吸附”。此法优点是目的产物纯度高，且可达 到浓缩目的，宜处理目的产物浓度低且处理的液量大。另一方式是将杂质离子化后被交 换，而目的产物不被交换直接流出，这种方式称为“负吸附”。采用此法通常可除去5 0 7 0 的杂质，适用于目的产物浓度高的工作液。以上两种方式的选择要依据样品及具体 要求而定。无论是正吸附还是负吸附，离子交换色谱均已成为多肽化学中一种重要的分 离方法。 1 3 1 3 反相高效液相色谱分离多肽 液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃柱在室温下和常压下用液位差数输送流动 相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长( 常要几个小时) 。高效液相色谱( h i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y , i - i p l c ) 是在经典液相色谱法基础上于6 0 年代后期引 1 0 古硫氨基酸寡肽的自组装合成及小分子寡肽与d n a 的相互作用研究初探 入气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀， 小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需要用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法 ( h i g hp r e s s u r el i q l l i dc h r o m a t o g r a p h y ，h p l c ) 。当流动相的极性小于固定相的极性时， 称为正相色谱；反之，称为反相色谱。 反相色谱固定相多以硅胶为基质，但通常在其表面键合上疏水基团，如键合 c l s ( o c t a d o c y ls i l i c a ，o d s ) 弼1 ，c 8 和苯基等，样品中的不同组分和各类疏水基团之间有 不同的疏水作用。极性较强或亲水的样品分子和反相柱中的载体间的相互作用较弱，因 此较快流出，反之，疏水性相对较强的分子和基质问存在较强的相互作用，在柱内保留 的时间相对较长。反相色谱是目前液相色谱分离模式中使用最为广泛的一种分离分析模 式，这是因为在流动相组成改变的情况下，有机强溶剂能够迅速在固定相表面达到平衡， 因此特别适合于梯度洗脱。 反相高效液相色谱( r e v e r s e - p h a s e 硪g hp e r f o r m a n c ec h r o m a t o g r a p h y , r p - h p l c ) 具 有十分高的分辨力，分离对象几乎覆盖了所有类型的化合物。由于可使用挥发性冲洗剂 作为流动相，所以这种色谱不仅适用于分析型的实验，还适用于制备型的分离。反相色 谱利用非极性的反相介质为固定相，极性有机溶剂( 如甲醇、乙腈等) 或其水溶液作为流 动相进行溶质的洗脱分离1 5 9 】，是根据溶质极性( 疏水性) 的差别进行分离纯化的洗脱色谱 法。近年来，高效液相色谱被成功地用来分离生物材料中的肽，鉴定和纯化合成的肽等。 它使用了多孔微粒固定相，装填在小口径、短的不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵进 入高柱压的色谱柱，溶质在固定相的扩散速度大大加快，它以分离效果好，速度快，样 品容量大，回收率高的特点已成为生物多肽的主要分离纯化方法唧l 。 1 3 2 毛细管电泳法分离多肽 毛细管电泳是一类以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力的新型液相分离 技术。基本机构包括进样系统、毛细管、检测系统、高压电源、清洗系统、温控系统等。 它是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和分配行 为上的差异而实现分离的一类液相分离技术。在高电压作用下，带电粒子在毛细管内电 解质溶液中迁移，迁移速度等于电泳和电渗流o f ) 的矢量和。中性粒子的电泳速度为零， 其迁移速度相当于e o f 的速度。各种粒子因迁移速度的不同而实现分离。 毛细管电色谱( c e c ) t 6 1 彤】综合了现代最新分离技术m ，l c 和毛细管电泳( c e ) 的优势 而发展起来的高效电分离微柱液相色谱技术。它是用高压直流电源( 或加一定的压力) 代 替高压泵，既用电渗流( e o d 驱动流动相，溶质依据它们在流动相与固定相中的分配系 河南工业大学硕士学位论文 数的不同和自身电泳淌度，的差异得到分离，即能分离中性物质，又能分析带电组分。 c e c 是h p l c 和c e 的有机结合，不仅具有c e 水平的高柱效，同时还具有h p l c 的选择 性，它克服了c e 选择性差的缺点，同时大大提高了液相色谱的分离效率，开辟了高效 微分离技术的新途径嗍。 蛋白质和多肽在特定溶液条件下如改变p h 值，可以带上不同数量的电荷，可以根据 带的电荷差异，利用毛细管电泳可以达到分离。毛细管电泳速度快，灵敏度高，可以对 样品进行定性、定量分析及分离纯化，在蛋白质和多肽的分析检测方面有着广阔的应用 前景。但是，毛细管电泳也存在如处理样品少和不能进行大量样品收集制备等缺点。目 前，还未实现大量的样品分离制备。 1 3 3 电喷雾质谱分析检测多肽 有机质谱分析的方法原理是将被测物质分子电离成各种不同质荷比( m z ) 的带电粒 子，然后在电场、磁场或电与磁的组合场的作用下，使这些带电粒子按质荷比的大小在 空间或时间上产生分离，并测量离子峰的强度，以此获得化合物的分子量及其它相关结 构信息l 叫。 有机质谱议有进样装置、离子源、质量分析器和检测器四个部分组成。离子源有： 电子轰击离子源( e l e c t r o ni m p a c t , e i ) 、化学电离源( c h e m i c a li o n i z a t i o n ，c i ) 、快速 原子轰击源( f a s ta t o mb o m b a r d m e n t , f a b ) 、大气压电离源( a t m o s p h e r i cp r e s s u r e i o n i z a t i o n , a p i ) 、解析化学电离源( d e s o r p t i o nc h e m i c a li o n i z a t i o n , d c i ) 、场致电离和 场解电离源( f i e l di o n i z a t i o na n df i e l dd e s o r p t i o ni o n i z a t i o n , f i & f d ) 、电喷雾电离源 ( e l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o n , e s i ) 和基质辅助激光解析电离源( m a t r i x - a s s i s t e dl a s e r d e s o r p t i o ni o n i z a t i o n , m a l d i ) 、表面增强激光解析电离源( s u r f a c ee n h a n c e d l a s e r d e s o r p t i o ni o n i z a t i o n , s e l d i ) 6 6 - 7 1 1 。 物理学家j z e l e n y 于1 9 1 7 年首次在实验室展示了电喷雾现象，1 9 6 8 年，m d o l e 首次 描述了电喷雾的原理。但最早将电喷雾和质谱成功联接是j b f e n n 于1 9 8 4 年在耶鲁大学 的实验室里实现的f 咧。他不仅发明了e s i 电离方法，用此方法测定了生物大分子的分子 量，并且揭示了多电荷态的存在和阐明了它的理论f 仞。由于他的工作对生物大分子分析 领域的贡献，而被授予2 0 0 2 年诺贝尔化学奖。 e s i - m s 的工作原理是样品溶液从毛细管流出时，在电场及辅助气流作用下喷成雾状 的带电微液滴( 图1 9 ) ，在加热气体作用下，液滴中溶剂被蒸发，导致液滴直径逐渐变 小，表面电荷密度增加。当达到雷利( r a y j e i g h ) 限度时，即表面电荷产生的库仑排斥力 古碗氨基酸寡肽的自组装合成及小分子寡肽与d n a 的相互作用研究初探 与液滴表面张力大致相等，则会发生“库仑爆炸”，把液滴炸碎，雾化成pm 粒径的带电 液滴；这些液滴中溶剂再蒸发；此过程不断重复，直到液滴交得足够小，表面电荷形成 的电场足够强，最终把样品分子离子从液滴中解吸出来。这些样品离子通过锥孔、聚焦 透镜进入质谱仪分析器后被检测7 3 7 4 1 。 _ 口 准分子膏子 图l - 9 电喷雾电离过程示意图 e s i 是一种软离子化技术，通过控制实验条件( 缓冲液、p h 值、温度、仪器参数等) ， 在离子化解吸过程中，可获得共价相互作用的有关信息。e s i m s 尤其适合高极性、熟 不稳定物质的测定，其应用范围之广超出所有质谱离子化方法，e s i m s 在多肽与蛋白质 的分子量测定、氨基酸序列测定、肽图谱分析、双硫键分析、后转译修饰如糖基化、磷 酰化以及蛋白质与小分子物质的非共价结合等方面均获得了应用。电喷雾离子化技术发 展使得质谱的检测的分子量范围超过1 0 5 d at 7 5 ，7 6 ，已广泛应用于生物学、生物医学、生 物化学等学科的研究。 1 4 生物小分子与d n a 的相互作用 核酸是生物体的重要组成物质，在它的碱基对中储存着大量的遗传信息，与生物的 生长、发育和繁殖等重要的生命活动以及癌变等异常生命活动息息相关。核酸主要分为 脱氧核糖核酸( d n a ) 和核糖核酸( r n a ) 。d n a 是所有生物遗传信息的主要载体， 任何一个生物体细胞都具有发育成完整生物的全套遗传信息，基因就是d n a 分子的一个 片段。许多小分子与d n a 相互作用后不同程度地导致d n a 分子结构与功能的变化，进 而对d n a 的基因调控和表达功能产生影响。由于一些小分子可以用作抗癌药物、核酸剪 切剂、核酸结构探针以及作为杂交指示剂用于特定碱基序列基因的检测【7 7 一叼。因此，研 究生物小分子与d n a 之间的相互作用，在医学、药学及生物学等领域都具有十分重要的 意义。 1 4 1d n a 及其与生物小分子作用方式 1 9 5 3 年w a t s o n 和c 删提出了d n a 的双螺旋结构模型( 图1 - 1 0 ) ，从分子水